Summary
एक ओपन-सोर्स, मॉड्यूलर फ्लोरीमीटर बनाने के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान किए जाते हैं जो वास्तविक समय, मात्रात्मक आइसोथर्मल न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन करने के लिए कई कम लागत वाले हीटर के साथ संगत है।
Abstract
न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए पारंपरिक तरीके पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) पर भरोसा करते हैं और एम्प्लिकॉन के एकीकृत फ्लोरेसेंस डिटेक्शन के साथ महंगे थर्मोसाइकिलर्स के उपयोग की आवश्यकता होती है। आइसोथर्मल न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन प्रौद्योगिकियां थर्मल साइकिलिंग की आवश्यकता को खत्म करते हैं; हालांकि, वास्तविक समय, मात्रात्मक परिणामों के लिए उत्पादों का फ्लोरेसेंस-आधारित पता लगाना अभी भी आवश्यक है। एकीकृत फ्लोरेसेंस डिटेक्शन के साथ कई पोर्टेबल आइसोथर्मल हीटर अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं; हालांकि, इन उपकरणों की लागत संसाधन-सीमित सेटिंग्स में व्यापक गोद लेने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा बनी हुई है। यहां वर्णित एक मॉड्यूलर, कम लागत वाले फ्लोरीमीटर के डिजाइन और असेंबली के लिए एक प्रोटोकॉल है जो ऑफ-द-शेल्फ घटकों से बनाया गया है। एक कॉम्पैक्ट 3 डी मुद्रित आवास में संलग्न, फ्लोरीमीटर को पीसीआर ट्यूब रखने वाले व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हीट ब्लॉक के ऊपर रखा जाना डिज़ाइन किया गया है। यहां वर्णित फ्लोरीमीटर फ्लोरोसिन आइसोथियोसायनेट (फिटसी) डाई का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन सिस्टम को वास्तविक समय न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं में संवाददाताओं के रूप में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले रंगों के साथ उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है। प्रणाली की नैदानिक प्रयोज्यता दो आइसोथर्मल प्रवर्धन प्रौद्योगिकियों के साथ वास्तविक समय न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के द्वारा प्रदर्शित की जाती है: एसएएसएस-सीओवी-2 आरएनए के नैदानिक रूप से सार्थक स्तरों का पता लगाने के लिए एक वाणिज्यिक किट और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (आरटी-लैंप) में प्रदान किए गए सकारात्मक नियंत्रण डीएनए का पता लगाने के लिए पॉलीमरेज प्रवर्धन (आरपीए) का पुनर्संयोजन करें।
Introduction
आइसोथर्मल प्रवर्धन प्रौद्योगिकियों का व्यापक रूप से नाभिक एसिड का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है। थर्मोसाइक्लिंग की आवश्यकता वाले पारंपरिक पीसीआर दृष्टिकोणों की तुलना में, आइसोथर्मल प्रवर्धन न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन को एक ही तापमान पर होने की अनुमति देता है, इस प्रकार तेजी से समय-से-परिणाम और अवरोधकों की बेहतर सहनशीलता1,2सक्षम होती है। आइसोथर्मल प्रवर्धन का एक और प्रमुख लाभ कम इंस्ट्रूमेंटेशन जटिलता है। अधिकांश इसोथर्मल प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं के लिए केवल एक हीट ब्लॉक और एक डिटेक्शन मोडलेमी-या तो वास्तविक समय का पता लगाने की आवश्यकता होती है फ्लोरेसेंस मॉनिटरिंग या एंडपॉइंट डिटेक्शन के माध्यम से, उदाहरण के लिए पार्श्व प्रवाह या जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस3,4। वास्तविक समय फ्लोरेसेंस का पता लगाने के माध्यम से पूरा किया जाता है, जो उन रंगों को इंटरकैलेट करके उत्पादित फ्लोरेसेंस का पता लगाया जाता है जो दोहरे फंसे डीएनए या शमन फ्लोरोसेंट जांच की उपस्थिति में सक्रिय होते हैं जो विशिष्ट डबल-फंसे डीएनए दृश्यों की उपस्थिति में सक्रिय होते हैं।
जबकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बेंचटॉप इसोथर्मल फ्लोरीमीटर मौजूद है, कई परख कार्यान्वयन के लिए अनुकूलन की कमी है। उदाहरण के लिए, कई उपकरणों के लिए विशिष्ट या कंपनी द्वारा प्रदान किए गए उपभोग्य वस्तुओं की आवश्यकता होती है, पसंदीदा विक्रेताओं की सिफारिश करते हैं, या विज्ञापित परिणाम प्राप्त करने के लिए मालिकाना सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हैं। इनमें से अधिकांश प्रणालियों की लागत $ 5,000 USD से अधिक है, जो संसाधन-सीमित सेटिंग्स में व्यापक उपयोग के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा का प्रतिनिधित्व करती है। इसके अलावा, कम संसाधन सेटिंग्स में उपयोगकर्ताओं को कठोर पर्यावरणीय स्थितियों, स्पेयर पार्ट्स के लिए कमजोर आपूर्ति श्रृंखला, और रखरखाव और मरम्मत 5 के लिए आवश्यक विशेष उपकरणों के कारण उच्च संसाधन सेटिंग्स के लिए डिजाइन किए गए उपकरणों को बनाए रखने के लिए चुनौतियों कासामनाकरना पड़ता है। इस आवश्यकता को पूरा करने के लिए, यहां वर्णित एक मॉड्यूलर और कम लागत वाले फ्लोरीमीटर का डिजाइन और असेंबली है जो दो वैकल्पिक विन्यास के साथ कॉम्पैक्ट 3 डी मुद्रित आवास(आंकड़े 1A-सी)में संलग्न ऑफ-द-शेल्फ घटकों से निर्मित है। इस डिवाइस का पहला विन्यास अतिरिक्त पृष्ठभूमि प्रकाश को ब्लॉक करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ग्लास फिल्टर और एक डिक्रोइक मिरर का उपयोग करता है और इसमें $ 830 USD की असेंबली की कुल लागत है। जबकि इन फिल्टरों का उपयोग आमतौर पर फ्लोरेसेंस-आधारित इमेजिंग सिस्टम में किया जाता है, महंगी उच्च ग्रेड ऑप्टिकल फिल्टर फॉयल की जगह पहले न्यूक्लिक एसिड डिटेक्शन6के लिए अनुमति देने के लिए दिखाया गया है। फ्लोरीमीटर का दूसरा विन्यास इन सस्ती फिल्टर को शामिल करता है और डिक्रोइक दर्पण को φ1/2 "बीम स्प्लिटर के साथ बदलता है, जिससे सिस्टम की समग्र लागत $ 830 से $ 450 USD तक कम हो जाएगी।
विधानसभा के प्रतिनिधि चित्र चित्र 1 और चित्रा 2 में पहले विन्यास के लिए दिखाए जाते हैं, लेकिन दूसरे विन्यासके लिए अनुरूप छवियां पूरक फ़ाइल 6में पाई जा सकती हैं। विशेष ऑप्टिकल संरेखण की आवश्यकता से बचने के लिए, ऑप्टिकल सिस्टम ने प्रत्येक ऑप्टिकल घटक को रखने के लिए क्षेत्रों को नामित किया है और डिजाइन के व्यापक उपयोग के लिए अपेक्षाकृत कम अंत 3 डी प्रिंटर के साथ बनाया जा सकता है। दो विन्यास के लिए निर्माण और विधानसभा में केवल अंतर 3 डी प्रिंटिंग और बाड़े में रखे ऑप्टिकल घटकों के लिए उपयोग की जाने वाली फाइलें हैं। दोनों प्रणालियों के लिए 3 डी मुद्रित बाड़े के बाहरी आयाम एक ही हैं। दोनों प्रणालियों की लागत तुलना तालिका 1में दिखाई गई है।
जैसा कि चित्रा 1Aमें दिखाया गया है, एक छोटे रूप कारक को बनाए रखने के लिए, फ्लोरीमीटर में Φ1/2 "(~ 12.5 मिमी) प्रकाशिकी शामिल हैं, जो कॉम्पैक्ट रोशनी और पता लगाने के साथ मिलकर पीसीआर ट्यूब के शीर्ष के माध्यम से संकेत को मापने के लिए रखे जाते हैं। चित्रा 1 में प्रणाली को क्रमशः 490 एनएम और 525 एनएम के पास पीक उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ रंगों का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिसमें फिटसी और सिबीआर और एसटीईटीओ-9 जैसे बारीकी से संबंधित रंग शामिल हैं, जो आमतौर पर वास्तविक समय न्यूक्लिक एसिडेशन प्रतिक्रियाओं7,8में संवाददाताओं के रूप में उपयोग किए जाते हैं। उत्तेजन स्रोत, ऑप्टिकल फिल्टर, और डिटेक्टर आसानी से वांछित के रूप में विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों के साथ संगत घटकों के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है। न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं को आम तौर पर पीसीआर ट्यूबों में किया जाता है, और फ्लोरीमीटर को किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हीट ब्लॉक के ऊपर रखा जा सकता है जो पीसीआर ट्यूब(चित्रा 1D) रखताहै जो इसोथर्मल प्रतिक्रियाओं की वास्तविक समय निगरानी के लिए अनुमति देता है। उपयुक्त हीट ब्लॉक अधिकांश जैव चिकित्सा प्रयोगशालाओं में उपलब्ध हैं और $ 500 USD से कम के लिए खरीदे जा सकते हैं।
इमेजिंग प्रौद्योगिकियों को नियंत्रित करने के लिए कम लागत, देखभाल विकल्प के बिंदु प्रदान करने के लिए एकल बोर्ड कंप्यूटरों का उपयोग पहले9का प्रदर्शन किया गया है । उस काम को बंद करना, इस प्रोटोकॉल में एक एकल-बोर्ड कंप्यूटर-संचालित ग्राफिकल यूजर इंटरफेस(चित्रा 1D)का उपयोग वास्तविक समय डेटा लॉगिंग और देखभाल के बिंदु पर परिणामों के प्रदर्शन को सुविधाजनक बनाने के लिए किया जाता है, जिससे डेटा को संसाधित करने या कल्पना करने के लिए लैपटॉप कंप्यूटर की आवश्यकता को समाप्त किया जा सके। फ्लोरेसेंस माप को आई2सी प्रोटोकॉल के माध्यम से प्रकाश सेंसर से माइक्रोकंट्रोलर में स्थानांतरित कर दिया गया था, और फिर धारावाहिक संचार के माध्यम से एकल बोर्ड कंप्यूटर को उपलब्ध कराया गया था। विशेष मुद्रित सर्किट बोर्डों (पीसीबी) की आवश्यकता को नकारते हुए, लघुकृत ब्रेडबोर्ड पर सरलीकृत तारों और टांका के माध्यम से रोशनी और डेटा हस्तांतरण के लिए विद्युत कनेक्शन प्रदान किए गए थे। फ्लोरीमीटर चलाने के लिए आवश्यक सॉफ्टवेयर ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर फ्रेमवर्क के माध्यम से उपलब्ध है और डिवाइस को चलाने के लिए आवश्यक कोड पूरक कोडिंग फाइलोंमें प्रदान किया जाता है। पूर्ण फ्लोरीमीटर $ 450 से $ 830 USD के बीच इकट्ठा किया जा सकता है, और परिणाम बताते हैं कि यह न्यूक्लिक एसिड के वास्तविक समय के आइसोथर्मल प्रवर्धन की निगरानी करने के लिए सटीक और विश्वसनीय फ्लोरेसेंस माप प्रदान करता है।
Protocol
1. तैयारी चरण: 3डी प्रिंटिंग और सोल्डरिंग
नोट: इस प्रोटोकॉल में वर्णित ऑप्टिकल सिस्टम एक मानक ड्राई ब्लॉक हीटर के लिए डिज़ाइन किया गया है।
- पहला विन्यास बनाने के लिए, 3डी क्रमशः पूरक फ़ाइलें 1, 2 और 3 के रूप में प्रदान की गई सीएडी फाइलों को प्रिंट करें:
- दूसरा विन्यास बनाने के लिए, 3डी क्रमशः पूरक फ़ाइलें 3, 4 और 5के रूप में प्रदान की गई सीएडी फाइलों को प्रिंट करें:
नोट: इन भागों को समर्थन के साथ मुद्रित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इस गाइड में ब्लैक पॉलीकार्बोनेट फिलामेंट का इस्तेमाल किया जाता है जो 110 डिग्री सेल्सियस तक तापमान के अधीन होने के बाद अपने फॉर्म को बनाए रख सकता है। सामान्य तौर पर, किसी भी सामग्री है कि महत्वपूर्ण विरूपण के बिना वांछित isothermal प्रतिक्रिया के तापमान को गर्म किया जा सकता है इस्तेमाल किया जा सकता है। आंतरिक प्रतिबिंब और परिवेश प्रकाश हस्तक्षेप के प्रभाव को कम करने के लिए, एक सामग्री है कि काले या किसी अंय काले रंग की सिफारिश की है । - दो नमूनों की समानांतर निगरानी के लिए दो प्रकाश-से-डिजिटल सेंसर मूल्यांकन मॉड्यूल तैयार करें। सेंसर परीक्षण बोर्डों में से एक पर, R4 प्रतिरोधी को हटा दें, और पीसीबी पर R4 क्षेत्र के दाहिने पैड से पीसीबी पर R1 क्षेत्र में शीर्ष पैड के लिए एक जम्पर तार मिलाप । यह सेंसर के आई2सी पते को बदल देगा, इस प्रकार दोनों सेंसरों के एक साथ माप की अनुमति देगा।
नोट: उपयोग किए गए सेंसर में दो पीसीबी होते हैं: एक यूएसबी एडाप्टर बोर्ड और प्रकाश सेंसर युक्त एक सेंसर परीक्षण बोर्ड; इस डिवाइस के लिए केवल सेंसर टेस्ट बोर्ड की जरूरत है। - दो प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) में से प्रत्येक के लिए मिलाप तार। एलईडी पर "1" लेबल पैड के लिए एक लाल तार (सकारात्मक) और एलईडी पर "2" लेबल पैड पर एक काला तार (नकारात्मक) कनेक्ट करें। एलईडी के पीछे थर्मल चिपकने वाली एक पतली परत लागू करें, एलईडी को एंड कैप के शीर्ष पर रखें, और थर्मल चिपकने वाले इलाज तक प्रतीक्षा करें। अंत टोपी के दूसरी तरफ, एक गर्मी सिंक जोड़ें।
नोट: बाड़े में सील होने से पहले एलईडी का परीक्षण करते समय, आंखों की सुरक्षा को अवरुद्ध करने वाली उचित नीली रोशनी पहनना सुनिश्चित करें। - दूसरा विन्यास बनाने के लिए, एक नीली उत्तेजन पन्नी शीट से दो 1/4 इंच व्यास हलकों और कैंची या एक रेजर ब्लेड के साथ एक पीले उत्सर्जन पन्नी शीट से चार 1/4 इंच व्यास हलकों में कटौती ।
- 'LCD_Screen_Holder.stl' भाग के तिरछे हिस्से पर चार छेद में से प्रत्येक में एक M2.5 हेक्स के आकार का डालें दबाएं।
2. ऑप्टिकल असेंबली
- एक 3/16 इंच लंबे 4-40 पिरोया ' Optics_Enclosure_Bottom. stl भाग के शीर्ष पर छेद में डालें रखें । चित्रा 2 एमें दिखाए गए 3डी मुद्रित भाग के अन्य सभी छेदों में 1/4 इंच लंबा 4-40 पिरोया डालने रखें ।
- सेंसर परीक्षण बोर्ड को आवास के शीर्ष गुहा में डालें, जिसमें पांच पिन शीर्ष की ओर सामना कर रहे हैं और डिवाइस के केंद्र धुरी के निकटतम हैं। सेंसर टेस्ट बोर्ड(चित्रा 2B)पर छेद के माध्यम से 3/16 इंच लंबे 4-40 पेंच के साथ सुरक्षित ।
- सेंसर टेस्ट बोर्ड के नीचे सेक्शन में 20 एमएम फोकल लेंथ लेंस में से एक को डिवाइस के नीचे और टेस्ट बोर्ड(चित्रा 2C)से दूर की ओर सामना करने वाले उत्तल पक्ष के साथ रखें ।
- पहला कॉन्फ़िगरेशन बनाने के लिए, लंबे पास फ़िल्टर को पिछले चरण में रखे गए 20 मिमी फोकल लेंथ लेंस(चित्रा 2D)के नीचे अगले खंड में रखें। दूसरा विन्यास बनाने के लिए, लेंस के नीचे अनुभाग में दो पीले उत्सर्जन फिल्टर पन्नी रखें।
- पहला विन्यास बनाने के लिए, निर्माता(चित्रा 2E)द्वारा निर्दिष्ट फिल्टर अभिविन्यास को देखते हुए डिक्रोइक मिरर को एनकेमेंट के केंद्र के पास विकर्ण अनुभाग में रखें। दूसरा विन्यास बनाने के लिए, बीम स्प्लिटर को विकर्ण अनुभाग में रखें। बीम स्प्लिटर के लिए किसी विशिष्ट अभिविन्यास की आवश्यकता नहीं है।
- डिवाइस के शीर्ष (चित्रा 2F) की ओर इशारा करते हुए उत्तल पक्ष के साथ डिक्रोइक मिरर (या बीम स्प्लिटर, कॉन्फिग्रेशन के आधार पर) के नीचे अनुभाग में एकदूसरे 20 मिमीफोकल लेंथ लेंस रखें।
- पहला विन्यास बनाने के लिए, सेक्शन में एक्सटिटेशन फिल्टर को डिक्रोइक मिरर के दाईं ओर रखें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि तीर डिक्रोइक मिरर(चित्रा 2जी)की ओर इशारा करता है। दूसरा विन्यास बनाने के लिए, बीम स्प्लिटर के दाईं ओर एक नीले उत्तेजन फिल्टर फॉइल को अनुभाग में रखें।
- 15 मिमी फोकल लेंथ लेंस को डिक्रोइक मिरर(चित्रा 2H)का सामना करने वाले उत्तल पक्ष के साथ उत्तेजन फिल्टर के दाईं ओर रखें।
- प्रिंट के शेष खंड में एक एलईडी रखें, जिसमें एलईडी को विन्यास के आधार पर डिक्रोइक मिरर (या बीम स्प्लिटर) की ओर सामना करना पड़ रहा है। सुनिश्चित करें कि एलईडी से अग्रणी दो तारों को अवकाश वाले चैनलों में डाला जाता है ताकि प्रिंट कसकर बंद हो जाए।
- 3डी प्रिंटेड पार्ट (चित्रा 2I) के दूसरी तरफ के लिए2.3-2.9कदम दोहराएं।
- प्रिंट के शीर्ष पर प्रिंट के खाली पक्ष को ऑप्टिकल घटकों के साथ बंद करें एनकेमेंट के शीर्ष आधे हिस्से के बाहर निकाले गए हिस्सों को एनकेमेंट के निचले आधे हिस्से के अवकाश वाले खांचे में रखकर। 3/8 इंच लंबे 4-40 शिकंजा(चित्रा 2J)के साथ एक साथ दो मुद्रित भागों को सुरक्षित करें ।
नोट: यदि दो मुद्रित भागों पूरी तरह से बंद नहीं कर रहे हैं, आवारा उत्तेजन प्रकाश ऑप्टिकल आवास से बच सकते हैं । सुनिश्चित करें कि उचित नीली रोशनी अवरुद्ध आंखों की सुरक्षा तब तक पहनी जाती है जब तक कि उचित सील प्राप्त न हो जाए। बाड़े को तब तक फिर से सील करें जब तक कि कोई अतिरिक्त प्रकाश बच न जाए।
3. इलेक्ट्रॉनिक्स और टचस्क्रीन असेंबली
- दो मिनी ब्रेडबोर्ड को एक साथ कनेक्ट करें, और फिर माइक्रोकंट्रोलर को ब्रेडबोर्ड में से एक पर रखें। सुनिश्चित करें कि माइक्रोकंट्रोलर का माइक्रोयूएसबी बंदरगाह बाहर की ओर सामना करता है।
- एलईडी मॉड्यूलेशन को कनेक्ट करने के लिए एलईडी (+) ड्राइवर के सीटीएल पिन को माइक्रोकंट्रोलर के डिजिटल पिन और एलईडी ड्राइवर के एलईडी (-) पिन को माइक्रोकंट्रोलर के जीएनडी पिन से कनेक्ट करें।
- ब्रेडबोर्ड के पीछे प्लास्टिक कवर निकालें। 'LCD_Screen_Holder.stl' मुद्रित भाग के पीछे के हिस्से के अंदर संयुक्त ब्रेडबोर्ड संलग्न करने के लिए 3 डी मुद्रित भाग के लिए ब्रेडबोर्ड के चिपकने वाला समर्थन दबाएं।
- एक इंच लंबे 4-40 शिकंजा के साथ धारा 2 में इकट्ठे ऑप्टिकल बाड़े के अंदर इकट्ठे ब्रेडबोर्ड के साथ तरल क्रिस्टल डिस्प्ले (एलसीडी) स्क्रीन धारक को सुरक्षित करें।
- एलईडी बिजली सप्लाई को जोड़ने के लिए एलईडी ड्राइवर के एलईडी (+) पिन को पहले एलईडी के पॉजिटिव वायर से कनेक्ट करें। ब्रेडबोर्ड पर दूसरी एलईडी के सकारात्मक तार के लिए पहली एलईडी के नकारात्मक तार कनेक्ट करें। दूसरी एलईडी के निगेटिव वायर को एलईडी ड्राइवर के एलईडी (-) पिन से कनेक्ट करें।
नोट: पहली या दूसरी एलईडी का आदेश मनमाना है। - एलईडी ड्राइवर बिजली की आपूर्ति को जोड़ने के लिए, क्रमशः वीईडी ड्राइवर के VIN + और VIN-पिन के लिए 10 वी बिजली की आपूर्ति के सकारात्मक और नकारात्मक तारों को जोड़ें। (दो पिन एडाप्टर के लिए एक बैरल जैक का इस्तेमाल किया गया था.)
- सेंसर टेस्ट बोर्ड बिजली आपूर्ति और डेटा ट्रांसफर से कनेक्ट करें। सेंसर परीक्षण बोर्ड पर केवल चार पिन का उपयोग किया जाता है: एससीके, एसडीए, वीडीयूटी और जीएनडी। पुरुष जम्पर तार के लिए एक 4 पिन महिला ले लो और एलसीडी धारक प्रिंट के शीर्ष अधिकार में अंतर के माध्यम से मिनी ब्रेडबोर्ड के लिए प्रकाश से डिजिटल सेंसर परीक्षण बोर्डों पर उन पिन कनेक्ट ।
- ब्रेडबोर्ड पर, निम्नलिखित के बीच कनेक्शन सुनिश्चित करें: माइक्रोकंट्रोलर का 3.3 वी पिन और दोनों परीक्षण बोर्डों का वीडीयूट पिन; माइक्रोकंट्रोलर का जीएनडी पिन और दोनों टेस्ट बोर्डों का जीएनडी पिन; माइक्रोकंट्रोलर का एनालॉग 4 (A4) पिन और दोनों टेस्ट बोर्डों का एसडीए पिन; और माइक्रोकंट्रोलर के एनालॉग 5 (A5) पिन और दोनों टेस्ट बोर्डों के एससीईक पिन।
नोट: क्योंकि मैं 2 सी संचार प्रकाश सेंसर के लिए प्रयोग कियाजाताहै, दोनों सेंसरों के SCK और SDA पिन दोनों माइक्रोकंट्रोलर के एक ही पिन के लिए कराई जा सकती है । - चार M2.5 शिकंजा के साथ एलसीडी स्क्रीन धारक पर एकल बोर्ड कंप्यूटर सुरक्षित। सुनिश्चित करें कि एकल बोर्ड कंप्यूटर के एचडीएमआई और पावर एडाप्टर पोर्ट ऊपर की ओर फेस करते हैं और सिंगल-बोर्ड कंप्यूटर 3डी प्रिंटेड पार्ट पर केंद्रित है ।
- टचस्क्रीन निर्देशों के अनुसार टचस्क्रीन डिस्प्ले को सिंगल-बोर्ड कंप्यूटर से कनेक्ट करें और फिर सिंगल बोर्ड कंप्यूटर के एचडीएमआई पोर्ट को टचस्क्रीन के एचडीएमआई पोर्ट से कनेक्ट करें ।
4. सॉफ्टवेयर स्थापना
- माइक्रोकंट्रोलर पर पूरक कोडिंग फाइल 1 में प्रदान किए गए कस्टम स्केच "MiniFluorimeter_2Diode.ino" अपलोड करने के लिए वेब संपादक को इंस्टॉल करें और उसका उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि "बंदक्यूब OPT3002" लाइब्रेरी प्रबंधक का उपयोग करके स्थापित की गई है।
- स्टेप 3.3 (इलेक्ट्रॉनिक्स और टचस्क्रीन असेंबली सेक्शन) में इस्तेमाल होने वाले डिजिटल पिन की संख्या में वेरिएबल led_A_pin बदलें।
- वेरिएबल एक्सपोजरटाइम के मूल्य को बदलकर फ्लोरेसेंस माप प्राप्त करते समय एलईडी चालू होता है मिलीसेकंड की संख्या को समायोजित करें। वेरिएबल led_A_Interval के मूल्य को बदलकर एलईडी एक्सपोजर के बीच मिलीसेकंड की संख्या को समायोजित करें।
- एक्सपोजर के दौरान एलईडी की चमक को समायोजित करने के लिए वेरिएबल led_Power को शून्य और एक के बीच की संख्या में बदलें। शून्य चमक की अधिकतम मात्रा देता है और एक चमक की सबसे कम राशि देता है।
- 3.5 इंच के डिस्प्ले के साथ प्रदान किए गए निर्माता के निर्देशों का पालन करके टचस्क्रीन के माध्यम से डिस्प्ले को नियंत्रित करने की क्षमता चालू करें।
नोट: यदि वांछित है, तो 3.5 इंच की स्क्रीन को टचस्क्रीन क्षमताओं के बिना मॉनिटर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और एकल बोर्ड कंप्यूटर के नियंत्रण के लिए एकल बोर्ड कंप्यूटर के यूएसबी बंदरगाहों से एक कीबोर्ड और माउस को जोड़ा जा सकता है। - पूरक कोडिंग फ़ाइल 2 से एकल बोर्ड कंप्यूटर पर एक वांछित स्थान के लिए "MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py" फ़ाइल डाउनलोड करें।
- सुनिश्चित करें कि पायथन का एक कार्य संस्करण एकल-बोर्ड कंप्यूटर पर स्थापित किया गया है। अजगर 3.7 प्रदान की अजगर मॉड्यूल में इस्तेमाल किया गया था, लेकिन किसी भी स्थिर अजगर संस्करण प्रदान की स्क्रिप्ट के लिए उचित परिवर्तन के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। सिंगल-बोर्ड कंप्यूटर पर पायथन प्रोग्राम के लिए आवश्यक पुस्तकालयों को स्थापित करें।
- माप लेने के लिए वांछित समय की लंबाई के लिए चर measurement_time बदलें। कार्यक्रम अधिग्रहण समाप्त होता है और वांछित समय बीत जाने के बाद बंद हो जाता है। जीयूआई यूजर इंटरफेस पर एक बटन के माध्यम से अधिग्रहण को समाप्त करने की भी अनुमति देता है।
- वेरिएबल सीरियलपोर्ट को कनेक्टेड माइक्रोकंट्रोलर के सीरियल एड्रेस में बदलें।
5. वास्तविक समय फ्लोरेसेंस डेटा रिकॉर्डिंग
- वाणिज्यिक गर्मी ब्लॉक चालू करें और इसे वांछित तापमान तक पहुंचने दें।
- एक मानक 5 वी बिजली की आपूर्ति के साथ एकल बोर्ड कंप्यूटर बिजली सबसे एकल बोर्ड कंप्यूटर खरीद के साथ प्रदान की । सिंगल बोर्ड कंप्यूटर को माइक्रोकंट्रोलर से यूएसबी केबल से माइक्रोयूएसबी से कनेक्ट करें ।
- टचस्क्रीन का उपयोग करके, प्रदान की गई पायथन स्क्रिप्ट खोलें। measurement_time और सीरियलपोर्ट वेरिएबल्स को मनचाए मानों बदलें। प्रोग्राम उत्पन्न डेटा फ़ाइल के नाम पर वेरिएबल आउटपुट फ़ाइलपाथ बदलें। सुनिश्चित करें कि फाइलनेम '.xlsx' में समाप्त होता है।
- दो पीसीआर ट्यूब रखें जिसमें प्रतिक्रियाओं को हीट ब्लॉक में निगरानी की जानी है। सुनिश्चित करें कि पीसीआर ट्यूबों का प्लेसमेंट हीट ब्लॉक पर रखे जाने के बाद फ्लोरीमीटर के ऑप्टिकल चैनलों के साथ संरेखित होता है।
- फ्लोरीमीटर के प्रत्येक ऑप्टिकल चैनल से बाहर निकलने वाले चार खूंटे के बीच केंद्रित पीसीआर ट्यूबों के साथ हीट ब्लॉक के ऊपर फ्लोरीमीटर रखें। इष्टतम माप के लिए, सुनिश्चित करें कि 3 डी मुद्रित फ्लोरीमीटर गर्मी ब्लॉक के कुओं में सुरक्षित रूप से जुड़ा हुआ है।
- सुरक्षित रूप से फ्लोरीमीटर संलग्न करें, एलईडी के लिए बिजली आपूर्ति एडाप्टर में प्लग करें।
- पायथन प्रोग्राम शुरू करने के लिए टचस्क्रीन का उपयोग करें। एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) एलसीडी स्क्रीन पर दिखाई देता है और वास्तविक समय फ्लोरेसेंस को मापता है।
- जीयूआई पर उपयोगकर्ता को दिखाए जाने वाले दोनों पीसीआर ट्यूबों के लिए समय के साथ वास्तविक समय फ्लोरेसेंस माप का निरीक्षण करें।
- उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित प्रयोग समय बीत जाने के बाद, अधिग्रहण समाप्त हो जाता है। उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित स्थान में सहेजे गए आउटपुट डेटा फ़ाइल में माप देखें. माप को जल्दी समाप्त करने के लिए, यूजर इंटरफेस पर "स्टॉप एक्विजिशन" लेबल वाले बटन पर क्लिक करें।
Representative Results
एक बार इकट्ठा होने के बाद, फ्लोरीमीटर प्रदर्शन को फिटसी डाई की कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला से फ्लोरेसेंस को मापकर मान्य किया जा सकता है। चित्रा 3 एमें फ्लोरीमीटर के पहले विन्यास के दोनों चैनलों पर 1x पीबीएस में तैयार 0, 20, 40, 60 और 80 पीजी/माइक्रोन की सांद्रता पर फिटसी डाई के माप दिखाए जाते हैं। प्रत्येक नमूने को 20 एस अंतराल पर 1.5 एस के एलईडी एक्सपोजर के साथ तीन बार मापा गया था। फ्लोरीमीटर के दोनों चैनल वांछित सीमा में एक रैखिक प्रतिक्रिया दिखाते हैं।
दो इसोथर्मल प्रवर्धन प्रौद्योगिकियों के साथ प्रवर्धन करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शुष्क गर्मी ब्लॉक के साथ प्रणाली का उपयोग करके फ्लोरीमीटर की नैदानिक प्रयोज्यता को आगे प्रदर्शित किया गया था: आरपीए और आरटी-लैंप।
चित्रा 3B एक मानक वाणिज्यिक किट में प्रदान की किट सकारात्मक नियंत्रण डीएनए के लिए वास्तविक समय आरपीए सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं के 50 माइक्रोन के 39 डिग्री सेल्सियस प्रवर्धन के दौरान मापा फ्लोरेसेंस के बेसलाइन-घटाया समय पाठ्यक्रम को दर्शाता है और निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार किया गया है। आरपीए प्रतिक्रियाओं, जो फ्लोरेसेंस के अपेक्षाकृत कम स्तर का उत्पादन, फ्लोरीमीटर के पहले विन्यास का उपयोग कर मापा गया है कि उत्तेजना प्रकाश के बेहतर दमन प्राप्त करता है ।
चित्रा 3 सी 65 डिग्री सेल्सियस पर एक कस्टम आरटी-लैंप परख के समय पाठ्यक्रम माप को दर्शाता है जो झांग एट अल 10, और राबे और सीप्को11द्वारा वर्णित N2,E1और As1e प्राइमर सेट का उपयोग करता है। आर टी-लैंप प्रतिक्रियाएं फ्लोरेसेंस की एक बड़ी राशि का उत्पादन करती हैं और दूसरे, कम लागत वाले फ्लोरीमीटर विन्यास का उपयोग करके मापी गई थीं। ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को 1 एमएम एकाग्रता पर 2x TE बफर में खरीदा गया और फिर से निलंबित कर दिया गया। फॉरवर्ड इनर प्राइमर (एफआईपी) और बैकवर्ड इनर प्राइमर (बीआईपी) ओलिगोस को हाई परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमेटोग्राफी शुद्धिकरण के साथ ऑर्डर किया गया था । प्रत्येक प्राइमर सेट (N2, E1, और As1e) को इस प्रकार के रूप में एक 25x मिश्रण के 1000 माइक्रोन बनाने के लिए संयुक्त किया गया था: एफआईपी के 40 माइक्रोन, बीआईपी के 40 माइक्रोन, एफ 3 के 5 माइक्रोन, बी 3 के 5 माइक्रोन, वामो के 10 माइक्रोन, एलबी के 10 माइक्रोन और 1x TE के 890 माइक्रोन। प्रत्येक आरटी-लैंप प्रतिक्रिया को इकट्ठा करने के लिए, प्रत्येक प्राइमर सेट के 1 माइक्रोन को 50x फ्लोरोसेंट डाई के 0.5 माइक्रोन और 2x मास्टर मिश्रण के 12.5 माइक्रोन में जोड़ा गया था और प्रतिक्रिया की मात्रा को निर्माता के निर्देशों के अनुसार नाभिक-मुक्त पानी के साथ 20 माइक्रोन तक लाया गया था। सार्स-सीओवी-2 आरएनए नियंत्रण को नाभिक मुक्त पानी में 10, 100, या 1,000 प्रतियों प्रति माइक्रोन की सांद्रता में क्रमिक रूप से पतला किया गया था, और 25 माइक्रोन की कुल प्रतिक्रिया मात्रा के लिए 5 माइक्रोन जोड़े गए थे। सभी प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया नो टारगेट कंट्रोल (एनटीसी) नाभिक मुक्त पानी था । आणविक जीव विज्ञान ग्रेड खनिज तेल के 25 माइक्रोन के साथ आरटी-लैंप प्रतिक्रियाओं को ओवरले किया गया ।
आरपीए और आरटी-लैंप प्रतिक्रियाओं को ०.२ एमएल लो-प्रोफाइल 8-ट्यूब पीसीआर स्ट्रिप के दो कुओं में इकट्ठा किया गया था और अल्ट्राक्लीयर फ्लैट कैप के साथ छाया हुआ था । प्रत्येक आरपीए और आरटी लैंप प्रतिक्रिया ट्रिपलीकेट में चलाया गया था। सभी परीक्षणों में, मिनी फ्लोरीमीटर सफलतापूर्वक डीएनए प्रवर्धन के साथ जुड़े फ्लोरेसेंस स्तर की लौकिक वृद्धि की मात्रा निर्धारित ।
चित्रा 1:ऑप्टिकल आवास और हीट ब्लॉक के ऊपर लघु फ्लोरीमीटर इकट्ठे। (A)ऑप्टिकल आवास का आरेख एक डिटेक्शन चैनल में रखे ऑप्टिकल घटकों को दिखाता है। (ख)विधानसभा के बाद लघु फ्लोरीमीटर के पहले विन्यास का आरेख । (ग)एक डिटेक्शन चैनल में रखे ऑप्टिकल कंपोनेंट्स के साथ ऑप्टिकल हाउसिंग की तस्वीर। (घ)व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हीट ब्लॉक के शीर्ष पर रखे गए इकट्ठे लघु फ्लोरीमीटर की तस्वीर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2:लघु फ्लोरीमीटर का असेंबली और विद्युत नियंत्रण आरेख। ए-जे)पहले सिस्टम कॉन्फ़िगरेशन के लिए 3 डी मुद्रित ऑप्टिकल आवास में ऑप्टिकल घटकों का चरण-दर-चरण प्लेसमेंट। (K)दोनों विन्यास के लिए लघु फ्लोरीमीटर के विद्युत आरेख । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3:लघु फ्लोरीमीटर के साथ प्राप्त प्रतिनिधि माप। (ए)मापा फ्लोरेसेंस बनाम फिटसी डाई एकाग्रता दोनों चैनलों में वांछित गतिशील सीमा में रैखिक प्रतिक्रिया दिखाता है । (ख)व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों के इसोथर्मल प्रवर्धन के लिए वास्तविक समय फ्लोरेसेंस बनाम समय। प्रवर्धन सकारात्मक नियंत्रण के लिए अपेक्षित के रूप में होता है। (ग)50, 500, और सार्स-सीओवी-2 आरएनए की 5000 प्रतियां और कस्टम आरटी-लैंप परख से एनटीसी नमूना के लिए वास्तविक समय फ्लोरेसेंस बनाम समय। परख का पता लगाने की सीमा के पास अपेक्षित रूप से प्रवर्धन होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| सिस्टम 1 | सिस्टम 2 | |||
| मद | परिमाण | कुल मूल्य (USD) | परिमाण | कुल मूल्य (USD) |
| ऑप्टिकल घटक | ||||
| लेंस | 6 | 158.14 | 6 | 158.14 |
| दर्पण | 2 | 244.56 | 2 | 60 |
| ऑप्टिकल फिल्टर | 4 | 200 | 6 | 5 |
| उपयोग | 602.7 | उपयोग | 223.14 | |
| रोशनी और पता लगाने | ||||
| एल ई डी | 2 | 72.62 | 2 | 72.62 |
| एलईडी ड्राइवर | 1 | 11.49 | 1 | 11.49 |
| फोटोडिओड | 2 | 50 | 2 | 50 |
| उपयोग | 134.11 | उपयोग | 134.11 | |
| इलेक्ट्रॉनिक्स और डिस्प्ले | ||||
| आर्डुइनो नैनो | 1 | 20.7 | 1 | 20.7 |
| रास्पबेरी पीआई | 1 | 35 | 1 | 35 |
| एलसीडी स्क्रीन | 1 | 25 | 1 | 25 |
| मिनी ब्रेडबोर्ड | 1 | 4 | 1 | 4 |
| 10वी बिजली आपूर्ति | 1 | 8.6 | 1 | 8.6 |
| उपयोग | 93.3 | उपयोग | 93.3 | |
| कुल लागत (USD) | 830.11 | 450.55 | ||
तालिका 1: लघु फ्लोरीमीटर के दो विन्यासों की लागत तुलना।
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Discussion
यहां वर्णित एक ओपन-सोर्स, कम लागत, मॉड्यूलर, पोर्टेबल फ्लोरीमीटर है जो इसोथर्मल प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं का मात्रात्मक फ्लोरेसेंस डिटेक्शन के लिए है। ओपन-सोर्स परियोजनाएं आसानी से उपलब्ध प्रतिस्थापन भागों के साथ तेजी से और सस्ती रखरखाव की सुविधा प्रदान करती हैं और उपयोगकर्ताओं को मॉड्यूलर डिजाइन के आधार पर सिस्टम को उनकी आवश्यकताओं के अनुकूल बनाने की छूट देती हैं। यह प्रोटोकॉल यांत्रिक, ऑप्टिकल और विद्युत घटकों को कोडांतरण करने और ऑप्टिकल प्रदर्शन को मान्य करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है। इसके अलावा, फ्लोरीमीटर के लचीलेपन को दो अलग-अलग प्रकार के आइसोथेमल प्रवर्धन परखने के लिए काफी अलग तापमान, मात्रा और फ्लोरेसेंस आवश्यकताओं, आरपीए एक्सो और आरटी-लैंप के साथ प्रदर्शित किया गया था। आरपीए 50 माइक्रोन प्रतिक्रियाओं में 39 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है जो फ्लोरेसेंस जनरेशन के लिए अनुक्रम-विशिष्ट एफएएम-टैग की गई जांच का उपयोग करता है, जबकि आरटी-लैंप 25 माइक्रोन प्रतिक्रिया मात्रा में 65 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है और प्रवर्धित डीएनए की उपस्थिति की रिपोर्ट करने के लिए एक इंटरकैलिंग डाई का उपयोग करता है। क्योंकि फ्लोरेसेंस माप फ्लैट टोपियां के साथ पीसीआर ट्यूबों के शीर्ष के माध्यम से किए जाते हैं, फ्लोरीमीटर दोनों परख की मात्रा से फ्लोरेसेंस का पता लगाने में सक्षम है, और गर्मी की आवश्यकताएं केवल वाणिज्यिक गर्मी ब्लॉक द्वारा सीमित हैं। इसके अलावा, आरटी-लैंप में उत्पादित फ्लोरेसेंस तीव्रता लगभग आरपीए में उत्पादित परिमाण से अधिक के क्रम में है, क्योंकि फ्लोरेसेंस सिग्नल उत्पादन के डाई बनाम जांच-आधारित तरीकों के कारण। हालांकि, चुने गए ऑप्टिकल सेंसर की गतिशील रेंज दोनों संकेतों का पता लगा सकती है और मात्रा निर्धारित कर सकती है, और इन मतभेदों के लिए बेसलाइन घटाव एल्गोरिदम खाते हैं ताकि विश्वसनीय फ्लोरेसेंस रीडिंग का उत्पादन किया जा सके।
प्रौद्योगिकी प्रसार को सुविधाजनक बनाने और संभावित रखरखाव लागत को कम करने के लिए, एक मॉड्यूलर डिजाइन जो विभिन्न सेटिंग्स में व्यापक रूप से उपलब्ध हीटर के साथ संगत है, नियोजित किया गया था। वर्तमान प्रोटोकॉल में, एक आम ड्राई ब्लॉक हीटर का उपयोग किया गया था; एक ही ऑप्टिकल और विद्युत डिजाइन आसानी से अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हीटर के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यदि एक और ड्राई ब्लॉक हीटर का उपयोग किया जाना है, तो 3 डी आवास डिजाइन में न्यूनतम परिवर्तन की आवश्यकता होगी। विशेष रूप से, ऑप्टिकल बाड़े एसटीएल फाइलों के नीचे खूंटे को अन्य वाणिज्यिक गर्मी ब्लॉकों के कुओं के साथ उचित संरेखण सुनिश्चित करने के लिए संशोधित किया जाना चाहिए। जबकि उदाहरणों में दिखाए गए बाड़ों को अपेक्षाकृत कम-अंत 3डी प्रिंटर (सामग्री की तालिकादेखें) पर मुद्रित किया गया था, यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि प्रिंटर संकल्प और/या प्रिंट सहिष्णुता ऑप्टिकल घटकों और थ्रेड्ड आवेषण को समायोजित करने के लिए पर्याप्त हैं । प्रदान की गई एसटीएल फाइलों में, निर्माता द्वारा निर्दिष्ट आयामों के आधार पर रेडियल और अक्षीय दिशाओं में ऑप्टिकल घटकों के दोनों ओर 0.01-0.02 इंच की सहिष्णुता जोड़ी गई थी। यह सुनिश्चित करता है कि सभी ऑप्टिकल घटक प्रिंट के भीतर सुरक्षित रूप से फिट होते हैं और बाड़े पूरी तरह से अतिरिक्त प्रकाश को प्रवेश करने या बचने से रोकता है। पिरोए गए आवेषण के लिए एक उचित प्रेस फिट सुनिश्चित करने के लिए, सीएडी फ़ाइल में निर्माता द्वारा प्रदान किए गए व्यास से 0.01-0.02 इंच की समान सहिष्णुता को घटाया गया था।
आरपीए प्रतिक्रियाओं को पहले फ्लोरीमीटर विन्यास का उपयोग करके सफलतापूर्वक निगरानी की गई थी, जबकि आरटी-लैंप प्रतिक्रियाओं को या तो विन्यास का उपयोग करके निगरानी की जा सकती थी। आरपीए प्रतिक्रियाओं में फ्लोरोजेनिक जांच द्वारा उत्पादित फ्लोरोसेंस के निम्न स्तर की निगरानी के लिए पहले विन्यास की बेहतर आवारा प्रकाश अस्वीकृति आवश्यक थी। इसके विपरीत, आरटी-लैंप सिग्नल उत्पादन के लिए एक इंटरकैलिटिंग डाई का उपयोग करता है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च फ्लोरेसेंस तीव्रता होती है जो फोटोग्राफिक फ़िल्टर फॉयल का उपयोग करके दूसरे विन्यास की कम गतिशील रेंज के साथ संगत होती है। उपयोगकर्ताओं को फ्लोरीमीटर विन्यास का चयन करना चाहिए जो फ्लोरेसेंस सिग्नल से मेल खाता है जो तत्व-इंटरकैलिटिंग डाई या फ्लोरोजेनिक प्रोब-ऑफ उनकी परख से मेल खाता है।
इस प्रणाली की एक सीमा यह है कि हीटिंग एक मानक दीवार आउटलेट के माध्यम से संचालित एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध गर्मी ब्लॉक द्वारा प्रदान की जाती है । इस प्रणाली को अन्यसमूहोंद्वारा दिखाए गए पोर्टेबल और रिचार्जेबल बैटरी पैक को शामिल करके बिजली तक विश्वसनीय पहुंच वाले क्षेत्रों में उपयोग के लिए और विकसित किया जा सकता है । एक और सीमा प्रणाली का अपेक्षाकृत कम थ्रूपुट है, जो एक समय में केवल दो नमूनों के एक साथ फ्लोरेसेंस माप की अनुमति देता है। थ्रूपुट बढ़ाने के लिए बाड़े के कई प्रिंट एक ही हीट ब्लॉक के ऊपर रखे जा सकते हैं; हालांकि, उपयोग किए गए प्रकाश सेंसर में केवल चार अद्वितीय I2C पते हैं। यह नमूनों की अधिकतम संख्या को प्रतिबंधित करता है जिसे एक साथ चार तक मापा जा सकता है। थ्रूपुट को और बढ़ाने के लिए बड़ी संख्या में अद्वितीय I2C पतों के साथ एक अलग प्रकाश सेंसर की आवश्यकता है।
Disclosures
लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।
Acknowledgments
नमूना तैयार करने के साथ उनकी सहायता के लिए चेल्सी स्मिथ, मेगन चांग, एमिली न्यूशम, साई पॉल और क्रिस्टोफर गोह को विशेष धन्यवाद। लेखक पांडुलिपि संशोधन के लिए कैरोलीन नोक्सन का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम के लिए धन USAVI द्वारा अमेरिकी लोगों से पुरस्कार सहायता के तहत एक IAVI अनुसंधान अनुदान CCID 9204 के माध्यम से प्रदान किया गया था-A16-A16-00032 IAVI और यूएसएड के बीच.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A116 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 10v power supply | GlobTek, Inc. | WR9HU1800CCP-F(R6B) | AC/DC Wall Mount Adapter 10V 18W |
| 15 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1074 | Two total are used for the fluorimeter. This lens is used to focus the LED illumination. |
| 1-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | ||
| 20 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1540 | Four total are used for the fluorimeter. |
| 2x WarmStart LAMP Master Mix | New England Biolabs, Inc | E1700 | Master mix was used to create the LAMP reactions shown in Figure 3C |
| 3.5” Touch Screen | Uctronics | BO10601 | |
| 3/16-inch-long 4-40 screw | McMaster-Carr | 90128A105 | |
| 3/16-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A115 | Used to secure the OPT3002 test board onto the 3D printed enclosure |
| 3/8-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | 90128A108 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 3D printer filament | 3D Universe | UMNFC-PC285-BLACK | Black or another dark color preferred |
| 3D printer used | Ultimaker | Ultimaker 2+ | |
| 8-tube PCR strips | BioRad | #TLS0801 | |
| Advanced Mini Dry Block Heater | VWR International | 10153-320 | The following heat blocks are acceptable substitutes without the need for redesigning the optical assembly: 949VWMNLUS, 949VWMHLUS, and 949VWMHLEU |
| barrel jack to two-pin adapter | SparkFun Electronics | 1568-1238-ND | |
| Blue Excitation Filter Foil | LEE | LE071S | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different filters. |
| Blue LED - 460 nm | Mouser | LZ1-30DB00-0100 | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
| Dichroic Mirror | Thorlabs | DMLP505T | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
| Emission Filter | Edmunds Optics | OG-515 | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts. The arrow on the part points away from the illumination source. |
| Excitation Filter | Omega Filters | 490AESP | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
| LED Driver | LEDdynamics | 3021-D-I-700 | |
| M2.5 Hex Shaped insert | McMaster-Carr | 91292A009 | Used to secure the Raspberry Pi to the 3D printed LCD Screen Holder |
| Microcontroller | Arduino | Nano | |
| Mini Breadboard | Adafruit | 65 | |
| Molecular biology-grade mineral oil | Sigma Aldrich | 69794 | |
| OPT3002EVM - Light-to-Digital Sensor | Texas Instruments | OPT3002EVM: | Light-to-digital sensor used. Consists of two PCBs: a SM-USB_DIG board and the OPT3002 test board; only the OPT3002 test board is needed for this device. |
| Purchased oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | ||
| RPA kit positive control DNA | TwistDx Limited | CONTROL01DNAE | |
| SARS-CoV-2 RNA Control | Twist Biosciences | MN908947.3 | |
| Single board computer | Raspberry Pi | Raspberry Pi 3 | |
| TwistAmp RPA exo kit | TwistDx Limited | TAEXO02KIT | |
| Ultraclear flat caps | BioRad | #TCS0803 | |
| Yellow Emmission Filter Foil | LEE | LE767S | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
References
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