ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Протокол, представленный здесь, обеспечивает пошаговый подход к выделению сердечных резидентных макрофагов из области синоатриального узла (SAN) и атриовентрикулярного узла (AVN) мышечных сердец.
Abstract
Было продемонстрировано, что резидентные сердечные макрофаги облегчают электрическую проводимость в сердце. Физиологический сердечный ритм инициируется электрическими импульсами, генерируемыми в синоатриальном узле (SAN), а затем проводится к желудочкам через атриовентрикулярный узел (AVN). Для дальнейшего изучения роли резидентных макрофагов в системе сердечной проводимости необходима правильная изоляция резидентных макрофагов от SAN и AVN, но это остается сложной задачей. Здесь мы предоставляем протокол для надежной микродиссекции SAN и AVN в сердцах мышей с последующей изоляцией и культивированием резидентных макрофагов.
Как SAN, который расположен на стыке crista terminalis с верхней полой веной, так и AVN, который расположен на вершине треугольника Коха, идентифицируются и микрорассекаются. Правильное расположение подтверждается гистологическим анализом ткани, выполненным с помощью трихромного пятна Массона и анти-HCN4.
Затем микродиссеченные ткани ферментативно перевариваются с получением одноклеточных суспензий с последующей инкубацией со специфической панелью антител, направленных против специфических поверхностных маркеров клеточного типа. Это позволяет идентифицировать, подсчитывать или изолировать различные клеточные популяции с помощью флуоресцентной активированной сортировки клеток. Чтобы дифференцировать сердечные резидентные макрофаги от других иммунных клеток в миокарде, особенно от макрофагов, полученных из моноцитов, необходима деликатная разработанная стратегия гатирования. Во-первых, клетки лимфоидной линии обнаруживаются и исключаются из дальнейшего анализа. Затем миелоидные клетки идентифицируются с резидентными макрофагами, определяемыми высокой экспрессией как CD45, так и CD11b, и низкой экспрессией Ly6C. При сортировке клеток изолированные сердечные макрофаги затем могут культивироваться in vitro в течение нескольких дней для дальнейшего исследования. Поэтому мы описываем протокол выделения сердечных резидентных макрофагов, расположенных в системе сердечной проводимости. Мы обсуждаем подводные камни в микрорассекании и переваривании SAN и AVN, а также предоставляем стратегию захвата для надежной идентификации, подсчета и сортировки сердечных макрофагов с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток.
Introduction
Синоатриальный узел (SAN) физиологически инициирует электрический импульс и, следовательно, является основным кардиостимулятором сердца. Атриовентрикулярный узел (AVN) проводит электрический импульс от предсердий к желудочкам, а также действует как вспомогательный кардиостимулятор1. В целом, генерация и проведение электрических импульсов является сложным процессом, который может модулироваться различными факторами2, включая резидентный макрофаг в областях SAN/AVN. Недавнее исследование Hulsmans et al. демонстрирует специфическую популяцию сердечных резидентных макрофагов, которые обогащены AVN и функционируют как ключевые игроки в поддержании устойчивого сердцебиения3. Они обнаружили, что макрофаги электрически связаны с кардиомиоцитами и могут изменять электрические свойства связанных кардиомиоцитов. Авторы также отмечают, что такие проводящие клетки, чередующиеся с макрофагами, присутствуют и в других компонентах системы сердечной проводимости, таких как SAN.
В настоящее время до конца не известно, отличается ли фенотип резидентных сердечных макрофагов между сердечными областями. Однако было показано, что микроокружение тканей может влиять на транскрипцию и пролиферативное обновление тканевых макрофагов4. Кроме того, поскольку было продемонстрировано, что фенотип кардиомиоцитов различается между областями, функциональное воздействие макрофагов на кардиомиоциты также может быть специфичным для региона, даже если сам фенотип макрофага может быть одинаковым. Поэтому необходимы дальнейшие исследования конкретных сердечных областей.
Недавние исследования показали, что в устойчивом состоянии тканевые резидентные макрофаги устанавливаются пренатально, возникая независимо от окончательного кроветворения, и сохраняются во взрослом возрасте5. Однако после истощения макрофагов или во время воспаления сердца моноциты Ly6chi способствуют пополнению популяции макрофагов сердца6. Исследования, включающие отслеживание генетической линии, парабиоз, картирование судьбы и отслеживание клеток, показали сосуществование различных популяций макрофагов-резидентов тканей в органах и тканях, а также различное клеточное поведение подмножеств макрофагов, которые потенциально связаны с их онтогенезом 7,8,9.
Характеристика резидентных сердечных макрофагов выиграла от использования магнитно-активированной сортировки клеток (MACS) и флуоресцентной активированной сортировки клеток. Эти методы особенно полезны для выделения специфических клеточных популяций из нескольких тканевых фракций путем маркировки их маркерами клеточной поверхности. Это не только приводит к более высокой чистоте изолированного типа иммунных клеток, но и позволяет проводить фенотипический анализ. Здесь мы представляем протокол, включающий магнитные клетки, покрытые шариками, с последующей флуоресцентной активированной сортировкой клеток для обогащения сердечных резидентных макрофагов, специально выделенных из области SAN и AVN.
Для изучения характеристик сердечных резидентных макрофагов в проводящей системе и их функции для сердечной проводимости и аритмогенеза решающее значение имеют точная локализация и рассечение SAN и AVN. Для микродиссекции SAN и AVN для идентификации региона10 используются анатомические ориентиры. Короче говоря, SAN расположен на стыке верхней полой вены и правого предсердия. AVN расположен в треугольнике Коха, который спереди граничит с перегородочным листком трикуспидального клапана, а сзади сухожилием Тодаро11. Мы также предоставляем точную процедуру микродиссекции SAN и AVN у мышей, что подтверждается гистологическим и иммунофлуоресцентным окрашиванием.
Изолированные резидентные макрофаги могут быть использованы для дальнейших экспериментов, таких как секвенирование РНК, или могут быть восстановлены и культивированы в течение более двух недель, что позволяет проводить различные эксперименты in vitro. Поэтому наш протокол описывает очень ценную процедуру для иммуноритмолога. В таблице 1 показан состав всех необходимых решений, на рисунке 1 показаны ориентиры микродиссекции для SAN и AVN. На рисунке 2 приведена схематическая иллюстрация локализации SAN и AVN. На рисунке 3 показано гистологическое окрашивание SAN и AVN (трихромное и иммунофлуоресцентное окрашивание Массона). На рисунке 4 показана пошаговая стратегия гатинга для изоляции сердечных резидентных макрофагов путем флуоресцентно-активированной сортировки клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Уход за животными и все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу за животными и этике Мюнхенского университета, и все процедуры, предпринятые на мышах, были одобрены правительством Баварии, Мюнхен, Германия. Мыши C57BL6/J были коммерчески получены.
1. Препараты
- Подготовьте буфер сортировки ячеек (таблица 1) и храните при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: В течение всей экспериментальной процедуры буфер сортировки клеток всегда должен находиться на льду. - Подготовьте буфер пищеварения (таблица 1) незадолго до переваривания, так как активность коллагеназы могла быть обнаружена только в течение нескольких часов при комнатной температуре.
- Обратитесь к ранее опубликованному протоколу приготовления блюда10 для вскрытия. Вкратце, добавьте 30 мл агарозного геля (3%-4%) в чашку Петри диаметром 100 мм и охладите при комнатной температуре.
2. Жертвоприношение животных и иссечение сердца
- Обезболивают мышь изофлураном, помещая его в инкубационную камеру, связанную с испарителем изофлурана и промывая 5% изофлураном/95% кислорода.
- После инъекции фентанила для обезболивания откройте грудную клетку и перфузируйте сердце, введя 5-10 мл ледяного 1x PBS непосредственно в левый желудочек (LV). Извлеките сердце мышей и положите его на тарелку для рассечения. Экспериментальные детали были подробно описаны ранее10.
3. Микродиссекция SAN и AVN
- После изоляции сердца выполните следующие процедуры микродиссекции в тарелке для рассечения с ледяным холодом 1x PBS под рассекающим микроскопом.
- Используйте анатомические ориентиры сердца, т.е. аорту, легочную артерию, коронарный синус, левый/правый желудочек и т.д. для определения левого/правого (слева: ЛЖ; правого: RV) и переднего/заднего (переднего: аорты; заднего: коронарного синуса) сердца. После того, как ориентация определена, оборачивайте сердце передней его частью на дне тарелки (чтобы обнажить крупные вены, которые расположены сзади).
- Микродиссекция SAN
ПРИМЕЧАНИЕ: Микродиссекция SAN была ранее описана10. Процесс кратко описан ниже.- Обнажите межкаваловую область, защемляя правые предсердные придатки (RAA) и ткань, прилегающую к верхней полой вене (SVC) и нижней полой вене (IVC) на микродиссекционной тарелке с помощью штифтов насекомых.
- Разрезаем сердце вдоль межпредсердной перегородки параллельно crista terminalis (CT), чтобы отделить межкаваловую область и получить образец SAN (рисунок 1A, рисунок 2A). Поместите образец в пустую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл на льду.
- Микродиссекция AVN
- После сбора образца SAN убедитесь, что РАА и части правого предсердия (РА) уже были отрезаны, оставив только межпредсердную перегородку (IAS) и межжелудочковую перегородку (IVS).
- Проведите оставшиеся части сердца через ткань, прилегающую к IAS и IVS, используя штифты насекомых, чтобы сделать правую предсердную сторону IAS обращенной вверх.
- Посмотрите на правое предсердие на поверхности эндокарда для треугольника Коха. Он будет окаймлен спереди шарнирной линией перегородчатого листа трикуспидального клапана (TV) и сзади сухожилием Тодаро. Отверстие коронарного синуса наблюдается у основания. (Рисунок 1B, Рисунок 2B).
- Вырежьте треугольник Коха, который содержит AVN, и непосредственно поместите его в пустую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл на льду.
4. Пищеварение
- Подготовьте буфер пищеварения (таблица 1) незадолго до использования.
- Измельчите ткань SAN и AVN скальпелями.
ПРИМЕЧАНИЕ: Измельчение ткани хорошо повысит эффективность пищеварения и поможет получить хорошую клеточную суспензию для сортировки. Поскольку образцы SAN и AVN довольно малы, рекомендуется измельчение ткани непосредственно внутри микроцентрифужной трубки объемом 1,5 мл для уменьшения потерь образца. - Добавьте 500 мкл буфера пищеварения на образец и смойте всю измельченную ткань со стенки пробирки микроцентрифуги объемом 1,5 мл. Мягкое пипетирование помогает переварить образец.
- Гомогенизируйте трубку на вихревой машине (настройки: 37 °C, 750 об/мин в течение 1 ч).
- После переваривания перенесите суспензию ткани в свежую центрифужную трубку объемом 15 мл, пройдя через клеточное ситечко 40 мкм. Промыть клеточный ситечко дополнительными 5 мл буфера сортировки клеток, чтобы остановить пищеварение.
- Центрифугировать трубку 15 мл при 350 х г в течение 7 мин при 4 °C. Затем удалите супернатант полностью с помощью пипетки. Повторное суспендирование гранулы ячейки с буфером сортировки клеток 90 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед магнитным разделением пипетку клеточной суспензии осторожно несколько раз или пройдите через 30-мкм клеточный сетчатый фильтр для удаления сгустков клеток, если это необходимо, для получения одноклеточной суспензии для оптимального выполнения магнитного обогащения интересных клеточных популяций.
5. Магнитное обогащение CD45 и окрашивание образцов
ПРИМЕЧАНИЕ: Для выделения сердечных макрофагов с высокой эффективностью сортировки исключение нежелательных клеток, включая лимфоциты, проводили с помощью микрошариков CD45 в соответствии с протоколом производителя. Основываясь на сортировочной панели, сердечные резидентные макрофаги были идентифицированы как CD45с высокимCD11bс высоким cd64высоким Ly6Cнизким / int F4 / 80высоким.
- Добавьте 10 мкл микрогранул CD45 на 107 общих клеток к клеточной суспензии в 15 мл центрифужной трубки. Хорошо перемешайте образцы и инкубируйте их в течение 15 мин при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчет клеток с помощью гемоцитометра должен быть кратковременным, чтобы убедиться, что каждая трубка содержит не более 107 общих клеток. При работе с более высокими числами ячеек объем магнитных шариков необходимо увеличить. - Приготовьте смесь антител путем разбавления следующих антител в буфере сортировки клеток (разведение 1:100 для каждого антитела): CD45-PE, CD11b-APC-Cy7, CD64-APC, F4/80-PE-Cy7, Ly6C-FITC. DAPI будет добавлен позже к окрашиванию для живой/мертвой дискриминации.
- После 15 мин инкубации магнитного шарика добавляют 100 мкл смеси антител непосредственно в клеточную суспензию в пробирке объемом 15 мл (тогда конечная концентрация всех антител составляет 1:200) и инкубируют в течение 20 мин при 4 °C.
- После 20 мин инкубации антител промыть клеточную суспензию, добавив 1-2 мл клеточного сортировочного буфера на 107 клеток и центрифугу при 350 х г в течение 10 мин. Полностью удалить супернатант путем пипетки.
- Повторное суспендирование до 108 ячеек в 500 мкл клеточного сортировочного буфера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальное число ячеек для магнитной сепарации должно определяться в соответствии с протоколом завода-изготовителя. - Подготовьте комплект магнитной сепарации.
- Прикрепите магнитную колонну к подходящему магнитному сепаратору и поместите коллекторную трубку под магнитную колонну.
- Подготовьте магнитные колонны, промыв с помощью буфера сортировки ячеек: добавьте 500 мкл буфера сортировки ячеек в верхней части столбца и дайте буферу пройти.
- Немедленно примените приостановку ячейки к столбцу во время прохождения буфера сортировки ячеек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков воздуха в колонне. В соответствии с протоколом производителя, хотя время заполнения колонны может изменяться в зависимости от условий хранения, оно не влияет на качество разделения. - Промывайте колонну буфером сортировки ячеек размером 3 x 500 мкл. Проточные на стадии 5.7 и стадии 5.8 содержат немаркированные ячейки, которые могут быть отброшены, если не требуется дальнейший эксперимент.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте буфер сортировки ячеек сразу же, когда резервуар столбца почти пуст. - Извлеките колонну из магнитного сепаратора и поместите ее на новую коллекторную трубку.
- Добавьте в столбец 1 мл буфера сортировки ячеек. Немедленно промыть колонну, плотно применив плунжер, поставляемый вместе с колонной. Проточный содержит магнитно меченые ячейки.
- Добавьте раствор DAPI во все собранные суспензии клеток с магнитной маркировкой незадолго до запуска их на сортировщике ячеек. Отрегулируйте конечную концентрацию DAPI до 0,3-0,5 мкг/мл.
- Выполните анализ FACS.
6. Образцы для компенсации
- Подготовьте 6 коричневых микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл с маркировкой «PE», «APC-Cy7», «APC», «PE-Cy7», «FITC» и «DAPI» соответственно для защиты антител от света. Подготовьте еще одну микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл с маркировкой «неокрашенная».
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть сделано одновременно с инкубацией клеточной суспензии с микрошариками и антителами. Незапятнанный образец может представлять собой ткань кардиомиоцитов, собранную случайным образом из сохраненной ткани сердца, а также обработанную в соответствии с этапом 4. - Разбавьте каждое отдельное флуоресцентно-конъюгированное антитело с буфером сортировки клеток в 1:50 в 1,5 мл коричневых микроцентрифужных трубках, которые помечены соответствующим образом.
- Добавить одну каплю раствора компенсационных шариков и инкубировать в течение 20 мин при 4 °C.
- Добавьте 2 мл клеточного сортировочного буфера в каждую 1,5 мл коричневой микроцентрифужной трубки и центрифугу при 450 х г в течение 5 мин. Полностью отбросьте супернатант и повторно суспендируйте шарик, содержащий гранулы, с буфером сортировки клеток 300 мкл и переложите их в трубки сортировщика ячеек, которые также помечены соответствующим образом.
7. Запуск на сортировщике ячеек и стратегия гатинга
- Сначала нанесите неокрашенные пробоотборники и компенсационные трубки и отрегулируйте напряжение каждого канала, чтобы выровнять как положительный, так и отрицательный пик в правильном положении оси. Сохраните параметры компенсации и примените их к следующим примерам.
- Примените образцы на сортировщике ячеек. Установите стратегию затвора, как показано на рисунке 4. Сердечные резидентные макрофаги идентифицируются как CD45с высокимCD11bс высоким cd64высокимLy6Cнизким / int F4 / 80высоким. DAPI используется в качестве маркера жизнеспособности клеток.
- Проверьте диаграммы проточной цитометрии, чтобы убедиться, что интересующая популяция клеток правильно показана на диаграммах. Если нет, отрегулируйте напряжение каждого канала в центральном представлении каждого графика.
- Если настройки напряжения удовлетворительны, запустите процедуру сортировки. Соберите отсортированную клеточную популяцию в культуральную среду, состоящую из ДМЭМ, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, дополненной 100 мкг/мл стрептомицина и 100 Ед/мл пенициллина.
8. Культура резидентных макрофагов
- После сбора отсортированных макрофагов перенесите клетки сразу либо на 35 мм тканей культуры посуды, либо на 24-луночную пластину, либо непосредственно используйте их для последующих экспериментов.
- Для культивирования отсортированных макрофагов инкубируют клетки при 37 °C, 5% CO2 инкубатора.
- Менять питательную среду каждые 48-72 ч. Плавающие мертвые клетки могут быть легко удалены путем изменения среды. Используйте живые макрофаги, прикрепленные к дну культуральной посуды для последующего эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описана практическая процедура выделения сердечных резидентных макрофагов конкретно из области SAN и AVN. Для подтверждения правильного рассечения проводится трихромное окрашивание Массона и иммунофлуоресцентное окрашивание HCN4 (рисунок 3)12. С помощью этого протокола мы могли бы собрать около 60 000 макрофагов из одного целого сердца. На рисунке 4 показана стратегия сортировки сердечных макрофагов. Живые резидентные сердечные макрофаги были идентифицированы как CD45 + CD11b + F4 / 80 + CD64 + Ly6C-. На рисунке 5 показаны свежеотсортированные сердечные макрофаги, которые были идентифицированы по их поверхностным антигенам CD45, F4/80 и CD11b. Свежеотсортированные клетки наблюдались под ярким полем микроскопа (рисунок 5A). Отсортированные клетки были положительными для CD45 (CD45+) при наблюдении под флуорофорно-ПЭ-каналом (рисунок 5B). Тот же вид отсортированных клеток при наблюдении под каналом флуорофор-APC-Cy7 показал фенотип CD11b+ (рисунок 5C). Тот же вид отсортированных клеток при наблюдении под каналом флуорофор-PE-Cy7 показал фенотип F4/80+ (рисунок 5D). Рисунок 5Е представляет собой объединенное изображение, полученное с помощью флуоресцентного микроскопа для отсортированных клеток. Эти тройные положительные клетки были идентифицированы как сердечные резидентные макрофаги. На рисунке 6 показаны изолированные сердечные макрофаги, культивируемые в среде до 6 дней. Белые стрелки указывают на макрофаги, черные стрелки указывают на плавающие мертвые клетки круглой формы.
Рисунок 1: Анатомия SAN и AVN под рассеченным микроскопом. (A) Анатомия SAN под рассеченным микроскопом. Местоположение SAN обозначается красной пунктирной линией в межколесной области (черные пунктирные линии). (B) Анатомия AVN под рассеченным микроскопом. Эта цифра была изменена по сравнению с ранее опубликованнойстатьей 10. AVN (красный пунктирный круг) расположен на вершине треугольника Коха (белый пунктирный треугольник) у дна перепончатой перегородки. Треугольник Коха образован сухожилием Тодаро (TT, зеленая пунктирная линия), трехстворчатым клапаном (TV, синяя пунктирная линия) и отверстием коронарного синуса (CS, желтая пунктирная линия). SVC, верхняя полая вена; IVC, нижняя полая вена; ИАС, межпредсердная перегородка; РА, правое предсердие; RAA, придаток правого предсердия; RV, правый желудочек; КТ, Криста терминалис; ИВС, межжелудочковая перегородка; ОФ, овальная ямка. ПА, легочная артерия; RV, правый желудочек; ЛЖ, левый желудочек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Схематическая иллюстрация локализации SAN и AVN. (A) схематическая иллюстрация локализации SAN. SAN обозначается красным пунктирным кругом в межкавалесной области помимо CT (черная пунктирная линия). (B) схематическая иллюстрация локализации AVN. AVN обозначается красным пунктирным кругом внутри треугольника Коха (серый пунктирный треугольник), состоящим из телевизора и отверстия CS. SVC, верхней полой вены; IVC, нижняя полая вена; ИАС, межпредсердная перегородка; РА, правое предсердие; RAA, придаток правого предсердия; КТ, Криста терминалис; ИВС, межжелудочковая перегородка; ОФ, овальная ямка; ИВС, межжелудочковая перегородка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Идентификация SAN и AVN с гистологическим пятном. Идентификация SAN (A,B) и AVN (C,D). Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток системы с положительной проводимостью HCN4 в SAN (A) и AVN (C), а также трихромное окрашивание Массоном SAN (B) и AVN (D). Красные стрелки указывают на синусовый узел артерии (SNA, B), черная стрелка и черная пунктирная линия указывают на компактный AVN, синяя стрелка указывает на центральное фиброзное тело (CFB). КТ, криста терминалис; CFB, центральная фиброза тела; CN, компактный AVN; РА, правое предсердие; RV, правый желудочек; ИАС, межпредсердная перегородка; ИВС, межжелудочковая перегородка; телевизор, трехстворчатый клапан; МВ, митральный клапан. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Стратегия гастинга для клеточной сортировки резидентных сердечных макрофагов. Мононуклеарные клетки идентифицируются, дублеты исключаются FSC-W против FSC-A, а мертвые клетки исключаются DAPI (A-D). Живые клетки закрываются на CD45+ лейкоциты (E), а затем на CD11b + миелоидные клетки (F). Сердечные макрофаги были идентифицированы экспрессией как F4/80, так и CD64 (G), а затем, наконец, стратифицированы экспрессией Ly6C (H). Живые резидентные сердечные макрофаги идентифицируются как CD45 + CD11b + F4 / 80 + CD64 + Ly6C-. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Свежеотсортированные сердечные макрофаги и иммунофлуоресцентное окрашивание. (А) Свежеотсортированные сердечные макрофаги. Иммунофлуоресцентное окрашивание специфических поверхностных антигенов, таких как CD45 (B), CD11b (C) или F4/80 (D). Согласно стратегии гатинга, сердечные макрофаги идентифицируются как тройные положительные клетки (E). Шкала представляет 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Культура отсортированных макрофагов. Культивирование отсортированных макрофагов в питательной среде в течение 48 ч (А, В), 96 ч (С,D) и 6 дней (Е,Ф) соответственно. Показаны две отдельные блюда культуры за точку времени (блюдо 1: A, C, E; блюдо 2: B, D, F). Белыми стрелками обозначены живые макрофаги с веретенообразной формой и типичными выступами3. Черные стрелки указывают на плавающие мертвые клетки круглой формы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Соединение | Конечная концентрация | требуется г или мл |
| Буфер FACS | ||
| БСА | 0.50% | |
| ЭДТА | 2 мМ | |
| ПБС (1X) | 500мл | |
| Буфер пищеварения | ||
| Коллагеназа I | 450 ЕД/мл | |
| Коллагеназа XI | 125 ЕД/мл | |
| ДНКаза I | 60 ЕД/мл | |
| Гиалуронидаза | 60 ЕД/мл | |
| Буфер HEPES | 20 мкл на 1 мл | |
| ПБС (1X) | Добавьте до 1 мл на 2 образца | |
| Культуральная среда | ||
| ДМЭМ | 79 мл | |
| Пенициллин/стрептомицин | 1% | 1 мл |
| ФБС | 20% | 20 мл |
| ТАЭ (50x) | ||
| Трис-база | 24.20% | 24.2 г |
| 100 % уксусная кислота | 5.71% | 5.71 мл |
| 0,5 МЛН ЭДТА | 0.05 млн | 10 мл |
| dH2O | Добавьте до 100 мл | |
Таблица 1: Состав необходимых растворов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой рукописи мы описываем протокол обогащения сердечных резидентных макрофагов конкретно из областей SAN и AVN с высокой чистотой.
Макрофаги делятся на субпопуляции в зависимости от их анатомического расположения и функционального фенотипа. Они также могут переключаться с одного функционального фенотипа на другой в ответ на переменные микроокружающие сигналы13. По сравнению с другими органами, такими как костный мозг и печень, сердечная ткань содержит более низкий процент иммунных клеток и более низкое абсолютное число каждой клеточной субпопуляции14. Поэтому методы сортировки, обогащения и очистки клеток являются необходимыми инструментами для получения достаточного количества интересующей клеточной популяции. Флуоресцентно-активированная сортировка клеток и MACS позволяют получать чистые, отсортированные клеточные популяции, поскольку это позволяет одновременно измерять различные свойства клеток.
Описаны различные панели проточной цитометрии для идентификации субпопуляций макрофагов сердца 3,6,15. Функция макрофагов в устойчивом состоянии и заболевания зависит не только от их развития, но и от тканевой среды. В целом, сердце взрослого человека содержит два основных подмножества макрофагов Ly6Clow/CCR2-резидентных, которые экспрессируют различные уровни MHC-II и которые могут поддерживать себя через локальную пролиферацию в устойчивом состоянии, тогда как во время болезни классическиевысокие моноциты Ly6C набираются в места воспаления, где они дифференцируются в макрофаги16 . Во время развития различные субпопуляции макрофагов занимают разные сердечные локализации, связанные с различными функциями17. Мы стремились изучить резидентные макрофаги конкретно из системы сердечной проводимости, особенно резидентные макрофаги из областей SAN и AVN. По данным Hulsmans et al., сердечные резидентные макрофаги идентифицированы как CD45с высоким CD11bс высокимCD64высокимF4 / 80высокимLy6Cнизким / int.
Сбор сердечных резидентных макрофагов с одной взрослой мыши для сортировки клеток занимает примерно 3 часа. Важно логически организовать экспериментальные процедуры и обеспечить параллельную инкубацию, чтобы сэкономить время и свести к минимуму обработку потенциально хрупких макрофагов в суспензии. Поскольку процедура сортировки может оказывать давление на отсортированные ячейки, мы рекомендовали сократить время сортировки с помощью магнитных шариков, которые могут значительно повысить эффективность сортировки, а также позволяют получить более высокую чистоту резидентных макрофагов.
Применение этого протокола включает, но не ограничивается очисткой макрофагов и/или любого другого некардиомиоцитарного типа клеток из сердечной ткани и любых других штаммов мышей. Отсортированные макрофаги могут быть использованы для последующих экспериментов, например, анализ подвижности клеток, исследований экспрессии генов или белков и т. Д. Секвенирование одноклеточной РНК также возможно путем сбора клеток по одной непосредственно из собирательной трубки клеточного сортировщика.
Однако сортировка клеток на основе проточной цитометрии имеет свои ограничения. Точно разработанная панель антител важна и должна учитывать экспрессию антигенов на интересующей популяции клеток и флуорофоре, конъюгированном с антителами. Функция и жизнеспособность клеток могут быть изменены связывающими антителами, что может повлиять на результаты последующих экспериментов. Кроме того, сложные инструменты сортировки ячеек являются дорогими, сложными, а также подвержены проблемам с блокировками жидкостных систем и лазерной калибровкой. Следовательно, требуется техническое обслуживание высококвалифицированным специалистом и надлежащая эксплуатация опытным профессиональным техником. Несмотря на то, что сортировка клеток может обеспечить чистую популяцию клеток, представляющую интерес, общая эффективность все еще относительно низка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
О потенциальном конфликте интересов, имеющем отношение к этой статье, не сообщалось.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Китайским стипендиальным советом (CSC, R. Xia), Немецким центром сердечно-сосудистых исследований (DZHK; 81X2600255 для S. Clauss, 81Z0600206 для S. Kääb, 81Z0600204 для C.S.), Фондом Corona (S199/10079/2019 для S. Clauss), SFB 914 (проект Z01 для S. Massberg), ERA-NET по сердечно-сосудистым заболеваниям (ERA-CVD; 01KL1910 для S. Clauss) и Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (для S. Clauss). Спонсоры не играли никакой роли в подготовке рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories |
References
- Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes. Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R.
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Pinto, A. R., et al.
- Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
Tags
Медицина выпуск 171 система сердечной проводимости синоатриальный узел атриовентрикулярный узел резидентные макрофаги сердца проточная цитометрия магнитно-активированная сортировка клеток MACS флуоресцентно-активированная сортировка клеток микродиссекция первичная клеточная культураErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node
Posted by JoVE Editors on 02/02/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU)
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU)
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU)
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
