Summary
우리는 설치류와 인간 과목의 뇌 조직에서 전 생체 생물학적 샘플에서 actin 필라멘트의 정량화를위한 간단하고 시간 효율적이고 높은 처리량 형광 분광 기반 분석법을보고합니다.
Abstract
세포 골격의 주요 구성 요소인 액틴은 신경 구조와 기능의 유지 에 중요한 역할을 합니다. 생리학적 상태에서 액틴은 모황 구형(G-actin) 및 중합된 필라멘트(F-actin)의 두 가지 형태의 평형에서 발생합니다. 시냅스 단자에서 액틴 세포골격은 중요한 시냅스 기능의 기초를 형성합니다. 더욱이, 액틴 중합 상태의 동적 변화(구형 및 필라멘트 형태의 액틴 간의 상호 변환)는 시냅스 구조 및 기능의 가소성 관련 변화에 밀접하게 연관되어 있다. 우리는 여기에 전 생체 조건에서 actin의 중합 상태를 평가하기 위해 변형 된 형광 기반 방법론을보고합니다. 이 분석법은 형광라벨이 부착된 플라로이드인을 사용하며, 이는 특히 액틴 필라멘트(F-actin)에 결합하여 중합화된 필라멘트 액틴을 직접 측정합니다. 원칙의 증거로, 우리는 설치류와 사후 인간 뇌 조직 균질화분석의 적합성에 대한 증거를 제공합니다. 라트룬큘린 A(액틴 필라멘트를 비합한 약물)를 사용하여, 우리는 F-액틴 수준에서 변경을 모니터링하는 분석의 유용성을 확인합니다. 또한, 우리는 높은 세포외 K+를가진 탈극화에 의한 자극시 증가된 액틴 중합화를 확인하는 고립된 시냅스 말단의 생화학적 분획으로 분석법을 확장한다.
Introduction
Cytoskeletal 단백질 액틴은 구조적 지지, 세포 수송, 세포 운동성 및 분열을 포함한 다중 세포 기능에 관여합니다. 액틴은 단일황 구형 액틴(G-actin) 및 중합필액트액틴(F-actin)의 두 가지 형태로 평형에서 발생한다. actin의 중합 상태의 급속한 변화 (G-와 F-형태 간의 상호 변환)는 신속한 필라멘트 조립 및 분해를 초래하고 세포 생리학에서 의 규제 역할을 기초로합니다. 액틴은 뉴런 사이토켈레탈 구조의 주요 성분을 형성하고 광범위한 뉴런 기능1,2에영향을 미친다. 참고로, 액틴 세포골격은 시냅스 단자의 구조 플랫폼의 필수적인 부분을 형성한다. 이와 같이, 시냅스 형태발생 및 생리학의 주요 결정자이며 시냅스3,4,5의크기, 수 및 형태에 대한 제어에 근본적인 역할을 한다. 특히, 동적 액틴 중합-중합제는 기억 및 학습 과정의 근간이 되는 시냅스 가소성과 관련된 시냅스 리모델링의 핵심 결정자이다. 실제로, 두 사전 시냅스(예:신경 전달물질 방출6,7,8,9,10)및 포스트냅스 기능(가소성 관련 동적 리모델링11,12,13,14)액틴 사이토스켈레톤의 중합 상태의 동적 변화에 비판적으로 의존한다.
생리학적 조건하에서, F-actin 수준은 번역 후 변형4,15,16뿐만 아니라 액틴결합 단백질(ABP)4,17을포함하는 다중 모달 통로를 통해 동적으로 엄격하게 조절된다. ABP는 여러 수준(예: 중합재 의 활성화 또는 억제, 필라멘트 분기 유도, 작은 조각으로 필라멘트의 단절, 중합을 촉진하고, 비합화로부터 보호)에서 액틴 역학에 영향을 미칠 수 있으며, 다양한 외세포 신호18,19,20에민감한 엄격한 변조 제어 하에 차례로 발생한다. 여러 수준에서 이러한 규제 검사는 시냅스 세포 골격에서 actin 역학의 엄격한 규제를 지시, 미세 조정 사전 튜닝 사전 및 기초 및 활동 유도 상태에서 신경 생리학의 포스트 냅스 측면.
신경 생리학에서 actin의 중요한 역할을 감안할 때, 여러 연구가 신경 변성, 심리질환뿐만 아니라 신경 발달 질환3,21,23,24,25,26, 27을포함한 광범위한 신경 질환에 연결된 중요한 병원성 이벤트로서 actin 역학의 변경에 대한 증거를 제공한 것은 놀라운 일이 아니다. 그러나, 중요한 격차는 특히 시냅스 세포골격에서 actin 역학의 이해에 남아 있는 신경 생리학 및 병리 생리학에 있는 actin의 중요한 역할을 가리키는 연구 데이터의 부에도 불구하고, 그러나, 중요한 간격은 아직도 actin 역학의 이해에 남아 있습니다. 더 많은 연구 연구는 신경 actin및 병리학 적인 조건 하에서 그것의 변경의 더 나은 이해가 필요 합니다. 이러한 맥락에서 초점의 한 가지 주요 영역은 액틴 중합 상태의 평가입니다. 서양 블로팅 기반 상용 키트가 있습니다 (생체 분석 생화학 키트의 G-Actin / F-Actin; 사이토스켈레톤 SKU BK03728,29)및 F-액틴 레벨6의평가를 위한 홈메이드 아세서. 그러나, 이들은 F-actin와 G-actin의 생화학적 격리를 필요로 하고 그들의 후속 정량화는 면역 blotting 프로토콜에 근거하기 때문에, 그(것)들은 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 본 명세서에서는 F-actin의 기저 수준과 조립 분해의 동적 변화를 평가하는 데 사용할 수 있는 수정으로 이전 연구30에서 조정된 형광 분광계 분석법을 보고합니다. 특히, 우리는 현재 96 웰 플레이트 포맷에 1mL 큐벳에 적합한 샘플을 필요로하는 원래 프로토콜을 효율적으로 수정했습니다. 따라서 수정된 프로토콜은 분석에 필요한 조직/샘플 양을 크게 감소시켰습니다. 또한, 우리는 프로토콜이 뇌 조직 균질화뿐만 아니라 고립 된 시냅스 말단 (시냅토좀 및 시냅토신경좀)과 같은 세포 외 분획에도 적합하다는 증거를 제공합니다. 마지막으로, 분석은 새로 해부 된 설치류 뇌 조직과 장기 저장된 사후 인간 뇌 샘플에 사용할 수 있습니다. 참고, 분석 신경 컨텍스트에서 제시 하는 동안, 그것은 적절 하 게 그들과 관련 된 다른 세포 유형 및 생리 과정에 확장 될 수 있습니다.
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Protocol
모든 실험 절차는 오타고 대학의 윤리위원회의 규정에 따라 실험실 동물의 치료 및 사용에 관한 규정에 따라 수행되었습니다 (윤리 프로토콜 번호. AUP95/18 및 AUP80/17) 및 뉴질랜드 의회. 인간의 뇌 조직은 바르셀로나, 스페인에 있는 병원 Clínic-IDIBAPS BioBank의 신경 조직 은행에서 취득되었습니다. 모든 조직 수집 프로토콜은 병원 Clínic의 윤리위원회에 의해 승인되었다, 바르셀로나, 통보 된 동의는 가족에서 얻은.
1. 버퍼 및 시약 준비
- 뇌 조직의 균질화 및 시냅스 말기의 농축 된 분수의 준비를 위해 다음과 같은 버퍼를 준비하십시오.
균질화 버퍼: 5 mM HEPES, pH 7.4 0.32 M 자당으로 보충
재서스펜션 버퍼: 5 mM Tris, pH 7.4 0.32 M 자당으로 보충
세척 버퍼 : 5 mM 트리스, pH 8.1
1.2 M 자당
1.0 M 자당
0.85 M 자당 - 프로테아제와 인산염 억제제의 수제 또는 상업적 혼합을 추가합니다.
참고: 우리는 완전한 프로테아제 억제제 믹스 (10 mL 버퍼 당 1 정)와 포스파타제 억제제 칵테일 IV (1:100; 볼륨 : 볼륨)의 EDTA가없는 버전을 사용했습니다. - 다음 버퍼 및 시약을 준비하여 펠로이드의 고정, 투과성 및 바인딩을 준비합니다.
크렙스 버퍼: 118.5 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgCl2,2 mM CaCl2,0.1 mM KH2PO4,5 mM NaHCO3,10mM 포도당, 20 mM HEPES, pH 7.4
1 M KCl
25% 글루타랄데히드 (스톡 솔루션)
크렙스 버퍼 포함 0.1% 트리톤 X-100 및 1 mg/mL NaBH4
400x 알렉사 플루어 647 DMSO의 팔로이드인
0.32 M 자당함유 크렙스 버퍼
DMSO의 50 μM 라트런큘린 A(스톡 솔루션)
1 M KCl (스톡 솔루션)
주의: 판로이드는 독성 (LD50 = 2 mg /kg) 조심스럽게 처리해야합니다. 글루타랄데히드의 흡입은 독성이 있으며 연기 후드로 처리해야합니다. - 버퍼를 4°C및 프할로이딘 및 라트룬쿨린 A에 -20°C에 저장하여 장기 보관합니다.
참고: 버퍼의 장기 저장소는 권장되지 않습니다. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
2. 뇌 조직 균질화
- 포터-엘베젬 유리 튜브에서 10권의 균질화 완충제에서 냉동 보존 또는 갓 해부된 쥐 뇌 조직을 균질화하고 얼음 위에 유봉합니다.
참고: 최적의 균질화는 뇌 조직을 위해 손으로 유봉의 15-20 스트로크에 의해 달성됩니다. 유리 튜브를 통한 서스펜션의 원활한 흐름에 의해 성공적인 균질화를 확인할 수 있다. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. - 브래드포드 분석31을사용하여 동종모네이트의 단백질 농도를 결정한다.
참고: 단백질 추정을 위한 대체 수제 또는 상업적인 소법도 사용될 수 있습니다. - 크렙스 버퍼의 균질화 샘플을 50 μL의 부피로 2-3 mg 단백질/mL 농도로 희석시 희석시.
참고 : 일부 실험에서, 우리는 1 h에 대한 37 ° C에서 2 μM 라트런큘린 A 또는 DMSO (컨트롤)로 균질화를 배양. 이를 위해 균질화는 크렙스 버퍼48μL로 재주항되며, 50 μM 라트런큘린 A 또는 DMSO 2 μL의 2μL이 첨가된다. 면역블로팅을 위해, 소량의 시료(10 μg)가 인큐베이션 후 수집된다. - 균등질 샘플을 수정합니다(섹션 5).
3. 고립 된 신경 단말의 준비
- 시냅토좀 의 준비
참고: 시냅토좀의 대체 프로토콜32,33도 사용할 수 있습니다.- 원심분리기 뇌는 4°C에서 10분 동안 1,200 x g에서 동형으로 항성합니다.
- 원유 핵 분획인 펠릿을 폐기하십시오.
- 추가 원심분리기 상류체(S1)는 4°C에서 15분 동안 12,000 x g에서 3.1.1 단계에서 수득하였다.
- 수용성 세포질 분획인 상체(S2)를 제거합니다.
- 3.1.3 단계에서 얻은 펠릿(P2)을 다시 중단하는 것은 재서스펜션 버퍼에서 원유 시냅토소말 분획이다.
참고: 재서스펜션 버퍼의 양은 시작 조직의 양과 얻은 펠릿의 양에 따라 달라집니다. 예를 들어, 뇌 조직의 150-300 mg으로 시작할 때, 얻어진 펠릿은 200 μL의 재서스펜션 버퍼에서 재장중단될 수 있다. - 재중단된 원유 시냅토솜을 0.85-1.0-1.2 M 의 동일한 부피로 만든 불연속 자당 그라데이션에 로드합니다.
참고: 우리는 일반적으로 사용 1 mL 자당 용액의 각 (에 대 한 150-300 mg 조직). 이것은 더 큰 조직 양을 위해 변경될 수 있습니다. 불연속 그라데이션은 초원심분리기 튜브의 내부 벽에 압착된 25G 주사기를 사용하여 만들 수 있으며, 자당층의 부드러운 층화를 할 수 있다. - 원심분리기는 85,000 x g에서 4°C에서 2시간 동안.
참고: 원심분리의 고속으로 인해 난방을 줄이기 위해 진공을 만들 수 있는 초원심분리기가 필요합니다. - 200 μL 파이펫 팁을 사용하여 1.0과 1.2 M 자당 사이의 인터페이스에서 시냅토소말 분획을 수집합니다.
- 시냅토소말 분획을 4°C에서 10분간 18,000 x g에서 원심분리로 원심분리하여 시냅토소말 분획을 세척합니다.
참고: 세척의 경우, 1.0 mL 및 1.2M 자당계에서 얻은 시냅토소말 분획은 신선한 1.5mL 튜브에서 수집되고, 동일한 양의 세척 버퍼가 첨가되어 매체로부터 높은 자당의 제거를 보장한다. - 시냅토소말 펠릿을 얼음냉균질화 버퍼로 4°C에서 10분간 12,000g으로 다시 세척합니다.
- 얼음에 균질화 버퍼에서 시냅토솜을 다시 일시 중지합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 잠시 일시 중지할 수 있습니다. - 브래드포드 분석서를 사용하여 단백질 농도를 결정합니다.
- Krebs 완충제의 시냅토좀을 50 μL의 부피에서 2-3 mg 단백질/mL의 농도로 재보페한다(시냅토좀이 KCl에 의해 탈극화될 경우 47.5 μL; 섹션 4 참조).
참고: 재서스펜션의 경우 시냅토소말 분획은 먼저 12,000 x g에서 4°C에서 5분 동안 회전하고 상체(buffer)가 제거됩니다. 시냅토소말 펠릿은 200 μL 파이펫 팁을 사용하여 부드러운 파이펫팅으로 크렙스 버퍼에서 다시 수주됩니다. - 탈극화를 진행합니다(섹션 4).
- 시 냅 토 신경증의 준비
참고: 시냅토신경좀의 대체 프로토콜34,35도 사용할 수 있다.- 1 mL 주사기를 사용하여 필터 홀더에 100 μm 모공 크기의 미리 습윤된 그물 필터를 통해 뇌를 균일지게 전달합니다.
참고: 모든 필터의 사전 습윤은 시료 손실을 방지하는 것이 중요하며 균질화 버퍼를 사용하여 수행해야 합니다. 이를 위해, 균질화 버퍼는 버퍼가 유출될 때까지 1mL 주사기를 사용하여 필터 홀더의 필터를 통과한다. - 얼음 에 미리 차가운 1.5 mL 튜브에 여과 (F1)를 수집합니다.
- F1 분획에 대한 프로세스(3.2.1 및 3.2.2 단계)를 반복하여 두 번째 여과(F2)를 얻습니다.
- 5 μm 모공 크기의 그물 필터를 통해 F2 여과를 전달합니다.
- 얼음 에 미리 차가운 1.5 mL 튜브에 여과 (F3)를 수집합니다.
- 원심분리기 는 4 °C에서 10 분 동안 1,500 x g에서 F3를 여과합니다.
- 50 μL의 부피에서 2-3 mg 단백질/mL의 농도에서 얼음에 크렙스 버퍼 (시 냅 토 신경좀)에서 펠릿 (시 냅 토 신경좀)을 다시 중단 (47.5 μL 시 냅 토성 KCl에 의해 탈극화 될 경우; 섹션 4 참조).
참고: 프로토콜은 여기에서 잠시 일시 중지할 수 있습니다. - 브래드포드 분석서를 사용하여 단백질 농도를 추정합니다.
- 탈극화를 진행합니다(섹션 4).
- 1 mL 주사기를 사용하여 필터 홀더에 100 μm 모공 크기의 미리 습윤된 그물 필터를 통해 뇌를 균일지게 전달합니다.
4. KCl 매개 분리된 시냅스 단자의 탈극성
- 시냅토좀/시냅토신경좀을 37°C에서 5-10분 동안 평형화한다.
- 37°C에서 30s에 대해 세포외 K+를 50mM로 늘리고 각 자극되지 않은 제어 세트에 크렙스 버퍼의 동일한 부피를 추가하기 위해 KCl을 추가하여 시냅토좀/시냅토신경좀을 자극한다.
참고: 예를 들어, 크렙스 버퍼의 47.5 μL에서 다시 중단된 시냅토좀에 1M KCl의 2.5 μL을 추가합니다. 그리고 각각의 자극되지 않은 제어 시냅토솜에 크렙스 버퍼의 2.5 μL을 추가합니다. 많은 수의 샘플이 관여하는 실험의 경우, 탈극화 시간이 30s를 초과하지 않도록 한 번에 2개 이상의 시료를 진행하지 않습니다. - 글루타랄데히드(섹션 5)를 추가하여 자극을 종료합니다.
5. 시료의 고정 및 팔로이진 염색
- 실온에서 2-3 분 동안 2.5 %의 최종 농도에 호모게네이트 / 시냅토소말 / 시냅토 신경소말 샘플에 글루타랄데히드를 추가합니다.
참고: 50μL 샘플(균질제/시냅토좀/시냅토신경좀)에 글루타랄데히드의 최종 농도가 2.5%가 되도록 25%의 글루타랄데히드 용액의 6μL을 추가했습니다. 고정은 중요하고 빠르므로 글루타랄데히드를 추가한 직후, 시료는 적극적으로 소용돌이쳐야 합니다. - 샘플을 5분 동안 20,000 x g로 퇴적시합니다.
- 상부체를 제거합니다.
참고: 글루타랄데히드가 독성이 있기 때문에 연기 후드에 상체를 버리십시오. - 0.1% 트리톤 X-100 및 1 mg/mL NaHB4를 함유한 크렙스 버퍼의 100 μL에서 실온에서 2-3분 동안 환액하여 펠릿을 페메아빌화한다.
- 샘플을 5분 동안 20,000 x g로 퇴적시합니다.
- 투과화 버퍼를 제거합니다.
- 200 μL의 Krebs 버퍼로 펠릿을 20,000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세척합니다.
- 1x 알렉사 플루어 647 Phalloidin (500 μU에 해당)으로 펠릿을 실온에서 10 분 동안 10 분 동안 버퍼링합니다.
참고: 다른 종류의 형광 판로이딘 유사체는 시판되고 분석용으로 대체될 수 있습니다. 판로이드의 농도와 배큐어의 총 샘플 부피는 테스트되는 조직 /샘플의 양 및 유형에 따라 수정되어야 할 수 있으며 최적의 조건은 그에 따라 표준화되어야합니다. - 5 분 동안 20,000 x g에서 스테인드 샘플을 원심 분리합니다.
- 언바운드 프할로이딘(상수)을 제거합니다.
- 크렙스 버퍼 200μL로 샘플을 5분 동안 20,000 x g에서 원심분리하여 세척합니다.
- 0.32 M 자당을 포함하는 크렙스 버퍼의 200 μL에서 재중단.
참고: 프로토콜은 여기에서 잠시 일시 중지할 수 있습니다.
6. 불소 분석 및 광 산란
- 블랙 96웰 플레이트에 알렉사 플루어 647 판로이드 염색 샘플을 분배합니다.
- 645nm의 발산 파장과 실온에서 플레이트 판독기에서 670nm의 방출 파장에서 형광 강도를 측정합니다.
- 200 μL 파이프 팁을 사용하여 검은 색 96 웰 플레이트에서 투명 96 웰 플레이트로 샘플을 전송합니다.
- 540nm에서 광 산란을 측정하여 고정, 투과화 및 염색의 이전 단계에서 발생할 수 있는 손실을 수정합니다.
참고: 스테인드 샘플에 유지되는 생물학적 물질의 변이는 더 적은 양의 시작 재료에 대해 더 두드러질 수 있습니다(토론 참조). - 다른 농도에서 Krebs 버퍼에 있는 알렉사 플루어 647 Phalloidin 세트를 포함 (0.05 x, 0.1 x, 0.25 x, 0.35 x, 0.75 x, 0.5 x 및 1x 에 해당 25, 50, 125, 175, 250, 375 및 500 μu) 각 배치의 경우.
참고: 이것은 선택적 단계이며 특히 F-액틴 수준이 상대적인 방식으로 표현될 때 분석 결과에 영향을 미치지 않습니다(섹션 7). 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
7. 데이터 분석
- 시료의 F-액틴의 양은 바운드 판로이드의 형광 강도에 직접 비례한다. 태그된 프할로이딘 표준의 선형 곡선으로부터 계산된 팔로이드진 바운드 단위의 절대적인 측면에서 표현한다.
참고: 예를 들어 그림 2A-B, 3A, 4A-B 및 보충 도 2를참조하십시오. - 제어 샘플의 일부로 F-액틴 수준을 표현합니다.
참고: 예를 들어 그림 5A-B를참조하십시오.
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Representative Results
F-액틴 레벨 평가를 위한 분석의 선형성
먼저, 알렉사 플루어(647)의 형광의 선형 증가를 위한 표준 곡선을 확인하였으며 각 실험세트(도 1)에대해 반복되었다. 분석의 선형 범위를 조사하기 위해 설치류(그림 2A 및 2B)와 사후 인간 과목(그림3A 및 3B)으로부터다양한 양의 뇌 균질화가 처리되었다. 상기 분석체는 라벨이 부착된 판로이드의 양에 의해 평가된 단백질의 50-200 μg 범위에서 선형으로 나타났다. 540 nm에서 광 산란은 샘플의 상이한 양을 확인하는 데 사용되었다(도 2C 및 도 3C).
라트룬큘린, 액틴 폴리머리징 제는 라벨이 부착된 남근의 결합을 감소시킵니다.
라트룬큘린 A는 액틴 필라멘트를 비합하고 F-액틴36,37,38,39의수준을 감소시키는 것으로 알려져있다. 설치류 또는 인간의 뇌 조직에서 균질화는 액틴 필라멘트를 부정하기 위해 37 °C에서 1 시간 동안 2 μM 라트런큘린 A로 배양되었다. 각각의 처리되지 않은 대조군 세트는 37°C에서 1시간의 동일한 지속 시간 동안 DMSO로 배양되었다. 분석법은 제어 샘플에서 95.7 ± 6.6(평균 ± SEM)에서 72.0 ± 3.2(평균 ± SEM) μU에서 설치류 뇌균질에서 A-처리 샘플의 농도를 강력하게 측정하였다(그림4A). 유사한 감소(83.7 ± 3.9에서 66.9 ± 4.2 μU)는 인간 뇌 조직으로부터 균질화될 때 라트런큘린 A치료(도 4B)를받게 될 때도 관찰되었다. 주목할 만한, 총 액틴 수준, 면역 blotting에 의해 평가된 바와 같이,쥐(보충도 1A-B)와 인간(보충도1C-D)뇌 균질화 모두에서 라트런큘린 A로 치료에 따라 변경되지 않았다.
격리된 시냅스 단자의 탈극성은액틴 중합및 필라멘트 형성을 자극합니다.
전생체분열단의 전생체탈극은 액틴중합6,30,40의신속한 자극을 초래하는 것으로 나타났으며, 본명 보고분석의 추가 확인으로 사용되었다. 시냅스 말기에서 농축된 생화학적 분획은 두 가지 다른 방식으로 제조되었다; 그라데이션 계 초원심분리방법은 "시냅토좀"41,42,43,44 및 순차여기반 프로토콜을 획득하여 "시냅토신경"43,45,46을획득한다. 후자의 수율이 높기 때문에, 우리는 조직 양이 종종 제한되는 인간 사후 뇌 조직에 사용했습니다. 다른 한편으로는, 우리는 우리의 쥐 두뇌 조직 실험에 대 한 시 냅 스 조각의 농축의 높은 정도 시 냅 토솜을 사용 하 여 선호41.
시냅토좀 또는 시냅토신경좀의 탈극화 및 액틴 중합의 자극은 세포외 K+에서 50mMM로 짧은(30초) 증가에 의해 달성되었다. KCl 노출은 각각의 모의 자극 대조군(도5A; 보충도 2A참조)에 비해 설치류 뇌 시냅토좀에서 거의 40% 증가된 프할로이드인 결합을 초래하였다. 더 작은 (약 20%) 그러나 일관된 증가는 또한 KCl으로 취급된 인간 시냅토신경성에서 관찰되었다(도 5B;또한 보충 도 2A참조). 이 실험은 고립된 시냅스 말기를 포함하여 뇌 조직 샘플에서 F-actin 수준에 있는 변경을 결정하는 우리의 분석의 견고성을 검증합니다.
그림 1. 알렉사 플루어 647 팔로이드의 형광을 위한 표준 곡선. 라벨이 부착된 팜로이드인의 상이한 양(25-500 μU)의 형광 방출의 선형성은 645nm의 발산및 670nm(R2 = 0.9942)의 방출에서 형광 분광법에 의해 확인되었다. 데이터는 평균 ± SEM(n=3)으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 전세포에 결합하는 프할로이딘의 선형성은 쥐 뇌 조직에서 균질화됩니다. (A)상이한 양의 균질화(50-300 μg 단백질)에 대한 판로이드의 결합을 평가하였다. (B)결합은 50-200 μg 단백질(R2 = 0.9602)의 범위에서 선형적이었다. (C)540 nm에서 산란하는 샘플의 상이한 양을 확인하는 데 사용되었다(R2 = 0.8319). 데이터는 평균 ± SEM(n=4)으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 전세포에 결합하는 Phalloidin은 사후 인간 뇌 조직에서 균질화합니다. (A)판로이드의 양이 균질화(50-300 μg 단백질)의 범위에서 유지되는 것을 평가하였다. (B)Phalloidin 결합은 50-200 μg 단백질 (R2 = 0.8832)의 범위에서 선형으로 나타났다. (C)540 nm에서 산란하는 것은 샘플의 다양한 양을 확인하였다(R2 = 0.9730). 데이터는 평균 ± SEM(n=4)으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. F 액틴 수준에 라트런큘린 A의 효과. 액틴 폴리머리징제 라트룬쿨린 A(2 μM)를 가진 뇌균질성 치료, 37°C에서 1h)는 설치류(p = 0.0034; 쌍2꼬리 학생의 t-test)(A)및 사후 인간조직(p= 0.001) -t-)에서 라벨이 붙은 팔로이드의 유지에 의해 평가된 바와 같이 각각의 모의 처리 대조료 샘플에 비해 액틴 필라멘트의 양이 현저한 감소로 나타났다. 데이터는 평균 ± SEM(n=6 쌍)으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 분리된 시냅스 단자에서 F-액틴 양에 대한 KCl 매개 탈극화의 효과. (A)37°C에서 30mM KCl을 가진 쥐 뇌로부터 시냅토좀을 배양하여 판로이딘 결합의 증가를 초래하였다(p = 0.0014; 쌍이 두 꼬리학생의 t-test). (B)더 작은 증가는 또한 사후 인간 뇌 조직에서 시냅토신경소말 분획에서 관찰되었다 (p = 0.014; 쌍 두 꼬리 학생의 t-test). 데이터는 평균 ± SEM(n=6 쌍)으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1. 총 액틴 레벨에 라트런큘린 A의 효과. 뇌 균질화는 라틀컬린 A (2 μM, 37 °C에서 1 h) 또는 DMSO (37 ° C에서 1 시간)의 동일한 부피로 배양되었다. 시료당 10μg 단백질(라트런쿨린 A 처리 및 DMSO 모의 처리 대조군)은 고정 전에 수집하였다. 총 액틴 수준은 면역 blotting에 의해 평가되었다. 대표적인 얼룩은쥐(A)와인간(C)뇌균질에 대해 도시된다. Latrunculin A는 두 쥐(B; p = 0.40; 쌍 두 꼬리 학생의 t-test)와 인간(D; p = 0.42; 쌍 두 꼬리 학생의 t-test) 뇌 균질화의 총 액틴 수준을 변경하지 않았다. 데이터는 SEM(n=3 쌍)± 평균으로 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 2. 쥐 시 냅 토 솜과 인간의 시 냅 토 신경에 F-actin 수준에 KCl 매개 탈극성의 효과. (A)50 mM KCl (37 °C에서 30 s)을 가진 쥐 뇌에서 시냅토좀의 인큐베이션은 액틴 중합화를 자극하고 판로이신 결합의 결과로 증가 (p = 0.0019; 쌍 두 꼬리 학생의 t-test). (B)판로이드 보유의 증가는 또한 각각의 자극되지 않은 대조군 (p = 0.015; 쌍 두 꼬리 학생의 t-test)에 비해 KCl에 의해 탈극화 인간 시냅토 신경 소말 분획에서 관찰되었다. 데이터는 평균 ± SEM(n=6 쌍)으로 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명된 분석체는, 본질적으로 수정과 이전 연구30에서 적응, 형광 라벨태그 남백색, 남근을 고용한다. 형광 판로이드 유사체는 고정조직47,48,49에서액틴 필라멘트를 염색하기위한 금 본위제로 간주됩니다. 사실, 그들은 특히 actin 필라멘트50을 식별하는 가장 오래된 도구이며, 여전히 특히 후속 형광 현미경 기반 분석을 위해 액틴 필라멘트를 검출하는 가장 널리 사용되는 계측기남아있다. 중요한 것은, phalloidin은 짧은 액틴 필라멘트(51)의느슨하고 불규칙한 메쉬 워크조차도 얼룩지게 된 것으로 나타났으며, 이는 phalloidin 결합이 필라멘트 길이에 의존하지 않는다는 것을 나타낸다. 반면에 당사의 프로토콜은 형광 분광법에 의존하여 설치류와 인간으로부터 의한 뇌 조직과 같은 전 생체 생물 학적 샘플의 액틴 역학을 분석합니다.
프로토콜의 주요 장점은 F-actin의 고속 원심분리 계 생화학적 격리(Triton X-100과 같은 특정 세제에서 액틴 필라멘트의 용해성에 기초한 G-actin로부터의 분리) 및29, 29를사용하여 면역반응성 수준의 후속 분석이 필요한 기존 프로토콜에 대하여 취한 시간을 상당히감소시킨다는것입니다. 우리의 분석의 시간 효율성은 또한 후자와 관련된 몇 가지 다른 이점이있을 수 있지만, phalloidin 기반 면역 세포 화학 기술40,52에관한 장점입니다. 또 다른 장점은 냉동 보존 후 인간의 뇌 조직에 적용 할 수 있다는 것입니다, 조달은 항상 일부 사후 지연과 관련이있다. 또한, 본 방법론이 수정된 원래프로토콜(30)과 관련하여, 조직량에 대한 요구 사항을 1mL 큐벳에서 96웰 플레이트의 단일 웰로 대폭 축소하였다. 더욱이, 각 실험 세트에 판로이드 표준 곡선이 포함되어 있기 때문에, 우리의 프로토콜은 판로이드 바운드 단위로 절대 수준의 액틴 필라멘트를 수량화할 수있습니다(그림 2A-B, 3A, 4A-B; 또한 보충 도 2)및 대조시 샘플에 비해 수준(그림5A-B)을참조하십시오.
그러나 F-액틴 수준을 평가하기 위해 Phalloidin을 적용하면 우리의 분석 프로토콜뿐만 아니라 현미경 기반 프로토콜에 대해 고정 된 세포 및 샘플로 제한됩니다. 이는 판로이드가 본질적으로 높은 친화력을 가진 F-actin 서브유닛 사이의 인터페이스에서 구체적으로 결합하고 이러한 액틴 필라멘트를 안정화시키는 독성 이두근 한 혈청타이드이기 때문에, 이를 무력화할 수 없게 만들고 실제로 G-actin의 순 변환을 F-actin40,53,54로증가시키기 때문이다. 따라서, phalloidin는 생체 내 및 체외에서액틴 필라멘트를 안정화시키고, se 당액틴의 평형 상태에 상당한 변화를 초래할 수있다(47,55). 형광 성 포로이드에 의해 매개 된 액틴 중합 상태의 이러한 평가는 체포 된 필라멘트 구조를 기반으로합니다. 더욱이, 지질 이중층을 통한 낮은 투과성 때문에, 남병계 방법론은 세포 또는 생물학적 견본의 투과화에 의존합니다. 타임 코스 라이브 세포 분석의 감염성은 따라서 Phalloidin을 채택하는 면역 세포 화학 기반 방법과 마찬가지로 프로토콜의 주요 한계이다.
살아있는 고정되지 않은 세포에서 액틴 필라멘트의 동적 변화를 평가하는 phalloidin 기반 방법의 감염성은 그렇게 할 대체 절차가 있는지 여부의 질문을 구걸. 실제로, 영상 현미경36,56,형광 회복 후 회복된 형광(FRAP)38 또는 형광 공명 에너지 전달(FRET)39와같은 프로토콜을 이용한 분석 전에 형광액의 외인성 발현과 관련하여 발전이 이루어졌다. 형광 태그 펩티드 및 액틴 필라멘트를 결합하는 단백질의 이종 발현은 또한 살아있는 세포에서 액틴 역학을 연구하기 위하여 이용됩니다; 그러나 형광 태그 액틴47,49,57의이종발뿐만 아니라 그들과 관련된 단점 및한계가있다. 예를 들어, 대부분의 세포에서 전체 액틴의 50-70%를 포함하는 G-actin은 세포솔에서 용해되고 자유롭게 확산되어, 특히57의액틴 필라멘트로부터 신호를 분화하는 데 어려움을 야기하는 더 높은 배경의 결과로.
분석의 중요한 요소는 그림 2 및 도 3에도시된 바와 같이; 그것은 테스트 된 단백질 량의 범위에 걸쳐 선형되지 않습니다. 따라서, 분석에 적합한 단백질의 최적 양은 먼저 결정되어야 하거나, 더 이상 제한되지 않는 폰로이드인 아날로그의 양을 조정해야 한다(더 높은 양의 단백질). 프로토콜의 또 다른 중요한 측면은 특히 더 적은 양의 시료가 사용되는 경우 고착, 투과화 제 및 언바운드 phalloidin을 제거하기위한 다중 원심 분리 기반 단계가 샘플에서 다양한 단백질 손실 (및 F-actin 바운드 판로이드)의 손실로 이어질 수 있다는 것입니다. 따라서 540 nm에서 광 산란을 모니터링하여 유지되는 시료의 양을 정상화하는 것이 중요합니다. 마지막으로 actin은 F-양식과 G-forms 간의 상호 변환상태가 동적이므로 수정은 빠릅니다. 분석의 사소한 관련 중요한 측면은 우리가 약리학적 액틴 중합을 평가하는 데 효율성을 평가 할 수 없다는 것입니다. 라트런큘린 A에 의한 약리학적 액틴 비합화와는 달리, jasplakinolide(신뢰할 수 있고 널리 사용되는 액틴 중합제)는 팔로이드인과 결합 부위가 겹쳐져 있으며, 경쟁적으로 액틴필라멘트(58,59)에대한 결합을 억제한다. 그럼에도 불구하고, KCl 자극시냅스 단말의 고용은 증가된 액틴 중합화를 위한 전 생체 내 모델로서 우리의 분석이 F-actin 수준의 증가를 감지할 수 있음을 나타낸다.
결론적으로, 우리는 actin 필라멘트 (F-actin)의 분석과 96 웰 플레이트 형식에 적합한 생리및 병리학 적 상태의 교대를위한 강력한 시간 효율적이고 높은 처리량 분석을 설명합니다. 고정 및 고정되지 않은 샘플에서 F-actin의 평가를 위한 다른 기존 방법과 함께, 프로토콜은 신경 과학 분야의 actin 관련 연구뿐만 아니라 생물 과학 연구의 다른 분야에서 필수적인 도구가 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 뉴질랜드의 신경학회(1835-PG), 뉴질랜드 건강 연구 위원회(#16-597) 및 뉴질랜드 오타고 대학교 해부학부에 의해 지원되었습니다. 우리는 인간의 뇌 조직에 대한 HCB-IDIBAPS 바이오 뱅크 (스페인)의 신경 조직 은행에 빚지고 있습니다. 우리는 비디오의 녹음 및 편집에 그녀의 도움 에 대한 Jiaxian 장 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube | Beckman Coulter | 349622 | For gradient centrifugation (synaptosome prep) |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | F-actin specific ligand |
| Antibody against b-actin | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47778 | For evaluation of total actin levels by immunoblotting |
| Antibody against GAPDH | Abcam | Ab181602 | For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Bradford based protein estimation |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Krebs buffer component |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation |
| Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene | Corning | 3596 | For light-scattering measurements |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Krebs buffer component |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | Solvent for phalloidin and latrunculin A |
| Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner) | Li-Cor Biosciences | For detection of immunoreactive signals on immunoblots | |
| Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II | Sigma-Aldrich | G6257 | Fixative |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component |
| Latrunculin A | Sigma-Aldrich | L5163 | Depolymerizer of actin filaments |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | M2670 | Krebs buffer component |
| Microplates | |||
| Mitex membrane filter 5 mm | Millipore | LSWP01300 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Nunc F96 MicroWell Black Plate | Thermo Fisher Scientific | 237105 | For fluorometric measurements |
| Nylon net filter 100 mm | Millipore | NY1H02500 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail IV | Abcam | ab201115 | For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals |
| Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Krebs buffer component |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 71320 | Component of Permeabilization buffer |
| Sodium chloride (NaCl) | LabServ (Thermo Fisher Scientific) | BSPSL944 | Krebs buffer component |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | LabServ (Thermo Fisher Scientific) | BSPSL900 | Krebs buffer component |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | For fluorometric measurements | |
| Sucrose | Fisher Chemical | S/8600/60 | Buffer ingredient for sample preparation |
| Swimnex Filter Holder | Millipore | Sx0001300 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem | Duran Wheaton Kimble | 358034 | For tissue homogenization |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Component of Permeabilization buffer |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066 | Buffer ingredient for sample preparation |
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