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Biochemistry

Adaptaciones específicas de miosina de ensayos de motilidad basados en microscopía de fluorescencia in vitro

Published: February 4, 2021 doi: 10.3791/62180
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

Aquí se presenta un procedimiento para expresar y purificar la miosina 5a seguido de una discusión de su caracterización, utilizando ensayos basados en microscopía de fluorescencia in vitro de conjunto y molécula única, y cómo estos métodos pueden modificarse para la caracterización de la miosina 2b no muscular.

Abstract

Las proteínas de miosina se unen e interactúan con la actina filamentosa (F-actina) y se encuentran en los organismos a través del árbol filogenético. Su estructura y propiedades enzimáticas se adaptan a la función particular que ejecutan en las células. La miosina 5a camina procesivamente sobre la F-actina para transportar melanosomas y vesículas en las células. Por el contrario, la miosina 2b no muscular funciona como un filamento bipolar que contiene aproximadamente 30 moléculas. Mueve la F-actina de polaridad opuesta hacia el centro del filamento, donde las moléculas de miosina trabajan de forma asíncrona para unir la actina, impartir un golpe de potencia y disociarse antes de repetir el ciclo. La miosina 2b no muscular, junto con sus otras isoformas no musculares de miosina 2, tiene funciones que incluyen la adhesión celular, la citocinesis y el mantenimiento de la tensión. La mecanoquímica de las miosinas se puede estudiar mediante la realización de ensayos de motilidad in vitro utilizando proteínas purificadas. En el ensayo de filamento de actina deslizante, las miosinas se unen a una superficie de cubierta de microscopio y translocan F-actina etiquetada fluorescentemente, que se puede rastrear. Sin embargo, en el ensayo de motilidad de molécula / conjunto único, la F-actina se une a un codaño y se observa el movimiento de moléculas de miosina etiquetadas fluorescentemente en la F-actina. En este informe, se describe la purificación de la miosina 5a recombinante de células Sf9 mediante cromatografía de afinidad. Después de esto, describimos dos ensayos basados en microscopía de fluorescencia: el ensayo de filamento de actina deslizante y el ensayo de motilidad invertida. A partir de estos ensayos, se pueden extraer parámetros como las velocidades de translocación de actina y las longitudes y velocidades de ejecución de una sola molécula utilizando el software de análisis de imágenes. Estas técnicas también se pueden aplicar para estudiar el movimiento de filamentos individuales de las isoformas de miosina 2 no muscular, discutidas aquí en el contexto de la miosina 2b no muscular. Este flujo de trabajo representa un protocolo y un conjunto de herramientas cuantitativas que se pueden utilizar para estudiar la dinámica de molécula única y conjunto de miosinas no musculares.

Introduction

Las miosinas son proteínas motoras que ejercen fuerza sobre los filamentos de actina utilizando la energía derivada de la hidrólisis de trifosfato de adenosina (ATP)1. Las miosinas contienen un dominio de cabeza, cuello y cola. El dominio de la cabeza contiene la región de unión a la actina, así como el sitio de unión al ATP y la hidrólisis. Los dominios del cuello están compuestos de motivos de CI, que se unen a cadenas ligeras, calmodulina o proteínas similares a la calmodulina2,3. La región de la cola tiene varias funciones específicas para cada clase de miosinas, que incluyen, entre otras, la dimerización de dos cadenas pesadas, la unión de moléculas de carga y la regulación de la miosina a través de interacciones autoinhibitorias con los dominios de la cabeza1.

Las propiedades móviles de la miosina varían mucho entre las clases. Algunas de estas propiedades incluyen la relación de trabajo (la fracción del ciclo mecánico de la miosina en la que la miosina se une a la actina) y la procesividad (la capacidad de un motor para hacer múltiples pasos en su pista antes del desprendimiento)4. Las más de 40 clases de miosinas se determinaron en base a análisis de secuencia5,6,7,8. Las miosinas de clase 2 se clasifican como "convencionales" ya que fueron las primeras en ser estudiadas; todas las demás clases de miosinas se clasifican, por lo tanto, como "no convencionales".

La miosina 5a (M5a) es una miosina de clase 5 y es un motor procesivo, lo que significa que puede tomar múltiples pasos a lo largo de la actina antes de disociarse. Tiene una alta relación de trabajo, lo que indica que pasa gran parte de su ciclo mecánico unido a la actina9,10,11,12,13,14. Al igual que otras miosinas, la cadena pesada contiene un dominio motor N-terminal que incluye tanto una unión a la actina como un sitio de hidrólisis de ATP seguido de una región del cuello que sirve como brazo de palanca, con seis motivos de CI que se unen a las cadenas ligeras esenciales (ELC) y la calmodulina (CaM)15. La región de la cola contiene α bobinas enrolladas semilicoidales, que dimerizan la molécula, seguidas de una región de cola globular para unir la carga. Su cinética refleja su implicación en el transporte de melanosomas en los melanocitos y del retículo endoplásmico en las neuronas de Purkinje16,17. M5a se considera el motor de transporte de carga prototípico18.

Las miosinas de clase 2, o las miosinas convencionales, incluyen las miosinas que potencian la contracción del músculo esquelético, cardíaco y liso, además de las isoformas no musculares de miosina 2 (NM2), NM2a, 2b y 2c19. Las isoformas NM2 se encuentran en el citoplasma de todas las células y tienen funciones compartidas en citocinesis, adhesión, morfogénesis tisular y migración celular19,20,21,22. Este artículo discute los protocolos convencionales de miosina en el contexto de la miosina no muscular 2b (NM2b)23. NM2b, en comparación con M5a, tiene una relación de servicio baja y es enzimáticamente más lento con unV máximo de 0.2 s-123 en comparación con el Vmax de M5a de ≈18 s-124. En particular, las construcciones NM2b truncadas con dos cabezales no se mueven fácilmente procesivamente sobre la actina; más bien, cada encuentro con la actina resulta en un golpe de potencia seguido de la disociación de la molécula25.

NM2b contiene dos cadenas pesadas de miosina, cada una con un dominio de cabeza globular, un brazo de palanca (con un ELC y una cadena ligera reguladora (RLC)), y un dominio de varilla / cola de bobina enrollada α-helicoidal, de aproximadamente 1.100 aminoácidos de largo, que dimeriza estas dos cadenas pesadas. La actividad enzimática y el estado estructural de NM2b están regulados por la fosforilación del RLC23. NM2b no fosfoesforilado, en presencia de ATP y fuerzas iónicas fisiológicas (aproximadamente 150 mM de sal), adopta una conformación compacta en la que las dos cabezas hacen participar en una interacción asimétrica y la cola se pliega hacia atrás sobre las cabezas en dos lugares23. En este estado, la miosina no interactúa fuertemente con la actina y tiene una actividad enzimática muy baja. Tras la fosforilación de RLC por la miosina quinasa de cadena ligera dependiente de calmodulina (MLCK) o la proteína quinasa asociada a Rho, la molécula se extiende y se asocia con otras miosinas a través de la región de la cola para formar filamentos bipolares de aproximadamente 30 moléculas de miosina23. La fosforilación antes mencionada del RLC también conduce a un aumento de la actividad atPasa activada por actina de NM2b en aproximadamente cuatro veces26,27,28. Esta disposición de filamento bipolar, con muchos motores de miosina en cada extremo, está optimizada para funciones en la contracción y el mantenimiento de la tensión, donde los filamentos de actina con polaridades opuestas se pueden mover entre sí23,29. En consecuencia, se ha demostrado que NM2b actúa como un conjunto de motores cuando interactúa con la actina. El gran número de motores dentro de este filamento permite que los filamentos NM2b se muevan procesivamente sobre filamentos de actina, haciendo posible caracterizar la procesividad del filamento in vitro29.

Si bien se ha avanzado en la comprensión del papel de las miosinas en la célula, existe la necesidad de comprender sus características individuales a nivel de proteínas. Para comprender las interacciones actomiosinas a un nivel simple de interacción proteína-proteína, en lugar de dentro de una célula, podemos expresar y purificar miosinas recombinantes para su uso en estudios in vitro. Los resultados de tales estudios informan a los mecanobiólogos sobre las propiedades biofísicas de las miosinas específicas que en última instancia impulsan procesos celulares complejos12,13,14,25,29. Por lo general, esto se logra agregando una etiqueta de afinidad a una construcción de miosina truncada o de longitud completa y purificando a través de cromatografía de afinidad29,30,31. Además, la construcción puede ser diseñada para incluir un fluoróforo genéticamente encodable o una etiqueta para el etiquetado de proteínas con un fluoróforo sintético. Al agregar una etiqueta fluorescente de este tipo, se pueden realizar estudios de imágenes de moléculas individuales para observar la mecánica y la cinética de la miosina.

Después de la purificación, la miosina se puede caracterizar de varias maneras. La actividad de la ATPasa se puede medir mediante métodos colorimétricos, lo que proporciona información sobre el consumo total de energía y la afinidad de actina del motor en diferentes condiciones32. Para aprender sobre la mecanoquímica de su motilidad, se requieren más experimentos. Este documento detalla dos métodos basados en microscopía de fluorescencia in vitro que se pueden utilizar para caracterizar las propiedades móviles de una proteína de miosina purificada.

El primero de estos métodos es el ensayo de filamento de actina deslizante, que se puede utilizar para estudiar cuantitativamente las propiedades del conjunto de motores de miosina, así como para estudiar cualitativamente la calidad de un lote de proteína purificada33. Aunque este artículo discute el uso de la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para este ensayo, estos experimentos se pueden realizar de manera efectiva utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio equipado con una cámara digital, que se encuentra comúnmente en muchos laboratorios34. En este ensayo, una capa saturada de motores de miosina se une a una cubierta. Esto se puede lograr utilizando nitrocelulosa, anticuerpos, membranas, superficies derivadas de SiO2(como trimetilorolosilano), entre otros29,33,35,36,37,38. Los filamentos de actina etiquetados fluorescentemente se pasan a través de la cámara de la cubierta, sobre la cual la actina se une a la miosina unida a la superficie. Tras la adición de ATP (y quinasas en el estudio de NM2), la cámara se toma una imagen para observar la translocación de filamentos de actina por las miosinas unidas a la superficie. El software de seguimiento se puede utilizar para correlacionar la velocidad y la longitud de cada filamento de actina deslizante. El software de análisis también puede proporcionar una medida del número de filamentos de actina móviles y estacionarios, lo que puede ser útil para determinar la calidad de una preparación de miosina dada. La proporción de filamentos estancados también puede ser modulada intencionalmente por la unión superficial de la actina a otras proteínas y medida para determinar la dependencia de la carga de la miosina39. Debido a que cada filamento de actina puede ser propulsado por un gran número de motores disponibles, este ensayo es muy reproducible, y la velocidad final medida es robusta a perturbaciones como alteraciones en la concentración de miosina inicial o la presencia de factores adicionales en la solución. Esto significa que se puede modificar fácilmente para estudiar la actividad de la miosina en diferentes condiciones, como la fosforilación alterada, la temperatura, la fuerza iónica, la viscosidad de la solución y los efectos de la carga inducida por las ataduras superficiales. Aunque factores como las "cabezas muertas" de miosina de unión fuerte incapaces de hidrólisis de ATP pueden causar filamentos de actina estancados, existen múltiples métodos para mitigar tales problemas y permitir mediciones precisas. Las propiedades cinéticas de la miosina varían mucho entre las clases y, dependiendo de la miosina específica utilizada, la velocidad del deslizamiento del filamento de actina en este ensayo puede variar desde menos de 20 nm / s (miosina9) 40,41y hasta 60,000 nm / s (miosinacharaceana 11)42.

El segundo ensayo invierte la geometría del ensayo de filamento de actina deslizante12. Aquí, los filamentos de actina se unen a la superficie de la cubierta y se visualiza el movimiento de moléculas individuales de M5a o de filamentos bipolares individuales de NM2b. Este ensayo se puede utilizar para cuantificar las longitudes y velocidades de ejecución de moléculas individuales de miosina o filamentos en la actina. Un coverslip está recubierto con un compuesto químico que bloquea la unión no específica y simultáneamente funcionaliza la superficie, como la biotina-polietilenglicol (biotina-PEG). La adición de derivados de avidina modificados luego prepara la superficie y la actina biotinilada pasa a través de la cámara, lo que resulta en una capa de F-actina unida de manera estable al fondo de la cámara. Finalmente, la miosina activada y etiquetada fluorescentemente (típicamente 1-100 nM) fluye a través de la cámara, que luego se toma una imagen para observar el movimiento de la miosina sobre los filamentos de actina estacionarios.

Estas modalidades representan métodos rápidos y reproducibles que se pueden emplear para examinar la dinámica de las miosinas no musculares y musculares. Este informe describe los procedimientos para purificar y caracterizar tanto M5a como NM2b, que representan miosinas no convencionales y convencionales, respectivamente. Esto es seguido por una discusión de algunas de las adaptaciones específicas de la miosina, que se pueden realizar para lograr una captura exitosa del movimiento en los dos tipos del ensayo.

Expresión y biología molecular
El ADNc para la miosina de interés debe clonarse en un vector pFastBac1 modificado que codifica para una etiqueta FLAG-terminal C (DYKDDDDK) si expresa M5a-HMM, o una etiqueta FLAG-terminal N si expresa la molécula de longitud completa de NM2b23,43,44,45,46. Las etiquetas FLAG-terminales C en NM2b producen una afinidad debilitada de la proteína por la columna flag-afinidad. Por el contrario, la proteína marcada con FLAG N-terminal generalmente se une bien a la columna de afinidad FLAG23. La proteína marcada N-terminalmente conserva la actividad enzimática, la actividad mecánica y la regulación dependiente de la fosforilación23.

En este artículo, se utilizó una construcción truncada similar a la meromiosina pesada (HMM) del ratón M5a con un GFP entre la etiqueta FLAG y el extremo C de la cadena pesada de miosina. Tenga en cuenta que, a diferencia de NM2b, M5a-HMM se puede etiquetar y purificar con éxito con etiquetas FLAG de terminal N o C y, en ambos casos, la construcción resultante estará activa. La cadena pesada M5a se truncó en el aminoácido 1090 y contiene un enlazador de tres aminoácidos (GCG) entre el GFP y la región de bobina enrollada del M5a47. No se agregó ningún vinculador adicional entre la GFP y la etiqueta FLAG. M5a-HMM se co-expresó con calmodulina. El constructo NM2b humano de longitud completa se co-expresó con ELC y RLC. El N-termini del RLC se fusionó con un GFP a través de un enlazador de cinco aminoácidos (SGLRS). Directamente adjunto a la etiqueta FLAG había un HaloTag. Entre el HaloTag y el N-terminal de la cadena pesada de miosina había un eslabón hecho de dos aminoácidos (AS).

Ambas preparaciones de miosina se purificaron a partir de un litro de cultivo celular Sf9 infectado con baculovirus a una densidad de aproximadamente 2 x 106 células / ml. Los volúmenes del baculovirus para cada subunidad dependían de la multiplicidad de infección del virus según lo determinado por las instrucciones del fabricante. En el caso de M5a, las células fueron coinfectadas con dos baculovirus diferentes: uno para la calmodulina y otro para la cadena pesada M5a. En el caso del NM2b, las células fueron coinfectadas con tres virus diferentes: uno para ELC, uno para RLC y otro para la cadena pesada NM2b. Para los laboratorios que trabajan con una diversidad de miosinas (u otras proteínas multi complejas), este enfoque es eficiente ya que permite muchas combinaciones de cadenas pesadas y ligeras y las cadenas ligeras de uso común, como la calmodulina, pueden ser co-transfectadas con muchas cadenas pesadas de miosina diferentes. Todo el trabajo celular se completó en un gabinete de bioseguridad con la técnica estéril adecuada para evitar la contaminación.

Para la expresión de M5a y NM2b, las células Sf9 que producen las miosinas recombinantes se recolectaron 2-3 días después de la infección, mediante centrifugación, y se almacenaron a -80 ° C. Los gránulos celulares se obtuvieron centrifugando las células Sf9 coinfectadas a 4 °C durante 30 min a 2.800 x g. El proceso de purificación de proteínas se detalla a continuación.

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Protocol

1. Purificación de proteínas

  1. Lisis celular y extracción de proteínas
    1. Prepare un búfer de extracción 1.5x basado en la Tabla 1. Filtrar y conservar a 4 °C.
    2. Comience a descongelar los gránulos celulares en hielo. Mientras los gránulos se descongelan, complemente 100 ml de tampón de extracción con 1,2 mM de ditiotereitol (TDT), 5 μg/ml de leupeptina, 0,5 μM de fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) y dos comprimidos inhibidores de la proteasa. Manténgase en hielo.
    3. Una vez que el pellet se haya descongelado, agregue 1 ml del tampón de extracción suplementado por 10 ml de cultivo celular. Por ejemplo, si los gránulos celulares se formaron a partir de 500 ml de cultivo celular, agregue 50 ml de tampón de extracción suplementado al pellet.
    4. Sonicar los gránulos celulares mientras los mantiene en hielo. Para cada pellet, use las siguientes condiciones: 5 s ON, 5 s OFF, duración de 5 min, potencia 4-5.
    5. Recoger todo el lisato homogeneizado en un beaker y añadir ATP (solución de stock de 0,1 M; pH 7,0) de tal manera que la concentración final de ATP sea de 1 mM. Revuelva durante 15 minutos en una cámara frigorífica. El ATP disocia la miosina activa de la actina, lo que permite separarla en el siguiente paso de centrifugación. Por lo tanto, es esencial proceder al siguiente paso de inmediato para minimizar la posibilidad de agotamiento del ATP y volver a unirse a la actina.
    6. Centrifugar los lisados a 48.000 x g durante 1 h a 4 °C. Mientras esto ocurre, comience a lavar 1-5 ml de una suspensión al 50% de resina de afinidad Anti-FLAG (para un pellet formado a partir de 1 L de células) con solución salina tamponada con fosfato (PBS) de 100 ml, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, para 5 ml de resina, lave 10 ml de una suspensión al 50%. En el paso final de lavado, vuelva a gastar la resina con 1-5 ml de PBS con suficiente volumen para crear una suspensión del 50%.
    7. Después de la centrifugación con lisato, combine el sobrenadante con la suspensión de resina lavada y la roca suavemente en la cámara frigorífica durante 1-4 h. Mientras espera, haga los amortiguadores descritos en la Tabla 1 y manténgalos en hielo.
  2. Preparación de purificación por afinidad FLAG
    1. Centrifugar la solución en el paso 1.7 a 500 x g durante 5 min a 4 °C. La resina se empaquetará en la parte inferior del tubo. Sin molestar la resina, retire el sobrenadante.
    2. Resuspend la resina en 50 ml de tampón A como se detalla en la Tabla 1 y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Sin molestar la resina, retire el sobrenadante.
    3. Resuspend la resina en 50 mL de Buffer B como se detalla en la Tabla 1 y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Repita este paso una vez más y vuelva a sususpend la resina en 20 ml de Buffer B. Luego, mezcle bien la resina y el tampón invirtiendo suavemente el tubo a mano aproximadamente 10 veces.
  3. Elución y concentración de proteínas
    1. Haga 30 ml de tampón de elución como se describe en la Tabla 1 y deje que se enfríe sobre hielo.
    2. Configure la columna de elución en una cámara frigorífica. Vierta suavemente la suspensión de resina en la columna. Lave la columna con 1-2 volúmenes de columna de Buffer B a medida que la resina se empaqueta en la parte inferior, asegurándose de que la resina no se seque.
    3. Fluya 1 mL del tampón de elución a través de la resina y recoja el flujo en un tubo de 1,5 ml. Repita de tal manera que se recolecten fracciones de 12, 1 ml.
    4. En este punto, realice una prueba de Bradford cruda en las fracciones para determinar cualitativamente qué fracciones son las más concentradas48. En una fila de una placa de 96 pozos, pipete 60 μL 1x reactivo Bradford. A medida que se recogen las fracciones, mezcle 20 μL de cada fracción por pozo. Una coloración azul más oscura indica las fracciones más concentradas.
    5. En un tubo de 50 ml, recoja la proteína restante canalizando suavemente el tampón de elución restante a través de la columna, para liberar cualquier miosina restante unida a la resina en el flujo de la columna. Este flujo se concentrará en el siguiente paso. Asegúrese de que la resina se regenera para su reutilización y se almacena de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    6. Acondicióne las tres fracciones más concentradas y concentre aún más el flujo a través en el tubo de 50 ml, así como las fracciones restantes de 1 ml utilizando un tubo de concentración de 100,000 MWCO. Cargue la muestra agrupada en el tubo concentrador y la centrífuga a 750 x g durante 15 min a 4 °C y repita hasta que toda la proteína eluida se haya concentrado en un volumen final de aproximadamente 0,5-1 ml.
      NOTA: Este tamaño de poro permite la retención de las moléculas de miosina, que tienen masas varias veces el límite de peso molecular. Las cadenas ligeras permanecen estrechamente unidas a los dominios motores durante este curso de concentración, como se verifica mediante la realización de la electroforesis en gel SDS-PAGE en el producto final.
  4. Diálisis y congelación por flash
    1. Haga 2 L de tampón de diálisis, como se describe en la Tabla 1. Cargue la muestra en una bolsa o cámara de diálisis y dialícelo durante la noche en la cámara frigorífica. Tenga en cuenta que la composición de los tampones de diálisis difiere para NM2b y M5a.
      NOTA: En el caso de NM2b, el propósito de este paso de diálisis es formar filamentos de miosina en el tampón de baja resistencia iónica. La sedimentación de estos filamentos proporciona un paso de purificación adicional y permite la concentración de la muestra. Por lo tanto, habrá un precipitado blanco visible en la cámara de diálisis al día siguiente. Estos filamentos se recogerán por centrifugación y se despolimerizarán en el paso 5.1. En el caso de M5a-HMM, después de la diálisis nocturna, la proteína será lo suficientemente pura para su uso en ensayos posteriores. Se pueden realizar pasos de purificación adicionales, como la filtración en gel o la cromatografía de intercambio iónico, si es necesario. Para la recuperación de M5a después de la diálisis, vaya al paso 5.2.
  5. Recuperación de la miosina después de la diálisis
    1. Para NM2b, descargue cuidadosamente toda la muestra de la bolsa o cámara de diálisis y centrífuga a 4 °C durante 15 min a 49,000 x g para recolectar los filamentos de miosina. Deseche el sobrenadante y agregue incrementalmente el tampón de almacenamiento al pellet como se describe en la Tabla 1 hasta que se haya disuelto. El pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo ayuda a solubilizar el pellet. Normalmente, esto no requiere más de 500 μL por tubo. Después de asegurarse de que el pellet esté completamente disuelto en el tampón de almacenamiento de alta resistencia iónica, se puede realizar un paso de centrifugación adicional (15 min a 49,000 x g)para eliminar los agregados no deseados si es necesario, ya que la miosina ahora no se utilizará y permanecerá en el sobrenadante.
    2. Para M5a-HMM, recoja cuidadosamente toda la muestra de la cámara de diálisis y la centrífuga a 4 °C durante 15 min a 49,000 x g en caso de que haya agregados no deseados. Toma el sobrenadante.
  6. Determinación de la concentración y congelación por flash
    1. Para determinar la concentración del producto, mida la absorbancia utilizando un espectrofotómetro en longitudes de onda de 260, 280, 290 y 320 nm. Calcule la concentración en mg/mL (cmg/mL) con la Ecuación 1, donde A280 representa la absorción a 280 nm y A320 representa la absorción a 320 nm. La concentración resultante en mg/mL se puede convertir en μM de moléculas de miosina con la Ecuación 2,donde M es el peso molecular de toda la proteína (incluidas las cadenas pesadas, las cadenas ligeras, los fluoróforos y todas las etiquetas).
      cmg/mL = (A280 - A320) / ε (1)
      Moléculas μM = 1000cmg/mL/M(2)
      NOTA: Si es necesaria una dilución, entonces debe hacerse en un tampón de alta resistencia iónica. El coeficiente de extinción (ε) se puede determinar importando la secuencia de aminoácidos de la proteína en un programa como ExPASy. El rendimiento típico para el M5a-HMM es de aproximadamente 0.5-1 mL de proteína 1-5 mg /mL y para el NM2b de longitud completa es de 0.5-1 mL de 0.5-2 mg/mL. El coeficiente de extinción para el M5a-HMM utilizado en este trabajo fue de 0,671. El coeficiente de extinción para el NM2b utilizado en este trabajo fue de 0,611.
    2. Almacene la miosina purificada de una de las dos maneras. Alícuota entre 10-20 μL en un tubo de pared delgada, como un tubo de reacción en cadena de polimerización, y deje caer el tubo en un recipiente de nitrógeno líquido para congelarlo por flash. Alternativamente, pipetee directamente entre 20-25 μL de miosina en nitrógeno líquido y almacene las perlas congeladas de proteína en tubos criogénicos estériles. En cualquier caso, los tubos resultantes se pueden almacenar en -80 °C o nitrógeno líquido para su uso futuro.
      NOTA: Dado que ambos ensayos de motilidad descritos a continuación requieren cantidades muy pequeñas de proteína, el almacenamiento en pequeñas alícuotas, como se describe, es económico.

2. Ensayo de filamento de actina deslizante

  1. Preparación de la cubierta
    1. Haga una solución de nitrocelulosa al 1% en acetato de amilo.
    2. Obtenga una placa de cultivo de tejidos (150 x 25 mm) y agregue un papel de filtro circular (125 mm de diámetro) al fondo del plato.
    3. Cargue ocho fundas cuadradas No. 1.5 de espesor 22 mm en una rejilla y lávese con aproximadamente 2-5 ml de etanol a prueba de 200 seguido de 2-5 ml de agua destilada (dH2O). Repita este paso de lavado, terminando con agua. Luego, seque los cubrecos completamente usando una línea de aire filtrada o una líneaN 2.
    4. Tome una funda y pipetee lentamente 10 μL de la solución de nitrocelulosa al 1% a lo largo de un borde del deslizamiento. Luego, en un movimiento suave, unte el resto de la cubierta usando el lado de una punta de pipeta de 200 μL de lado liso. Coloque este cubrecubres en la placa de cultivo de tejidos con el lado de nitrocelulosa hacia arriba. Repita para los cubrecos restantes y deje que se sequen mientras prepara los reactivos restantes y use los cubrehojes dentro de las 24 horas posteriores al recubrimiento.
  2. Preparación de la cámara
    1. Limpie un portaobjetos de microscopio con un papel de lente óptica para limpiar los escombros grandes. Cortar dos trozos de cinta de doble cara, de aproximadamente 2 cm de longitud.
    2. Coloque una pieza a lo largo del centro del borde largo del portaobjetos del microscopio. Asegúrese de que el borde de la cinta se alinea con el borde de la diapositiva. Coloque la segunda pieza de cinta aproximadamente 2 mm por debajo de la primera pieza de cinta de modo que las dos estén paralelas y alineadas. Esto crea una cámara de flujo que puede contener aproximadamente 10 μL de solución (ver Figura 1).
    3. Tome uno de los cobiertos recubiertos de nitrocelulosa de la Parte 1. Pegue cuidadosamente la cubierta en la cinta de modo que el lado recubierto con nitrocelulosa esté haciendo contacto directo con la cinta (ver Figura 1). Con una punta de pipeta, presione suavemente hacia abajo en la interfaz de cinta deslizante para asegurarse de que la cubierta se haya adherido correctamente a la diapositiva. Corte el exceso de cinta que cuelga sobre el borde de la corredera con una cuchilla de afeitar.
  3. Preparación de actina
    1. Hacer 20 μM de F-actina polimerizando actina globular (G-actina) en tampón de polimerización (50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM TDT, 25 mM MOPS (pH 7.0)) a 4 °C durante la noche.
    2. Diluir F-actina a 5 μM en tampón motilidad (20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 1 mM TDT (pH 7,4)). Etiqueta con al menos 1,2 veces de exceso molar de rodamina-faloidina. Dejar (cubierto de papel de aluminio) durante al menos 2 h sobre hielo. Esto se puede usar hasta por 1-2 meses, almacenado en hielo.
  4. Realización del ensayo de filamento de actina deslizante myosin 5a
    NOTA: En esta sección, se proporcionan los detalles del ensayo de deslizamiento de miosina 5a (HMM).
    1. Prepare las soluciones para la miosina 5a descritas en la Tabla 2 y manténgalas en hielo.
    2. Flujo en 10 μL de la miosina 5a (50-100 nM) a través de la cámara de flujo y esperar 1 min.
    3. Flujo en 10 μL de la BSA de 1 mg/mL en 50 mM MB con 1 mM de TDT (tampón "bajo en sal"). Repita este lavado dos veces más y espere 1 minuto después del tercer lavado. Use la esquina de un papel de seda o papel de filtro para absorber la solución a través del canal colocando suavemente la esquina del papel en la salida de la cámara de flujo.
    4. Lavar con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM TDT. Repita este lavado dos veces más.
    5. Flujo en 10 μL de la solución de actina negra (5 μM F-actina, 1 μM calmodulina y 1 mM ATP en 50 mM MB con 1 mM TDT) para eliminar "cabezas muertas", como se discutió en la sección Discusión.
      1. Pipetear la solución con una jeringa de 1 ml y una aguja de 27 G para esquilar los filamentos de actina antes de introducir la solución en la cámara. Repita este paso dos veces más y espere 1 minuto después de la tercera vez. Aproximadamente 20 eventos de pipeteo son suficientes.
      2. Para realizar el giro de "cabeza muerta", agregue una cantidad estequiométrica de F-actina a la miosina en presencia de 1 mM de ATP y 1 mM de MgCl2 a una concentración de sal de 500 mM. A continuación, ultracentrífuga a 480.000 x g durante 15 min a 4 °C. La miosina muerta estará en el perdigón.
    6. Flujo en 50 μL de 50 mM MB con 1 mM TDT y 1 mM ATP para agotar la cámara de filamentos de actina libre.
    7. Lavar con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM TDT. Repita este lavado dos veces más para agotar la cámara de cualquier ATP.
    8. Flujo en 10 μL de 20 nM de solución de rodina de rodamina (Rh-Actina) que contiene 1 mM de TDT en 50 mM MB y espere 1 min para permitir la unión rigor de los filamentos de actina a la miosina 5a unida a la superficie de la cubierta.
    9. Lavar con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM de TDT para eliminar los filamentos de Rh-Actina no unidos a la superficie. Repita este lavado dos veces más.
    10. Flujo en 30 μL de buffer final.
    11. Grabe imágenes en un microscopio de fluorescencia utilizando una longitud de onda de excitación de 561 nm para visualizar la Rh-Actina. Un tiempo de exposición apropiado es de 200 ms a una potencia láser de 1,4 mW para una duración total de adquisición de 0,5-1 min.
      NOTA: Asegúrese de que la tasa de adquisición se escale adecuadamente a la velocidad de los filamentos en movimiento. Una consideración importante antes de recopilar datos para su uso con programas de seguimiento es la velocidad de fotogramas de adquisición. Los movimientos de subpíxeles entre fotogramas darán como resultado una sobreestimación de la velocidad, y se requieren movimientos de varios cientos de nanómetros para obtener valores precisos. Una tasa de adquisición óptima presenta deslizamiento de actina durante al menos una distancia de píxeles entre fotogramas. En el caso del microscopio TIRF utilizado para la obtención de imágenes aquí, este umbral se traduce en 130 nm; por lo tanto, una miosina que se espera que viaje 1 μm/s debe ser fotografiada a una velocidad de 5 fotogramas/s (intervalo de 0,2 s) para lograr 200 nm de movimiento, mientras que una miosina que se espera que viaje a 10 nm/s requiere 0,05 fotogramas/s (intervalos de 20 s). Por lo tanto, los datos se pueden reducir en esta etapa si es necesario (consulte Discusión para obtener más detalles).
  5. Realización del ensayo de filamento de actina deslizante de miosina 2b no muscular
    NOTA: En esta sección, se proporcionan los detalles del ensayo de deslizamiento de miosina no muscular 2b de longitud completa. El protocolo de ensayo de filamento de actina deslizante de miosina 2b no muscular es diferente del protocolo de miosina 5a en ciertos pasos. Asegúrese de que se utilizan los búferes correctos para cada uno de estos pasos. Por ejemplo, el ensayo NM2b requiere la unión de miosina al coverslip en el tampón de sal alta, mientras que el M5a se puede unir al coverslip en tampones de sal alta o baja. Además, el ensayo de filamento de actina deslizante M5a utiliza una concentración más baja de miosina para mitigar la frecuencia de los filamentos de actina que se rompen durante la adquisición.
    1. Prepare las soluciones para NM2b como se describe en la Tabla 2 y manténgalas en hielo.
    2. Flujo en 10 μL de la miosina no muscular 2b (0,2 μM) en 500 mM Motility Buffer (MB) (tampón "alto en sal") y 1 mM de ditiotreitol (TDT) a través de la cámara de flujo y esperar 1 min.
      NOTA: Los tampones de alta sal disocian los filamentos de miosina y permiten la unión de moléculas individuales de miosina a la superficie, ya que la miosina 2b no muscular puede polimerizarse en filamentos a concentración iónica <150 mM.
    3. Flujo en 10 μL de la albúmina sérica bovina (BSA) de 1 mg/ml en 500 mM MB con 1 mM de TDT (tampón "alto en sal") como se describe en la Tabla 2. Repita este lavado dos veces más y espere 1 minuto después del tercer lavado. Use la esquina de un papel de seda o papel de filtro para absorber la solución a través del canal.
    4. Lavar con 10 μL de 500 mM MB con 1 mM TDT como se describe en la Tabla 2. Repita este lavado dos veces más.
    5. Flujo en 10 μL de la solución de actina negra como se describe en la Tabla 2 para eliminar "cabezas muertas", como se discute más adelante en la sección Discusión. La solución de actina negra contiene 5 μM de F-actina sin etiquetar, 1-10 nM MLCK, 1 mM ATP, 0,2 mM CaCl2,1 μM CaM y 1 mM TDT en un tampón de motilidad de NaCl de 50 mM para fosforilar la miosina 2b no muscular en la superficie de la cámara.
      1. Pipetear la solución con una jeringa de 1 ml y una aguja de 27 G para esquilar los filamentos de actina antes de introducir la solución en la cámara. Repita este paso dos veces más y espere 1 minuto después de la tercera vez. Aproximadamente, 20 eventos de pipeteo son suficientes.
    6. Flujo en 50 μL de 50 mM MB con 1 mM TDT y 1 mM ATP para agotar la cámara de filamentos de actina libre.
    7. Lavar con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM TDT. Repita este lavado dos veces más para agotar la cámara de cualquier ATP.
    8. Flujo en 10 μL de solución de Rh-Actina de 20 nM que contiene 1 mM de TDT en 50 mM MB y espere 1 min para permitir la unión rigor de los filamentos de actina a la miosina 2b no muscular unida a la superficie de la cubierta.
    9. Lavar con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM de TDT para eliminar los filamentos de Rh-Actina no unidos a la superficie. Repita este lavado dos veces más.
    10. Flujo en 30 μL de buffer final. Para el ensayo de filamento de actina deslizante de miosina 2b no muscular, el tampón final también incluye calmodulina, CaCl2y miosina quinasa de cadena ligera para proporcionar una fosforilación completa de la miosina 2b no muscular durante las imágenes de video. La metilcelulosa al 0,7% también se puede incluir en el tampón final si los filamentos de actina solo están unidos libremente o no están unidos a la superficie. Esto se discute más a fondo en la sección Discusión.
    11. Grabe imágenes en un microscopio de fluorescencia utilizando una longitud de onda de excitación de 561 nm. Un tiempo de exposición apropiado es de 200 ms a 1,4 mW de potencia láser para una duración total de adquisición de 0,5 a3 min.
      NOTA: Asegúrese de que la tasa de adquisición se escale adecuadamente a la velocidad de los filamentos en movimiento. Una consideración importante antes de recopilar datos para su uso con programas de seguimiento es la velocidad de fotogramas de adquisición. Los movimientos de subpíxeles entre fotogramas darán como resultado una sobreestimación de la velocidad, y se requieren movimientos de varios cientos de nanómetros para obtener valores precisos. Una tasa de adquisición óptima presenta deslizamiento de actina durante al menos una distancia de píxeles entre fotogramas. En el caso del microscopio TIRF utilizado para la obtención de imágenes aquí, este umbral se traduce en 130 nm; por lo tanto, una miosina que se espera que viaje 1 μm/s debe ser fotografiada a una velocidad de 5 fotogramas/s (intervalo de 0,2 s) para lograr 200 nm de movimiento, mientras que una miosina que se espera que viaje a 10 nm/s requiere 0,05 fotogramas/s (intervalos de 20 s). Por lo tanto, los datos se pueden muestrear en esta etapa, si es necesario (consulte Discusión para obtener más detalles).

3. Ensayo TIRF de molécula única

  1. Preparación de la cubierta
    1. Divida el polvo caldo en 10 mg de alícuotas (en tubos de 1,5 ml) de metoxi-Peg-silano (mPEG) y 10 mg de alícuotas de biotina-Peg-silano (bPEG). Conservar a -20 °C en un recipiente sellado y libre de humedad y utilizarlo en un plazo de 6 meses.
    2. Cargue ocho fundas cuadradas No. 1.5H (alta precisión) de espesor de 22 mm en una rejilla y lávese con 2-5 ml de etanol a prueba de 200 seguido de 2-5 ml de agua destilada. Repita este paso de lavado, terminando con agua. Luego, seque las cubiertas completamente usando una línea de aire o N2 y limpie con plasma con argón durante 3 minutos.
    3. Coloque las fundas limpias sobre papel de filtro (90 mm) en una placa de cultivo de tejidos (100 x 20 mm) e incube en un horno de 70 °C mientras realiza los siguientes pasos.
      NOTA: La limpieza por plasma puede ser reemplazada por otros métodos de limpieza química49.
    4. Prepare una solución de etanol al 80% con dH2O y ajuste el pH a 2.0 usando HCl. Agregue 1 ml de esto a una alícuota de 10 mg de mPEG y 1 ml a una alícuota de 10 mg de bPEG. Vórtice para disolver, que no debe tomar más de 30 s.
    5. Tomar 100 μL de la solución de bPEG y añadir 900 μL de etanol al 80% (pH 2.0). Esta solución es de 1 mg/ml de bPEG. Luego, haga una solución de ambos PEG de la siguiente manera, mezclando a fondo.
      1. 200 μL de 10 mg/ml mPEG (concentración final: 2 mg/ml).
      2. 10 μL del 1 mg/ml de bPEG (concentración final: 10 μg/ml).
      3. 790 μL de la solución de etanol al 80% (pH 2.0).
    6. Saca las fundas del horno. Dispense cuidadosamente 100 μL de la solución de PEG en el centro de cada cubierta, asegurándose de que solo la superficie superior esté húmeda. Luego, coloque los resbalones de nuevo en el horno e incube durante 20 a 30 minutos.
    7. Cuando los cubrecuestas comiencen a tomar una apariencia agujereada, con pequeños círculos aparentes a través de la superficie, retírelos del horno.
    8. Lave cada funda con etanol al 100%, séquela con una línea de aire y vuelva a colocarla en el horno. Incubar solo durante el tiempo requerido para crear cámaras en el paso 2.
  2. Preparación de la cámara
    1. Limpie un portaobjetos de microscopio para usarlo en la fabricación de la cámara. Cortar dos trozos de cinta de doble cara, de aproximadamente 2 cm de longitud.
    2. Coloque una pieza a lo largo del centro del borde largo del portaobjetos del microscopio. Asegúrese de que el borde de la cinta se alinea con el borde de la diapositiva. Coloque la segunda pieza de cinta aproximadamente 2 mm por debajo de la primera pieza de cinta de modo que las dos estén paralelas y alineadas.
    3. Tome uno de los cosidos funcionalizados del horno (creado en 3.1). Pegue cuidadosamente la cubierta en la cinta de modo que el lado recubierto con PEG esté boca abajo y haga contacto directo con la cinta, como se muestra en la Figura 1. Con una punta de pipeta, presione suavemente hacia abajo en la interfaz de cinta deslizante para asegurarse de que la cubierta se haya adherido correctamente a la diapositiva.
    4. Corte el exceso de cinta que cuelga sobre la diapositiva con una cuchilla de afeitar. Estas cámaras se pueden usar inmediatamente o colocarse por pares en un tubo de 50 ml y almacenarse en un congelador de -80 ° C para su uso futuro. Es importante almacenar inmediatamente o la superficie se degradará.
  3. Realización del ensayo de microscopía TIRF de miosina 5a
    1. Prepare las soluciones para el ensayo de motilidad invertida de miosina 5a descritas en la Tabla 3 y manténgalas en hielo.
    2. Lavar la cámara con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM de TDT.
    3. Flujo en 10 μL de la BSA de 1 mg/mL en 50 mM MB con TDT de 1 mM. Repita este lavado dos veces más y espere 1 minuto después del tercer lavado. Use la esquina de un papel de seda o papel de filtro para absorber la solución a través del canal.
    4. Lavar con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM TDT. Repita este lavado dos veces más.
    5. Flujo en 10 μL de la solución NeutrAvidin en 50 mM MB con 1 mM TDT y esperar 1 min.
    6. Lavar con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM TDT. Repita este lavado dos veces más.
    7. Flujo en 10 μL de actina rodamina biotinilada (bRh-Actina) que contiene 1 mM TDT en 50 mM MB y esperar 1 min. Para este paso, use una punta de pipeta de gran perforación y evite pipetear hacia arriba y hacia abajo para minimizar el cizallamiento de los filamentos de actina fluorescentes para garantizar que los filamentos de actina largos se puedan unir a la superficie (20-30 μm o más). Una alternativa efectiva es cortar el cono de una punta de pipeta estándar (con una abertura de ≈1-1.5 mm).
    8. Lavar con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM TDT. Repita este lavado dos veces más.
    9. Flujo en 30 μL de Tampón Final con 10 nM de miosina 5a agregada, luego cargar inmediatamente en el microscopio TIRF y registrar después de encontrar el enfoque óptimo para la modalidad de imágenes TIRF. Los tiempos de exposición entre 100-200 ms son apropiados a una potencia láser de 1,4 mW para la actina y la miosina etiquetada con GFP. Un tiempo de adquisición apropiado para el análisis de velocidad es de 3 min.
  4. Realización del ensayo de microscopía TIRF de miosina 2b no muscular
    NOTA: En esta sección, se proporcionan los detalles del ensayo TIRF de miosina 2b no muscular que utiliza filamentos polimerizados y fosforilados. Se incluye un protocolo detallado (secciones 4.1-4.3) para fosforilación y polimerización de la miosina-2b no muscular en un tubo.
    1. Para fosforilar el NM2b purificado, haga una mezcla de quinasa 10x con las siguientes condiciones: 2 mM CaCl2, 1 μM CaM, 1-10 nM MLCK y 0.1 mM ATP. Esto se puede llevar al volumen con 500 mM MB con 10 mM TDT. Agregue la mezcla de quinasa 10x a la miosina en una proporción volumétrica de 1:10 y deje que esto se incube durante 20-30 minutos a temperatura ambiente. Típicamente, la concentración de miosina para este paso es de 1 μM.
    2. Para polimerizar la miosina fosforilada en filamentos, reduzca la concentración de sal del NM2b a 150 mM NaCl. Para hacerlo, haga un tampón de motilidad 1x (1x MB) sin sal diluyendo el 4x MB cuatro veces en dH2O. Este 1x MB se puede utilizar para reducir la concentración de sal porque el NM2b se congeló en un tampón de sal de 500 mM.
    3. Por cada 3 μL de stock NM2b, agregue 7 μL de 1x MB para reducir la concentración de sal a 150 mM NaCl e incube en hielo durante 20-30 min para formar filamentos NM2b.
      NOTA: El orden en las secciones 4.1-4.3 no es crucial siempre que el NM2b esté fosforilado y la concentración final de sal sea de 150 mM. La incubación del orden de 30 min-1 h permite un tiempo suficiente para la fosforilación completa y la polimerización.
    4. Preparar las soluciones para el ensayo de motilidad invertida de miosina 2b no muscular descritas en la Tabla 3 y mantenerlas en hielo.
    5. Lavar la cámara con 10 μL de 150 mM MB con 1 mM TDT.
    6. Flujo en 10 μL de la BSA de 1 mg/mL en 150 mM MB con TDT de 1 mM Repita este lavado dos veces más y espere 1 min después del tercer lavado. Use la esquina de un papel de seda o papel de filtro para absorber la solución a través del canal.
    7. Lavar con 10 μL de 150 mM MB con 1 mM TDT. Repita este lavado dos veces más.
    8. Flujo en 10 μL de la solución NeutrAvidin en 150 mM MB con 1 mM TDT y esperar 1 min.
    9. Lavar con 10 μL de 150 mM MB con 1 mM TDT. Repita este lavado dos veces más.
    10. Flujo en 10 μL de bRh-Actina y esperar 1 min. Para este paso, use una punta de pipeta de gran perforación y evite pipetear hacia arriba y hacia abajo para minimizar el cizallamiento de los filamentos de actina fluorescentes, para asegurarse de que se puedan unir filamentos de actina largos a la superficie (20-30 μm o más). Una alternativa efectiva es cortar el cono de una punta de pipeta estándar.
    11. Lavar con 10 μL de 150 mM MB con 1 mM TDT. Repita este lavado dos veces más.
    12. Flujo en 10 μL de la solución no muscular de miosina 2b (aproximadamente 30 nM) y esperar 1 min.
    13. Lavar con 10 μL de 150 MB con 1 mM TDT. Repita este lavado dos veces más.
    14. Flujo en 30 μL de búfer final, luego cargue inmediatamente en el microscopio TIRF y registre después de encontrar el enfoque óptimo para la modalidad de imagen TIRF. Los tiempos de exposición entre 100-200 ms son apropiados a una potencia láser de 1,4 mW para la actina y la miosina etiquetada con GFP. Un tiempo de adquisición apropiado para el análisis de velocidad es de 3 min.

4. Análisis de imágenes

  1. Análisis de imágenes para el ensayo de filamento de actina deslizante
    NOTA: Las imágenes se pueden analizar utilizando el software y los manuales vinculados en la Lista de Materiales. Es importante tener en cuenta que el programa descrito aquí requiere pilas TIFF para el análisis. El proceso para analizar el ensayo de filamento de actina deslizante es el siguiente50.
    1. Cargue pilas de películas sin procesar en una estructura de carpetas especificada e ingrese el directorio superior de las carpetas de películas en el programa.
      NOTA: El programa analiza los archivos a través de este directorio y subdirectorios, tratando los directorios de nivel más bajo como réplicas. Se producirán estadísticas promedio para cada grupo de réplicas. En este caso, se utilizó una sola película para cada miosina. Al caracterizar una nueva miosina o investigar una nueva condición experimental, se recomienda analizar películas de tres campos de visión (FOV) por cámara para un total de tres cámaras y repetir este flujo de trabajo para tres preparaciones de la miosina que se está investigando.
    2. Utilice el script "stack2tifs" junto con la velocidad de fotogramas ingresada por el usuario para convertir cada pila TIFF en una carpeta que contenga una serie de archivos TIFF individuales y un archivo de metadatos.txt correspondiente que contenga la hora de inicio de cada fotograma. Para los datos que no están en el formato de pila TIFF, primero se debe aplicar una conversión utilizando software como los enumerados en la Tabla de materiales.
      NOTA: Este script es la parte del paquete de software. La información del script se puede encontrar aquí: "https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
    3. Utilice el parámetro -px, que es el tamaño de píxel (en nm) durante la adquisición. En este caso, el tamaño de píxel es de 130 nm. Utilice los parámetros -xmax y -ymax para escalar los ejes de las salidas del gráfico de dispersión. Estos corresponden a la longitud de filamento trazado más largo y la velocidad máxima trazada (en nm/s).
      NOTA: Estos son valores estimados y se pueden establecer en valores superiores a los esperados para garantizar que los datos estén contenidos en la gráfica. Después del análisis, los datos sin procesar también se pueden exportar para su uso en otro software estadístico o gráfico para su visualización y análisis.
    4. Utilice el parámetro -minv, que es un parámetro de corte de velocidad mínima, para definir los filamentos que no se mueven y, por lo tanto, pueden excluirse del análisis. Para una miosina lenta como NM2b, este parámetro debe ser bajo (en este ejemplo, 5 nm / s) para evitar cortar los verdaderos movimientos de deslizamiento. Para una miosina rápida como M5a, este parámetro puede ser mayor (en este ejemplo, 100 nm / s) para aplicar un filtro más estricto, al tiempo que conserva la verdadera distribución de velocidad de deslizamiento.
    5. Utilice el parámetro de corte -pt para identificar el movimiento suave. Para cada ventana de muestreo, se calcula un valor equivalente a 100 x Velocidad Desviación estándar/Velocidad media. Las pistas con valores más altos que el punto de corte, tienen velocidades más variables y se excluyen de un análisis posterior. En este ejemplo, se utilizó un valor de corte de 33. Las pistas con valores más altos tienen velocidades más variables y se excluyen de un análisis posterior.
    6. Utilice -maxd para establecer una distancia de enlace máxima permitida entre fotogramas. Esta es una distancia calculada de fotograma a fotograma movida por el centroide del filamento en unidades de nm. Puede ser útil para excluir movimientos esporádicos o enlaces incorrectos entre filamentos. En los ejemplos siguientes, el parámetro se dejó en el valor predeterminado de 2.000 nm.
  2. Análisis de imágenes para el ensayo de microscopía TIRF
    NOTA: El proceso para analizar el ensayo TIRF de molécula única en el software de imágenes específicamente enumerado en el Tabla de Materiales es el siguiente29.
    1. Haga clic y arrastre el video de microscopía grabado al espacio de trabajo del software para abrirlo51. Luego, divida los canales de adquisición. Haga clic en Imagen > Color > Dividir canales.
      NOTA: En caso de deriva de etapa apreciable durante la adquisición, las imágenes deben estabilizarse para corregir la deriva instrumental en el plano de imagen. En este caso, no se utilizó ninguna compensación por la deriva del eje Z, ya que el microscopio utilizado para obtener estos datos estabiliza bien el enfoque Z. Para estabilizar la imagen en el programa de análisis de imágenes, instale el complemento estabilizador adecuado que esté vinculado en la Lista de materiales. El estabilizador de imagen asume posiciones fijas para los objetos de la imagen y utiliza como referencia un promedio móvil de los fotogramas anteriores. Por lo tanto, el procedimiento recomendado es comenzar con el canal que contiene imágenes de actina etiquetada, ya que esta se encuentra en una posición fija.
    2. Haga clic en Plugins, luego busque Estabilizador de imagen; asegúrese de que traducción está seleccionada y mantenga la configuración predeterminada. Marque la casilla situada junto a Coeficientes de transformación de registro. La aplicación de este paso de registro permite que los parámetros de desplazamiento calculados se apliquen al otro canal en el siguiente paso. Permita que se complete el proceso.
    3. Luego, abra el canal con miosina etiquetada y aplique la estabilización haciendo clic en Complementos > Image Stabilizer Log Applier. Si las imágenes de actina no se pueden adquirir durante la misma adquisición debido a un requisito de imágenes de mayor velocidad en un solo canal, la deriva estabiliza la pila de imágenes seleccionando una región que contiene objetos estáticos como un marcador fiduciario biotinilado o fluoróforos unidos no específicamente a la superficie de biotina-PEG. Esta región se puede recortar de la pila original y estabilizar, seguida de la aplicación de los valores de desplazamiento resultantes a la pila original.
      NOTA: En la práctica, la deriva observada en los experimentos de motilidad será insignificante en relación con el movimiento de las miosinas que se mueven a varios cientos de nm / s, pero para las miosinas más lentas esto se convierte en una consideración importante.
    4. Luego, abra TrackMate, haga clic en Plugins; luego, en su menú desplegable haga clic en Seguimiento y finalmente en TrackMate. En este punto, el análisis de imágenes está sujeto a una optimización basada en los parámetros del fluoróforo y las condiciones del ensayo. Sin embargo, los parámetros de partida ideales son los siguientes.
      1. Ajustes de calibración: mantenga todos los valores predeterminados.
      2. Detector: Detector LoG.
      3. Diámetro estimado de la mancha: 0.5-1.0 micras.
      4. Umbral: 25-200. (Esto se puede determinar haciendo clic en Vista previa después de elegir un número para ver si los puntos detectados coinciden con la película y ajustarlos adecuadamente).
      5. Umbral inicial: no establecido.
      6. Vista: HyperStack Displayer.
      7. Establecer filtros en puntos: no establecido.
      8. Rastreador: Rastreador LAP simple.
        NOTA: Estos dependen de la velocidad de fotogramas y la velocidad de miosina y deben ser lo suficientemente grandes como para conectar posiciones posteriores, excluyendo las conexiones no deseadas entre diferentes partículas.
      9. Distancia máxima de enlace: 1,0 micras.
      10. Distancia máxima de cierre de huecos: 1,0 micras.
      11. Brecha máxima del marco de cierre de brecha: 1.
      12. Establecer filtros en las pistas: Desplazamiento de pista (>0.39 para incluir solo los puntos que se mueven más de 3 píxeles), Puntos en las pistas (>3 para incluir solo pistas con al menos 3 puntos). Se pueden introducir otros filtros como velocidad mínima para excluir puntos que se detienen durante largos períodos. Los resultados del filtrado deben verificarse mediante una inspección visual de las pistas para garantizar que las pistas espurias (es decir, el movimiento de la miosina en el fondo que no está a lo largo de una pista de actina) se eliminen mientras se conservan las pistas asociadas con la actina.
    5. Una vez que aparece la pantalla Opciones de visualización, haga clic en Análisis para obtener los resultados relevantes. Guarde las tres tablas producidas (Estadísticas de seguimiento, Enlaces en Estadísticas de seguimiento y Puntos en Estadísticas de seguimiento). La tabla Estadísticas de seguimiento contendrá los datos de velocidad y desplazamiento que luego se pueden analizar para caracterizar una nueva proteína o los efectos de una determinada condición experimental, por ejemplo.

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Representative Results

La purificación de la miosina se puede evaluar mediante la realización de una electroforesis en gel reductora de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) como se muestra en la Figura 2. Si bien esta cifra representa la miosina final post-dializada, SDS-PAGE se puede realizar en alícuotas de las diversas etapas del procedimiento de purificación para identificar cualquier producto perdido por el sobrenadante. Myosin 5a HMM tiene una banda en el rango de 120-130 kDa y la miosina no muscular de longitud completa 2b tiene una banda en el rango de 200-230 kDa, correspondiente a las cadenas pesadas29,44. La miosina 5a también tiene una banda cerca de la marca de 17 kDa, marcando la calmodulina. La miosina no muscular 2b tiene una banda de aproximadamente 17 kDa, denotando el ELC. Debido a que un RLC marcado con GFP está presente en esta preparación NM2b, el RLC aparece a aproximadamente 47 kDa; sin embargo, un RLC sin etiquetar estará presente a aproximadamente 20 kDa si no está etiquetado con un GFP.

El ensayo de filamento de actina deslizante que se muestra en el Video 1 y la Figura 3 representa las características de una película ideal y rastreable. Este ensayo de filamento de actina deslizante presenta el movimiento suave de los filamentos de actina etiquetados. El lavado de actina negra asegura que las cabezas de miosina muertas se eliminen del campo de medición, lo que contribuye aún más al movimiento suave general de los filamentos de actina. Los filamentos etiquetados fluorescentemente son lo suficientemente cortos como para que un solo filamento no se cruce sobre sí mismo, lo que es más óptimo para el programa de seguimiento. Los filamentos de actina que son demasiado largos se cruzarán con otros filamentos, lo que puede presentar dificultades para el programa de seguimiento del ensayo de filamento de actina deslizante. Este problema se puede evitar pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10-20 veces para cizallamiento los filamentos de actina antes de cargarlos en el cubrecubriós.

En el caso de NM2b, el uso de metilcelulosa puede mejorar significativamente la calidad de las películas grabadas, ya que reduce la difusión de la actina lejos de la superficie de la imagen. Esto no es necesario para M5a porque su mayor relación de trabajo permite una unión más fuerte de la actina a la superficie recubierta de miosina. Si se utiliza metilcelulosa, es necesario absorber la solución a través de la cámara para garantizar que la solución fluya. Como se muestra en el video 2,cuando todas las demás condiciones son idénticas, excepto por la exclusión de la metilcelulosa, los filamentos de actina no permanecen tan estrechamente asociados con la superficie recubierta de miosina.

Por el contrario, el objetivo del ensayo de motilidad invertida que se muestra en el Video 3 y la Figura 4 es introducir filamentos de actina fluorescentes atados a la superficie sobre los cuales se pueda observar el movimiento de la miosina. Un requisito importante del ensayo invertido es garantizar que el movimiento de la miosina se observe de manera consistente en todo el CAMPO de visión, como se muestra. El uso de una mezcla de TDT, glucosa, catalasa y glucosa oxidasa puede minimizar el fotobleaching para permitir mediciones más largas52. Además, si la tasa de adquisición para el ensayo es baja, apagar la luz de iluminación entre los fotogramas de adquisición puede ayudar con el fotobleaching excesivo. El encofrado de la luz de excitación se puede hacer a través de un obturador mecánico o un filtro sintonizable acusto-óptico (AOTF).

Figure 1
Figura 1: Preparación de cámaras de células de flujo funcionalizadas. (A) Comience con un portaobjetos de microscopio limpio, dos piezas de cinta de doble cara cortadas a aproximadamente 2 cm y un codamiento funcionalizado. (B) Agregue la cinta al centro del portaobjetos del microscopio. (C) Fije la cubierta a la cinta con el recubrimiento (es decir, nitrocelulosa) hacia abajo y presione suavemente las regiones superpuestas con la cinta utilizando una punta de pipeta de plástico para asegurarse de que la cubierta se haya adherido a la cámara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS de NM2b y M5a-HMM expresados. (A) Una imagen representativa del gel SDS PAGE para una cadena pesada NM2b de longitud completa (≈230 kDa) y GFP-RLC (≈47 kDa) y ELC (≈17 kDa). Imagen de gel reproducida y modificada de Melli et al. (2018)29. (B) Una imagen representativa del gel SDS PAGE para una cadena pesada similar a M5a-HMM (≈120 kDa) y calmodulina (≈17 kDa). Tenga en cuenta que el gel de esta imagen no tiene una GFP insertada en el extremo del terminal C. Una GFP insertada en la cadena pesada de miosina aumenta el peso molecular en ≈27 kDa. La imagen del gel reproducida y modificada fue publicada originalmente en el Journal of Biological Chemistry44. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Resultados del ensayo de filamento de actina deslizante adquiridos a través de la iluminación TIRF. (A) Fotograma de ejemplo de una película que muestra la translocación de filamentos de actina etiquetados con rodamina-falotina (en rojo) en 0,2 μM NM2b en presencia de metilcelulosa al 0,7% a 30 °C. Barra de escala = 10 μm. (B) Salida de imagen de seguimiento de filamentos del programa FASTrack para NM2b para el mismo FOV como se muestra en (A) Barra de escala = 10 μm. (C) Histograma representativo de la velocidad de deslizamiento acto-NM2b, que muestra que esta muestra de NM2b puede generar una velocidad de deslizamiento de actina de 77 ± 15 nm / s (media ± desviación estándar; número de pistas = 550). (D) Fotograma de ejemplo de una película que muestra la translocación de filamentos de actina etiquetados con rodamina-falotina (en rojo) en 75 nM M5a-HMM. Barra de escala = 10 μm. (E) Salida de imagen de seguimiento de filamentos por el programa FASTrack para M5a-HMM para el mismo FOV como se muestra en (D) Barra de escala = 10 μm. (F) Un histograma representativo de la velocidad de deslizamiento acto-M5a-HMM, que muestra que esta muestra de M5a puede generar una velocidad de deslizamiento de actina de 515 ± 165 nm / s (media ± desviación estándar; número de pistas = 25098). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Resultados del ensayo invertido adquiridos a través de la iluminación TIRF. (A) Un FOV representativo de una pila de imágenes combinadas de dos canales que muestra el movimiento de los filamentos NM2b (mostrados en verde) en filamentos de actina biotinilados etiquetados con AF647-faloidina (mostrados en azul) a 30 °C. Los filamentos polimerizados de NM2b recombinantemente expresados y purificados co-expresados con ELC y GFP-RLC se observan como las partículas verdes y alargadas en el FOV. Barra de escala = 10 μm. (B) Histograma representativo de la velocidad de los filamentos NM2b. El análisis se realizó utilizando el software de análisis de imágenes descrito en la Tabla de Materiales. Los filamentos NM2b individuales tienen una velocidad de 84 ± 22 nm/s (media ± desviación estándar; número de partículas rastreadas = 133), cuando se mueven a lo largo de filamentos de actina individuales. (C) Ejemplo de kymograph del movimiento del filamento NM2b a lo largo de un solo filamento de actina. Tenga en cuenta que algunas de las regiones de la partícula muestran una "rotación" del filamento NM2b, a lo largo del filamento de actina, que muy probablemente representa el momento en que un lado del filamento bipolar NM2b se separa del filamento de actina, como se mostró anteriormente en Melli et al.29. (D) Un FOV representativo del movimiento de molécula única M5a-HMM (mostrado en verde) en filamentos de actina biotinilados etiquetados con rodamina-faloidina (mostrado en rojo). Barra de escala = 10 μm. (E) Histograma representativo de la longitud de ejecución de M5a-HMM, ajustado a un solo exponencial. El análisis se realizó utilizando el software de análisis de imágenes descrito en la Lista de Materiales. La longitud de ejecución característica es de 1,3 μm con un intervalo de confianza del 95% de 1,23-1,42 μm en este ejemplo. (F) Histograma representativo de la velocidad M5a-HMM de una sola molécula en filamentos de actina simple. La salida de datos analizados del análisis de imágenes muestra una velocidad media de 668 ± 258 nm / s (media ± desviación estándar; número de partículas rastreadas = 684). (G) Ejemplo de kymograph de moléculas individuales de movimiento M5a-HMM a lo largo de un solo filamento de actina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: Comparación del ensayo de filamento de actina deslizante NM2b y M5a-HMM. El ensayo de filamento de actina deslizante NM2b se realizó en presencia de metilcelulosa (izquierda; panel de video A) y M5a-HMM en ausencia de metilcelulosa (derecha; panel de video B) a 30 ° C. Tenga en cuenta que la marca de tiempo avanza más rápido en el panel de video NM2b, en comparación con el panel de video M5a-HMM para mostrar el movimiento de los filamentos de actina marcados con rodamina (rojo) que es aproximadamente el mismo. Esto se debe a que la velocidad real de translocación de actina de NM2b es casi 7 veces más lenta que la de M5a-HMM (77 nm / s, frente a 515 nm / s, respectivamente, extraída del pico gaussiano ajustado al histograma en la Figura 3). Barra de escala = 10 μm en ambos paneles de vídeo. Datos NM2b adquiridos a 0,33 fotogramas por segundo con una exposición de 200 ms. Datos M5a-HMM adquiridos a 5 fotogramas por segundo con una exposición de 200 ms (continua) y posteriormente muestreados a 1 fotograma por segundo. Las marcas de tiempo se agregaron utilizando el complemento descrito en la Lista de materiales. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 2: Ensayo de filamento de actina deslizante de NM2b en ausencia de metilcelulosa. Cuando todas las demás condiciones son las mismas, excepto por la ausencia de metilcelulosa, los filamentos de actina a veces no se adhieren bien a la cubierta recubierta con 0.2 μM NM2b, lo que lleva a películas de menor calidad con filamentos de actina "flopping" cerca de la superficie de la cubierta recubierta NM2b. Barra de escala = 10 μm. Esto se puede resolver introduciendo metilcelulosa para mostrar el movimiento suave de los filamentos de actina, como se muestra en el panel de video izquierdo del Video 1 (ensayo de filamento de actina deslizante NM2b). Otra alternativa es aumentar la concentración de NM2b a ≈1 μM. Esta película fue adquirida a 0,33 fotogramas por segundo con una exposición de 200 ms. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 3: Comparación del ensayo de motilidad invertida NM2b y M5a-HMM. El ensayo de motilidad invertida NM2b se realizó en presencia de metilcelulosa y se registró a una velocidad de 0,33 fotogramas por segundo con el uso de un obturador (izquierda; panel de video A), el panel de video C muestra el mismo FOV que A, pero con partículas se identifican y rastrean utilizando un software de análisis de imágenes. Del mismo modo, el ensayo de motilidad invertida para M5a-HMM en ausencia de metilcelulosa se registró a una velocidad de 5 cuadros por segundo (derecha; panel de video B). El panel de video D muestra el mismo FOV que B, pero con partículas identificadas y rastreadas utilizando un software de análisis de imágenes. Barras de escala = 10 μm en todos los paneles de vídeo. Los dos láseres se alternaron de un lado a otro con el uso de una sola cámara para su adquisición. Haga clic aquí para descargar este video.

Nombre del búfer Composición Paso(s) utilizado(s) Comentarios
Búfer de extracción M5a 0,3 M naCl 1.1 Manténgase en hielo.
MOPS de 15 mM, pH 7.2
15 mM MgCl2
EGTA de 1,5 mM
4,5 mM NaN3
Búfer de extracción NM2b 0,5 M naCl 1.1 Manténgase en hielo.
MOPS de 15 mM, pH 7.2
15 mM MgCl2
EGTA de 1,5 mM
4,5 mM NaN3
Búfer A 0,5 M naCl 2.2 Manténgase en hielo.
MOPS de 10 mM, pH 7.2
EGTA de 0,1 mM
3 mM NaN3
1 mM ATP
1 mM TDT
5 mM MgCl2
Búfer 0,5 M naCl 2.3 Manténgase en hielo.
MOPS de 10 mM, pH 7.2
EGTA de 0,1 mM
3 mM NaN3
1 mM TDT
Búfer de elución 0,5 M naCl 3.1 Manténgase en hielo.
0,5 mg/ml de péptido FLAG
MOPS de 10 mM, pH 7.2
EGTA de 0,1 mM
3 mM NaN3
pH 7.2
M5a Tampón de diálisis 500 mM KCl 4.1 Utilice dH2O frío para llevar al volumen.
10 mM MgCl2
MOPS de 10 mM, pH 7.2
EGTA de 0,1 mM
1 mM TDT
Tampón de diálisis NM2b 25 mM NaCl 4.1 Utilice dH2O frío para llevar al volumen.
10 mM MgCl2
MOPS de 10 mM, pH 7.2
EGTA de 0,1 mM
1 mM TDT
Búfer de almacenamiento NM2b 0,5 M naCl 5.1 Manténgase en hielo.
MOPS de 10 mM, pH 7.2
EGTA de 0,1 mM
3 mM NaN3

Tabla 1: Tampones utilizados en la purificación de proteínas.

Nombre del búfer Composición (M5a) Composición (NM2b) Paso(s) utilizado(s) (M5a/NM2b) Comentarios
Búfer de motilidad 4X (4X MB) 80 mM MOPS, pH 7.2 80 mM MOPS, pH 7.2 Filtro de vacío y almacenamiento a 4°C
20 mM MgCl2 20 mM MgCl2
EGTA de 0,4 mM EGTA de 0,4 mM
pH 7.4 pH 7.4
Búfer de motilidad de sal de 50 mM (50 mM MB) 25% v/v 4X MB 25% v/v 4X MB Filtro de vacío y almacenamiento a 4°C
50 mM KCl NaCl de 50 mM
Elevar al volumen con dH2O Elevar al volumen con dH2O
Búfer de motilidad de sal de 500 mM (500 mM MB) N/A 25% v/v 4X MB Filtro de vacío y almacenamiento a 4°C
NaCl de 500 mM
Elevar al volumen con dH2O
Miosina 0.05-0.1 μM de miosina 0,2 μM de miosina 4.2/5.2 Manténgase en hielo.
1 mM TDT 1 mM TDT
Diluir en 50 mM MB Diluir en 500 mM MB
1 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) 1 mg/ml de BSA 1 mg/ml de BSA 4.3/5.3 Manténgase en hielo.
Diluir en 50 mM MB Diluir en 500 mM MB
1 mM TDT 1 mM TDT
5 μM F-actina sin etiquetar en 50 mM MB (actina negra) 5 μM de F-actina sin etiquetar 5 μM de F-actina sin etiquetar 4.5/5.5 Manténgase en hielo. Corte la actina mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 5-10 veces, o mediante el uso de una jeringa.
1 μM de calmodulina (CaM) 1 mM ATP
1 mM ATP 0,2 mM CaCl2
Diluir en 50 mM MB 1 μM CaM
1–10 nM miosina quinasa de cadena ligera (MLCK)
Diluir en 50 mM MB
MB con 1 mM TDT y 1 mM ATP 1 mM TDT 1 mM TDT 4.6/5.6 Manténgase en hielo.
1 mM ATP 1 mM ATP
Diluir en 50 mM MB Diluir en 50 mM MB
MB con TDT 1 mM TDT 1 mM TDT 4.4, 4.7, 4.9/5.4, 5.7, 5.9 Manténgase en hielo.
Diluir en 50 mM MB Diluir en 50 mM MB
20 nM Rodamina-Falotina F-actina (Rh-Actina) 20 nM Rodamina-faloína F-actina 20 nM Rodamina-faloína F-actina 4.8/5.8 Manténgase en hielo. No vórtice.
1 mM TDT 1 mM TDT
Diluir en 50 mM MB Diluir en 50 mM MB
Búfer final 50 mM KCl 0,7% metilcelulosa (opcional) 4.10/5.10 Agregue la glucosa, la glucosa oxidasa y la catalasa inmediatamente antes de realizar el experimento. Manténgase en hielo.
MOPS de 20 mM, pH 7.2 NaCl de 50 mM
5 mM MgCl2 MOPS de 20 mM, pH 7.2
EGTA de 0,1 mM 5 mM MgCl2
1 mM ATP EGTA de 0,1 mM
TDT de 50 mM 1 mM ATP
1 μM de calmodulina TDT de 50 mM
2,5 mg/ml de glucosa 1–10 nM MLCK
100 μg/ml de glucosa oxidasa 0,2 mM CaCl2
40 μg/ml de catalasa 1 μM de calmodulina
2,5 mg/ml de glucosa
100 μg/ml de glucosa oxidasa
40 μg/ml de catalasa

Tabla 2: Tampones utilizados en el ensayo de deslizamiento.

Nombre del búfer Composición (M5a) Composición (NM2b) Paso(s) utilizado(s) (M5a/NM2b) Comentarios
Búfer de motilidad 4X (4X MB) 80 mM MOPS, pH 7.2 80 mM MOPS, pH 7.2 Filtro de vacío y almacenamiento a 4°C
20 mM MgCl2 20 mM MgCl2
EGTA de 0,4 mM EGTA de 0,4 mM
pH 7.4 pH 7.4
Búfer de motilidad de sal de 50 mM (50 mM MB) 25% v/v 4X MB 25% v/v 4X MB Filtro de vacío y almacenamiento a 4°C
50 mM KCl NaCl de 50 mM
Elevar al volumen con dH2O Elevar al volumen con dH2O
Búfer de motilidad de sal de 150 mM (150 mM MB) 25% v/v 4X MB Filtro de vacío y almacenamiento a 4°C
NaCl de 150 mM
Elevar al volumen con dH2O
Miosina 30 nM de miosina Ver receta de "búfer final"/4.12 Manténgase en hielo.
1 mM TDT
Diluir en 150 mM MB
2 mg/ml de NeutrAvidin 2 mg/ml de NeutrAvidin 2 mg/ml de NeutrAvidin 3.5/4.8 Manténgase en hielo.
1 mM TDT 1 mM TDT
Diluir en 50 mM MB Diluir en 150 mM MB
1 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) 1 mg/ml de BSA 1 mg/ml de BSA 3.3/4.6 Manténgase en hielo.
1 mM TDT 1 mM TDT
Diluir en 50 mM MB Diluir en 150 mM MB
200 nM rodamina-faloidina F-actina biotinilada (bRh-Actina) 200 nM de rodamina-faloína F biotinilado F-actina 200 nM de rodamina-faloína F biotinilado F-actina 3.7/4.10 Evite el cizallamiento al no vórtice o pipetear hacia arriba y hacia abajo. Para mezclar, invierta suavemente.
1 mM TDT 1 mM TDT
Diluir en 50 mM MB Diluir en 150 mM MB
MB con TDT TDT de 50 mM TDT de 50 mM 3.2, 3.4, 3.6, 3.8/4.5, 4.7, 4.9, 4.11, 4.13 Manténgase en hielo.
Diluir en 50 mM MB Diluir en 150 mM MB
Búfer final 50 mM KCl 0,7% metilcelulosa (opcional) 3.9/4.14 Agregue la glucosa, la glucosa oxidasa y la catalasa inmediatamente antes de realizar el experimento. Manténgase en hielo.
MOPS de 20 mM, pH 7.2 NaCl de 50 mM
5 mM MgCl2 MOPS de 20 mM, pH 7.2
EGTA de 0,1 mM 5 mM MgCl2
1 mM ATP EGTA de 0,1 mM
TDT de 50 mM 1 mM ATP
1 μM de calmodulina TDT de 50 mM
2,5 mg/ml de glucosa 1–10 nM MLCK
100 μg/ml de glucosa oxidasa 0,2 mM CaCl2
40 μg/ml de catalasa 1 μM de calmodulina
10 nM de miosina 2,5 mg/ml de glucosa
100 μg/ml de glucosa oxidasa
40 μg/ml de catalasa

Tabla 3: Tampones utilizados en el ensayo TIRF.

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Discussion

Aquí se presenta un flujo de trabajo para la purificación y caracterización in vitro de la miosina 5a y la miosina no muscular 2b. Este conjunto de experimentos es útil para cuantificar las propiedades mecanoquímicas de las construcciones de miosina purificada de una manera rápida y reproducible. Aunque las dos miosinas que se muestran aquí son solo dos ejemplos específicos de las muchas posibilidades, las condiciones y técnicas se pueden aplicar, con cierta sastrería, a la mayoría de las miosinas y a muchas otras proteínas motoras.

Los protocolos discutidos aquí están sujetos a variaciones dependiendo de las necesidades individuales del laboratorio y los experimentos. Por ejemplo, como se discutió en la sección Expresión y Biología Molecular, las proteínas utilizadas en este artículo se generaron a partir de una coinfección de dos o más virus; sin embargo, la expresión exitosa de proteínas también se puede lograr con vectores de múltiples expresiones como el vector de doble expresión p-FastBac o el sistema de expresión BiGBac53.

Varios factores pueden obstaculizar la producción exitosa de la proteína recombinante. Para evitar la degradación de proteínas, es imperativo que cada paso de la purificación de proteínas se complete a la temperatura adecuada, con todos los pasos de centrifugación que ocurran a 4 ° C y todos los demás pasos se realicen en hielo. El exceso de bandas puede ser evidente en el gel del producto proteico dializada. Esto podría ser indicativo de degradación o contaminación. La purificación posterior mediante exclusión de tamaño o cromatografía de intercambio iónico puede mejorar la pureza de las muestras54. A tal efecto, se recomienda guardar alícuotas en cada paso del proceso de purificación de proteínas para la solución de problemas, en caso de que haya un bajo rendimiento de miosina o sospecha de contaminación por proteínas. A veces, puede haber una unión inadecuada del lisato a la resina en el paso 1.8, lo que puede resultar en la pérdida de la miosina al sobrenadante en centrifugaciones posteriores. Esto se puede resolver variando la duración de la unión de la resina durante este paso, incluso dejándola unirse durante la noche, si es necesario. Los tiempos de incubación más largos introducen un mayor riesgo de degradación de proteínas si las proteasas contaminantes no se inhiben lo suficiente, y las miosinas con regiones proteolíticamente sensibles se verán afectadas negativamente. Además, el lavado inadecuado de la resina tanto antes como después del uso puede resultar en la elución de un producto proteico no deseado, por lo que es imperativo que se sigan los protocolos adecuados antes y después de usar la resina de afinidad FLAG. Si la resina se lava inmediatamente después de su uso y se almacena adecuadamente, se puede reutilizar hasta 20 veces.

Es importante tener en cuenta que la degradación de proteínas también ocurre durante la etapa de expresión y acortar los tiempos de expresión puede ser ventajoso en términos de degradación, aunque esto puede ser a expensas del rendimiento total. Seguir los procedimientos descritos aquí para monitorear la muestra de proteína en diferentes etapas del protocolo (es decir, antes, durante y después de la purificación) ayudará a determinar las etapas necesarias para la optimización. Para las miosinas que se resisten repetidamente a la expresión y purificación exitosas, los problemas comunes pueden ser la coexpresión con cadenas ligeras insuficientes o inapropiadas, así como el plegamiento inadecuado durante la sobreexpresión. Las cadenas ligeras apropiadas deben seleccionarse en función de las interacciones conocidas cuando sea posible y las proporciones de baculovirus de cadena pesada a cadena ligera deben probarse en experimentos a pequeña escala para determinar el óptimo. Para las miosinas que se agregan o producen poco o ningún producto activo soluble, la coexpresión con chaperonas puede ayudar a obtener con éxito la proteína activa54,55.

Los productos de miosina purificada inevitablemente contienen una pequeña población de miosina dañada, conocida como "cabezas muertas", que se pueden abordar de dos maneras. Un método, descrito en este protocolo, implica el flujo de actina sin etiquetar, o "negra", a través de la cámara en el ensayo de filamento de actina deslizante. Posteriormente, el lavado con ATP hace que las miosinas funcionales se disocian de la actina negra, mientras que las cabezas muertas permanecerán unidas a esta actina no etiquetada debido a su incapacidad para hidrolizar atp y debido a su alta afinidad. Mientras se realiza el lavado de actina negra, se puede usar una jeringa para esquilar la actina de manera efectiva. El cizallamiento adicional se puede lograr mediante vórtice, siempre que las burbujas resultantes se eliminen por centrifugación. Un método alternativo es gletizar selectivamente las cabezas muertas de la muestra de miosina mezclando miosina con F-actina y Mg-ATP a altas concentraciones de sal (0,5 M) y sedimentando en una ultracentrífuga de mesa. Las miosinas capaces de hidrolizar ATP en estas condiciones no permanecen unidas a la actina debido a su baja afinidad por la actina en estas condiciones de alta sal y se encuentran en el sobrenadante, mientras que las cabezas muertas de miosina permanecen unidas a la actina en el pellet56. Del mismo modo, una sedimentación con actina y la resuspensión del pellet también se puede utilizar para eliminar las miosinas que son incapaces de unirse a la actina en ausencia de ATP. Tenga en cuenta que una pequeña proporción de este tipo de cabezas muertas tendrá un impacto menor en este tipo de ensayos. Al realizar una sedimentación y resuspensión libres de nucleótidos seguida de una centrifugación y resuspensión unidas a ATP, se pueden aislar las miosinas que son competentes tanto para la unión a actina como para la liberación dependiente de ATP de la actina.

Los ensayos de motilidad también se pueden modificar de varias maneras. Por ejemplo, en el ensayo de filamento de actina deslizante para el NM2b, el NM2b se fosforila en la cámara mediante la adición de MLCK, calmodulina, calcio y ATP en el paso de actina negra, así como en el tampón final. Sin embargo, el NM2b también se puede fosforilar en un tubo, antes de realizar el ensayo. Al hacerlo, el porcentaje de NM2b fosforilado se puede cuantificar ejecutando un gel nativo con un tampón de muestra que contenga urea o realizando espectrometría de masas57,58. El efecto de la temperatura sobre la actividad de la miosina también puede ser investigado. Esto se puede lograr empleando un sistema de calentamiento objetivo en el microscopio o en un recinto ambiental, de modo que la celda de flujo se mantenga a temperatura constante. La fuerza iónica es otra consideración importante. Para muchas miosinas, la afinidad con la actina y la actividad enzimática aumentarán a una fuerza iónica más baja; para otros, se necesita una mayor fuerza iónica59. Además de proporcionar información valiosa sobre el mecanismo de la miosina, reducir la fuerza iónica puede mejorar la motilidad y hacer que la miosina sea más accesible a la investigación con muchos ensayos. En contraste, algunos motores exhibirán efectos de anclaje electrostático, lo que ralentizará la motilidad a intensidades iónicas más bajas. Finalmente, al ensayar el movimiento de los filamentos NM2b, es crucial mantener la fuerza iónica dentro de un rango estrecho (fuerza iónica de 150-200 mM), aproximándose a las que se encuentran en la mayoría de los tipos de células. El uso de fuerzas iónicas más bajas da como resultado la agregación de los filamentos de miosina, mientras que los filamentos se despolimerizan a fuerzas iónicas más altas.

Con muchas miosinas, particularmente aquellas con bajas proporciones de servicio, las condiciones del tampón final dadas para M5a darían como resultado que los filamentos de actina etiquetados fluorescentemente solo se unen libremente a la superficie o se disocian por completo. Esto resulta en movimientos erráticos que complican la cuantificación. A menudo se puede obtener un movimiento de mejor calidad utilizando metilcelulosa (0,7%) en el tampón final. La metilcelulosa es un agente de apiñamiento viscoso y obliga a los filamentos de actina a permanecer cerca de la superficie incluso cuando la densidad de los motores de miosina unidos es escasa60. Del mismo modo, se ha observado que la inclusión de metilcelulosa en el tampón final del ensayo de motilidad de filamento único es necesaria para observar el movimiento con NM2a, y el mismo fenómeno fue reportado para los filamentos de miosina del músculo liso29,61. Esto también aumenta la procesividad de los filamentos NM2b. Un efecto secundario potencialmente no deseado del uso de metilcelulosa en este ensayo es que las propiedades del agente de apiñamiento pueden promover la asociación lateral de los filamentos de miosina en haces. Las alternativas a la metilcelulosa al solucionar problemas de falta de movimiento o filamentos de actina ligeramente unidos en el ensayo de filamento de actina deslizante son reducir la concentración de sal en los tampones de motilidad o aumentar la densidad de la superficie de miosina. Como se indicó anteriormente, se ha demostrado que una alta fuerza iónica en los tampones de motilidad reduce la capacidad de algunas miosinas para unirse a la actina29,34,62.

Otra variación del ensayo de filamento de actina deslizante es el uso de anticuerpos para anclar la miosina en la cubierta de vidrio. Por ejemplo, si una GFP está presente en el extremo C-terminal de la construcción de la miosina, se puede usar un anticuerpo anti-GFP para fijar la GFP-miosina al coda decubierta 36,63,64. Esto puede ayudar a obtener una motilidad exitosa en situaciones en las que la geometría del sistema puede dificultar la translocación de actina, como en el caso de probar brazos de palanca artificiales o cortos54,64. Además, el efecto de la carga sobre las velocidades de translocación se puede investigar en el ensayo de filamento de actina deslizante mediante el empleo de proteínas de unión a actina como la α-actinina o la utrofina39,50,65. Tal medición puede ser útil para comparar el efecto de la carga en un conjunto de miosinas versus la cinética dependiente de la carga de una sola miosina que se puede medir utilizando un ensayo de atrapamiento óptico66,67. Esto se puede lograr agregando cantidades crecientes de una proteína de unión a la actina junto con la miosina en el paso inicial. La proteína de unión a actina se une a la superficie y ejerce una carga de fricción sobre los filamentos de actina que están siendo movidos por las miosinas, lo que resulta en una velocidad graduada a medida que aumenta la concentración de proteína de unión a actina en la superficie39.

El ensayo de motilidad de molécula única / conjunto también se puede adaptar para investigar el efecto de varias estructuras de actina en el movimiento de la miosina. Por ejemplo, en lugar de observar el movimiento de la miosina en la parte superior de filamentos de actina individuales, los haces de actina mediados por fasina o α actinina se pueden estudiar como una reconstitución in vitro de la red de filamentos de actina que se encuentra en las células68,69. El efecto de las proteínas de unión a actina como la tropomiosina también se puede estudiar65,70,71,72.

Cabe destacar la versatilidad en la elección de una etiqueta para el ensayo de motilidad de molécula única / conjunto. En este informe, se utilizó una etiqueta GFP tanto en el M5a-HMM como en el NM2b; sin embargo, se pueden usar muchas otras etiquetas. Los ejemplos incluyen HaloTag o SNAP-tag, que pueden fusionarse genéticamente con la miosina y unirse covalentemente a un tinte sintético. El beneficio de la tecnología HaloTag radica en su versatilidad para varias adaptaciones experimentales, como el etiquetado con diferentes colores o la adición de una etiqueta de afinidad de biotina29,73. Además, el uso de la tecnología de puntos cuánticos se puede emplear para mejorar la resolución del seguimiento de fluorescencia de una sola molécula, lo que también aborda la limitación del bajo brillo de GFP y la tendencia al fotobleaching74. Las etiquetas se pueden unir con éxito a las cadenas ligeras, así como a la cadena pesada11,75,76.

Para lograr el éxito en el ensayo de motilidad TIRF de molécula única, un factor clave es el uso de una superficie bien bloqueada y funcionalizada. Un método simple para lograr un bloqueo moderado es usar BSA biotinilado unido a una superficie de nitrocelulosa. Aunque esto funcionará lo suficientemente bien como para caracterizar muchos motores, incluido M5a, el nivel de unión inespecífica en dicha superficie es prohibitivo para reproducir el movimiento limpio con muestras como NM2b. Un avance clave en este sentido fue la transición a superficies PEGiladas dopadas con biotina-PEG para la funcionalización77. Las superficies PEG proporcionan un nivel muy superior de bloqueo de superficie y una superficie PEGylated libre de defectos puede permanecer libre de unión inespecífica durante períodos de tiempo muy largos. El protocolo específico que se detalla aquí permite la producción de superficies de PEG biotinilados en cuestión de horas y, si se almacenan inmediatamente como se describe, las superficies se pueden usar durante varias semanas con solo una disminución marginal de la calidad.

Una consideración clave antes de recopilar datos para el seguimiento es la velocidad de fotogramas de adquisición. El movimiento entre fotogramas posteriores debe ser lo suficientemente grande como para evitar errores de sobremuestreo. Las altas tasas de muestreo producirán velocidades sobreestimadas debido a la división de los errores de localización por un pequeño intervalo de tiempo y aumentarán el error aparente de la medición. En los casos en que los datos sin procesar se muestrean demasiado finamente, los datos se pueden muestrear tomando cada enésima trama para crear una nueva pila y considerando el cambio en la velocidad de fotogramas que resulta. Se deben evitar los movimientos de subpíxeles entre fotogramas y se requieren movimientos de varios cientos de nanómetros para obtener valores precisos. En todos los casos en que se está caracterizando una nueva muestra, los resultados generados por el análisis automatizado deben compararse con un pequeño conjunto de datos de filamentos rastreados manualmente para mayor consistencia.

Al analizar datos de experimentos de motilidad de moléculas individuales, se debe tener cuidado al elegir qué parámetros medir, cómo filtrar datos y cómo ajustar los datos. Como se indicó anteriormente, la frecuencia de muestreo puede ser un factor importante al analizar los datos de velocidad. Para muchas miosinas, las carreras procesivas serán cortas y bien aproximadas por una línea recta. En tales casos, la distancia de inicio a punto final de la pista puede proporcionar una buena medida de la longitud de la carrera y esto se puede dividir por la duración de la pista para obtener una buena estimación de la velocidad. En los casos en que las pistas son muy largas y siguen trayectorias curvas alrededor de filamentos doblados, este tipo de análisis arrojará resultados inexactos y se debe utilizar una distancia total recorrida, utilizando una tasa de adquisición que permita que los puntos de localización sucesivos estén lo suficientemente bien espaciados para evitar errores de sobremuestreo como se describió anteriormente, al tiempo que se está lo suficientemente cerca como para que la distancia en línea recta entre ellos siga siendo una buena aproximación de la curva entre esos puntos. Además, para las proteínas motoras con longitudes de carrera largas en relación con la longitud de la pista, se deben realizar estadísticas adicionales como el estimador de Kaplan-Meier al calcular las longitudes de carrera78. Lo mismo es cierto para situaciones en las que es suficientemente probable que ocurra el fotobleaching antes del final de una carrera procesiva. Otro fenómeno que se puede observar en estudios de fluorescencia de molécula única es el fotoblinking, en el que los fluoróforos cambian entre el estado de encendido y apagado rápidamente y parecen parpadear. Esto típicamente no ocurre en estos experimentos de motilidad; sin embargo, si esto ocurre, la intensidad del láser y los tiempos de exposición pueden disminuir, lo que debería minimizar el efecto. Varios productos químicos, incluyendo β-mercaptoetanol, Trolox, ciclooctaterano, galato de n-propilo, alcohol 4-nitrobencil y 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano se pueden utilizar para mitigar esto también79.

En resumen, este artículo presenta protocolos detallados que son robustos en su capacidad para cuantificar las propiedades mecanoquímicas, como la velocidad de translocación de actina, la velocidad de translocación de miosina y la longitud de ejecución de la miosina. Estos ensayos son reproducibles y se pueden utilizar para determinar la calidad de la miosina purificada incluso en situaciones en las que las características móviles no son el objetivo final específico del estudio. Además, se pueden introducir cambios como el pH, la temperatura y los reguladores químicos en estos ensayos para examinar cómo se ve afectada la mecanoquímica de la miosina estudiada. Tomados en conjunto, los ensayos de deslizamiento de actina y motilidad invertida pueden permitir una mejor comprensión del comportamiento del conjunto de miosina y las variaciones intermoleculares en la mecánica motora molecular y la cinética. Los ensayos basados en microscopía de fluorescencia descritos aquí apoyan el enfoque reduccionista de la investigación citoesquelética y pueden ser una herramienta poderosa para comprender la dinámica proteína-proteína in vitro. Juntos, los datos recopilados de estos experimentos altamente controlados se pueden usar para asesorar a los mecanobiólogos sobre comportamientos clave de actomiosina que pueden ser relevantes a nivel biológico celular y más allá.

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Disclosures

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Acknowledgments

Agradecemos al Dr. Fang Zhang por la asistencia técnica con la preparación de los reactivos utilizados para recopilar estos datos. Este trabajo fue apoyado por los fondos del Programa de Investigación Intramuros NHLBI / NIH HL001786 a J.R.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe BD 309628
2 M CaCl2 Solution VWR 10128-558
2 M MgCl2 Solution VWR 10128-298
27 Gauge Needle Becton Dickinson 309623
5 M NaCl Solution KD Medical RGE-3270
Acetic Acid ThermoFisher Scientific 984303
Amyl Acetate Ladd Research Industries 10825
Anti-FLAG M2 Affinity Gel Millipore Sigma A2220 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP Millipore Sigma A7699
Biotinylated G-Actin Cytoskeleton, Inc. AB07
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma 5470
bPEG-silane Laysan Bio, Inc Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006
Calmodulin PMID: 2985564
Catalase Millipore Sigma C40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM ThermoFisher Scientific 11496015 http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper - Gliding Assay Millipore Sigma WHA1001125
Circular Filter Paper - Inverted Assay Millipore Sigma WHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets Millipore Sigma 5056489001 This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C. 
Concentrating Tubes (100,000 MWCO) EMD Millipore Corporation UFC910024 The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye ThermoFisher Scientific 20278
Coverslip Rack Millipore Sigma Z688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament Assay VWR International 48366-227
Coverslips: Inverted Motility Assay Azer Scientific ES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO) Fischer Scientific 08-670-5A The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D0632
Double-Sided Tape Office Depot 909955
DYKDDDDK Peptide GenScript RP10586 This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots. 
EGTA Millipore Sigma E4378
Elution Column Bio-Rad 761-1550 These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
Ethanol Fischer Scientific A4094
G-actin PMID: 4254541 G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
Glucose Millipore Sigma G8270
Glucose Oxidase Millipore Sigma G2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L Santa Cruz Biotechnology sc-295018
HaloTag Promega G100A
HCl Millipore Sigma 320331
KCl Fischer Scientific P217-500
Large-Orifice Pipet Tips Fischer Scientific 02-707-134
Leupeptin Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 78435
Mark12 Unstained Standard Ladder ThermoFisher Scientific LC5677
Methanol Millipore Sigma MX0482
Methylcellulose Millipore Sigma M0512
Microscope Slides Fischer Scientific 12-553-10
MOPS Fischer Scientific BP308-100
mPEG-silane Laysan Bio, Inc MPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain Kinase PMID: 23148220 FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein. 
NaN3 Millipore Sigma S8032
NeutrAvidin ThermoFisher Scientific 31050
Nitrocellulose Ladd Research Industries 10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well ThermoFisher Scientific NP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010023
PMSF Millipore Sigma 78830 PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM. 
Razor Blades Office Depot 397492
Rhodamine-Phalloidin ThermoFisher Scientific R415 Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 Media ThermoFisher Scientific 12658-027 This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish - Gliding Assay Corning 353025 Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish - Inverted Assay Corning 353003 Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette Tips Thomas Scientific 1158U38
EQUIPMENT
Centrifuge ThermoFisher Scientific 75006590
Microscope Nikon Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope Camera Andor Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control Box Tokai HIT Custom Thermobox
Microscope Laser Unit Nikon LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench Centrifuge ThermoFisher Scientific Model: CR3i
Misonix Sonicator Misonix XL2020
Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315
Plasma-Cleaner Diener electronic GmbH + Co. KG System Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm) Qsonica 4418
Standard Incubator Binder Model: 56
Waverly Tube Mixer Waverly TR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJI https://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01) http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements FAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Plugin https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMate https://imagej.net/TrackMate
Imaging Software NIS Elements (AR package)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
File:TrackMate-manual.pdf
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md

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Bioquímica Número 168 miosina filamentos de actina purificación de proteínas microscopía de fluorescencia ensayo de motilidad ensayo de molécula única filamentos bipolares microscopía de fluorescencia de reflexión interna total
Adaptaciones específicas de miosina de ensayos de motilidad basados en microscopía de fluorescencia in vitro
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Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J.… More

Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J. R., Billington, N., Takagi, Y. Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays. J. Vis. Exp. (168), e62180, doi:10.3791/62180 (2021).

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