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मुराइन सिनोट्रियल और एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड से निवासी कार्डियक मैक्रोफेज का अलगाव और संस्कृति

Published: May 7, 2021 doi: 10.3791/62236
Automatic Translation
1,2,3, 1, 1,3, 1, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU), 2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU), 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)

ERRATUM NOTICE

Summary

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल माउस दिल के सिनोट्रियल नोड (एसएएन) और एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड (एवीएन) क्षेत्र से कार्डियक निवासी मैक्रोफेज के अलगाव के लिए एक चरण-दर-चरण दृष्टिकोण प्रदान करता है।

Abstract

हृदय में विद्युत चालन को सुविधाजनक बनाने के लिए निवासी कार्डियक मैक्रोफेज का प्रदर्शन किया गया है। फिजियोलॉजिकल हृदय ताल को सिनोएट्रियल नोड (एसएएन) में उत्पन्न विद्युत आवेगों द्वारा शुरू किया जाता है और फिर एट्रिओवेंट्रिकुलर नोड (एवीएन) के माध्यम से वेंट्रिकल्स में आयोजित किया जाता है। कार्डियक चालन प्रणाली में निवासी मैक्रोफेज की भूमिका का आगे अध्ययन करने के लिए, सैन और एवीएन से निवासी मैक्रोफेज का उचित अलगाव आवश्यक है, लेकिन यह चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। यहां, हम निवासी मैक्रोफेज के अलगाव और संस्कृति के बाद मुराइन दिलों में सैन और एवीएन के विश्वसनीय सूक्ष्म विच्छेदन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

दोनों, सैन जो क्रिस्टा टर्मिनल के जंक्शन पर बेहतर वेना कावा के साथ स्थित है, और एवीएन जो कोच के त्रिकोण के शीर्ष पर स्थित है, की पहचान की जाती है और सूक्ष्म विच्छेदन किया जाता है। मैसन के ट्राइक्रोम दाग के साथ और एंटी-एचसीएन 4 द्वारा किए गए ऊतक के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण द्वारा सही स्थान की पुष्टि की जाती है।

माइक्रोविच्छेदित ऊतकों को तब एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए एंजाइमेटिक रूप से पचाया जाता है, जिसके बाद इनक्यूबेशन सेल-प्रकार विशिष्ट सतह मार्करों के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के एक विशिष्ट पैनल के साथ होता है। यह फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा विभिन्न सेल आबादी की पहचान, गिनती या अलग करने की अनुमति देता है। मायोकार्डियम में अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं से कार्डियक निवासी मैक्रोफेज को अलग करने के लिए, विशेष रूप से भर्ती मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज, एक नाजुक तैयार गेटिंग रणनीति की आवश्यकता होती है। सबसे पहले, लिम्फोइड वंश कोशिकाओं का पता लगाया जाता है और आगे के विश्लेषण से बाहर रखा जाता है। फिर, माइलॉयड कोशिकाओं की पहचान निवासी मैक्रोफेज के साथ की जाती है जो सीडी 45 और सीडी 11 बी दोनों की उच्च अभिव्यक्ति और एलवाई 6 सी की कम अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित की जाती है। सेल सॉर्टिंग के साथ, पृथक कार्डियक मैक्रोफेज को आगे की जांच के लिए कई दिनों तक विट्रो में खेती की जा सकती है। इसलिए, हम कार्डियक चालन प्रणाली के भीतर स्थित कार्डियक निवासी मैक्रोफेज को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम सैन और एवीएन को माइक्रोडिसेक करने और पचाने में नुकसान पर चर्चा करते हैं, और फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा कार्डियक मैक्रोफेज को विश्वसनीय रूप से पहचानने, गिनती करने और सॉर्ट करने के लिए एक गेटिंग रणनीति प्रदान करते हैं।

Introduction

साइनोएट्रियल नोड (सैन) शारीरिक रूप से विद्युत आवेग शुरू करता है और इसलिए, हृदय का प्राथमिक पेसमेकर है। एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड (एवीएन) एट्रिया से वेंट्रिकल्स तक विद्युत आवेग का संचालन करता है और सहायक पेसमेकर1 के रूप में भी कार्य करता है। सामान्य तौर पर, विद्युत आवेगों का उत्पादन और चालन एक जटिल प्रक्रिया है जिसे सैन / एवीएन क्षेत्रों में निवासी मैक्रोफेज सहित विभिन्नकारकों 2 द्वारा संशोधित किया जा सकता है। हुल्समैन्स एट अल द्वारा हाल ही में किए गए एक अध्ययन में कार्डियक निवासी मैक्रोफेज की एक विशिष्ट आबादी प्रदर्शित होती है जो एवीएन में समृद्ध होते हैं औरस्थिर दिल की धड़कन को बनाए रखने में प्रमुख खिलाड़ियों के रूप में कार्य करते हैं। उन्होंने पाया कि मैक्रोफेज कार्डियोमायोसाइट्स के साथ विद्युत रूप से युग्मित होते हैं और युग्मित कार्डियोमायोसाइट्स के विद्युत गुणों को बदल सकते हैं। लेखकों ने यह भी ध्यान दिया कि मैक्रोफेज के साथ इंटरलीविंग ऐसी संचालन कोशिकाएं कार्डियक चालन प्रणाली के अन्य घटकों में भी मौजूद हैं, जैसे कि सैन।

वर्तमान में, यह पूरी तरह से ज्ञात नहीं है कि निवासी कार्डियक मैक्रोफेज का फेनोटाइप हृदय क्षेत्रों के बीच भिन्न होता है या नहीं। हालांकि, यह दिखाया गया है कि ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट ऊतक मैक्रोफेज4 के प्रतिलेखन और प्रोलिफेरेटिव नवीकरण को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, चूंकि कार्डियोमायोसाइट्स फेनोटाइप को क्षेत्रों के बीच अलग-अलग दिखाया गया है, कार्डियोमायोसाइट्स पर मैक्रोफेज के कार्यात्मक प्रभाव भी क्षेत्र-विशिष्ट हो सकते हैं, भले ही मैक्रोफेज फेनोटाइप स्वयं समान हो। इसलिए, विशिष्ट हृदय क्षेत्रों पर आगे के अध्ययन की आवश्यकता है।

हाल के अध्ययनों से पता चला है कि, स्थिर अवस्था में, ऊतक निवासी मैक्रोफेज प्रसवपूर्व रूप से स्थापित होते हैं, जो निश्चित हेमटोपोइजिस से स्वतंत्र रूप से उत्पन्न होते हैं, और वयस्कता5 में बने रहते हैं। हालांकि, मैक्रोफेज की कमी के बाद या हृदय की सूजन के दौरान, लाइ6सीहाय मोनोसाइट्स कार्डियक मैक्रोफेज आबादी 6 को फिर से भरनेमें योगदान करते हैं। आनुवंशिक वंश अनुरेखण, पैराबायोसिस, भाग्य मानचित्रण और सेल ट्रैकिंग से जुड़े अध्ययनों ने अंगों और ऊतकों में विभिन्न प्रकार के ऊतक निवासी मैक्रोफेज आबादी के सह-अस्तित्व को दिखाया, और, मैक्रोफेज उपसमुच्चय के विभिन्न सेलुलर व्यवहार जो संभावित रूप से उनके ऑन्टोजेनी 7,8,9 से जुड़े हैं।

निवासी कार्डियक मैक्रोफेज के लक्षण वर्णन ने चुंबकीय सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) और फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल सॉर्टिंग के उपयोग से लाभ उठाया है। ये विधियां विशेष रूप से विशिष्ट सेल आबादी को उनके सेल सतह मार्करों के साथ लेबल करके कई ऊतक अंशों से अलग करने के लिए उपयोगी हैं। यह न केवल पृथक प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार की उच्च शुद्धता की ओर जाता है, बल्कि फेनोटाइपिक विश्लेषण की भी अनुमति देता है। यहां, हम विशेष रूप से सैन और एवीएन क्षेत्र से अलग कार्डियक निवासी मैक्रोफेज के संवर्धन के लिए फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल सॉर्टिंग के साथ चुंबकीय मोती-लेपित कोशिकाओं सहित एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

चालन प्रणाली में कार्डियक निवासी मैक्रोफेज की विशेषताओं और कार्डियक चालन और अरिदमोजेनेसिस के लिए उनके कार्य का पता लगाने के लिए, सैन और एवीएन का सटीक स्थानीयकरण और विच्छेदन महत्वपूर्ण है। सैन और एवीएन के सूक्ष्म विच्छेदन के लिए, क्षेत्र पहचान10 के लिए शारीरिक स्थलों का उपयोग किया जाता है। संक्षेप में, सैन बेहतर वेना कावा और दाएं आलिंद के जंक्शन पर स्थित है। एवीएन कोच के त्रिकोण के भीतर स्थित है, जो ट्राइकसपिड वाल्व के सेप्टल पत्रक से घिरा हुआ है, और पीछे की ओर टोडारो11 के कण्डरा से घिरा हुआ है। हम चूहों में सैन और एवीएन की एक सटीक सूक्ष्म विच्छेदन प्रक्रिया भी प्रदान करते हैं जो हिस्टोलॉजी और इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा पुष्टि की जाती है।

पृथक निवासी मैक्रोफेज का उपयोग आरएनए अनुक्रमण जैसे आगे के प्रयोगों के लिए किया जा सकता है या विभिन्न इन विट्रो प्रयोगों की अनुमति देने वाले दो सप्ताह से अधिक समय तक पुनर्प्राप्त और खेती की जा सकती है। इसलिए, हमारा प्रोटोकॉल इम्यूनो-रिदमोलॉजिस्ट के लिए एक अत्यधिक मूल्यवान प्रक्रिया का वर्णन करता है। तालिका 1 आवश्यक सभी समाधानों की संरचना को दर्शाती है, चित्र 1 सैन और एवीएन के लिए माइक्रोडिसेक्शन लैंडमार्क दिखाता है। चित्रा 2 सैन और एवीएन स्थानीयकरण का योजनाबद्ध चित्रण है। चित्रा 3 सैन और एवीएन (मैसन के ट्राइक्रोम और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला) के हिस्टोलॉजिकल धुंधलापन को दर्शाता है। चित्रा 4 प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा कार्डियक निवासी मैक्रोफेज को अलग करने के लिए एक चरण-दर-चरण गेटिंग रणनीति दिखाता है।

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Protocol

म्यूनिख विश्वविद्यालय की पशु देखभाल और नैतिकता समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार पशु देखभाल और सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का आयोजन किया गया था और चूहों पर की गई सभी प्रक्रियाओं को बवेरिया, म्यूनिख, जर्मनी की सरकार द्वारा अनुमोदित किया गया था। C57BL6/J चूहों को व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया गया था।

1. तैयारी

  1. सेल सॉर्टिंग बफर (तालिका 1) तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: पूरी प्रयोगात्मक प्रक्रिया के दौरान, सेल सॉर्टिंग बफर हमेशा बर्फ पर होना चाहिए।
  2. पाचन से कुछ समय पहले पाचन बफर (तालिका 1) तैयार करें क्योंकि कोलेजनेज की गतिविधि केवल कमरे के तापमान पर कुछ घंटों के लिए पता लगाया जा सकता है।
  3. विच्छेदन डिश10 की तैयारी के लिए पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल देखें। संक्षेप में, 100 मिमी व्यास पेट्री डिश में 30 एमएल अगारोस जेल (3% -4%) जोड़ें और कमरे के तापमान पर ठंडा करें।

2. पशु बलि और दिल काटना

  1. माउस को आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थेटाइज करें, इसे आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र से जुड़े इनक्यूबेशन कक्ष में रखें और 5% आइसोफ्लुरेन / 95% ऑक्सीजन के साथ फ्लश करें।
  2. एनाल्जेसिया के लिए फेंटानिल के इंजेक्शन के बाद, पसली के पिंजरे को खोलें और 5-10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा 1x पीबीएस को सीधे बाएं वेंट्रिकल (एलवी) में इंजेक्ट करके दिल को संक्रमित करें। चूहों के दिल को निकालें और इसे विच्छेदन पकवान पर रखें। प्रायोगिक विवरण पहले10 में विस्तार से वर्णित किया गया है।

3. सैन और एवीएन का सूक्ष्म विच्छेदन

  1. दिल को अलग करने के बाद, विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत बर्फ-ठंडा 1x PBS के साथ विच्छेदन डिश में निम्नलिखित सूक्ष्म विच्छेदन प्रक्रियाएं करें।
  2. कार्डियक एनाटोमिकल लैंडमार्क का उपयोग करें, यानी, महाधमनी, फुफ्फुसीय धमनी, कोरोनरी साइनस, बाएं / दाएं वेंट्रिकल, आदि। हृदय के बाएं /दाएं (बाएं: एलवी; दाएं: आरवी) और पूर्ववर्ती / पीछे (पूर्ववर्ती: महाधमनी; पीछे: कोरोनरी साइनस) को निर्धारित करने के लिए। अभिविन्यास निर्धारित होने के बाद, डिश के निचले भाग में इसके सामने के साथ दिल को घुमाएं (पीछे की ओर स्थित बड़ी नसों को उजागर करने के लिए)।
  3. सैन का सूक्ष्म विच्छेदन
    नोट: सैन के माइक्रोडिसेक्शन को पहले10 वर्णित किया गया है। प्रक्रिया नीचे संक्षेप में वर्णित है।
    1. कीट पिन का उपयोग करके माइक्रोडिसेक्शन डिश पर दाएं एट्रियल उपांग (आरएए) और बेहतर वेना कावा (एसवीसी) और अवर वेना कावा (आईवीसी) से सटे ऊतक को पिन करके अंतर-कैवल क्षेत्र को उजागर करें।
    2. इंटर-कैवल क्षेत्र को अलग करने और सैन नमूना प्राप्त करने के लिए क्रिस्टा टर्मिनलिस (सीटी) के समानांतर इंटरट्रियल सेप्टम के साथ दिल को काटें (चित्रा 1 ए, चित्रा 2 ए)। नमूने को बर्फ पर एक खाली 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें।
  4. एवीएन का सूक्ष्म विच्छेदन
    1. सैन नमूने के संग्रह के बाद यह सुनिश्चित करें कि आरएए और दाहिने आलिंद (आरए) के कुछ हिस्सों को पहले ही काट दिया गया है, केवल इंटरट्रियल सेप्टम (आईएएस) और, इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम (आईवीएस) को छोड़ दिया गया है।
    2. आईएएस और आईवीएस से सटे ऊतक के माध्यम से हृदय के शेष हिस्सों को कीट पिन का उपयोग करके पिन करें ताकि आईएएस के दाहिने एट्रियल पक्ष को सामने रखा जा सके।
    3. कोच के त्रिकोण के लिए एंडोकार्डियल सतह पर दाएं आलिंद को देखें। यह ट्राइकसपिड वाल्व (टीवी) के सेप्टल पत्रक की हिंज-लाइन से और पीछे की ओर टोडारो के कण्डरा से घिरा होगा। कोरोनरी साइनस का छिद्र आधार पर देखा जाता है। (चित्रा 1 बी, चित्रा 2 बी)।
    4. कोच के त्रिकोण को काटें, जिसमें एवीएन शामिल है, और इसे सीधे बर्फ पर एक खाली 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डाल दें।

4. पाचन

  1. उपयोग से कुछ समय पहले पाचन बफर (तालिका 1) तैयार करें।
  2. स्केलपेल के साथ सैन और एवीएन ऊतक को अच्छी तरह से मिलाएं।
    नोट: ऊतक को अच्छी तरह से काटने से पाचन दक्षता में वृद्धि होगी और छंटाई के लिए अच्छा सेल निलंबन प्राप्त करने में मदद मिलेगी। चूंकि सैन और एवीएन नमूने काफी छोटे हैं, इसलिए नमूने के नुकसान को कम करने के लिए सीधे 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के अंदर ऊतक को छोटा करने की सिफारिश की जाती है।
  3. प्रति नमूने 500 μL पाचन बफर जोड़ें और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब की दीवार से सभी कीमा ऊतक को धो लें। कोमल पिपेटिंग नमूने को पचाने में मदद करता है।
  4. एक भंवर मशीन पर ट्यूब को समरूप करें (सेटिंग्स: 37 डिग्री सेल्सियस, 1 घंटे के लिए 750 आरपीएम)।
  5. पाचन के बाद, ऊतक निलंबन को 40 μm सेल छन्नी से गुजरकर एक ताजा 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। पाचन को रोकने के लिए अतिरिक्त 5 एमएल सेल सॉर्टिंग बफर के साथ सेल छन्नी को कुल्ला करें।
  6. 15 एमएल ट्यूब को 350 x g पर 7 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। फिर पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को पूरी तरह से हटा दें। सेल पेलेट को 90 μL सेल सॉर्टिंग बफर के साथ पुन: निलंबित करें।
    नोट: चुंबकीय पृथक्करण से पहले, सेल निलंबन को धीरे-धीरे कुछ बार दोहराएं या यदि आवश्यक हो तो सेल क्लंप को हटाने के लिए 30 μm सेल स्ट्रेनर से गुजरें, ताकि दिलचस्प सेल आबादी के चुंबकीय संवर्धन के इष्टतम प्रदर्शन के लिए एकल सेल निलंबन प्राप्त किया जा सके।

5. सीडी 45 का चुंबकीय संवर्धन और नमूना धुंधला होना

नोट: उच्च सॉर्टिंग दक्षता के साथ कार्डियक मैक्रोफेज को अलग करने के लिए, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार सीडी 45 माइक्रोबीड्स के साथ लिम्फोसाइटों सहित अवांछित कोशिकाओं का बहिष्करण किया गया था। सॉर्टिंग पैनल के आधार पर, कार्डियक रेजिडेंट मैक्रोफेज की पहचान सीडी 45उच्चसीडी 11 बीउच्चसीडी 64उच्च एलवाई 6 सीकम /

  1. 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सेल निलंबन में प्रति 107 कुल कोशिकाओं में सीडी 45 माइक्रोबीड्स के 10 μL जोड़ें। नमूनों को अच्छी तरह से मिलाएं और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल गिनती संक्षेप में यह सुनिश्चित करने के लिए की जानी चाहिए कि प्रत्येक ट्यूब में 107 से अधिक कुल कोशिकाएं नहीं हैं। उच्च सेल संख्याओं के साथ काम करते समय, चुंबकीय मोतियों की मात्रा को बढ़ाने की आवश्यकता होती है।
  2. सेल सॉर्टिंग बफर (प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए 1: 100 कमजोर पड़ने) में निम्नलिखित एंटीबॉडी को पतला करके एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें: सीडी 45-पीई, सीडी 11 बी-एपीसी-साइ 7, सीडी 64-एपीसी, एफ 4/80-पीई-साइ 7, एलवाई 6 सी-एफआईटीसी। DAPI को बाद में जीवित /मृत भेदभाव के लिए धुंधला करने में जोड़ा जाएगा।
  3. चुंबकीय मोती इनक्यूबेशन के 15 मिनट के बाद, 15 एमएल ट्यूब में सेल निलंबन में सीधे 100 μL एंटीबॉडी मिश्रण जोड़ें (फिर सभी एंटीबॉडी की अंतिम एकाग्रता 1: 200 है) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के 20 मिनट के बाद, 107 कोशिकाओं में 1-2 एमएल सेल सॉर्टिंग बफर और 10 मिनट के लिए 350 x g पर सेंट्रीफ्यूज जोड़कर सेल निलंबन को धोएं। पाइपिंग द्वारा सतह पर तैरने वाले को पूरी तरह से हटा दें।
  5. सेल सॉर्टिंग बफर के 500 μL में 108 कोशिकाओं तक पुन: निलंबित।
    नोट: चुंबकीय पृथक्करण के लिए अधिकतम सेल संख्या निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार निर्धारित की जानी चाहिए।
  6. चुंबकीय पृथक्करण सेट तैयार करें।
    1. चुंबकीय स्तंभ को एक उपयुक्त चुंबकीय विभाजक से जोड़ें और चुंबकीय स्तंभ के नीचे एक संग्रह ट्यूब रखें।
    2. सेल सॉर्टिंग बफर के साथ कुल्ला करके चुंबकीय कॉलम तैयार करें: कॉलम के शीर्ष पर 500 μL सेल सॉर्टिंग बफर जोड़ें और बफर को गुजरने दें।
  7. सेल सॉर्टिंग बफर गुजरते समय कॉलम पर तुरंत सेल निलंबन लागू करें।
    नोट: कॉलम में हवा के बुलबुले के गठन से बचें। निर्माण के प्रोटोकॉल के अनुसार, हालांकि कॉलम भरने का समय भंडारण स्थितियों से बदल सकता है, लेकिन पृथक्करण की गुणवत्ता पर इसका कोई प्रभाव नहीं पड़ता है।
  8. कॉलम को 3 x 500 μL सेल सॉर्टिंग बफर के साथ धोएं। चरण 5.7 और चरण 5.8 में प्रवाह-थ्रू में बिना लेबल वाली कोशिकाएं होती हैं, जिन्हें आगे के प्रयोग की आवश्यकता होने पर छोड़ा जा सकता है।
    नोट: कॉलम जलाशय लगभग खाली होने पर तुरंत सेल सॉर्टिंग बफर जोड़ें।
  9. चुंबकीय विभाजक से स्तंभ निकालें और इसे एक नई संग्रह ट्यूब पर रखें।
  10. कॉलम पर 1 एमएल सेल सॉर्टिंग बफर जोड़ें। कॉलम के साथ आपूर्ति किए गए प्लंजर को दृढ़ता से लागू करके तुरंत कॉलम को फ्लश करें। प्रवाह-माध्यम में चुंबकीय रूप से लेबल कोशिकाएं होती हैं।
  11. सेल सॉर्टर पर चलाने से कुछ समय पहले सभी एकत्रित चुंबकीय रूप से लेबल सेल सस्पेंशन में डीएपीआई समाधान जोड़ें। DAPI की अंतिम सांद्रता को 0.3-0.5 μg/mL में समायोजित करें।
  12. FACS विश्लेषण करें।

6. मुआवजे के लिए नमूने

  1. प्रकाश से एंटीबॉडी की रक्षा के लिए क्रमशः "पीई", "एपीसी-साइ 7", "एपीसी", "पीई-साइ 7", "एफआईटीसी" और "डीएपीआई" के रूप में लेबल किए गए 6 भूरे रंग के 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें। एक और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें जिसे "बिना दाग" के रूप में लेबल किया गया है।
    नोट: यह उसी समय किया जा सकता है जब सेल निलंबन को माइक्रोबीड्स और एंटीबॉडी के साथ जोड़ा जाता है। बिना दाग वाला नमूना कार्डियोमायोसाइट्स ऊतक हो सकता है जो बाएं हृदय ऊतक से यादृच्छिक रूप से एकत्र किया जाता है और चरण 4 के अनुसार भी इलाज किया जाता है।
  2. सेल सॉर्टिंग बफर के साथ प्रत्येक एकल प्रतिदीप्ति-संयुग्मित एंटीबॉडी को 1.5 एमएल ब्राउन माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 1:50 में पतला करें जो तदनुसार चिह्नित होते हैं।
  3. मुआवजे के मोतियों के घोल की एक बूंद जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. प्रत्येक 1.5 एमएल ब्राउन माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 2 एमएल सेल सॉर्टिंग बफर जोड़ें और 5 मिनट के लिए 450 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। सतह पर तैरने वाले को पूरी तरह से त्याग दें और 300 μL सेल सॉर्टिंग बफर के साथ गोली युक्त मोती को फिर से निलंबित करें और उन्हें सेल सॉर्टर ट्यूबों में स्थानांतरित करें जो तदनुसार चिह्नित भी हैं।

7. सेल सॉर्टर और गेटिंग रणनीति पर चलना

  1. पहले बिना दाग वाले नमूने और मुआवजे ट्यूबों को लागू करें और अक्ष की उचित स्थिति में सकारात्मक और नकारात्मक शिखर दोनों को संरेखित करने के लिए प्रत्येक चैनल के वोल्टेज को समायोजित करें। मुआवजा सेटिंग्स सहेजें और इसे निम्न नमूने पर लागू करें।
  2. सेल सॉर्टर पर नमूने लागू करें। चित्र 4 में वर्णित गेटिंग रणनीति सेट करें। कार्डियक निवासी मैक्रोफेज को सीडी 45उच्चसीडी 11 बीउच्चसीडी 64उच्चएलवाई 6 सीकम / आईएनटी एफ 4 /80 उच्च के रूप में पहचाना जाताहै। DAPI का उपयोग सेल व्यवहार्यता मार्कर के रूप में किया जाता है।
  3. यह पुष्टि करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री चार्ट की जांच करें कि चार्ट पर रुचि की सेल आबादी ठीक से दिखाई गई है। यदि नहीं, तो प्रत्येक चैनल के वोल्टेज को प्रत्येक चार्ट के केंद्र दृश्य में समायोजित करें।
  4. यदि वोल्टेज सेटिंग्स संतोषजनक हैं, तो सॉर्टिंग प्रक्रिया शुरू करें। क्रमबद्ध कोशिका आबादी को कल्चर माध्यम में इकट्ठा करें जो डीएमईएम से बना है जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम होता है, जो 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन और 100 U / mL पेनिसिलिन के साथ पूरक होता है।

8. निवासी मैक्रोफेज संस्कृति

  1. क्रमबद्ध मैक्रोफेज को इकट्ठा करने के बाद, कोशिकाओं को तुरंत 35 मिमी ऊतक संवर्धन व्यंजन या 24 अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें, या बाद के प्रयोगों के लिए सीधे उनका उपयोग करें।
  2. क्रमबद्ध मैक्रोफेज को कल्चर करने के लिए, कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर पर इनक्यूबेट करें।
  3. हर 48-72 घंटे में संस्कृति माध्यम बदलें। तैरती हुई मृत कोशिकाओं को मध्यम परिवर्तन द्वारा आसानी से हटाया जा सकता है। बाद के प्रयोग के लिए संस्कृति डिश के तल से जुड़े लाइव मैक्रोफेज का उपयोग करें।

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Representative Results

हम विशेष रूप से सैन और एवीएन क्षेत्र से कार्डियक निवासी मैक्रोफेज के अलगाव के लिए एक व्यावहारिक प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। एक सही विच्छेदन की पुष्टि करने के लिए, मैसन के ट्राइक्रोम स्टेनिंग और इम्यूनोफ्लोरोसेंट एचसीएन 4-स्टेनिंग का प्रदर्शन किया जाता है (चित्रा 3)12। इस प्रोटोकॉल के साथ, हम एक पूरे दिल से लगभग 60,000 मैक्रोफेज एकत्र कर सकते हैं। चित्रा 4 कार्डियक मैक्रोफेज को सॉर्ट करने के लिए गेटिंग रणनीति दिखाता है। लाइव रेजिडेंट कार्डियक मैक्रोफेज की पहचान सीडी 45 + सीडी 11 बी + एफ 4 / 80 + सीडी 64 + एलवाई 6 सी के रूप में की गई थी। चित्रा 5 ताजा क्रमबद्ध कार्डियक मैक्रोफेज दिखाता है जिन्हें उनके सतह एंटीजन सीडी 45, एफ 4/80 और सीडी 11 बी द्वारा पहचाना गया था। फ्लोरोफोरे-पीई चैनल (चित्रा 5 बी) के तहत देखे जाने पर क्रमबद्ध कोशिकाएं सीडी 45 (सीडी 45 +) के लिए सकारात्मक थीं। फ्लोरोफोरे-एपीसी-साइ 7 चैनल के तहत देखे जाने पर क्रमबद्ध कोशिकाओं का एक ही दृश्य सीडी 11 बी + फेनोटाइप (चित्रा 5 सी) दिखाता है। फ्लोरोफोरे-पीई-साइ 7 चैनल के तहत देखे जाने पर क्रमबद्ध कोशिकाओं का एक ही दृश्य एफ 4/80+ फेनोटाइप (चित्रा 5 डी) दिखाता है। चित्रा 5 ई क्रमबद्ध कोशिकाओं के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त विलय की गई छवि है। इन ट्रिपल पॉजिटिव कोशिकाओं को कार्डियक निवासी मैक्रोफेज के रूप में पहचाना गया था। चित्रा 6 6 तक मध्यम से 6 दिनों में सुसंस्कृत पृथक कार्डियक मैक्रोफेज दिखाता है। सफेद तीर मैक्रोफेज को इंगित करते हैं, काले तीर फ्लोटिंग गोल आकार की मृत कोशिकाओं का संकेत देते हैं।

Figure 1
चित्र 1: विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत सैन और एवीएन की शारीरिक रचना। (ए) विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत सैन की शारीरिक रचना। सैन का स्थान अंतर-कैवल क्षेत्र (काली डैश्ड लाइनों) के भीतर लाल डैश लाइन द्वारा इंगित किया जाता है। (बी) विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत एवीएन की शारीरिक रचना। यह आंकड़ा पहले प्रकाशित लेख10 से संशोधित किया गया है। एवीएन (लाल डैश्ड सर्कल) झिल्लीदार सेप्टम के तल के पास कोच (सफेद डैश्ड त्रिकोण) के त्रिकोण के शीर्ष पर स्थित है। कोच का त्रिकोण टोडारो (टीटी, हरे डैश्ड लाइन), ट्राइकसपिड वाल्व (टीवी, ब्लू डैश्ड लाइन) और कोरोनरी साइनस (सीएस, पीले डैश्ड लाइन) के छिद्र से बनता है। एसवीसी, बेहतर वेना कावा; आईवीसी, अवर वेना कावा; आईएएस, इंटरट्रियल सेप्टम; आरए, दाएं आलिंद; आरएए, दाएं एट्रियल उपांग; आरवी, दाएं वेंट्रिकल; सीटी, क्रिस्टा टर्मिनलिस; आईवीएस, इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम; अंडाकार फोसा। पीए, फुफ्फुसीय धमनी; आरवी, दाएं वेंट्रिकल; एलवी, बाएं वेंट्रिकल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: सैन और एवीएन स्थानीयकरण का योजनाबद्ध चित्रण। (ए) सैन स्थानीयकरण का योजनाबद्ध चित्रण। सैन को सीटी (काली डैश्ड लाइन) के अलावा अंतर-कैवल क्षेत्र के भीतर एक लाल डैश्ड सर्कल द्वारा इंगित किया जाता है। (बी) एवीएन स्थानीयकरण का योजनाबद्ध चित्रण। एवीएन को कोच त्रिकोण (ग्रे डैश्ड त्रिकोण) के अंदर एक लाल डैश्ड सर्कल द्वारा इंगित किया जाता है जो टीवी और सीएस एसवीसी के छिद्र से बना होता है। आईवीसी, अवर वेना कावा; आईएएस, इंटरट्रियल सेप्टम; आरए, दाएं आलिंद; आरएए, दाएं एट्रियल उपांग; सीटी, क्रिस्टा टर्मिनलिस; आईवीएस, इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम; अंडाकार फोसा; आईवीएस, इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: हिस्टोलॉजिकल दाग के साथ सैन और एवीएन की पहचान। सैन (ए, बी) और एवीएन (सी, डी) की पहचान। सैन (ए) और एवीएन (सी) में एचसीएन 4 सकारात्मक चालन प्रणाली कोशिकाओं के इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होने के साथ-साथ मैसन के सैन (बी) और एवीएन (डी) के ट्राइक्रोम धुंधलापन। लाल तीर साइनस नोड धमनी (एसएनए, बी) को इंगित करते हैं, काले तीर और काले डैश्ड लाइन कॉम्पैक्ट एवीएन का संकेत देते हैं, नीला तीर केंद्रीय रेशेदार शरीर (सीएफबी) को इंगित करता है। सीटी, क्रिस्टा टर्मिनलिस; सीएफबी, केंद्रीय रेशेदार शरीर; सीएन, कॉम्पैक्ट एवीएन; आरए, दाएं आलिंद; आरवी, दाएं वेंट्रिकल; आईएएस, इंटरट्रियल सेप्टम; आईवीएस, इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम; टीवी, ट्राइकसपिड वाल्व; एमवी, माइट्रल वाल्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: निवासी कार्डियक मैक्रोफेज की सेल सॉर्टिंग के लिए गेटिंग रणनीति। मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं की पहचान की जाती है, डबल्स को एफएससी-डब्ल्यू बनाम एफएससी-ए द्वारा बाहर रखा जाता है और मृत कोशिकाओं को डीएपीआई (ए-डी) द्वारा बाहर रखा जाता है। जीवित कोशिकाओं को सीडी 45 + ल्यूकोसाइट्स (ई) पर गेट किया जाता है, और फिर सीडी 11 बी + माइलॉयड कोशिकाओं (एफ) पर गेट किया जाता है। कार्डियक मैक्रोफेज को एफ 4/80 और सीडी 64 (जी) दोनों की अभिव्यक्ति द्वारा पहचाना गया था, और फिर अंत में एलवाई 6 सी अभिव्यक्ति (एच) द्वारा स्तरीकृत किया गया था। लाइव रेजिडेंट कार्डियक मैक्रोफेज को सीडी 45 + सीडी 11 बी + एफ 4 / 80 + सीडी 64 + एलवाई 6 सी के रूप में पहचाना जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: ताजा क्रमबद्ध कार्डियक मैक्रोफेज और इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन। सीडी 45 (बी), सीडी 11 बी (सी), या एफ 4/80 (डी) जैसे विशिष्ट सतह एंटीजन का इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होना। गेटिंग रणनीति के अनुसार, कार्डियक मैक्रोफेज को ट्रिपल पॉजिटिव कोशिकाओं (ई) के रूप में पहचाना जाता है। स्केल पट्टी 50 μm का प्रतिनिधित्व करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: क्रमबद्ध मैक्रोफेज की संस्कृति। संस्कृति माध्यम में क्रमबद्ध मैक्रोफेज की संस्कृति क्रमशः 48 एच (ए, बी), 96 एच (सी, डी) और 6 दिनों (ई, एफ) के लिए। प्रति समय बिंदु दो अलग-अलग संस्कृति व्यंजन दिखाए जाते हैं (पकवान 1: ए, सी, ई; डिश 2: बी, डी, एफ)। सफेद तीर स्पिंडल जैसे आकार और विशिष्ट प्रोट्रूशियंसके साथ जीवित मैक्रोफेज का संकेत देते हैं। काले तीर फ्लोटिंग गोल आकार की मृत कोशिकाओं का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

यौगिक अंतिम एकाग्रता g या ml की आवश्यकता
FACS बफर
बीएसए 0.50%
ईडीटीए 2 mM
पीबीएस (1X) 500 मिलीलीटर
पाचन बफर
कोलेजनेज I 450 U/
कोलेजनेज XI 125 U/
DNase I 60 U/
Hyaluronidase 60 U/
HEPES बफर 20 μl प्रति 1 ml
पीबीएस (1X) 2 नमूने के लिए 1 मिलीलीटर तक जोड़ें
संस्कृति माध्यम
DMEM 79 मिलीलीटर
पेनिसिलिन/ 1% 1 मिलीलीटर
FBS 20% 20 मिलीलीटर
TAE (50x)
Tris-base 24.20% 24.2 ग्राम
100% एसिटिक एसिड 5.71% 5.71 मिलीलीटर
0.5 एम ईडीटीए 0.05 M 10 मिलीलीटर
dH2O 100 मिलीलीटर तक जोड़ें

तालिका 1: आवश्यक समाधानों की संरचना।

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Discussion

इस पांडुलिपि में, हम विशेष रूप से उच्च शुद्धता पर सैन और एवीएन क्षेत्रों से कार्डियक निवासी मैक्रोफेज के संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

मैक्रोफेज को उनके शारीरिक स्थान और कार्यात्मक फेनोटाइप के आधार पर उप-आबादी में विभाजित किया गया है। वे चर माइक्रोएन्वायरमेंटल संकेतों के जवाब में एक कार्यात्मक फेनोटाइप से दूसरे में भी स्विच कर सकतेहैं। अस्थि मज्जा और यकृत जैसे अन्य अंगों की तुलना में, हृदय ऊतक में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का कम प्रतिशत और प्रत्येक सेलुलर उप-जनसंख्या की कम पूर्ण संख्याहोती है। इसलिए, सेल सॉर्टिंग, संवर्धन और शुद्धिकरण विधियां रुचि की सेल आबादी की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करने के लिए आवश्यक उपकरण हैं। फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल सॉर्टिंग, और एमएसीएस शुद्ध, क्रमबद्ध सेल आबादी प्राप्त करने की अनुमति देते हैं क्योंकि यह कोशिकाओं के विभिन्न गुणों के एक साथ माप की अनुमति देता है।

कार्डियक मैक्रोफेज 3,6,15 की उप-आबादी की पहचान के लिए विभिन्न फ्लो साइटोमेट्री पैनलों का वर्णन किया गया है। स्थिर अवस्था और बीमारी में मैक्रोफेज का कार्य न केवल उनके विकास की उत्पत्ति पर निर्भर करता है, बल्कि ऊतक वातावरण पर भी निर्भर करता है। सामान्य तौर पर, वयस्क हृदय में Ly6Cनिम्न / CCR2- निवासी मैक्रोफेज के दो प्रमुख उपसमुच्चय होते हैं जो MHC-II के विभिन्न स्तरों को व्यक्त करते हैं और जो स्थिर अवस्था में स्थानीय प्रसार के माध्यम से खुद को बनाए रख सकते हैं जबकि रोग के दौरान शास्त्रीय Ly6Cउच्च मोनोसाइट्स को सूजन की साइटों पर भर्ती किया जाता है, जहां वे मैक्रोफेज16 में अंतर करते हैं। . विकास के दौरान, मैक्रोफेज की विभिन्न उप-आबादी अलग-अलग कार्यों से जुड़े विभिन्न हृदय स्थानों पर कब्जा करलेती है। हमने विशेष रूप से कार्डियक चालन प्रणाली से निवासी मैक्रोफेज का अध्ययन करने का लक्ष्य रखा, विशेष रूप से सैन और एवीएन क्षेत्रों से निवासी मैक्रोफेज। कार्डियक निवासी मैक्रोफेज को सीडी 45उच्च सीडी 11 बी उच्च सीडी 64उच्चएफ 4/80उच्चएलवाई 6 सीकम /

सेल सॉर्टिंग के लिए एक वयस्क माउस से कार्डियक निवासी मैक्रोफेज की फसल को लगभग 3 घंटे की आवश्यकता होती है। प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को तार्किक रूप से व्यवस्थित करना और समय बचाने और निलंबन में संभवतः नाजुक मैक्रोफेज की हैंडलिंग को कम करने के लिए समानांतर में इनक्यूबेशन की अनुमति देना महत्वपूर्ण है। चूंकि सॉर्टिंग प्रक्रिया क्रमबद्ध कोशिकाओं पर दबाव डाल सकती है, इसलिए हमने चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके छंटाई के समय को कम करने की सिफारिश की जो सॉर्टिंग दक्षता को काफी बढ़ा सकता है और निवासी मैक्रोफेज की उच्च शुद्धता प्राप्त करने की अनुमति भी देता है।

इस प्रोटोकॉल के आवेदन में मैक्रोफेज और / या हृदय ऊतक और किसी अन्य चूहों के उपभेदों से किसी अन्य गैर-कार्डियोमायोसाइट्स सेल प्रकार के शुद्धिकरण तक सीमित नहीं है। क्रमबद्ध मैक्रोफेज का उपयोग बाद के प्रयोगों के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए सेल गतिशीलता परख, जीन या प्रोटीन अभिव्यक्ति अध्ययन, आदि। सेल सॉर्टर के संग्रह ट्यूब से सीधे कोशिकाओं को एक-एक करके एकत्र करके एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण भी संभव है।

हालांकि, फ्लो साइटोमेट्री-आधारित सेल सॉर्टिंग की अपनी सीमाएं हैं। एक सटीक रूप से डिज़ाइन किया गया एंटीबॉडी पैनल महत्वपूर्ण है और इसे रुचि की सेल आबादी पर एंटीजन की अभिव्यक्ति और एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित फ्लोरोफोरे पर विचार करना चाहिए। कोशिकाओं के कार्य और व्यवहार्यता को बाध्यकारी एंटीबॉडी द्वारा बदल दिया जा सकता है, जो बाद के प्रयोगों के परिणामों को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, जटिल सेल सॉर्टिंग उपकरण महंगे, परिष्कृत हैं, और फ्लूइडिक्स सिस्टम ब्लॉकेज और लेजर अंशांकन के साथ समस्याओं से भी ग्रस्त हैं। इसलिए उच्च प्रशिक्षित विशेषज्ञ द्वारा रखरखाव और एक अनुभवी पेशेवर तकनीशियन द्वारा ठीक से संचालन की आवश्यकता होती है। भले ही सेल सॉर्टिंग रुचि की शुद्ध सेल आबादी प्रदान कर सकती है, लेकिन समग्र दक्षता अभी भी अपेक्षाकृत कम है।

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Disclosures

इस लेख से संबंधित हितों के किसी संभावित टकराव की सूचना नहीं दी गई थी।

Acknowledgments

इस कार्य को चीन छात्रवृत्ति परिषद (सीएससी, से आर ज़िया), जर्मन सेंटर फॉर कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च (डीजेडएचके; 81X2600255 से एस क्लॉस, 81Z0600206 से S. Kab, 81Z0600204 से C.S.S.), कोरोना फाउंडेशन (S199/10079/2019 से S. C. C.S. पांडुलिपि तैयार करने में फंड की कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system Hugo Sachs Elektronik 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit Hugo Sachs Elektronik 73-4860 Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform Kent scientific SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps Fine Science Tools 11295-51
Iris scissors Fine Science Tools 14084-08
Spring scissors Fine Science Tools 91500-09
Tissue forceps Fine Science Tools 11051-10
Tissue pins Fine Science Tools 26007-01 Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker Sunlab D-8040
Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul Eppendorf Z683884-1EA
Magnetic stirrer IKA RH basic
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope vwr 10836-004
Leica microscope Leica microsystems Leica DM6
Flow cytometry machine
Beckman Coulter Beckman coulter MoFlo Astrios
Software
FlowJo v10 FlowJo
General Lab Material
0.2 µm syringe filter sartorius 17597
100 mm petri dish Falcon 351029
27G needle BD Microlance 3 300635
50 ml Polypropylene conical Tube FALCON 352070
Cover slips Thermo scientific 7632160
Eppendorf Tubes Eppendorf 30121872
5ml Syringe Braun 4606108V
Chemicals
0.5 M EDTA Sigma 20-158
Acetic acid Merck 100063 Component of TEA
Agarose Biozym 850070
Bovine Serum Albumin Sigma A2153-100G
Collagenase I Worthington Biochemical LS004196
Collagenase XI Sigma C7657
DNase I Sigma D4527
Hyaluronidase Sigma H3506
HEPES buffer Sigma H4034
Bovine Serum Albumin Sigma A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco 14190-094
Fetal bovine serum Sigma F2442-500ml
Penicillin − Streptomycin Sigma P4083
DMEM Gibco 41966029
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 ml Braun Melsungen
Isoflurane 1 ml/ml Cp-pharma 31303
Oxygen 5L Linde 2020175 Includes a pressure regulator
Antibodies
Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) BioLegend Cat# 128006 diluted to 1:100
Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) BioLegend Cat# 123114 diluted to 1:100
Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) BioLegend Cat# 139306 diluted to 1:100
Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) BioLegend Cat# 101226 diluted to 1:100
Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) BioLegend Cat# 103106 diluted to 1:100
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) Invitrogen H3570 diluted to 1:1000
Animals
Mouse, C57BL/6 Charles River Laboratories

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References

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Tags

चिकित्सा अंक 171 कार्डियक चालन प्रणाली साइनोएट्रियल नोड एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड निवासी कार्डियक मैक्रोफेज फ्लो साइटोमेट्री चुंबकीय सक्रिय सेल सॉर्टिंग एमएसीएस फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल सॉर्टिंग माइक्रोडिसेक्शन प्राथमिक सेल कल्चर

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node
Posted by JoVE Editors on 02/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node. The Authors section was updated from:

Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU)
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)

to:

Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU)
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU)
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)

मुराइन सिनोट्रियल और एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड से निवासी कार्डियक मैक्रोफेज का अलगाव और संस्कृति
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Xia, R., Loy, S., Kääb,… More

Xia, R., Loy, S., Kääb, S., Titova, A., Schulz, C., Massberg, S., Clauss, S. Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node. J. Vis. Exp. (171), e62236, doi:10.3791/62236 (2021).

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