Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Whole-Mount kleuring, visualisatie en analyse van fungiforme, circumvallaat en gehemelte smaakpapillen

Published: February 11, 2021 doi: 10.3791/62126
Automatic Translation
1, 1
1Anatomical Sciences and Neurobiology, University of Louisville

Summary

Dit artikel beschrijft methoden voor weefselvoorbereiding, kleuring en analyse van hele fungiforme, circumvallaat- en gehemelte-smaakpapillen die consequent hele en intacte smaakpapillen opleveren (inclusief de zenuwvezels die ze innerveren) en de relaties tussen structuren in smaakpapillen en de omliggende papilla onderhouden.

Abstract

Smaakpapillen zijn verzamelingen van smaaktransducerende cellen die gespecialiseerd zijn om subsets van chemische stimuli in de mondholte te detecteren. Deze transducerende cellen communiceren met zenuwvezels die deze informatie naar de hersenen brengen. Omdat smaaktransducerende cellen continu sterven en gedurende de volwassenheid worden vervangen, is de smaakpapillenomgeving zowel complex als dynamisch, wat gedetailleerde analyses van de celtypen, hun locaties en eventuele fysieke relaties tussen hen vereist. Gedetailleerde analyses zijn beperkt door heterogeniteit en dichtheid van tongweefsel die de permeabiliteit van antilichamen aanzienlijk hebben verminderd. Deze obstakels vereisen sectieprotocollen die resulteren in het splitsen van smaakpapillen over secties, zodat metingen alleen worden benaderd en celrelaties verloren gaan. Om deze uitdagingen te overwinnen, omvatten de hierin beschreven methoden het verzamelen, in beeld brengen en analyseren van hele smaakpapillen en individuele terminale prieeltjes uit drie smaakregio's: fungiforme papillen, circumvallate papillen en het gehemelte. Het verzamelen van hele smaakpapillen vermindert bias en technische variabiliteit en kan worden gebruikt om absolute getallen te rapporteren voor functies zoals smaakpapillenvolume, totale smaakpapilleninterwevatie, transducerende celtellingen en de morfologie van individuele terminale priëlen. Om de voordelen van deze methode aan te tonen, biedt dit artikel vergelijkingen van smaakpapillen en innervatievolumes tussen fungiforme en circumvallaat smaakpapillen met behulp van een algemene smaakpapillenmarker en een label voor alle smaakvezels. Een workflow voor het gebruik van schaarscellige genetische etikettering van smaakneuronen (met gelabelde subsets van smaaktransducerende cellen) is ook aanwezig. Deze workflow analyseert de structuren van individuele smaak-zenuwprieeltjes, celtypenummers en de fysieke relaties tussen cellen met behulp van beeldanalysesoftware. Samen bieden deze workflows een nieuwe benadering voor weefselvoorbereiding en analyse van zowel hele smaakpapillen als de volledige morfologie van hun innerverende priëlen.

Introduction

Smaakpapillen zijn verzamelingen van 50-100 gespecialiseerde epitheelcellen die subsets van chemische smaakprikkels binden die aanwezig zijn in de mondholte. Smaaktransducerende cellen worden over het algemeen verondersteld te bestaan als typen1,2,3,4,5,6,7,8,9,aanvankelijk gebaseerd op elektronenmicroscopiecriteria die later werden gecorreleerd met moleculaire markers. Type II-cellen drukken fosfolipase C-beta 2 (PLCβ2)2 en transiënte receptorpotentiaal kationkanaal, subfamilie M-lid 51 tot expressie en omvatten cellen die zoet, bitter en umamitransduceren 1,10. Type III-cellen drukken koolzuuranhydrase 4 (Car4)11 en synaptosomaal geassocieerd eiwit 258 uit en duiden cellen aan die voornamelijk reageren op zure smaak11. De cellen die zoutheid transduceren, zijn niet zo duidelijk afgebakend12,13,14,maar kunnen mogelijk type I-, type II- en type III-cellen15,16,17,18,19omvatten. De smaakpapillenomgeving is complex en dynamisch, aangezien smaaktransducerende cellen gedurende de volwassenheid voortdurend omdraaien en worden vervangen door basale voorlopers3,20,21. Deze smaaktransducerende cellen verbinden zich met pseudo-unipolaire zenuwvezels uit de geniculate en petrosale ganglia, die smaakinformatie doorgeven aan de hersenstam. Deze neuronen zijn voornamelijk gecategoriseerd op basis van het soort smaakinformatie dat ze dragen22,23 omdat informatie over hun morfologie tot voor kort ongrijpbaar was24. Type II-cellen communiceren met zenuwvezels via calciumhomeostasemodulatoreiwit 1 ionkanalen25, terwijl Type III-cellen communiceren via klassieke synapsen8,26. Verdere karakterisering van smaakpapillencellen, inclusief transducerende celtype-afstammingslijnen, factoren die hun differentiatie beïnvloeden en de structuren van verbindende priëlen zijn allemaal gebieden van actief onderzoek.

Smaakpapillenstudies zijn gehinderd door verschillende technische uitdagingen. De heterogene en dichte weefsels waaruit de tong bestaat, verminderen de antilichaamdoorlaatbaarheid voor immunohistochemieaanzienlijk 27,28,29. Deze obstakels hebben sectieprotocollen noodzakelijk gemaakt die resulteren in het splitsen van smaakpapillen over secties, zodat metingen worden benaderd op basis van representatieve secties of worden opgeteld over secties. Voorheen werden representatieve dunne secties gebruikt om zowel volumewaarden als transducerende celtellingen te benaderen30. Dikkere seriële secties maken de beeldvorming van alle smaakpapillensecties en de som van metingen van elke sectie31 mogelijk. Het snijden van dergelijke dikke secties en het selecteren van alleen hele smaakpapillen vertekent het proeven naar kleinere smaakpapillen32,33,34. Zenuwinnervatieschattingen van gesegmenteerde smaakpapillen zijn gebaseerd op analyses van pixelgetallen13,35,indien gekwantificeerd op alle36,37,38. Deze metingen negeren volledig de structuur en het aantal individuele zenuwprieels, omdat priëlen zijn gesplitst (en meestal slecht gelabeld). Ten slotte, hoewel het epitheel kan worden afgepeld, kunnen hele smaakpapillen worden gekleurd39,40, het verwijdert ook smaakpapillen zenuwvezels en kan de normale relaties tussen cellen verstoren. Daarom is het onderzoek naar de structurele relaties binnen smaakpapillen beperkt vanwege deze verstoring veroorzaakt door kleuringsbenaderingen.

Verzameling van hele structuren elimineert de noodzaak van representatieve secties en maakt het mogelijk om absolute waardemetingen van volumes, celtellingen en structuurmorfologieën te bepalen41. Deze aanpak verhoogt ook de nauwkeurigheid, beperkt bias en vermindert technische variabiliteit. Dit laatste element is belangrijk omdat smaakpapillen een aanzienlijke biologische variabiliteitvertonen,zowel binnen34,42 als tussen regio's43,44,en hele smaakpapillenanalyses maken het mogelijk om absolute celaantallen te vergelijken tussen controle- en experimentele omstandigheden. Bovendien maakt het vermogen om intacte smaakpapillen te verzamelen de analyse van de fysieke relaties tussen verschillende transducerende cellen en hun bijbehorende zenuwvezels mogelijk. Omdat smaaktransducerende cellen met elkaar kunnen communiceren45 en communiceren met zenuwvezels46, zijn deze relaties belangrijk voor de normale functie. Verlies van functie kan dus niet te wijten zijn aan een verlies van cellen, maar in plaats daarvan aan veranderingen in celrelaties. Hier wordt een methode verstrekt voor het verzamelen van hele smaakpapillen om de voordelen van absolute metingen te bereiken voor het verfijnen van volumeanalyses voor zowel smaakpapillen als hun innervataties, smaakceltellingen en vormen, en voor het vergemakkelijken van analyses van transducerende celrelaties en zenuw-prieelmorfologieën. Twee workflows worden ook gepresenteerd stroomafwaarts van deze nieuwe whole-mount methode voor weefselvoorbereiding: 1) voor het analyseren van smaakpapillenvolume en totale innervatie en 2) voor schaarscellige genetische labeling van smaakneuronen (met subsets van smaaktransducerende cellen gelabeld) en daaropvolgende analyses van smaak-zenuwprieelmorfologie, aantallen smaakceltypen en hun vormen, en het gebruik van beeldanalysesoftware om de fysieke relaties tussen transducerende cellen en die tussen transducerende cellen te analyseren cellen en hun zenuwprieeltjes. Samen bieden deze workflows een nieuwe benadering van weefselvoorbereiding en voor de analyses van hele smaakpapillen en de volledige morfologie van hun innerverende priëlen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: Alle dieren werden verzorgd in overeenstemming met de richtlijnen van het Amerikaanse volksgezondheidsbeleid inzake humane zorg en gebruik van proefdieren en de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Phox2b-Cre muizen (MMRRC stam 034613-UCD, NP91Gsat/Mmcd) of TrkBCreER muizen (Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg) werden gefokt met tdTomato reporter muizen (Ai14). AdvillinCreER47 werden gefokt met Phox2b-flpo48 en Ai65. Voor 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) injecties werd de EdU bereid en doses berekend volgens Perea-Martinez et al.49.

1. Voorbereiding van materialen

  1. Bereiding van oplossingen
    1. Los 5.244 g monobasisch natriumfosfaat en 23.004 g dibasisch natriumfosfaat op in dubbel gedestilleerd water (ddH2O) op een roerplaat. Stel de pH in op 7,4 en breng het totale volume om 1 l van 0,2 M natriumfosfaatbuffer (PB) te verkrijgen.
    2. Los paraformaldehyde op in ddH2O in een zuurkast door het roeren onder roeren verhitting tot de oplossing 90 °C bereikt. Voeg 4 M NaOH-oplossing druppelsgewijs toe om het paraformaldehyde te verwijderen en filtreer de oplossing met behulp van een vacuüm Erlenmeyer en een keramisch filter met filtreerpapier. Voeg een gelijk volume van 0,2 M PB toe en stel de pH in op 7,4 om 4% PFA in 0,1 M PB te verkrijgen.

2. Weefselpreparaat

  1. Weefselverzameling
    1. Offer muizen op met behulp van een overdosis anesthesie met een werkoplossing die 10 ml steriele zoutoplossing en 0,25 ml van een stamoplossing bevat die 5 g 2,2,2-tribroomethanol en 5 ml tert-amylalcohol bevat. Transcardiaal perfuseren met 4% PFA in 0,1 M PB; verwijder de tongen en het gehemelte.
    2. Isoleer de circumvallaat smaakpapillen met behulp van een coronale snee die de achterste tong scheidt, achter de intermolar eminence; snijd de smaakpapillen af met een scheermesje; en dan de voorste tong op de middellijn doorsnijden. Post-fix 's nachts bij 4 °C met 4% PFA in 0,1 M PB.
    3. Cryoprotect het weefsel in 30% sucrose gedurende een nacht bij 4 °C.
      OPMERKING: Het weefsel kan worden ingevroren in een optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding met behulp van 2-methylbutaan gekoeld in een bekerglas op droogijs en bewaard bij -80 °C als de procedure hier moet worden gepauzeerd.
  2. Fungiform smaakpapillen
    1. Koel 2-methylbutaan in een bekerglas op droogijs ter voorbereiding op stap 2.2.8.
    2. Ontdooi en spoel de tong in 0,1 M PB. Leg de ene helft van de voorste tong met daarin de fungiforme papillen op een glazen glaasje onder een ontleedmicroscoop.
    3. Gebruik een stompe tang en een dissectieschaar om de spier te verwijderen. Gebruik een stompe tang om het weefsel open te houden terwijl het linguale epitheel gebogen is en zorg voor een vlakke oriëntatie door de messen van de grove dissectieschaar parallel aan het epitheel te houden.
    4. Gooi het ventrale niet-verhoornde epitheel van de tong weg omdat het geen smaakpapillen bevat.
    5. Gebruik een fijne dissectieschaar voor een nauwere dissectie aan de onderkant van het verhoornde epitheel.
      OPMERKING: Het is belangrijk om dicht bij het epitheel te ontleden, zodat de resterende spier van uniforme dikte is en het oppervlak glad is om een uniforme penetratie van antilichamen te garanderen. Het gevolg van niet-uniforme dikte van de resterende spier zal een ongelijke sectie op de cryostaat zijn, met blootstelling van het epitheel in gebieden met minder spieren en een dikkere spierlaag voor andere gebieden, wat de penetratie van antilichamen belemmert.
    6. Gebruik de stompe tang om een stuk epitheel in een weefselvorm (spierzijde naar beneden) te leggen en zorg ervoor dat het plat ligt. Zodra het weefsel plat is, voegt u een druppel OCT toe aan het weefsel.
      OPMERKING: Aangezien het puntje van de tong gebogen is, kan het nodig zijn om een snede te maken in het epitheel waar het is gebogen, zodat het weefsel plat kan worden gelegd.
    7. Plaats de weefselvorm op een metalen basis (eerder afgekoeld in droogijs) onder de ontleedkijker. Blijf lichtjes met de tang op het weefsel tikken totdat de OCT is ingevroren om ervoor te zorgen dat het weefsel zo plat mogelijk bevriest.
    8. Zodra de OCT is bevroren, voegt u snel extra OCT toe en plaatst u de vorm in een bekerglas van 2-methylbutaan (afgekoeld in droogijs) totdat deze bevroren is.
    9. Cryostaat sectie
      OPMERKING: De cryostaat wordt gebruikt voor fijne verwijdering van achtergebleven onderhuids weefsel, wat de penetratie van antilichamen kan remmen(figuur 1).
      1. Monteer de OCT-mallen op de cryostaat en snijd 20 μm-secties. Verzamel elke sectie en bekijk deze onder de lichtmicroscoop om de nabijheid van de basis van het epitheel te beoordelen (Figuur 1E - H).
      2. Nadat het weefsel van de onderkant van het epitheel is geschoren, ontdooit u het epitheel en spoelt u het tweemaal in 0,1 M PB op een shaker.
  3. Omrandeer smaakpapillen
    1. Gebruik een coronale snee met een scheermesje en scheid de circumvallaatpapillen van de voorste tong. Gebruik twee parasagittale sneden met hetzelfde scheermes om het weefsel lateraal aan de papilla te verwijderen onder een ontleedafstand. Plaats de papilla in een weefselvorm met behulp van een tang, zodat een laterale rand van de circumvallaatpapillen naar de onderkant van de weefselvorm is gericht.
      OPMERKING: Het weefsel kan in OCT worden ingevroren met behulp van 2-methylbutaan gekoeld in een bekerglas op droogijs en bewaard bij -80 °C als de procedure hier moet worden onderbroken.
    2. Snijd het weefsel in drijvende secties van 90 μm op de cryostaat.
  4. Smaakpapillen in de mond
    1. Snijd het harde gehemelte vooraan tot de kruising van het zachte en harde gehemelte(figuur 2). Gebruik een schaar om het zachte gehemelte van het onderliggende weefsel te scheiden en zorg ervoor dat eventuele resterende botfragmenten worden weggesneden. Verwijder extra spier- en bindweefsel.
      OPMERKING: Eenmaal verwijderd, zal al het weefsel dat overblijft bestaan uit klieren en los bindweefsel, die licht aan de onderkant van het gehemelte worden gehecht.
    2. Houd het gehemelte vast met een stompe tang en verwijder de resterende klieren en los bindweefsel door ze voorzichtig te schrapen met een scheermesje.
      OPMERKING: Het weefsel kan in OCT worden ingevroren met behulp van 2-methylbutaan gekoeld in een bekerglas op droogijs en bewaard bij -80 °C als de procedure hier moet worden onderbroken.

3. Immunohistochemische kleuring

  1. Was de tissues met 0,1 M PB, 3 x 15 min. Plaats de weefsels in buisjes van 1 ml met blokkerende oplossing (3% ezelserum, 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve stof (zie de materiaaltabel),0,1 M PB) bij 4 °C gedurende de nacht.
  2. Verwijder de blokkerende oplossing en incubeer het weefsel in primair antilichaam (konijn anti-PCLβ2) in antilichaamoplossing (0,1 M PB, 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve stof) gedurende 5 dagen bij 4 °C.
  3. Was met 0,1 M PB, 4 x 15 min elke wasbeurt, en incubeer in secundair ezel anti-konijn 488 antilichaam (1:500) in antilichaamoplossing gedurende 2 dagen bij 4 °C.
  4. Was met 0,1 M PB, 4 x 15 min elke wasbeurt, en blok met 5% normaal konijnenserum in antilichaamoplossing.
  5. Wassen met 0,1 M PB, 4 x 15 min. Incubeer met ezel anti-konijn blokkerend antilichaam (20 μg/ml) in antilichaamoplossing gedurende 2 dagen bij 4 °C.
  6. Was met 0,1 M PB, 4 x 15 min elke wasbeurt, en incubeer vervolgens met primair antilichaam dsRed (konijn) geconjugeerd aan een fluorescerend label (volgens de instructies van de fabrikant) in een antilichaamoplossing gedurende 5 dagen bij 4 °C.
  7. Wassen met 0,1 M PB, 4 x 15 min elke wasbeurt, en vervolgens incuberen met primair antilichaam (geiten anti-Car4 (1:500)) in antilichaamoplossing gedurende 5 dagen bij 4 °C.
  8. Wassen met 0,1 M PB, 4 x 15 min elke wasbeurt. Incubeer met secundair ezel anti-geit 647 antilichaam (1:500) in antilichaamoplossing gedurende 2 dagen bij 4 °C.
  9. Was met 0,1 M PB, 4 x 15 min elke wasbeurt, en monteer (epitheliale zijde naar boven) in waterige bevestigingsmedia en plaats een deklap over het weefselgedeelte.
    OPMERKING: Als u antilichamen van verschillende soorten gebruikt, zoals in het geval van keratine-8 en alleen dsRed, voegt u alle primaire antilichamen toe aan de antilichaamoplossing in stap 3.2 en alle secundaire antilichamen in stap 3.3 voordat u doorgaat naar stap 3.9.

4. Confocale beeldvorming en deconvolutie

  1. Leg confocale beelden vast met een confocale microscoop met een objectief van 60x (numeriek diafragma = 1,40), 4 ms /pixel, zoom van 3, Kalman van 2 en grootte van 1024 x 1024. Selecteer een stapgrootte van 0,47 mm langs de z-as. Gebruik voor het vastleggen van innervatie naar de papilla een zoom van 2,5 als het gezichtsveld met een zoom van 3 te smal is om alle innervatie naar de papilla vast te leggen.
  2. Als u de afbeeldingen wilt deconvolueren, moet u er rekening mee houden dat sommige instellingen automatisch met de afbeelding worden geïmporteerd; vul daarom de resterende details in voor modaliteit, objectieflens, numeriek diafragma, onderdompelingsmedium, monstermedium en fluoroforen die in de afbeelding zijn vastgelegd. Selecteer vervolgens 3D-deconvolutie.

5. Beeldanalyse

  1. Smaakpapillen en innervatievolume
    1. Importeer gedeconvolueerde afbeeldingsstapels naar een pixelgebaseerde beeldanalysesoftware (zie de tabel met materialen)om het volume van de smaakpapillen en het volume van de totale innervatie in de smaakpapillen te bepalen.
      1. Verwijder het vinkje bij Volume in het hoofdmenu Object.
      2. Selecteer Nieuwe oppervlakken toevoegen in het menu Object. Selecteer Automatisch maken overslaan, handmatig bewerkenen selecteer vervolgens Contour.
      3. Klik op Selecteren en observeer de pijl die verschijnt als een + om de rand van de smaakpapillen te traceren. Beweeg de snijmachine en schets de smaakpapillen in elke optische sectie. Zodra de contouren zijn voltooid, klikt u op Surface maken.
      4. Observeer het volumeobject van de smaakpapillen dat nu wordt weergegeven in het hoofdmenu Object. Zoek het volume van de smaakpapillen onder Tools.
    2. Volume van innervatie in de smaakpapillen
      1. Selecteer het potloodpictogram onder het smaakpapillenobject en selecteer vervolgens Alles maskeren.
      2. Selecteer in het vervolgkeuzemenu het fluorescerende kanaal dat overeenkomt met het zenuwvezellabel. Schakel Het selectievakje Duplicaatkanaal maken in.
      3. Schakel het selectievakje Voxels buitenoppervlak instellen in op:en typ 0 in het vak.
      4. Observeer het nieuwe kanaal dat verschijnt in het venster Display Adjustment, een ongewijzigd duplicaat van het fluorescerende kanaal dat in de smaakpapillen is geselecteerd.
      5. Selecteer in het hoofdmenu Object de optie Nieuwe Surface maken. Verwijder het vinkje bij Automatische aanmaak overslaan, handmatig bewerken.
      6. Klik twee keer op de blauwe pijl om door te gaan naar de volgende stap.
      7. Klik op Verwijderenen klik vervolgens op de groene dubbele pijl om het oppervlak te voltooien, dat het volume van de zenuwvezels in de smaakpapillen vertegenwoordigt. Als u de waarde voor het volume wilt vinden, selecteert u Gereedschappen in het menu Zenuwvezelobject en selecteert u Volume in het vervolgkeuzemenu.
    3. Volume van innervatie aan de papilla
      1. Maak een volume van de smaakpapillen zoals beschreven in rubriek 5.1.
      2. Selecteer het potloodpictogram onder het smaakpapillenobject en selecteer vervolgens Alles maskeren.
      3. Selecteer in het vervolgkeuzemenu het fluorescerende kanaal dat overeenkomt met het zenuwvezellabel. Schakel Het selectievakje Duplicaatkanaal maken in.
      4. Schakel het selectievakje Voxels binnenoppervlak instellen in op: in en typ 0 in het vak. Klik op OK.
      5. Genereer een oppervlak door op Nieuwe Surface toevoegente klikken. Selecteer Alleen een interessegebied segmenteren.
      6. Klik op de blauwe pijlen verhoog de Z-waarde zodat het interessegebied begint aan de basis van de smaakpapillen.
      7. Klik twee keer op de blauwe pijl om door te gaan naar de volgende stap.
      8. Klik op Verwijderenen klik vervolgens op de groene dubbele pijl om het oppervlak te voltooien, dat het volume van de innervatie naar de papillen vertegenwoordigt. Als u de waarde voor het volume wilt vinden, selecteert u Gereedschappen in het menu Zenuwvezelobject en selecteert u Volume in het vervolgkeuzemenu.
    4. Terminal arbor contact analyse
      1. Beeldvoorbereiding
        1. Ga naar het menu Bewerken en selecteer 3D bijsnijden. Snijd de afbeelding aan alle kanten bij en verwijder ruimte buiten de smaakpapillen.
          OPMERKING: Snijd zo dicht mogelijk bij de smaakpapillen zonder een relevante structuur te verwijderen - een overtollig beeld zal de verwerkingstijd verlengen.
        2. Selecteer Bewerken in het hoofdmenu en klik op Gegevenstype wijzigen. Selecteer Aan: 32 bit float in het vervolgkeuzemenu.
        3. Selecteer Nieuwe oppervlakken toevoegen in het menu Object. Klik op Automatisch maken overslaan, handmatig bewerken,selecteer Contouren sleep de segmentpositie naar rechts om het totale aantal optische segmenten te vinden.
        4. Genereer isometrische voxels en zorg ervoor dat in plaats van dat de voxels rechthoeken zijn (0,0691 x 0,0691 x 0,474) als XxYxZ, de voxels respectievelijk 0,0691 x 0,0691 x 0,0691 zijn door de rechthoeken te verdelen in kubussen met identieke waarden voor fluorescentie-intensiteit als de oorspronkelijke, rechthoekige voxel. Selecteer Afbeeldingseigenschappen. Deel vervolgens de Z-waarde voor Voxel-grootte door de X- of Y-waarde (= 0,474/0,0691) en vermenigvuldig die waarde met het aantal segmenten (optische secties) in de vorige stap.
        5. Ga terug naar Bewerken in het hoofdmenu en selecteer Resample 3D.
        6. Vervang de Z-waarde (aantal segmenten) door de nieuw berekende waarde.
      2. Automatische oppervlakken creëren op basis van fluorescentie
        1. Klik nogmaals op Nieuwe Surface toevoegen om een nieuw oppervlak toe te voegen, schakel Deselecteer alleen een interessant gebieden klik op Volgende.
        2. Selecteer in het vervolgkeuzemenu Bronkanaal het kanaal voor een van de smaaktransducerende celtypen. Schakel Vloeiend uit en ga verder met de volgende stap.
        3. Wijzig niets op het volgende scherm dat het bereik van fluorescerende intensiteiten in het beeld weergeeft. Klik nogmaals op de blauwe pijl onderaan om naar de volgende stap te gaan.
        4. Klik op Verwijderenen klik vervolgens op de groene dubbele pijl om het oppervlak te voltooien.
        5. Ga naar het menu Object aan de linkerkant van het scherm waar het voltooide celoppervlak wordt weergegeven en iets generieks wordt genoemd, zoals Surface 2. Dubbelklik op de naam van het oppervlak om deze een naam te geven op basis van wat het label vertegenwoordigt.
          OPMERKING: In dit geval is het gegenereerde oppervlak gebaseerd op de PLCß2-gelabelde cel.
        6. Als er stippen in plaats van een oppervlak zijn, klikt u onder het menu in de linkerbenedenhoek op Surface in plaats van op middelpunt. Klik vervolgens op OK wanneer daarom wordt gevraagd.
        7. Herhaal stap 5.3.2.1-5.3.2.5 voor de andere smaaktransducerende celmarkers en de zenuwvezelmarker.
        8. Bewaar (exporteer) de voortgang.
        9. Klik op een celtype Surface in het hoofdmenu. Klik in het menu van dat object op Extraen klik vervolgens op Afstandstransformatie.
        10. Wacht tot er een pop-upvenster met de titel XTDistanceTransformation verschijnt. Selecteer Buitenoppervlakobject. Noteer het nieuwe kanaal dat wordt weergegeven in het menu Weergaveaanpassing met de naam Afstand tot oppervlak.
        11. Selecteer het zenuwvezeloppervlak in het menu Object. Klik op het potloodpictogram en vervolgens op Alles maskeren.
        12. Selecteer in het vervolgkeuzemenu dat wordt weergegeven de nieuwe kanaalafstand tot oppervlaktenaam. Noteer het nieuwe kanaal dat wordt weergegeven in het venster Weergaveaanpassing met de naam Gemaskeerde afstand tot oppervlaktenaam.
        13. Maak een nieuw object met het hoofdmenu Object. Schakel de selectie van Segmenteer alleen een interessant gebied uit en klik op de blauwe pijl. Selecteer het kanaal Masked Distance to PLCß2 en schakel Smooth uit.
        14. Controleer op het volgende scherm of er regio's zijn waar de smaaktransducerende cellen zich binnen de kleinste afstand van de zenuwvezels bevinden die door deze software kunnen worden waargenomen. Stel hiervoor een limiet in van 0,01-0,11 μm om te controleren op receptorcelfluorescentie zo dicht bij de zenuwvezels.
        15. Typ 0.01 in het groene vak aan de linkerkant om de onderste drempel in te stellen, druk op Tab. Klik vervolgens op de rode knop en typ 0.11 om de bovengrens in te stellen. Druk op Tab en klik vervolgens op de blauwe pijl onderaan om door te gaan naar de volgende stap.
        16. Klik op Verwijderen en vervolgens op de groene dubbele pijl om te voltooien.
        17. Wijzig de naam van dit oppervlak binnen 0,01-0,11 van PLCß2 in het menu Object. Selecteer Binnen 0,01 - 0,11 van plcß2-oppervlak in het menu Object.
        18. Selecteer het potlood en klik vervolgens op Alles maskeren. Selecteer het rode kanaal (zenuwvezel) in het vervolgkeuzemenu en klik op OK. Noteer het nieuwe kanaal dat wordt weergegeven in het venster Aanpassing weergeven met de naam Masked CHS2.
        19. Klik op de naam van het kanaal; hernoem het kanaal Binnen 0.01 - 0.11 van PLCß2.
          OPMERKING: Dit is een fluorescerend kanaal dat een duplicaat vertegenwoordigt van het rode fluorescerende kanaal dat aanwezig is in het gecreëerde oppervlak.
        20. Klik op wit in het midden van de kleurkiezer. Selecteer een kleur die contrasteert met de kleuren van de structuren.
        21. Exporteer (d.w.z. sla op) het bestand in dit stadium.
        22. Herhaal stap 5.4.2.9-5.4.2.21 voor andere smaaktransducerende celmarkers.
        23. Exporteer (d.w.z. sla op) het bestand in dit stadium.
          OPMERKING: Om de nabijheid van het ene gelabelde celtype tot het andere te analyseren, vervangt u eenvoudig het zenuwvezeloppervlak in stap 5.4.2.11 (en de volgende stappen) door het object van belang en de equivalente componenten die betrekking hebben op elke volgende stap.

6. Reconstructie van het prieel van neuronen en kwantificering van het absolute celnummer

  1. Tracering en analyse van terminalprieel
    1. Open het gedeconvolueerde afbeeldingsbestand in een op 3D-vector gebaseerde beeldanalysesoftware (zie de tabel met materialen),selecteer Traceren,klik op Neuronen klik vervolgens op Dendriet.
    2. Scrol naar de basis van de smaakpapillen in de afbeeldingsstapel. Traceer elke vezel tot het einde terwijl u door de afbeeldingsstapel scrolt.
    3. Wanneer u aan het filiaaleinde bent, klikt u met de rechtermuisknop op het einde en selecteert u Beëindigen. Klik op vertakkingspunten met de rechtermuisknop en selecteer Bifurcating Node.
      OPMERKING: Dit maakt het mogelijk om de ene tak naar het einde te traceren en vervolgens terug te keren naar het splitsingspunt en de andere tak te traceren met het programma dat erkent dat deze tracering nog steeds van hetzelfde neuron is.
    4. Sla het gegevensbestand op als een . DAT-bestand, dat vervolgens kan worden geopend voor analyse in de 3D vector-gebaseerde beeldanalysesoftware.

7. Kwantificering van het celnummer

  1. Kwantificeer de gelabelde smaakpapillencellen in elk softwarepakket voor beeldanalyse, zolang verschillende markers voor transducerende celtypen die verankerd zijn in de z-positie op nucleair niveau kunnen worden geplaatst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kleuring van het linguale epitheel met antilichamen tegen dsRed en keratine-8 (een algemene smaakpapillenmarker) gelabeld zowel hele smaakpapillen als alle smaakpapillen innervatie in Phox2b-Cre:tdTomato muizen50,51 (Figuur 3A). Het afbeelden van deze smaakpapillen van hun poriën tot hun basen gaf de hoogste resolutie x-y vlakbeelden(Figuur 3A,B). De contourfunctie van het pixelgebaseerde beeldvormingsprogramma werd gebruikt om de periferie van de smaakpapillen in elke sectie te schetsen (figuur 3B) en vervolgens een oppervlak te genereren (figuur 3C) dat het volume van de smaakpapillen vertegenwoordigde. Het maskeren (of dupliceren) van de fluorescentie geassocieerd met het smaakpapillenlabel alleen binnen het oppervlak creëerde een nieuw kanaal dat alleen deze fluorescentie bevatte en elimineerde eventuele papillakleuring die de smaakpapillen verduisterde(Figuur 3D). De zenuwvezelfluorescentie in de smaakpapillen werd gemaskeerd(figuur 3E)en gebruikt om automatisch een oppervlak te creëren dat het volume van innervatie erin vertegenwoordigt(figuur 3F). Een soortgelijke benadering werd ook gebruikt om het volume van de smaakpapillen en die van de bijbehorende innervatie in circumvallaat smaakpapillen te meten (Figuur 3G). Representatieve meetgegevens toonden geen correlaties aan tussen smaakpapillenvolumes en innervatievolumes in de fungiforme (p = 0,115) of de circumvallaat (p = 0,090) meetgebieden (figuur 3H).

De toediening van een lage dosis tamoxifen bij TrkBCreER:tdTomato muizen veroorzaakt genrecombinatie en de etikettering van een klein aantal neuronen zodat smaakpapillen worden geïnnerveerd door nul tot enkele gelabelde terminale prieeltjes (het neuronale gedeelte in de smaakpapillen). Het linguale epitheel werd gekleurd met behulp van een anti-dsRed-antilichaam voor de terminale priëlen en anti-Car4 (zuur) en anti-PLCβ2 (zoet, bitter en umami) antilichamen voor de smaaktransducerende cellen (figuur 4A). Een vectorgebaseerd beeldanalyseprogramma werd gebruikt om de gelabelde terminalprieels te traceren(figuur 4B). De orthogonale hoogten van de priëlen geassocieerd met de blauwe en groene traceringen waren respectievelijk 33,4 μm (figuur 4C) en 32,4 μm (figuur 4D). De 3D Convex Hull-metingen (d.w.z. de omvang van het terminalprieel in de smaakpapillen) voor het blauwe terminalprieel waren 644,0 μm3 en 3647,0 μm3 voor het groene prieel. Het dendrogram voor de groene tracering is weergegeven in figuur 4E met taklengtes gemeten in micron. Het groene prieel had zeven takeinden en een totale lengte van 183,4 μm. Kwantificering van de absolute aantallen PLCβ2+ en Car4+ cellen onthulde dat deze smaakpapillen 17 PLCβ2+ cellen en twee Car4+ cellen hadden. Met behulp van op celpixels gebaseerde beeldvormingssoftware om de dichtstbijzijnde nabijheid tussen zenuwvezels en smaaktransducerende cellen te bepalen, bleek dat van de in totaal 19 smaaktransducerende cellen in de smaakpapillen, het blauwe terminale prieel (weergegeven in rood in figuur 4F,G) zich binnen 200 nm (de resolutie van de lichtmicroscoop) van de lichtblauwe Car4 + -cel bevond (witte gebieden aangegeven door pijlen in figuur 4G). Het terminale prieel geassocieerd met de groene tracering wordt weergegeven in magenta (figuur 4F en figuur 4H) en bevindt zich binnen 200 nm van zowel de licht- als donkerblauwe Car4 + -cellen (witte gebieden in figuur 4H). Omdat de volgende dichtstbijzijnde cel bij deze priëlen meer dan 200 nm verwijderd was, was er een ongelabelde voxel die de twee structuren scheidde.

Delende voorlopercellen werden gelabeld met behulp van injecties van EdU op dag 0, 1 en 3, en weefsels werden verzameld op dag 4. Whole-mount keratine-8 en EdU kleuring van fungiforme smaakpapillen onthulden dat EdU-gelabelde cellen zowel binnen als buiten de smaakpapillen aanwezig waren(Figuur 5A-C). Individuele EdU+/keratine-8+ cellen (groenblauw en geel) en EdU+/keratine-8- kernen (paars en magenta) werden gesegmenteerd(figuur 5B,C). De getoonde donkerblauwe cel was keratine-8+ en had een langwerpige vorm die consistent was met volwassen smaaktransducerende cellen. Deze oppervlakken worden getoond met de smaakpapillen georiënteerd van porie tot basis (figuur 5B) en langs de lange as van de smaakpapillen (figuur 5C). Elke structuur kon in afzonderlijke optische plakjes worden bekeken door de fluorescentie binnen elke structuur te maskeren (Figuur 5D-F). De magenta en paarse kernen bevinden zich buiten de keratine-8+ rand van de smaakpapillen aangegeven door de wit-gestippelde omtrek (Figuur 5D,E). De gele, groenblauwe en blauwe cellen zaten in de smaakpapillen(Figuur 5D-F). Individuele smaaktransducerende cellen kunnen worden gereconstrueerd met behulp van pixelgebaseerde beeldvormingssoftware van Car4-etikettering(figuur 6A-C)of PLCβ2-etikettering(figuur 6D-F). Een pixelgebaseerde beeldvormingssoftware werd gebruikt om de dichtstbijzijnde nabijheid tussen cellen te meten en onthulde dat een Car4 + -cel (dezelfde cel als weergegeven in figuur 6B) zich binnen 200 nm van een enkele PLCβ2 + -cel bevond(figuur 6G,groen). Het gebied waar de cellen zich binnen 200 nm van elkaar bevonden, wordt in het wit weergegeven (figuur 6G) en aangegeven met witte pijlen. De volgende dichtstbijzijnde cel was meer dan 200 nm verwijderd en is in figuur 6H(I) in twee verschillende oriëntaties geel weergegeven. Figuur 7 toont de isolatie en analyse van de innervatie die eindigt in de papilla (maar buiten de smaakpapillen) en omvat de verdeling rond de smaakpapillen en de afstand tot het epitheel.

Figure 1
Figuur 1: Bereiding van linguaal epitheel voor fungiforme smaakpapillenkleuring. (A) Aanzicht van de gesneden tong met epitheel en spier gelabeld voorafgaand aan een dissectie. (B)Zodra voldoende spier is verwijderd, is er slechts een kleine hoeveelheid resterende spier aan de onderkant van het epitheel. Naast het evalueren van de voortgang van de dissectie door de gesneden kant van het epitheel te bekijken, (C) het epitheel plat op een glazen dia onder de ontleedkijker legt, onthult dat sommige delen van het weefsel gelijkmatig doorschijnend zijn (paarse rechthoek); er is voldoende spier uit dit gebied verwijderd. De paarse pijlen geven daarentegen gebieden aan de linkerkant aan waar meer spieren moeten worden verwijderd. Zodra de hele onderkant van het epitheel vergelijkbaar is met het gebied in de paarse rechthoek, gaat u verder met de volgende stap. DNadat delen van het epitheel zijn ingevroren met de spierzijde naar beneden, worden extra spier- en laminapropria verwijderd als dunne secties met behulp van de cryostaat. Wanneer de sectie is voltooid, is het resterende epitheel dun en doorschijnend. (E-F) Seriële secties (20 μm) werden verzameld op een glazen dia en elke sectie werd bekeken onder een fluorescerende microscoop voordat de volgende sectie werd gesneden. Ruim onder het epitheel zijn spiervezels in meerdere richtingen georiënteerd, zodat spiervezels zowel in doorsnede als langs de spiervezel(E,rode rechthoek) aanwezig zijn. De seriële secties in E-F tonen de overgang van spiervezels georiënteerd in meerdere richtingen(E,rode rechthoek) naar spiervezels die meestal in één richting worden georiënteerd(F,rode rechthoek), wat indicatief is voor de spier-lamina propria-rand. Een ander gebied van hetzelfde stuk weefsel (gele rechthoeken) toont aan dat wanneer de spiervezels in één richting zijn georiënteerd, het volgende gedeelte waarschijnlijk bindweefsel zal opleveren omdat alle spieren uit dat gebied zijn verwijderd. De blauwe rechthoeken vertegenwoordigen beide de onderkant van het epitheel. Als er smaakpapillen aanwezig zijn op de sectie(G,rode pijlen), is er te veel weefsel verwijderd. Idealiter is de sectie voltooid wanneer de onderkant van het epitheel (maar geen smaakpapillen) zichtbaar is in de verwijderde secties(F,gele rechthoek). Hoewel gebieden met spiervezels die in dezelfde richting zijn georiënteerd(E,gele rechthoek en F,rode rechthoek) ook geschikt zijn voor secties, moeten gebieden waar de spiervezels in meerdere richtingen zijn georiënteerd(E,rode rechthoek) worden vermeden. (G)Zodra secties de onderkant van het epitheel / lamina propria bevatten, is het alleen mogelijk om een paar extra secties te snijden voordat te veel van het epitheel is verwijderd en secties smaakpapillen bevatten. (H)De meest voorkomende fout wordt onthuld door cryostaatsecties waar epitheel wordt gezien aan de rand van het weefsel, spier wordt gezien in het epitheel en OTC / schaarse spier is aanwezig in het midden. Dit is meestal te wijten aan het niet plat leggen van het weefsel op de bodem van de weefselvorm voor het bevriezen of onvoldoende afvlakken met een stompe tang. Schaalbalken in A-C = 1 mm; schaalstaven in E, F, H = 100 μm; schaalbalk in G = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Dissectie van het gehemelte voor kleuring. (A) Het gehemelte werd eerst ontleed met behulp van een dunne messchaar om het harde gehemelte te knippen, (B) en vervolgens met dezelfde schaar om het zachte gehemelte te scheiden van het onderliggende bindweefsel. Na het verwijderen van het weefsel uit de mondholte, werd het resterende weefsel met de schaar verwijderd. Op dit punt kunnen alleen klieren overblijven aan de achterkant van het zachte gehemelte. Een scheermes werd gebruikt om deze klieren voorzichtig weg te schrapen. Het (C) rug- en (D) epitheeloppervlak van de voltooide dissectie van het gehemelte worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Meetvolume in whole-mount smaakpapillen. (A) Whole-mount smaakpapillen werden afgebeeld van de smaakporie tot de basis van de smaakpapillen, zodat het vlak van de hoogste resolutie het x-y-vlak is. Elk optisch plakje werd bekeken in pixelgebaseerde beeldanalysesoftware en de contourfunctie werd gebruikt om handmatig de periferie van de smaakpapillen te schetsen die gekleurd waren met keratine-8. (B) Er wordt een voorbeeld gegeven van één optisch segment. (C) De positie van dit representatieve gedeelte langs de lange as van de smaakpapillen wordt aangegeven door de gele lijn. Nadat elke optische sectie was geschetst, werd een oppervlak gecreëerd dat het volume van de smaakpapillen vertegenwoordigt (wit). Maskeren of dupliceren van het fluorescerende kanaal dat overeenkomt met de smaakpapillen (keratine-8 in D) of de tdTomato-gelabelde innervatie (pseudo-gekleurd blauw in E) binnen het volume dat de smaakpapillen vertegenwoordigt. De fluorescentie in de smaakpapillen in (E) werd gebruikt om een oppervlak te genereren dat het volume van innervatie in de smaakpapillen vertegenwoordigt (F, blauw). (G) Een soortgelijke benadering werd toegepast op smaakpapillen met hele omtrekken die in dezelfde oriëntatie zijn afgebeeld als de fungiforme smaakpapillen in A. (H) Het meten van het volume fungiforme en circumvallaat smaakpapillen en hun respectieve volume van innervatie onthulde dat er geen correlatie is tussen de smaakpapillen en het innervatievolume voor smaakpapillen die voor beide regio's werden bemonsterd. Schaalstaven in A-D, F = 4 μm; schaalbalk in G = 5 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Ohman-Gault et al.50. Afkortingen: FF = fungiform; CV = omtrekken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Representatieve terminale prieeltjes in fungiforme smaakpapillen met behulp van schaarse cel genetische etikettering. (A) Whole-mount smaakpapillen gekleurd met smaak-transducerende-celmarkers Car4 (wit) en PLCβ2 (groen). (B) Deze smaakpapillen heeft twee gelabelde terminale prieeltjes, die worden getoond met de smaakpapillen verwijderd na het reconstrueren van de vezels. (C) Het blauwe prieel heeft 6 takeinden en een orthogonale hoogte in de smaakpapillen van 33,4 μm en (D) het groene prieel heeft 7 takeinden. (E) Het dendrogram dat overeenkomt met het groene prieel is voorzien van elke segmentlengte in micrometers. (F-H) De afstand tussen structuren werd gemeten. (F-G) De blauwe overtrek in C was gesegmenteerd en wordt in rood weergegeven. (G) De gebieden waar dit terminale prieel zich binnen 200 nm van de lichtblauwe Car4+ cel bevindt, worden aangegeven met witte pijlen. (F, H) Het terminale prieel vertegenwoordigd door de groene reconstructie wordt weergegeven in magenta. (H) Het magenta prieel (geassocieerd met de groene tracering in 4B, D) bevindt zich binnen 200 nm van zowel de donkere als de lichtblauwe Car4+ cellen. Schaalbalk in A, B = 4 μm; schaalbalken in F-H = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Whole-mounts kunnen worden gebruikt om de integratie van nieuwe smaakpapillencellen te volgen. Muizen werden geïnjecteerd met EdU om verdelende voorlopers op dag 0, 1 en 3 te labelen en op dag 4 geofferd. (A, B) Cellen gelabeld met EdU (groen) kunnen zowel rond als in de smaakpapillen worden geïdentificeerd, die is gelabeld met keratine-8 (A, wit, B, grijs). (B, C) Individuele EdU-gelabelde, keratine-8+ cellen in de smaakpapillen en keratine-8-, EdU-gelabelde kernen zijn gesegmenteerd buiten de smaakpapillen. (D-F) De fluorescentie binnen elke structuur gesegmenteerd in A-B was gemaskeerd en kan worden gezien in doorsnede. De omtrek van de smaakpapillen is omlijnd met een witte stippellijn (D-F). (D) De gele cel bevindt zich in de smaakpapillen en is zowel EdU-gelabeld als keratine-8 +. De magenta nucleus bevindt zich buiten de smaakpapillen en is keratine-8-. (E) De groenblauwe cel bevindt zich in de smaakpapillen en zowel EdU-gelabeld als keratine-8 +. De paarse EdU-gelabelde kern is keratine-8- en buiten de smaakpapillen (witte pijl). (F) De blauwe cel is keratine-8+ en langwerpig, consistent met volwassen smaak-transducerende cellen. Schaalbalken in A-C = 3 μm; schaalstaven in D = 2 μm; schaalstaven in E, F = 4 μm. Afkorting: EdU = 5-ethynyl-2′-deoxyuridine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Vormen van hele smaakpapillencellen kunnen worden geanalyseerd samen met hun relaties met andere smaakpapillencellen. (A-F). Het segmenteren van individuele smaakpapillencellen om oppervlakken te creëren, isoleert individuele smaakpapillencellen, waardoor een duidelijke visualisatie mogelijk wordt. Individuele (A-C) Car4+ en (D-F) PLCβ2+ cellen tonen de variatie in individuele celvormen. (G) De dichtstbijzijnde PLCβ2+ cel bij de Car4+ cel in B werd bepaald binnen 200 nm (op een enkele kleine 0,5 μm 2 locatieaangegeven met pijl). De volgende dichtstbijzijnde cel was groter dan 300 nm verwijderd en te onderscheiden als een afzonderlijke structuur van de gesegmenteerde Car4 + -cel. (H, I) De volgende dichtstbijzijnde cel werd gesegmenteerd; en de gemaskeerde fluorescentie wordt in geel weergegeven. De drie dichtstbijzijnde punten voor de volgende dichtstbijzijnde cel (geel) worden aangegeven door pijlpunten in H, I. Schaalbalken in A-C = 3 μm; schaalstaven in D, E = 4 μm; schaalbalk in F = 2 μm; schaalbalken in G-I = 3 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Kwantificering van innervatie naar de papilla. (A) Sommige labels voor smaakneuronen labelen ook innervatie naar de papilla. B) De innervatie in de smaakpapillen wordt gescheiden van de innervatie buiten de smaakpapillen door de smaakpapillen te segmenteren (zoals beschreven voor figuur 3),(C) de innervatie in de smaakpapillen te maskeren (rood) en vervolgens de innervatie alleen buiten de smaakpapillen te maskeren (donkerblauw). Het volume innervatie naar de smaakpapillen (rood) was 1649,6 μm3. De innervatie buiten de smaakpapillen bevat smaakvezels onder de papilla die niet mogen worden opgenomen in de kwantificering van de innervatie naar de papilla. (D) De fluorescentie van de innervatie naar de papilla werd gemaskeerd (lichtblauw). Het volume van innervatie naar de papilla was 121,8 μm3. Schaalbalken in A-D = 4 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De ontwikkeling van een aanpak om consequent hele smaakpapillen te verzamelen en te kleuren uit drie smaakgebieden van de mondholte (fungiform, circumvallaat en het gehemelte) biedt aanzienlijke verbeteringen voor het analyseren van smaaktransducerende cellen, het volgen van nieuw opgenomen cellen, innervatie en relaties tussen deze structuren. Bovendien vergemakkelijkt het de lokalisatie van een potentiële secundaire neuronmarker zowel binnen als buiten een gelabelde populatie50. Dit is met name relevant omdat smaakpapillen ook robuuste somatosensorische innervatie52 , 53ontvangen , die ook sommige smaakneuronen kan labelen. De papillen die smaakpapillen bevatten, kunnen ook worden afgebeeld met behulp van een lagere vergroting. Dit maakt visualisatie van de innervatie naar de hele papilla mogelijk, evenals naar de smaakpapillen, en maakt onafhankelijke analyses mogelijk van de innervatie die de smaakpapillen en de omliggende zenuwvezels binnendringt.

Somatosensorische zenuwuiteinden in de huid kunnen worden onderscheiden op basis van hun organisatie rond haarzakjes en hun relaties met andere componenten van het epitheel; parallelle analyses in smaakpapillen kunnen vergelijkbare karakteriseringen opleveren54,55. Het leggen van een normale basis voor de relaties binnen en de samenstelling van smaakpapillen en papillen zal dienen als basis voor het bepalen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan tekorten in perifere smaakfuncties56,57. De smaakpapillen zijn een dynamisch sensorisch eindorgaan waar celvernieuwing en terminale prieelremodellering worden gecoördineerd door verschillende factoren58. Onderzoek naar de mogelijke circuits in de smaakpapillen59, ziekteprocessen57, en chemotherapieën die de normale smaakfunctie verstoren58 kunnen worden verbeterd door deze methode, die hele smaakpapillen en zenuwvezels intact houdt. De hier beschreven whole-mount methode breidt zowel de analysemogelijkheden uit als verfijnt de metingen die mogelijk zijn.

Gezien het feit dat de tong een dicht en heterogeen weefsel is en dat de smaakpapillen zelf veel cel-tot-celverbindingen bevatten die de permeabiliteit beperken27, vormde het ontwikkelen van een aanpak om hele kleuring van smaakpapillen te bereiken een aanzienlijke uitdaging. Eerdere methoden omvatten het nemen van representatieve secties60 of het snijden van dikkere secties, die vervolgens de penetratie van antilichamenbeperkten 32,33,34. Bovendien vertekende de selectie van hele smaakpapillen uit deze dikkere secties de gegevens naar kleinere smaakpapillen. Als alternatief zal het pellen van het epitheel waarschijnlijk de zenuwvezels van de smaakpapillen verstoren; deze zijn niet specifiek gelabeld wanneer deze aanpak wordt gebruikt39,40. Zenuwprieeltjes vormen een grote plexus in een smaakpapillen26,50,61, dus het is onduidelijk of het verwijderen van prieel de normale relaties tussen andere cellen in de smaakpapillen verstoort. De huidige whole-taste-bud-methode maakt het daarentegen mogelijk om absolute getallen en metingen te kwantificeren. Deze kleuring maakt het mogelijk om veel transducerende celkenmerken (type, vorm en locatie) en de terminale priëlen (evenals relaties tussen hen) te behouden en te analyseren.

Er zijn verschillende beperkingen aan deze aanpak. In het bijzonder werken sommige antilichamen die zijn gebruikt in dunne secties62 niet in hele mounts, wat de soorten structuren die kunnen worden onderzocht, zal beperken. Bovendien, omdat de resolutie van confocale microscopie beperkt is, zullen de structurele gegevens geanalyseerd van individuele cellen en van relaties tussen cellen ook beperkt zijn24. Er kan bijvoorbeeld worden vastgesteld dat cellen zich binnen 200 nm van elkaar bevinden, maar gespecialiseerde structuren tussen cellen (bijv. Synapsen)63 kunnen niet worden onderzocht. Ten slotte kunnen niet alle celtypen met deze aanpak worden gelabeld. Het is bijvoorbeeld moeilijk gebleken om specifiek cellen te labelen die zout in dit preparaat transduceren. Deze cellen kunnen een subset zijn van een combinatie van type 1-, type II- en type III-cellen14,15,16,17,18,19,64. Type I-cellen, die voornamelijk ondersteunende cellen zijn, kunnen niet in hele-mounts worden onderzocht omdat ze zich om andere cellen lijken te wikkelen, waardoor ze moeilijk te onderscheiden zijn als afzonderlijke entiteiten65. Het hebben van een betrouwbare marker voor zouttransducerende cellen zou uitgebreidere analyses mogelijk maken14,66. Evenzo, aangezien PLCβ2-kleuring smaakcellen vertegenwoordigt die in staat zijn om meerdere soorten stimuli te transduceren, zou een label dat verdere scheiding van dit celtype mogelijk maakte ook een verbetering zijn.

Hieronder volgen belangrijke voorbereidende stappen die zorg vereisen. Zorg er eerst voor dat de spierlaag die overblijft na dissectie gelijkmatig en zo dun mogelijk is. Als deze laag niet gelijkmatig is, zal de penetratie van antilichamen uiteindelijk niet uniform zijn. Ten tweede is het van cruciaal belang dat de stukjes epitheel plat in de bodem van de weefselvorm liggen voordat ze bevriezen, en dat stompe tangen worden gebruikt om lichtjes op het weefsel te drukken totdat het bevroren is. Wanneer de minimale hoeveelheid spier (in een gelijkmatige laag) aan de onderkant van het epitheel blijft, zullen slechts drie cryostaatsecties de onderkant van het epitheel bereiken. Positionering van het weefsel in een cryostaat, zodat secties over het hele weefselvlak worden genomen, resulteert soms in delen van het weefsel die ongelijkmatig worden verwijderd. Om deze redenen wordt het sterk aanbevolen om extra ontdooien, verdere dissectie en het opnieuw bevriezen van het weefsel te voorkomen. In plaats daarvan moet ervoor worden gezorgd dat weefseldissectie wordt geëvalueerd voordat het weefsel wordt bevroren.

Over het algemeen kan de hier gepresenteerde methode voor de bereiding van het hele weefsel worden gebruikt voor het verzamelen van hele smaakpapillen en de omliggende papilla uit drie smaakpapillenregio's: fungiform, circumvallaat en het gehemelte. Hoewel bekend is dat verschillende ziekteaandoeningen56,57 en chemotherapieën56 de smaakfunctie verstoren, blijven de mechanismen die aan deze veranderingen ten grondslag liggen onbekend. Het gebruik van de hier gepresenteerde kleuringsbenadering voor smaakpapillen vertegenwoordigt een robuust experimenteel ontwerp waarbij zowel smaaktransducerende cellen als hun zenuwvezels kunnen worden gelabeld om te bepalen of een tekort te wijten is aan verlies van een specifiek celtype, gecompromitteerde terminale prieelmorfologieën, verstoorde relaties tussen smaaktransducerende cellen of verstoorde relaties tussen transducerende cellen en hun zenuwvezels. Bovendien zou het niet alleen mogelijk zijn om het absolute aantal gelabelde nieuwe cellen in smaakpapillen te kwantificeren, maar ook om het aantal nieuwe smaaktransducerende cellen (EdU-gelabeld) van een gedefinieerd type (d.w.z. PLCβ2 + of Car4 + ) te kwantificeren. Of deze nieuwe cellen normale vormen ontwikkelen en normaal in de smaakpapillen opnemen (d.w.z. na de behandeling in de smaakpapillen gaan) kan ook worden onderzocht. Veel van deze maatregelen, samen met het aantal smaakpapillen, kunnen allemaal worden gemaakt van hetzelfde weefsel, waardoor het aantal verschillende dieren dat nodig is voor een experiment wordt beperkt. Deze mogelijkheden kunnen de stroomlijning van experimentele methoden vergemakkelijken om klinische interventies voor smaaktekorten te bieden, evenals inzicht geven in de normale mechanismen die ten grondslag liggen aan de smaakfunctie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We bedanken Kavisca Kuruparanantha voor haar bijdragen aan weefselkleuring en de beeldvorming van circumvallaat smaakpapillen, Jennifer Xu voor het kleuren en afbeelden van innervatie aan de papilla, Kaytee Horn voor dierenverzorging en genotypering, en Liqun Ma voor haar weefselkleuring van de smaakpapillen van het zachte gehemelte. Dit project werd ondersteund door R21 DC014857 en R01 DC007176 naar R.F.K en F31 DC017660 naar L.O.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,2,2-Tribromoethanol ACROS Organics AC421430100
2-Methylbutane ACROS 126470025
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-007-003 15.5μL/mL
Alexa Fluor® 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG Jackson Immuno Research 712-605-150 (1:500)
AutoQuant X3 software  Media Cybernetics
Blunt End Forceps Fine Science Tools  FST 91100-12
Click-iT™ Plus EdU Cell Proliferation Kit Molecular Probes C10637 Follow kit instructions 
Coverglass Marienfeld 107242
Cytokeratin-8 Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), (RRID: AB_531826)  Troma1 supernatant (1:50, store at 4°C)
Dissection Scissors (coarse) Roboz RS-5619
Dissection Scissors (fine) Moria MC19B
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A21206 (1:500)
Donkey anti-Rabbit, Alexa Fluor® 555 ThermoFisher Scientific A31572 (1:500)
DyLight™ 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgG Jackson Immuno Research 805-477-008 (1:500)
Fluoromount G Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope Slides) 12-550-15
Goat anti-Car4 R&D Systems  AF2414 (1:500)
Imaris  Bitplane  pixel-based image analysis software
Neurolucida 360 + Explorer MBF Biosciences 3D vector based image analysis software
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Normal Rabbit Serum  Equitech-Bio, Inc SR30
Olympus FV1000 (multi-Argon laser with wavelengths 458, 488, 515 and additional HeNe lasers emitting 543 and 633)
Paraformaldehyde EMD PX0055-3 4% in 0.1M PB
Rabbit anti-dsRed Living Colors DsRed Polyclonal Antibody; Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496) 632496 (1:500)
Rabbit anti-PLCβ2  Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-206 (1:500)
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodium Phosphate Monobasic Fisher Scientific BP330-500
tert-Amyl alcohol Aldrich Chemical Company 8.06193
Tissue Molds Electron Microscopy Sciences 70180
Tissue-Tek® O.C.T. Compound Sakura 4583
Triton X-100 BIO-RAD #161-0407
Zenon™ Alexa Fluor™ 555 Rabbit IgG Labeling Kit ThermoFisher Scientific Z25305 Follow kit instructions 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clapp, T. R., Medler, K. F., Damak, S., Margolskee, R. F., Kinnamon, S. C. Mouse taste cells with G protein-coupled taste receptors lack voltage-gated calcium channels and SNAP-25. BMC Biology. 4 (1), 7 (2006).
  2. Clapp, T. R., Yang, R., Stoick, C. L., Kinnamon, S. C., Kinnamon, J. C. Morphologic characterization of rat taste receptor cells that express components of the phospholipase C signaling pathway. The Journal of Comparative Neurology. 468 (3), 311-321 (2004).
  3. Delay, R. J., Roper, S. D., Kinnamon, J. C. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: II. Cell types and cell lineage. The Journal of Comparative Neurology. 253 (2), 242-252 (1986).
  4. Finger, T. E. Cell types and lineages in taste buds. Chemical Senses. 30, Supplement 1 54-55 (2005).
  5. Kataoka, S., et al. The candidate sour taste receptor, PKD2L1, is expressed by type III taste cells in the mouse. Chemical Senses. 33 (3), 243-254 (2008).
  6. Murray, R. Fine structure of gustatory cells in rabbit taste buds. Journal of Ultrastructure Research. 27 (5-6), 444 (1969).
  7. Murray, R. G., Murray, A. Fine structure of taste buds of rabbit foliate papillae. Journal of Ultrastructure Research. 19 (3), 327-353 (1967).
  8. Yang, R., Crowley, H. H., Rock, M. E., Kinnamon, J. C. Taste cells with synapses in rat circumvallate papillae display SNAP-25-like immunoreactivity. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 205-215 (2000).
  9. Yee, C. L., Yang, R., Böttger, B., Finger, T. E., Kinnamon, J. C. "Type III" cells of rat taste buds: Immunohistochemical and ultrastructural studies of neuron-specific enolase, protein gene product 9.5, and serotonin. Journal of Comparative Neurology. 440 (1), 97-108 (2001).
  10. Zhang, Y., et al. Coding of sweet, bitter, and umami tastes. Cell. 112 (3), 293-301 (2003).
  11. Chandrashekar, J., et al. The taste of carbonation. Science. 326 (5951), 443-445 (2009).
  12. Oka, Y., Butnaru, M., Von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  13. Stratford, J. M., Larson, E. D., Yang, R., Salcedo, E., Finger, T. E. 5-HT3A-driven green fluorescent protein delineates gustatory fibers innervating sour-responsive taste cells: A labeled line for sour taste. Journal of Comparative Neurology. 525 (10), 2358-2375 (2017).
  14. Baumer-Harrison, C., et al. Optogenetic stimulation of type I GAD65(+) cells in taste buds activates gustatory neurons and drives appetitive licking behavior in sodium-depleted mice. The Journal of Neuroscience. 40 (41), 7795-7810 (2020).
  15. Nomura, K., Nakanishi, M., Ishidate, F., Iwata, K., Taruno, A. All-electrical Ca(2+)-independent signal transduction mediates attractive sodium taste in taste buds. Neuron. 106 (5), 816-829 (2020).
  16. Ohmoto, M., Jyotaki, M., Foskett, J. K., Matsumoto, I. Sodium-taste cells require Skn-1a for generation and share molecular features with sweet, umami, and bitter taste cells. eneuro. 7 (6), (2020).
  17. Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
  18. Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  19. Lewandowski, B. C., Sukumaran, S. K., Margolskee, R. F., Bachmanov, A. A. Amiloride-insensitive salt taste is mediated by two populations of type III taste cells with distinct transduction mechanisms. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1942-1953 (2016).
  20. Beidler, L. M., Smallman, R. L. Renewal of cells within taste buds. The Journal of Cell Biology. 27 (2), 263-272 (1965).
  21. Hamamichi, R., Asano-Miyoshi, M., Emori, Y. Taste bud contains both short-lived and long-lived cell populations. Neuroscience. 141 (4), 2129-2138 (2006).
  22. Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
  23. Spector, A. C., Travers, S. P. The representation of taste quality in the mammalian nervous system. Behavoiral and Cognitive Neuroscience Reviews. 4 (3), 143-191 (2005).
  24. Huang, T., Ohman, L. C., Clements, A. V., Whiddon, Z. D., Krimm, R. F. Variable branching characteristics of peripheral taste neurons indicates differential convergence. bioRxiv. , (2020).
  25. Taruno, A., et al. CALHM1 ion channel mediates purinergic neurotransmission of sweet, bitter and umami tastes. Nature. 495 (7440), 223-226 (2013).
  26. Kinnamon, J. C., Taylor, B. J., Delay, R. J., Roper, S. D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds. I. Taste cells and their associated synapses. The Journal of comparative neurology. 235 (1), 48-60 (1985).
  27. Dando, R., et al. A permeability barrier surrounds taste buds in lingual epithelia. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 308 (1), 21-32 (2015).
  28. Mistretta, C. M. Permeability of tongue epithelium and its relation to taste. American Journal of Physiology. 220 (5), 1162-1167 (1971).
  29. Michlig, S., Damak, S., Le Coutre, J. Claudin-based permeability barriers in taste buds. The Journal of Comparative Neurology. 502 (6), 1003-1011 (2007).
  30. Kinnamon, S. C., Finger, T. E. Recent advances in taste transduction and signaling. F1000Research. 8, 2117 (2019).
  31. Meng, L., Huang, T., Sun, C., Hill, D. L., Krimm, R. BDNF is required for taste axon regeneration following unilateral chorda tympani nerve section. Experimental Neurology. 293, 27-42 (2017).
  32. Meng, L., Ohman-Gault, L., Ma, L., Krimm, R. F. Taste bud-derived BDNF is required to maintain normal amounts of innervation to adult taste buds. eneuro. 2 (6), (2015).
  33. Tang, T., Rios-Pilier, J., Krimm, R. Taste bud-derived BDNF maintains innervation of a subset of TrkB-expressing gustatory nerve fibers. Molecular and Cellular Neuroscience. 82, 195-203 (2017).
  34. Zhang, G. H., Zhang, H. Y., Deng, S. P., Qin, Y. M. Regional differences in taste bud distribution and -gustducin expression patterns in the mouse fungiform papilla. Chemical Senses. 33 (4), 357-362 (2008).
  35. Huang, T., Ma, L., Krimm, R. F. Postnatal reduction of BDNF regulates the developmental remodeling of taste bud innervation. Developmental Biology. 405 (2), 225-236 (2015).
  36. Nosrat, I. V., Margolskee, R. F., Nosrat, C. A. Targeted taste cell-specific overexpression of brain-derived neurotrophic factor in adult taste buds elevates phosphorylated TrkB protein levels in taste cells, increases taste bud size, and promotes gustatory innervation. Journal of Biological Chemistry. 287 (20), 16791-16800 (2012).
  37. Liebl, D. J., Mbiene, J. -P., Parada, L. F. NT4/5 mutant mice have deficiency in gustatory papillae and taste bud formation. Developmental Biology. 213 (2), 378-389 (1999).
  38. Kumari, A., Yokota, Y., Li, L., Bradley, R. M., Mistretta, C. M. Species generalization and differences in Hedgehog pathway regulation of fungiform and circumvallate papilla taste function and somatosensation demonstrated with sonidegib. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  39. Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
  40. Meisel, C. T., Pagella, P., Porcheri, C., Mitsiadis, T. A. Three-dimensional imaging and gene expression analysis upon enzymatic isolation of the tongue epithelium. Frontiers in Physiology. 11, 825 (2020).
  41. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  42. Guagliardo, N. A., Hill, D. L. Fungiform taste bud degeneration in C57BL/6J mice following chorda-lingual nerve transection. The Journal of Comparative Neurology. 504 (2), 206-216 (2007).
  43. Ohtubo, Y., Yoshii, K. Quantitative analysis of taste bud cell numbers in fungiform and soft palate taste buds of mice. Brain Research. 1367, 13-21 (2011).
  44. Ogata, T., Ohtubo, Y. Quantitative analysis of taste bud cell numbers in the circumvallate and foliate taste buds of mice. Chemical Senses. 45 (4), 261-273 (2020).
  45. Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
  46. Finger, T. E. ATP signaling is crucial for communication from taste buds to gustatory nerves. Science. 310 (5753), 1495-1499 (2005).
  47. Lau, J., et al. Temporal control of gene deletion in sensory ganglia using a tamoxifen-inducible Advillin-CreERT2 recombinase mouse. Molecular Pain. 7 (1), 100 (2011).
  48. Hirsch, M. -R., D'Autréaux, F., Dymecki, S. M., Brunet, J. -F., Goridis, C. APhox2b::FLPotransgenic mouse line suitable for intersectional genetics. genesis. 51 (7), 506-514 (2013).
  49. Perea-Martinez, I., Nagai, T., Chaudhari, N. Functional cell types in taste buds have distinct longevities. PLoS ONE. 8 (1), 53399 (2013).
  50. Ohman-Gault, L., Huang, T., Krimm, R. The transcription factor Phox2b distinguishes between oral and non-oral sensory neurons in the geniculate ganglion. Journal of Comparative Neurology. 525 (18), 3935-3950 (2017).
  51. Dvoryanchikov, G., et al. Transcriptomes and neurotransmitter profiles of classes of gustatory and somatosensory neurons in the geniculate ganglion. Nature Communications. 8 (1), (2017).
  52. Whitehead, M. C., Ganchrow, J. R., Ganchrow, D., Yao, B. Organization of geniculate and trigeminal ganglion cells innervating single fungiform taste papillae: a study with tetramethylrhodamine dextran amine labeling. Neuroscience. 93 (3), 931-941 (1999).
  53. Suemune, S., et al. Trigeminal nerve endings of lingual mucosa and musculature of the rat. Brain Research. 586 (1), 162-165 (1992).
  54. Rutlin, M., et al. The cellular and molecular basis of direction selectivity of Aδ-LTMRs. Cell. 159 (7), 1640-1651 (2014).
  55. Abraira, V. E., Ginty, D. D. The sensory neurons of touch. Neuron. 79 (4), 618-639 (2013).
  56. Feng, P., Huang, L., Wang, H. Taste bud homeostasis in health, disease, and aging. Chemical Senses. 39 (1), 3-16 (2014).
  57. Cooper, K. W., et al. COVID-19 and the chemical senses: supporting players take center stage. Neuron. 107 (2), 219-233 (2020).
  58. Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142 (21), 3620-3629 (2015).
  59. Roper, S. D. Taste buds as peripheral chemosensory processors. Seminars in Cell & Developmental Biology. 24 (1), 71-79 (2013).
  60. Ma, H., Yang, R., Thomas, S. M., Kinnamon, J. C. BMC. Neuroscience. 8 (1), 5 (2007).
  61. Kinnamon, J. C., Sherman, T. A., Roper, S. D. Ultrastructure of mouse vallate taste buds: III. Patterns of synaptic connectivity. The Journal of Comparative Neurology. 270 (1), 1-10 (1988).
  62. Romanov, R. A., et al. Chemical synapses without synaptic vesicles: Purinergic neurotransmission through a CALHM1 channel-mitochondrial signaling complex. Science Signaling. 11 (529), 1815 (2018).
  63. Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Superresolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68 (5), 843-856 (2010).
  64. Vandenbeuch, A., Clapp, T. R., Kinnamon, S. C. Amiloride-sensitive channels in type I fungiform taste cells in mouse. BMC Neuroscience. 9 (1), 1 (2008).
  65. Bartel, D. L., Sullivan, S. L., Lavoie, ÉG., Sévigny, J., Finger, T. E. Nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-2 is the ecto-ATPase of type I cells in taste buds. The Journal of Comparative Neurology. 497 (1), 1-12 (2006).
  66. Wilson, C. E., Vandenbeuch, A., Kinnamon, S. C. Physiological and behavioral responses to optogenetic stimulation of PKD2L1+ type III taste cells. eneuro. 6 (2), (2019).

Tags

Neurowetenschap Nummer 168 smaakpapillen hele berg innervatie afferente tong smaak
Whole-Mount kleuring, visualisatie en analyse van fungiforme, circumvallaat en gehemelte smaakpapillen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ohman, L. C., Krimm, R. F.… More

Ohman, L. C., Krimm, R. F. Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds. J. Vis. Exp. (168), e62126, doi:10.3791/62126 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter