Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מיקרוסקופיה לסריקת לייזר קונפוקלית של דינמיקת סידן בפרוסות רקמת לבלב חריפה של עכבר

Published: April 13, 2021 doi: 10.3791/62293
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3, 1
1Institute of Physiology, Faculty of Medicine, University of Maribor, 2Faculty of Natural Sciences and Mathematics, University of Maribor, 3Center for Physiology and Pharmacology, Medical University of Vienna

Summary

אנו מציגים את ההכנה של פרוסות רקמת לבלב חריפה ואת השימוש בהן במיקרוסקופיה לסריקת לייזר קונפוקלית לחקר דינמיקת סידן בו זמנית במספר רב של תאים חיים, לאורך תקופות זמן ארוכות, ועם רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה.

Abstract

פרוסת רקמת הלבלב החריפה של העכבר היא תכשיר ייחודי באתרו עם תקשורת בין-תאית משומרת וארכיטקטורת רקמות הכוללת הרבה פחות שינויים המושרים על ידי הכנה מאשר איים מבודדים, אצ'יני, תעלות או תאים מפוזרים המתוארים במחקרים טיפוסיים במבחנה. על ידי שילוב פרוסת רקמת הלבלב החריפה עם הדמיית סידן בתאים חיים במיקרוסקופיה לסריקת לייזר קונפוקלית (CLSM), ניתן לחקור אותות סידן במספר רב של תאים אנדוקריניים ואקסוקריניים בו זמנית, עם רזולוציה חד-תאית או אפילו תת-תאית. הרגישות מאפשרת זיהוי של שינויים ומאפשרת לחקור גלים בין-תאיים וקישוריות תפקודית, כמו גם לחקור את התלות של תגובות פיזיולוגיות של תאים על לוקליזציה שלהם בתוך האיים והיחסים הפאראקריניים עם תאים אחרים. לבסוף, מנקודת המבט של רווחת בעלי החיים, רישום אותות ממספר רב של תאים בכל פעם מקטין את מספר בעלי החיים הנדרשים בניסויים, ותורם לעקרון ההחלפה, ההפחתה והעידון של 3R.

Introduction

הלבלב של היונקים הוא בלוטה אקסוקרינית ואנדוקרינית גדולה. החלק האקסוקריני מהווה 96-99% מנפח הלבלב הכולל ומורכב מאצ'יני ותעלות. החלק האנדוקריני מורכב ממספר רב של איים של לנגרהנים המהווים את 1-4% הנותרים של נפח הלבלב הכולל1. החלק האקסוקריני מפריש אנזימי עיכול עיקריים המפרקים פולימרים עשירים באנרגיה במזון, כמו גם נוזל עשיר בביקרבונט, המשלב הפרשות אחרות במערכת העיכול כדי לספק סביבה המתאימה לפעולה של אנזימים. החלק האנדוקריני מפריש הורמונים המווסתים את ההתפלגות, האחסון והשחרור הבין-פרינדיאלי של חומרים מזינים עשירים באנרגיה. אף על פי שהרקמה האקסוקרינית אינה מפותחת יחסית והאנדוקרינית מפותחת יחסית בלידה, הראשונה מתגברת במהירות על האחרונה עם גמילהשל 2,3,4. מחקרים מוקדמים על תפקוד הלבלב סימנו את לידתה של הפיזיולוגיה המודרנית, וההתקדמות המתודולוגית העיקרית בתחום לוותה בשברים מדעיים גדולים5. העבודה עם הלבלב היא מאתגרת מבחינה טכנית בשל המבנה המורכב של הבלוטה, אך היא גם מוטיבציה גדולה בגלל מחלות כמו סרטן הלבלב, דלקת הלבלב וסוכרת המהוות איומים גדולים על בריאות הציבור, ואשר עבורן יש צורך בגישות טיפוליות חדשניות.

איים מבודדים6, אצ'יני 7,8 ושברי צינורות פותחו ושימשו במשך עשרות שנים כשיטות תקן זהב בשל יתרונותיהם בהשוואה לקווי תאים ותאים אנדוקריניים, אצינריים ותאים דוקטליים מפוזרים ראשוניים 9,10. למרות התפקוד המשופר במידה ניכרת של קולקטיבים של תאים מבודדים, שיטות אלה עדיין כרוכות בלחץ מכני ואנזימטי ניכר, מבודדות תאים מהרקמה הסובבת ולכן חסרות אינטראקציות פאראקריניות ותמיכה מכנית, והכי חשוב, מלוות בשינויים משמעותיים בפיזיולוגיה הרגילה 11,12,13 . פרוסת רקמת הלבלב החריפה של העכבר פותחה בשנת 2001 מתוך צורך נתפס לפתח פלטפורמה ניסיונית הדומה לפרוסות מוח, יותרת המוח ואדרנל עם מגעים בין-תאיים משומרים, אינטראקציות פאראקרין, מזנכים וארכיטקטורת רקמות, כמו גם ללא כמה מהחסרונות החשובים ביותר של שיטת תקן הזהב במחקר האיים של אותה תקופה - האיים המבודדים12, 14. בין החסרונות הללו ניתן למנות את הפגיעה בשכבות החיצוניות ביותר, היעדר נגישות לאזורי הליבה של האיים, והצורך בטיפוח עם השפעות חשובות על זהות התא ועל הפיזיולוגיה12,15. יתר על כן, שיטת פרוסת הרקמה מאפשרת מחקרים על מודלים של בעלי חיים עם ארכיטקטורת איים מעוותת באופן גס, שבהם לא ניתן לבודד איים, או כאשר תפוקת האיים נמוכה ביותר על ידי בידוד מסורתי 16,17,18,19,20,21.

בנוסף, הפרוסה מתאימה יותר לחקר שינויים מורפולוגיים במהלך התפתחות סוכרת ודלקת הלבלב, למשל, מכיוון שהיא מאפשרת סקירה טובה יותר של הרקמה כולה ותואמת גם את חקר ההבדלים האזוריים. חשוב לציין שלמרות ההתמקדות המוקדמת בחלק האנדוקריני, שיטת פרוסת הרקמה מאפשרת מטבעה לחקור את הרכיבים האקסוקריניים 9,22,23. במהלך העשור הראשון לאחר הצגתה, נעשה שימוש בשיטה למחקרים אלקטרופיזיולוגיים של תאי בטא 14,24,25,26,27,28,29 ואלפא30,31 וכן לבחינת ההבשלה המורפולוגית והתפקודית של הלבלב 2,3 . עשור לאחר מכן, בשנת 2013, השיטה הותאמה בהצלחה להדמיית סידן בתאים חיים של תאי איון באמצעות CLSM כדי לאפיין את תגובותיהם לגלוקוז32, את דפוסי הקישוריות התפקודיים שלהם33, ואת הקשר בין פוטנציאל הממברנה לסידן תוך-תאי על ידי שילוב צבע סידן פלואורסצנטי עם צבע פוטנציאלי של קרום34. מאוחר יותר באותה שנה, השיטה שימשה גם להערכת דינמיקת הסידן בתאים אצינריים22,35. במהלך השנים הבאות, פרוסות רקמת הלבלב שימשו במספר מחקרים שונים והותאמו בהצלחה לרקמת חזירים ובני אדם 9,36,37,38,39,40,41. עם זאת, יחד, הדמיית סידן - בפרוסות רקמת הלבלב של העכבר בכלל ובאיים בפרט - עדיין מבוצעת בעיקר על ידי קבוצה זו. אחת הסיבות העיקריות לכך עשויה להיות טמונה בשילוב של הכנת פרוסת רקמה מאתגרת מבחינה טכנית, הצורך במיקרוסקופ קונפוקלי וניתוח נתונים מורכב למדי. המטרה העיקרית של המאמר הנוכחי היא להפוך את השיטה החזקה הזו לנגישה יותר למשתמשים פוטנציאליים אחרים.

ישנם כבר כמה מאמרים מתודולוגיים מצוינים העוסקים בפירוט בהכנת פרוסות טישו ושימוש בפרוסות למחקרים מבניים והפרשתיים, אך לא להדמיית סידן קונפוקלית 9,42,43. לכן, מאמר זה מתמקד בכמה טיפים וטריקים נוספים במהלך הכנת פרוסות, בשלבים קריטיים לטעינת צבע מוצלחת, רכישת תמונה, כמו גם על השלבים העיקריים של ניתוח נתוני סידן בסיסי. לפיכך, יש לראות בתרומה זו משלימה ולא כחלופה לשיטה הנ"ל ולא כחלופה לשיטה הנ"ל. באופן דומה, הדמיית סידן בפרוסות רקמת לבלב של עכברים תיתפס כגישה ניסיונית שיש להשתמש בה כדי לענות על שאלות ספציפיות ולכן היא משלימה ולא חלופה מוחלטת לגישות הדמיית סידן אחרות בפיזיולוגיה של הלבלב כגון צינורות מבודדים או אצ'יני, איונים מבודדים, אורגנואידים, איונים המושתלים בתא הקדמי של העין, והקלטות in vivo 11,44,45,46,47,48. ההבטחה להדמיית סידן בפרוסות רקמת הלבלב של עכברים מומחשת כנראה בצורה הטובה ביותר על ידי הקלטות מוצלחות אחרונות של דינמיקת סידן בתאים מזנכימליים באיים כגון פריסיטים49 ומקרופאגים50, כמו גם בתאי צינור23.

Protocol

הערה: כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בהם במחקר. הפרוטוקול אושר על ידי מינהל הרפובליקה של סלובניה לבטיחות מזון, מגזר וטרינרי והגנת הצומח (מספר היתר: 34401-35-2018/2).

1. הכנת פרוסות רקמת הלבלב

הערה: הכנת פרוסות רקמות לבלב חריפות של עכברים להדמיית סידן באמצעות CLSM דורשת מספר מכשירים, תמיסות שונות, ומתקדמת בסדרה של שלבים קריטיים המוצגים באופן סכמטי באיור 1 ומתוארים בפירוט להלן.

Figure 1
איור 1: דיאגרמת זרימת עבודה. ייצוג סכמטי של כל השלבים בתהליך הכנת פרוסת רקמת הלבלב, החל בהזרקת אגרוז לתוך צינור המרה המשותף, ואחריו מיצוי הלבלב וחיתוך. הפרוסות המוכנות יכולות לשמש להערכת הכדאיות של הרקמה באמצעות ערכת Live/Dead או מוכתמות בחיישן סידן. ברגע שהם מוכתמים, הם מוכנים להדמיה. הקלטות המתקבלות מתהליך ההדמיה משמשות לאחר מכן לניתוח נתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. הכנת פתרונות
    הערה: יש להכין את כל הפתרונות מראש וניתן לאחסן אותם במקרר בטמפרטורה של 4-8 מעלות צלזיוס למשך עד חודש. להכנה ואחסון של פרוסות טישו, יש צורך בכ-0.5 ליטר של תמיסה חוץ-תאית (ECS) עם 6 מ"מ גלוקוז ו-0.3 ליטר של 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזין-אתאנסולפונית (HEPES) מאגר חומצה (HEPES). עבור יום אחד של הדמיית סידן עם מערכת פריפוזיה שנקבעה בקצב זרימה של 1-2 מ"ל לדקה, יש צורך בכ-0.5 ליטר של ECS.
    1. תמיסה חוץ-תאית עם 6 mM גלוקוז
      1. הכן 1 ליטר של ECS המכיל 125 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 6 mM גלוקוז, 6 mM חומצה לקטית, 3 mM מיו-אינוזיטול, 2.5 mM KCl, 2 mM Na pyruvate, 2 mM CaCl2, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, ו 0.5 mM חומצה אסקורבית. מערבבים היטב עד שכל המרכיבים מתמוססים לחלוטין. קח 50 μL של ECS לתוך צינור microcentrifuge 0.5 מ"ל, להניח אותו על האוסמומטר על פי הוראות היצרן, ולבדוק את osmolarity.
        הערה: osmolarity צריך להיות 300-320 mOsm. לגירוי של תאי בטא, השתמש בתמיסות עם ריכוזי גלוקוז גבוהים יותר. כדי להבטיח ערך pH פיזיולוגי של 7.4 במהלך חיתוך וניסויים, כל הזמן מבעבעים את ה-ECS עם קרבוגן (כלומר, תערובת גזים של 95% O2 ו-5% CO2) בלחץ ברומטרי. ניתן להגדיר מערכת מבעבעת פשוטה על ידי חיבור קצה אחד של צינורות סיליקון בקוטר 5 מ"מ למקור של קרבוגן (כלומר, בלון גז בלחץ) והקצה השני של הצינורות המונח ישירות לתוך הבקבוק המכיל ECS.
      2. לחלופין, הכינו מלאי 10x המכיל 1250 mM NaCl, 260 mM NaHCO3, 30 mM מיו-אינוזיטול, 25 mM KCl, 20 mM Na pyruvate, 12.5 mM NaH2PO4, ו 5 mM חומצה אסקורבית. כאשר יש צורך ב- ECS המכיל 6 mM גלוקוז, יש לערבב 100 מ"ל מהמלאי עם 2 מ"ל של 1 M CaCl2, 1 מ"ל של 1 M MgCl2, 0.455 מ"ל של 13.2 M חומצה לקטית, ו-1.08 גרם גלוקוז, ולמלא במים מזוקקים כפולים עד 1 ליטר. במידת הצורך, השתמש בכמויות שונות של גלוקוז כדי להשיג ריכוזי גלוקוז אחרים.
    2. חיץ HEPES עם 6 mM גלוקוז
      1. הכן 0.5 ליטר של תמיסה עם חציצה HEPES (HBS) המכילה 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 6 mM גלוקוז, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 ו- 1 mM MgCl2; titrate ל- pH = 7.4 עם 1 M NaOH.
        הערה: אם קרבוגן אינו זמין, ניתן להשתמש במאגר זה עבור כל השלבים במקום ECS.
    3. אגרוז (1.9% w/w)
      1. מחממים מראש אמבט מים ל-40 מעלות צלזיוס.
      2. הוסיפו 0.475 גרם של אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה ו-25 מ"ל של ECS המכיל 6 מ"מ גלוקוז לבקבוקון ארלנמאייר, והניחו את הבקבוקון בתנור מיקרוגל בעוצמה מקסימלית למשך מספר שניות עד שהוא מתחיל לרתוח. מוציאים את הבקבוקון מהתנור ומסובבים אותו כמה פעמים, עד שהאגרוז מתמוסס לחלוטין. מעבירים את הבקבוקון עם האגרוז הנוזלי לאמבט המים המלוחמים מראש ב-40 מעלות צלזיוס כדי לקרר את האגרוז לטמפרטורה הרצויה ולשמור עליו נוזלי עד ההזרקה. מאבטחים את הבקבוקון באמצעות טבעת עופרת מייצבת.
        הערה: ניתן להכין את האגרוז מראש ולשמור במקרר. לפני השימוש, מחממים את האגרוז בתנור המיקרוגל עד שהוא נוזל, ומעבירים את בקבוקון ארלנמאייר לאמבטיית מים מתוכננת מראש ל-40 מעלות צלזיוס. ניתן להשתמש מחדש באגרוז עד פי 5. אם נעשה בו שימוש חוזר מעבר ל-5x, הוא יהפוך צפוף וקשה יותר להזרקה.
  2. הזרקת לבלב עם אגרוז
    הערה: סעיפים 1.2 ו-1.3 מסבירים את הכנת פרוסות הרקמות שניתן להשתמש בהן למטרות ניסוי שונות כגון הדמיית סידן, אלקטרופיזיולוגיה, אימונוהיסטוכימיה, מחקרי הפרשה ומחקרים מבניים/מיקרו-אנטומיים.
    1. מלאו מזרק 5 מ"ל עם האגרוז הנוזלי מבקבוקון ארלנמאייר באמבט המים משלב 1.1.3.2, הסירו את כל הבועות והרכיבו מחט 30 גרם. הגן על המחט עם כובע, ושמור את המזרק המלא בחזרה באמבט המים כאשר המחט פונה כלפי מטה וכל נפח האגרוז מתחת לפני המים. אבטח את המזרק באמצעות טבעת עופרת מייצבת באופן כזה שהטבעת לוחצת את המזרק על קיר אמבט המים.
      הערה: היזהר לא לדחוף כל אגרוזה לתוך המחט מכיוון שהיא תתקשה במהירות ותחסום את המחט. אם טמפרטורת החדר נמוכה, ואם ההזרקה מבוצעת על ידי אדם פחות מנוסה, הגדל את הטמפרטורה של אמבט המים עד 42 °C (74 °F) כדי לקבל קצת זמן נוסף להזרקה.
    2. מלאו דלי קרח בקרח, והניחו את הבקבוק המכיל בו ECS. מבעבעים את ה-ECS כל הזמן ב-1.5 מ"ל/דקה עם קרבוגן בלחץ ברומטרי וטמפרטורת החדר כדי להבטיח חמצון ו-pH של 7.4.
    3. להקריב עכבר על ידי מתן ריכוז גבוה של CO2 ואחריו פריקה צוואר הרחם. עשו את כל המאמצים כדי למזער את סבלם של בעלי החיים.
    4. בעבודה תחת סטריאומיקרוסקופ, ניגשו לבטן דרך לפרוטומיה (איור 2A). הפוך בעדינות את המעיים לצד שמאל של העכבר (מנקודת המבט האנטומית של העכבר) כדי לחשוף את צינור המרה המשותף. השתמש במלקחיים כדי להרים מעט את החלק התריסריון, ולמצוא את הפפילה-פפילה-פפילה של התריסריון הגדול של ואטר. מהדקים את צינור המרה הנפוץ בפפילה התריסריון באמצעות המוסטאט (איור 2B,C) כדי למנוע דליפה של אגרוז מהצינור לתוך התריסריון.
      הערה: כדי למנוע דליפת אגרוז לתוך התריסריון ועוד למעלה ולמטה במערכת העיכול, מניחים את ההמוסטט באופן כזה שהוא גם מהדק את התריסריון הן באופן פרוקסימלי והן דיסטלי מהפפילה. עדיף להשתמש hemostat מעוקל למטרה זו.
    5. עם מלקחיים חדים קטנים, להגיע מתחת לצינור המרה המשותף, ולשבור את הממברנה המחברת את הצינור לרקמת הלבלב. לשליטה ויזואלית טובה יותר ולהזרקה קלה יותר, יש לנקות כמה שיותר שומן ורקמת חיבור מהצינור.
    6. מניחים את הצינור בניצב על מלקחיים גדולים (איור 2D), ומזריקים את האגרוז הנוזלי המוכן לחלק הפרוקסימלי של צינור המרה המשותף (איור 2D). הקפידו לסחוט את המזרק בחוזקה מכיוון שהאגרוז צמיג. ממשיכים למלא את הלבלב עד שהוא הופך לבנבן ומעט מעוות או לפחות 20-30 שניות.
      הערה: זהו השלב הקריטי ביותר בהכנת פרוסות. אם יש סטיות כלשהן בעץ הצינור של הלבלב, הגבהו או משכו את הלבלב בעדינות הרחק מהמזרק כדי ליישר אותם. אין להחליט מתי להפסיק את ההזרקה על סמך נפח ההזרקה מהמזרק, שכן הזרימה האחורית בנקודת ההזרקה והדליפה קדימה לתוך התריסריון בדרך כלל גבוהים בהרבה מהנפח המוזרק לעץ הצינור של הלבלב. חשוב לציין, זריקות מוצלחות יכולות להתבצע עם שינויים כמעט בלתי מורגשים בנפח המזרק.
    7. הסירו את המזרק, ושפכו באיטיות 20 מ"ל של ה-ECS הקר כקרח מבעבע בטמפרטורה של 0-4 מעלות צלזיוס מהבקבוק אל הלבלב כדי לקרר את הרקמה ולהקשיח את האגרוז.
    8. יש לחלץ בעדינות את הלבלב באמצעות מלקחיים ומספריים דקיקים בחיתוך קשיח. מכניסים את הלבלב שחולץ לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ המכילה כ-40 מ"ל של ECS קר כקרח, ומזיזים אותה בעדינות כדי לשטוף אותה. מעבירים את הלבלב לתוך צלחת פטרי טרייה בקוטר 100 מ"מ המכילה כ-40 מ"ל של ECS קר כקרח.
    9. מהחלק המוזרק היטב של הלבלב, שנראה לבנבן (איור 3A), חתכו עד 6 גושי רקמה, בגודל 0.1-0.2 ס"מ3 , באמצעות מלקחיים ומספריים קשים. נקו אותם מכל רקמת חיבור ושומנית.
    10. מלאו תבשיל תחתית-פטרי לא דביק בקוטר 35 מ"מ בכ-5 מ"ל של אגרוז נוזלי בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס, העבירו לתוכה את גושי הרקמה, ומיד הניחו את צלחת הפטרי על הקרח כדי לקרר אותה ולהקשיח את האגרוז.
      הערה: האופן שבו גושי הלבלב נלכדים באגרוז קובע את האופן שבו הם נחתכים במהלך החיתוך. נסיינים מנוסים יכולים לנסות לכוונן את מיקום הבלוקים ברגעים הספורים שלפני שהאגרוז מתקשה כאשר הוא מונח על קרח.
    11. לאחר שהאגרוז עם בלוקי הרקמה מתקשה, הופכים את צלחת הפטרי על משטח חלק ושטוח כמו המכסה של צלחת פטרי 100 מ"מ, ומסירים את האגרוז על ידי חיתוך עדין עם חצי סכין גילוח לתוך השוליים שבין הדופן הצדדית של צלחת פטרי לבין האגרוז. בעזרת סכין גילוח, חותכים קוביות אגרוז בודדות, שכל אחת מהן מכילה גוש רקמה אחד, ומטפלים בכך שכל גוש רקמה מוקף באגרוז. הדביקו את גושי האגרוז על צלחת הדגימה של הוויברטום באמצעות דבק ציאנואקרילט (איור 3B).

Figure 2
איור 2: הזרקת אגרוז לתוך צינור המרה המשותף. (A) פתחו את חלל הבטן, וחשפו את האיברים בחלל הצפק. (ב) החלק המוגדל של השטח הסגור על ידי המלבן בלוח A. הכתם הלבן על התריסריון (המסומן על ידי החץ) מציין את האמפולה של ואטר. איי לנגרהאנס מסומנים על ידי ראשי חץ. (C) מהדקים את האמפולה של ואטר על ידי המוסטאט מעוקל, ומעלים אותה מעט כדי לחשוף ולמתוח בעדינות את צינור המרה המשותף (חץ). (D) שימורים של צינור המרה הנפוץ והזרקה של תמיסת אגרוז של 1.9% באמצעות מזרק 5 מ"ל ומחט של 30 גרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. חיתוך
    1. מלאו את תא החיתוך של הוויברטום בכ-0.15 ליטר של ECS קר כקרח, ובועטים ללא הרף בקרבוגן. הקיפו את תא החיתוך בקרח, והוסיפו 2 קוביות קרח (כ-10 מ"ל כל אחת) העשויות מ-ECS עם גלוקוז של 6 מ"מ לתוך תא החיתוך. הרכיבו את סכין הגילוח לחיתוך על הוויברטום, והברגו במקומו את צלחת הדגימה עם בלוקי אגרוז.
    2. הגדר את החותך לחתוך בלוקים אגרוזים ב-0.05 עד 1 מ"מ לשנייה ו-70 הרץ לפרוסות בעובי 140 מיקרומטר עם שטח פנים של 20-100 מ"מ2. לקבלת הגדרות כלי פריסה, בצע את הוראות היצרן.
    3. מיד לאחר כל שלב חיתוך, השהו את החתך, אספו בעדינות את הפרוסות במברשת צבע עדינה והעברו אותן לצלחת פטרי 100 מ"מ מלאה ב-40 מ"ל של חיץ HEPES עם 6 מ"מ גלוקוז בטמפרטורת החדר (איור 3C).
      הערה: ניתן לשמור את הפרוסות במאגר HEPES בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות לפחות, ויש להחליף את המאגר כל 2 שעות.

Figure 3
איור 3: הכנה וחיתוך של רקמת הלבלב. רקמה לבנה משמאל מצביעה על חלק מוזרק היטב (חלק תריסריון), בעוד החלק האדמדם יותר בצד ימין מראה את החלק המוזרק מספיק של הלבלב (חלק splenic). (B) חיתוך ויברטום של שני גושי רקמת לבלב המשובצים באגרוז. (C) פרוסת רקמת לבלב חריפה עם איים של לנגרהנים המסומנים על ידי ראשי חץ. סרגל קנה מידה = 3000 μm. (D) פרוסת רקמת לבלב חריפה מתחת למיקרוסקופ האור עם האי לנגרהנס המצוין על ידי ראש חץ, כוכבית מציינת צינור לבלב. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

2. בדיקה חיה/מתה באמצעות כדאיות חיה/מתה/ערכת ציטוטוקסיות לתאי יונקים

הערה: עבור ניסויים מסוימים, כדאי לבדוק את הכדאיות של התאים בפרוסות (איור 4) על-ידי הבדיקה החיה/מתה באופן הבא.

  1. עקוב אחר הוראות היצרן כדי להפשיר בקבוקונים עם ריאגנטים של ערכת LIVE /DEAD Viability / Cytotoxicity, והכן פתרונות עבודה של calcein AM רגע לפני השימוש. השתמש בפתרונות תוך יום אחד.
  2. בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, יש לערבב 5 μL של 4 mM calcein AM (רכיב A), 20 μL של 2 mM ethidium homodimer-1 (EthD-1, רכיב B), ו-10 מ"ל של מלוחים עם חיץ פוספט (D-PBS) של D-PBS של Dulbecco כדי להכין תמיסת עבודה המכילה כ-2 μM calcein AM ו-4 μM EthD-1. מערבולת ביסודיות.
  3. באמצעות מברשת צבע עדינה, מעבירים בעדינות את פרוסות הרקמה לצלחת פטרי בגודל 3 מ"ל עם חיץ HEPES טרי כדי לדלל את פעילות האסטראז בסרום. הסר את מאגר HEPES וכסה את הפרוסות ב- 100-200 μL (או יותר במידת הצורך) של הפתרון העובד משלב 2.2.
  4. דגירו את הפרוסות למשך 30-45 דקות בטמפרטורת החדר בצלחת פטרי סגורה. דמיינו את פרוסות הרקמה באמצעות מסנני עירור/פליטה בהתאם להמלצת היצרן.

3. העמסת צבע סידן

הערה: צבעים פלואורסצנטיים צריכים להיות מוגנים מפני חשיפה לאור במהלך כל תהליך ההכנה וההעמסה של הצבע, כמו גם במהלך הטיפול בפרוסות הרקמה המוכתמות. ניתן להשתמש בנייר כסף לכיסוי צינורות או צלחות פטרי המכילות את צבע הסידן.

  1. הכנת צבע
    1. להמיס את התוכן של בקבוקון אחד (50 מיקרוגרם) של צבע מחוון Ca2+ החדיר לתא (עירור/פליטה 495/523 ננומטר; ראו טבלת החומרים), 7.5 μL של דימתילסולפוקסיד (DMSO) ו-2.5 μL של הפולקסאמר (20% תמיסה ב-DMSO; טבלת חומרים) ב 6.667 מ"ל של HBS המכיל 6 mM גלוקוז בצינור מכסה בורג 15 מ"ל.
      הערה: פתרון סופי זה מכיל 6 μM של צבע מחוון Ca2+ , 0.11% DMSO ו-0.037% פולקסאמר.
    2. לשאוף ולגרש את הפתרון בצינור מכסה הבורג שוב ושוב עם פיפטה במשך 20 שניות; להטביע את הצינור בתא אמבטיה על-קולי במשך 30 שניות, ולסובב מערבולת במשך 30 שניות כדי לשפר את הסולוביליזציה. Aliquot 3.333 מ"ל של תמיסת הצבע הסופית Ca2+ מחוון שהוכן בשלב 3.1.1 לתוך 5 מ"ל צלחות פטרי.
  2. טעינת צבע
    1. מעבירים את פרוסות הרקמה המוכנות מצלחת פטרי 60 מ"ל עם HBS לתוך 5 מ"ל צלחות פטרי מלאות בתמיסת הצבע על ידי הרמה עדינה של כל פרוסת טישו באמצעות מברשת צבע דקה ורכה והנחתה בתמיסת הצבע. דגירה של עד 10 פרוסות טישו לכל צלחת פטרי.
    2. הניחו את צלחת הפטרי עמוסת הפרוסות על שייקר מסלולי בטמפרטורת החדר שנקבעה לתנועה מסלולית של 40 סיבובים לדקה למשך 50 דקות. דגירה של הפרוסות בתמיסת הצבע החשופה לאוויר הסביבה בטמפרטורת החדר, אך מוגנת מפני אור על ידי כיסוי צלחת הפטרי בנייר כסף.
  3. אחסון פרוסות
    1. מעבירים את פרוסות הרקמות המוכתמות מצלחת פטרי 5 מ"ל לצלחת פטרי 60 מ"ל במילוי HBS ללא צבע על ידי הרמתן בעדינות באמצעות מברשת צבע עדינה ורכה. יש לאחסן עד 20 פרוסות לכל צלחת פטרי.
      הערה: השתמש בפרוסות הרקמות להדמיה בשלב זה. פרוסות הרקמה ישמרו על צבע מחוון Ca2+ למשך מספר שעות. ניתן לשפר את הישרדות הפרוסות ואת שימור הצבע על ידי הצבת צלחת פטרי במיכל מבודד, מוקף בקרח. זה חשוב במיוחד אם יש להעביר את הפרוסות הטעונות בצבעים. בנוסף, החליפו את ה-HBS כל שעתיים.

4. הדמיית סידן

  1. הגדרת המיקרוסקופ הקונפוקלי
    1. בחר הגדלה אובייקטיבית מתאימה בהתאם לעניין של המחקר. בחר 20x ו- 25x (מפתח צמצם מספרי [NA] 0.77-1.00) להדמיית איון שלם, מספר אציני בו-זמנית, או צינורות גדולים יותר. בחר הגדלות גבוהות יותר כדי לחקור את הדינמיקה התוך-תאית.
    2. בחר את מצב הרכישה להדמיית קיטועי זמן (לדוגמה, קיטועי זמן, xyt או מצב דומה). הגדר את חור הסיכה ל- 100-200 מיקרומטר.
    3. קבעו את נתיב האור לפלואורופורים ירוקים: עירור ב-488 ננומטר, ואיסוף פליטה ב-500-700 ננומטר. עדיף לבחור גלאים בעלי נצילות קוונטית גבוהה (למשל, גליום ארסניד פוספיד) על פני גלאים פוטומולטיפליים יותר.
  2. הגדרת תא ההקלטה ומערכת הפריפיוז'ן
    1. הרכיבו את תא ההקלטה על השלב מבוקר הטמפרטורה של המיקרוסקופ ומערכת הפריפוזיה (התקנה הניזונה מכוח הכבידה או מבוססת משאבה פריסטלטית, נפח 1 מ"ל). מקם את הכניסה ואת השקע בקצוות הרחוקים של תא ההקלטה כדי למנוע התפתלות של השקע בתוך התא, והגדר את הזרימה ואת הזרימה לערכים שווים (1-2 מ"ל לדקה). הימנעו מסחיפה של גובה המניסקוס הנוזלי והטיפות בפריפוסאט.
    2. הגדר את בקרת הטמפרטורה של מערכת הפריפוזיה ל 37 °C (84 °F. התחל את הפריפוזיה עם הפתרון שאינו מגרה, והכן את הפתרונות הממריצים. שנה את הפתרונות באמצעות שסתומים ממונעים או על ידי החלפה ידנית של הפתרונות המזינים את מערכת הפריפוזיה.
  3. שיא הדינמיקה של הסידן
    1. מעבירים פרוסת טישו בודדת לתא ההקלטה. שתקו את פרוסת הרקמה במשקל פלטינה בצורת U עם רשת ניילון מתוחה (למשל, מגרבי ניילון). הימנעו ממיקום חוטי ניילון על מבנה העניין.
    2. אתר איון/אצינוס/תעלה באמצעות אפשרות שדה בהיר. הפעל הדמיה חיה כדי למקם את המבנים הנחקרים בשדה הראייה, והגדר את פרמטרי ההדמיה. מטב את יחס האות לרעש על-ידי התאמת הספק הלייזר, הגברת הגלאי וממוצע הקווים/ניתוק כדי לאפשר הדמיה של התאים תוך שמירה על הספק הלייזר מינימלי.
    3. התאימו את מישור המוקד של ההקלטה לכ-15 מיקרומטר מתחת למשטח החיתוך (איור 5) כדי להימנע מהקלטה של תאים שעלולים להינזק במשטח החיתוך.
    4. רכוש תמונות. הגדר את תדר הדגימה ל- 1-2 הרץ כדי לזהות תנודות בודדות בתחילה, והשתמש בסורק תהודה המסוגל לבצע ממוצע קו מהיר (8-20) בקצב רכישה גבוה יותר (>10 הרץ) כדי להקליט פעילות Ca2+ תוך-תאית ([Ca2+]IC). אפשר מרווח (לדוגמה, 30% מזמן הדגימה הכולל) בין תאורת נקודה עוקבת כדי למנוע פוטוטוקסיות. הקלט תמונה ברזולוציה גבוהה (לדוגמה, 1024 x 1024 פיקסלים, ממוצע קו > 50) לפני רכישת סדרת הזמן (ראה סעיף 5).
      הערה: תדר הדגימה של 1-2 הרץ נמצא מתחת לקריטריון Nyquist לתדר רכישה עבור רוב התאים, וצורת האות תהיה תחת דגימה כברירת מחדל.
    5. עיין בתרשים מקוון, אם זמין בתוכנת ההדמיה, כדי לקבל משוב מיידי על תגובת ההכנה, תאורת יתר, הלבנת תמונות וסחף מכני. במקרה של קצב גבוה של הלבנה במהלך הרכישה, עצרו את ההקלטה והפחיתו את כוח הלייזר תוך הגדלת רווח הגלאי כדי לשמור על יחס האות לרעש. במקרה של סחיפה מכנית, יש לבדוק מתח בין צינורות/כבלים לבין שלב המיקרוסקופ וכן דליפת נוזלים או שינויים בנפח בתא ההקלטה. לחלופין, נסה לתקן את הסחף במהלך הרכישה באופן ידני; עם זאת, שים לב כי זה מטבעו יניב תוצאות מוגבלות.
      הערה: תאים אנדוקריניים הם הטרוגניים מאוד בריכוזים קרובים לסף. יש צורך במשך מספיק של גירוי כדי לזהות את טווח העיכובים בהפעלה/השבתה בתאים בודדים. זה חשוב במיוחד לזיהוי מדויק של תגובות מחוץ לתגובות בעקבות פרוטוקולים מעוררי מאוד.
    6. השתמשו בהדמיית סידן כדי להבחין באופן פונקציונלי בין תאים אנדו ואקסוקריניים (איור 6). כדי לתעד פעילות חולפת במהלך ההפעלה וההשבתה, החל גירויים מבלי לעצור את ההקלטה.
    7. שמור את הנתונים לאחר סיום הניסויים (שקול להשתמש בפונקציית שמירה אוטומטית). אפשרו תקופת קירור לפני כיבוי כוח הלייזר כדי לא לפגוע בלייזרים במהלך הליך הכיבוי.

5. ניתוח נתונים

  1. בדוק חזותית את ההקלטה באופן איכותי על ידי השמעה חוזרת של הסרטון בהילוך מהיר. בדוק אם יש סחף של תאים משדה הראייה או מהמישור האופטי. אם התרחש סחף בתוך המישור האופטי, השתמש בתוסף תיקון הסחף ב- ImageJ.
  2. בחר אזורי עניין (ROIs) באמצעות תוכנת מיקרוסקופ או תוכנת צד שלישי. השתמש בתמונה ברזולוציה גבוהה, בהקרנה מקסימלית או בממוצע המסגרות כהפניה לבחירת ROIs. הפעל מחדש את ההדמיה של קיטועי הזמן כדי להמחיש תאים מגיבים שאינם נראים בתמונות ייחוס. מקם את ה- ROIs כך שהאזור שנבחר של החזר השקעה אינו חופף לתאים שכנים כדי למנוע הצלבת אות בין ROIs.
  3. ייצא את נתוני סדרת הזמן כערך ממוצע ROI לכל מסגרת. ייצא קואורדינטות ROI.
  4. תיקון נתוני סדרות הזמן להלבנה (איור 7A) על-ידי שימוש בשילוב של התאמה מעריכית וליניארית, כפי שמתואר על-ידי
    Equation 1(1)
    כאשר x(t) מציין את האות הפלואורסצנטי בנקודת זמן t; xcorr(t) האות המתוקן בנקודות הזמן המתאימות; ו-a, b ו-c הפרמטרים של ההתאמה המחושבים כסכום הריבועים הנמוך ביותר בין ה-corr(t) ל-x(t).
  5. נתחו את שלב ההפעלה וההשבתה של התגובה (איור 7B). חשב את הנגזרת הראשונה של נתוני סדרת הזמן, וקבע את השיא ואת השפל של הנגזרת המתאימים להפעלה ולהשבתה, בהתאמה. לחלופין, בחר באופן ידני את תחילת העלייה הפאזית. שמור וייצא את זמני ההפעלה/ביטול ההשבתה ואת קואורדינטות התא המתאימות.
  6. נתחו את שלב המישור (איור 7C). זהה תנודות בודדות על-ידי סף הנתונים הגולמיים או על-ידי סף הנגזרת הראשונה של נתוני סדרות הזמן. הגדר את ההתחלה והסוף של תנודה בודדת כזמן המתאים לחצי משרעת של התנודה.
    1. חשב את משך הזמן ואת התדירות של תנודות בודדות עבור כל תא. חשב את הערך ההופכי של מרווח interspike (מתאים לדפוסי פעילות רגילים). לחלופין, חלקו את מספר התנודות במרווח הזמן של הרשומה (מתאים לדפוסי פעילות לא סדירים).
    2. חשב את הזמן הפעיל. ציין את הזמן הפעיל כסכום משכי הזמן, וחלק ערך זה במרווח הזמן. לחלופין, הכפל את התדירות ואת משך הזמן המתאימים לתנודה.
      הערה: חלוקת סכום משכי הזמן במרווח הזמן מספקת תוצאות חזקות, אך יש לה הבחנה סטטיסטית נמוכה כאשר מתקבלת נקודת נתונים יחידה לכל תא. הכפלת התדירות והמשך של תנודה מספקת רזולוציה טמפורלית של תנודה לתנודה.

Representative Results

הזרקת תמיסת האגרוס לתוך צינור הלבלב היא השלב הקריטי ביותר בהכנת פרוסת רקמות הלבלב. ניתן לזהות הזרקה מוצלחת על ידי הלבנה של רקמת הלבלב, כפי שניתן לראות בצד שמאל של איור 3A, בעוד שחלק מוזרק חלקית של הלבלב מוצג בצד ימין של איור 3A. ניתן לזהות את האיים של לנגרהאן בעין בלתי או תחת סטריאומיקרוסקופ, וזה מסייע בחיתוך החלקים המתאימים של הלבלב להטבעה לאחר מכן בבלוקים אגרוזים (איור 3B). בפרוסת רקמת לבלב של עכבר שזה עתה נחתכה, ניתן להבחין בקלות בין איים של לנגרהנים לבין הרקמה האקסוקרינית שמסביב ומזנכים ככתמים לבנים מתחת לסטריאומיקרוסקופ (איור 3C) או כמבנים חומים מתחת למיקרוסקופ האור (איור 3D). פרוסות רקמת הלבלב יכולות לשמש לסוגים שונים של ניסויים במשך 12 שעות לפחות לאחר החיתוך. בנוסף להערכה המורפולוגית הגסה תחת הסטריאומיקרוסקופ, מיקרוסקופ האור והתגובות התפקודיות של תאים במהלך הדמיית סידן, ניתן להעריך את הכדאיות של פרוסות רקמת הלבלב (איור 4).

Figure 4
איור 4: כדאיות התאים בתוך פרוסת הרקמה. הכדאיות של התאים נקבעה באמצעות בדיקת Live/Dead. תאים חיים מוכתמים על ידי Calcein AM (מוצג בירוק), בעוד שתאים מתים מוכתמים באתידיום הומודימר-1 (מוצג באדום). קווים צהובים מציינים את המיקום של חתך X-Y של מחסנית Z המוצגת בתחתית ובימין. העומק המלא של מחסנית Z הוא 88 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

עבור ניסויי הדמיית סידן, מחוון הסידן הפלואורסצנטי צריך לחדור דרך כמה שכבות של תאים. איור 5A מציג טעינה מוצלחת של צבע האינדיקטור Ca2+ החדיר לתאים לתוך פרוסת רקמת הלבלב שבה ניתן לזהות תאי איון ואצינר בודדים. לעומת זאת, פרוסות באיור 5B-D אינן אופטימליות בשל חדירה לא מוצלחת של הצבע (איור 5B), היעדר תאי איון (איור 5C) והרבה רקמה נמקית על פני השטח (איור 5D). ניתן להשליך פרוסות כאלה, לבדוק את נוכחותם של איונים נוספים שנחתכים או מוכתמים טוב יותר (ראה טבלה 1 לפתרון בעיות), או להשתמש בהם לתיעוד התגובות של תאים אקסוקריניים.

Figure 5
איור 5: דוגמאות לתכשירים שמישים ובלתי שמישים. (A) דוגמה להכנה מוצלחת של פרוסת רקמת הלבלב עם תאים מוכתמים היטב באיים של לנגרהנס, כמו גם תאי צינור ורקמה אסינארית מסביב. (B) דוגמה לפרוסת טישו מוכתמת בצורה גרועה. (C) דוגמה של איון של לנגרהנים עם הפסקות מבניות. (D) דוגמה לאי של לנגרהנים המכיל תאים מתים רבים והרבה פסולת. טבלת בדיקת המידע "זוהר-מעל, זוהר-תחת" בצד ימין מציגה עוצמה 0 בירוק ורוויה בכחול. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

תוצאות מייצגות מהדמיית סידן באמצעות צבע האינדיקטור Ca2+ החדיר לתאים מוצגות באיור 6. באיור 6A מוצגת תמונה ברזולוציה גבוהה של פרוסת רקמת לבלב, המכילה איון של לנגרהנים, רקמה סינרית וצינור לבלב. להבחנה טובה יותר, החלק האנדוקריני, האקסוקריני והצינורי של פרוסת רקמת הלבלב המוצג באיור 6A צבועים באיור 6B. שימוש בגירויים מתאימים יכול להבחין באופן פונקציונלי בין תאי איון שונים, או תאי איון ולא תאי איון51. תאי בטא יגיבו בדרך כלל לגירוי של דופק ריבועי על ידי גלוקוז עם עלייה חולפת ב-[Ca2+] IC ואחריה תנודות סידן מהירות על מישור מתמשך (איור 6C, פאנל עליון).

מכיוון שכל תאי הבטא מצומדים לסינסיטיום יחיד, גדול ומתפקד, תנודות אלה גם מסונכרנות היטב בין תאים שונים באמצעות התפשטות גלי IC [Ca2+] 32,34,52,53,54 (איור 7C). תנודות IC איטיות יותר [Ca2+] עם פרק זמן של 5-15 דקות עשויות לעמוד בבסיס התנודות המהירות או אפילו להיות הסוג השולט של תגובה55,56. אותו פרוטוקול פשוט עשוי לחשוף סוגים אחרים של תגובות, במיוחד בשולי האיים (איור 6C, פאנל תחתון). מכיוון שתאים אלה אינם מסונכרנים עם תאי בטא ומגיבים עם תנודות מהירות ולא סדירות יותר שכבר קיימות בתנאי גלוקוז נמוכים או עם ירידה בפעילות, תגובות כאלה מרמזות מאוד על תאים שאינם בטא 21,32,57,58. עם זאת, האפיון התפקודי הסופי שלהם דורש פרוטוקולים מורכבים יותר עם שלבי גירוי נוספים או גישות חלופיות, שיידונו להלן. תגובות אופייניות של תאים אצינריים ותאים דוקטליים מוצגות באיור 6D ובאיור 6E, בהתאמה. עיין בספרות לקבלת פרטים נוספים על תאים אצינריים ותאים צינוריים 22,23,35.

Figure 6
איור 6: תוצאות מייצגות של דינמיקת סידן בסוגים שונים של תאי לבלב. סרגל קנה מידה = 100 μm. (B) תיחום של חלקים שונים של רקמת הלבלב עם רקמה אסינארית המוצגת בצהוב, איון של לנגרהנים המוצג באדום, וקטע של עץ הצינור בכחול. סרגל קנה מידה = 100 μm. (C) עקבות אופייניים של דינמיקת סידן בתאי בטא ותאי פוטטיביים שאינם בטא במהלך גירוי עם גלוקוז של 12 mM; 3 mM גלוקוז שימש למצבים שאינם מעוררים. פרוטוקולים שניתן להשתמש בהם לאפליה ספציפית יותר של תאים שאינם בטא מתוארים בסעיף הדיון. (D) עקבות אופייניים של דינמיקת סידן של תאים אצינריים מגורה על ידי אצטילכולין של 25 ננומטר. (E) עקבות אופייניים של דינמיקת סידן של תאים צינוריים המעוררים על ידי חומצה כנודאוקסיכולית של 1 mM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

לאחר הדמיית סידן מוצלחת, הנתונים מיוצאים ומתוקנים תחילה להלבנה על ידי שילוב של התאמה מעריכית וליניארית, כמתואר בסעיף הפרוטוקול. סדרת זמן לפני ואחרי תיקון הלבנה מוצגת באיור 7A. לאחר מכן, ניתן לנתח מספר פרמטרים בשלב ההפעלה וההשבתה של התגובה, כמו גם את שלב המישור. ניתן למדוד עיכוב בהתפרצות של [Ca2+]IC עלייה לאחר גירוי כפי שהוא מיוצג על ידי עיכובA באיור 7B וההטרוגניות בעיכובים בין תאים בודדים (עיכובA1). ניתן להשתמש באותם פרמטרים (השהיהD ו- delayD1) כדי לתאר את שלב ההשבתה. בעקבות העלייה הארעית הראשונית [Ca2+] IC , שלב הרמה ברוב תאי הבטא של הלבלב באי מתאפיין בתדר גבוה יחסית [Ca2+]IC תנודות IC בתדירות גבוהה. ניתן לתאר את שלב המישור על ידי ניתוח הפרמטרים הפונקציונליים הקלאסיים. ההצגה הסכמטית של משך הזמן, התדירות ואחוז הזמן הפעיל של [Ca2+]IC מוצגת באיור 7C. בהדמיית סידן עם קצבי רכישה גבוהים מ-10 הרץ, ניתן לזהות בבירור גם גלי סידן המתפשטים שוב ושוב על פני האי (איור 7C).

Figure 7
איור 7: ניתוח של נתוני סדרות זמן. (B) ניתוח עיכובים בהפעלה לאחר גירוי ולהשבתה לאחר הפסקת גירוי עם גלוקוז של 12 מ"מ. משך הגירוי מסומן על ידי הפס האפור הבהיר, המוצלל בתמונה. (C) ניתוח של מספר פרמטרים של שלב המישור: I) משך התנודה שנקבע בחצי גובה, II) תדירות התנודות הנקבעות על ידי מרווחי בין תנודות. III) זמן פעיל כתוצר של תדירות ומשך של תנודות. I-IV) עיכובים בין תנודות בכל גל נתון של תנודות המתפשטות על פני האי לנגרהנס שנקבעו על ידי העיכובים (Δt) בזמן שבו תא יחיד מגיע לחצי גובה של התנודה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

שיטת פרוסת רקמת הלבלב היא שיטה ניסיונית מהירה לחקר המורפולוגיה והפיזיולוגיה של החלקים האנדוקריניים והאקסוקריניים של הלבלב בהכנה שמורה יותר, באתרה. רבים מהיתרונות כבר צוינו במבוא. ראוי לציין כי באופן כללי (כלומר, לא רק להדמיית סידן), גישת הפרוסה לחקר הפיזיולוגיה של הלבלב חוסכת זמן מכיוון שהיא אינה כרוכה בתקופת התאוששות לאחר הבידוד. זה האחרון אינו הכרחי לחלוטין עם כל סוגי הניסויים והשימושים של איים מבודדים ממינים שונים, אבל הוא משמש בדרך כלל כדי להגביר את הטוהר, להחזיר את הכדאיות ואת הפונקציונליות, ולפעמים כדי לאסוף איים מכמה תורמים 59,60,61,62,63,64 . עם זאת, בהקשר של הדמיית סידן, תגובות תאי בטא נמצאו תלויות במשך התרבית ובתנאים, וזהו מקור חשוב לשונות שיש לקחת בחשבון בעת שימוש באיים מבודדים15,65. אותה בעיה צריכה להילקח בחשבון עבור פרוסות טישו אם התרבית ארוכת הטווח שלהן תהפוך לאופציה בשימוש נרחב בעתיד22,36. לשיטת פרוסת הרקמה יש גם תפוקה גבוהה ולכן היא עלולה להפחית את הסבל של בעלי החיים ולהגביר את העוצמה הסטטיסטית. יתר על כן, כפי שניתן להכין פרוסות רבות מבעל חיים יחיד ומכיוון שהפרוסות שורדות תקופות ארוכות, כולל אותה חיה או אפילו אותו איון הן בקבוצות הניסוי והן בקבוצות הביקורת הופך להיות אפשרי.

ככל שהארכיטקטורה המקורית והתקשורת בין התא לתא נשמרות, ומכיוון שהיא תואמת למספר אנליזות מבניות, אלקטרופיזיולוגיות, שיטות הדמיה ומבחני הפרשת הורמונים, שיטה זו שימושית במיוחד לחקר תפקודי לבלב התלויים באינטראקציות ללא הפרעה בין תאים בודדים, למשל, רגישות להפרשות, פרקרין ואינטראקציות חיסוניות בין סוגי תאים שונים, דפוסים של פעילות חשמלית, תכונות של דינמיקת סידן, והפרשת הורמונים שונים. עבור הדמיית סידן באופן ספציפי, היתרונות העיקריים של שימוש בפרוסות הם החשיפה של ליבת האי והאפשרות לרכוש אותות מסוגי תאים רבים ושונים ברזולוציה גבוהה. בהתאם לדרישות הניסוי וגיל בעלי החיים, ניתן לגוון את העובי, ניתן לגוון את הפרוסות, או לקבל אותן מבעלי חיים עם כתבים מקודדים גנטית. כפי שיוסבר ביתר פירוט בהמשך, שתי הגישות האחרונות מאפשרות גם זיהוי תפקודי ספציפי ואפיון של תגובות מתאים שאינם בטא 31,66. יתר על כן, איים מחלקים מוגדרים היטב של האיבר ניתן לחקור עבור הבדלים בתגובה או רגישות למחלה. למרות שהם אינם דורשים תקופת דגירה של התאוששות, הם יכולים בקלות להיות דגירה עם חומרים פרמקולוגיים שונים, חומצות שומן, גלוקוז גבוה, וציטוקינים.

והכי חשוב, מכיוון שניתן להשיג רזולוציה גבוהה בשילוב עם רזולוציה חד-תאית או אפילו תת-תאית, הדמיית סידן קונפוקלית בפרוסות היא אחת השיטות המתאימות ביותר לניתוח גלי סידן, קישוריות תפקודית והתפקידים התפקודיים השונים של תאים בחלקים שונים שלאיון 54,67. למרות מספר יתרונות, לגישת פרוסת הרקמה יש מגבלות חשובות. ראשית, הוא עדיין משבש לפחות באופן חלקי את ארכיטקטורת האיים והאקסוקריניים, במיוחד במשטח החתך, ויש צורך באמצעי זהירות, כגון טמפרטורה נמוכה, חילופי פתרונות תכופים ומניפולציה עדינה ומהירה, במהלך ההכנה כדי למנוע נזק מכני ואנזימטי אנדוגני נוסף. שנית, דפוסי ההזנה וההפרשה עדיין נחותים ממסלול ה-in vivo, ההכנה מנותקת מעירויה מערכתית, ומשוב בין איברים, כגון בין האי לבין רקמות המטרה שלו, הוא בלתי אפשרי, בניגוד לגישות in vivo. שלישית, עובי פרוסה מרבי מוגבל על ידי חמצון, אספקת חומרים מזינים וויסות pH של כ-200 מיקרומטר9. יתר על כן, הן הכנת פרוסות והן הדמיה זקוקות להכשרה רבה, וניתוחים מעמיקים של נתוני סידן מסדרות ארוכות טווח ומתאים רבים דורשים ידע מיוחד שלעתים קרובות אינו נכלל בארגז הכלים של פיזיולוג קלאסי ודורש עזרה מפיזיקאים או מדעני נתונים. היתרון בכך שאינטראקציות הומו והטרוטיפיות נשמרות יכול גם לסבך את ניתוח הדגימות בשל נוכחותם של אותות מתאים אחרים באזורי עניין. בהתאם לפרוטוקולים, הפעלה של תאים אחרים יכולה להוביל לגירוי נוסף עקיף או עיכוב של תא שנצפה.

ניתן לפתור זאת רק באופן חד משמעי על ידי גישות של דה-קונבולוציה, על ידי פרוטוקולי גירוי מורכבים יותר, כולל חומרים החוסמים חלק מההשפעות העקיפות, על ידי שימוש בבעלי חיים ספציפיים, ועל ידי השוואה זהירה של התוצאות עם תוצאות ממחקרים אחרים המשתמשים במתודולוגיות רדוקציוניסטיות יותר. בנוסף, אם יש צורך במדידות הפרשה, יש לזכור כי פרוסות מסוימות עשויות להיות חסרות איים, והמסה הכוללת של רקמה אנדוקרינית בפרוסה אחת היא בדרך כלל נמוכה. הכנת פרוסות רקמת לבלב חריפה להדמיה כוללת מספר שלבים קריטיים שנדונו בסעיפים הבאים וסוכמו בטבלה 1, שם הקורא יכול למצוא גם טיפים קצרים אך חשובים לפתרון בעיות. ראשית, בעת הכנת תמיסת האגרוס, אבקת האגרוס חייבת להתמוסס לחלוטין, אחרת החלקיקים הלא פתורים עלולים לחסום את ההזרקה. שמור על תמיסת האגרוז ההומוגנית בטמפרטורה של 37-45 מעלות צלזיוס כדי למנוע התקשות של אגרוז עקב טמפרטורה נמוכה מדי מצד אחד וכדי למנוע נזק לרקמות עקב טמפרטורות גבוהות מדי מצד שני. לאחר השימוש, האגרוז הנותר עשוי להיות מאוחסן ב 4 °C (66 °F) ולחמם מחדש, אם כי חימום חוזר ונשנה יכול לגרום לצפיפות מוגברת עקב אידוי מים, בסופו של דבר מה שהופך את הזריקה קשה או בלתי אפשרית.

השלב הקריטי הבא בהכנה הוא הידוק נכון של הפפילה התריסריון הגדול. נקודה לבנה על התריסריון מציינת את הצומת של צינור המרה המשותף והתריסריון. מהדק המוצב באופן פרוקסימלי מדי יגרום לחסימה של כמה ענפי לבלב לרוחב של הצינור המשותף, ובכך ישבית את ההזרקה של חלקים אלה, בעוד שמהדק המונח באופן דיסטלי מדי יגרום לדליפת אגרוז דרך נתיב ההתנגדות התחתון ישירות לתוך התריסריון. לפני שימורים של צינור המרה המשותף, ניתן להסיר בזהירות את רקמת השומן שמסביב להדמיה טובה יותר של הצינור ושליטה רבה יותר במהלך ההזרקה. דיוק לא מספיק במהלך הסרת הרקמה הסובבת עלול לגרום לניקוב של הצינור. בחירת קוטר המחט המשמשת להזרקת אגרוז חשובה גם היא. בעכברים, עדיף להשתמש במחט של 30 גרם; מחטים קטנות יותר (32 או 33 גרם) דורשות מאמץ רב יותר בשל צמיגות גבוהה של תמיסת האגרוז והן מועדות יותר לחסימה. עם זאת, אם משתמשים בהם בשילוב עם תמיסת אגרוז בצפיפות נמוכה יותר, הם יכולים לעזור מאוד בזני עכברים קטנים יותר ובבעלי חיים צעירים יותר. במהלך הימים הראשונים שלאחר הלידה, ניתן לחלופין להזריק אגרוז באופן תת-קפסולרי ולא באופן תוך-כיווני2. שימוש במחטים עם קוטר גדול יותר בעכברים יגרום ככל הנראה לפגיעה בצינור המרה הנפוץ. זה יכול לקרות גם עם קוטר המחט הנכון, ומלקחיים יכולים לעזור בשמירה על המחט במקום במהלך ההזרקה. מחטים בקוטר גדול יותר עשויות להיות הפתרון היחיד במקרה של צינורות גדולים יותר, כפי שנמצא בחולדות. אם המחט צרה מכדי להבטיח אטימה הדוקה המונעת דליפה אחורית, ניתן להניח ליגטורה סביבה עם כניסה מוצלחת לתעלה.

הזרקת אגרוז דורשת מאמץ מסוים בשל צמיגות התמיסה, וברגע שתהליך ההזרקה החל, אין לקטוע אותה מכיוון שתמיסת האגרוז בעלת נקודת ההיתוך הנמוכה עשויה להתמצק במחט או בחלקים הגדולים ביותר של עץ הצינור לפני השלמת ההזרקה. זה יגרום לחדירה לקויה של רקמות ותמיכה גרועה יותר במהלך החיתוך. הצינור צריך תמיד להיות משומר בנקודה שבה צינור הכבד השמאלי והצינור הציסטי מתחברים ליצירת צינור המרה המשותף.. אם צינור המרה המשותף מחורר, נסה שוב ושוב לחדור קרוב יותר לתריסריון. כאשר הלבלב מיוצב מספיק עם תמיסת אגרוז ומופק מחלל הצפק, חתיכות קטנות של רקמה מוזרקת היטב נחתכות. לפני הטבעתם באגרוס, חשוב להסיר את כל רקמות השומן והחיבור מכיוון שהשאריות שלהם הופכות את החיתוך למאתגר יותר. כנ"ל לגבי כלי דם ושאריות צינורות, למעט כאשר הם נמצאים במוקד הניסוי. במקרה זה, הקפד למקם אותם באופן כזה כי החתך הרצוי יתקבל. בעת הטבעת הרקמה באגרוס, ודא כי הטמפרטורה מתאימה (37 °C ), וכי הרקמה מוקפת לחלוטין באגרוז, שכן כוחות במהלך חיתוך ויברטום יכולים לקרוע את רקמת הלבלב מגושי האגרוז.

ייבוש מהיר של גושי הרקמה לפני הנחתם באגרוז על ידי הנחתם לזמן קצר על רקמת נייר יכול לסייע במניעת מגע לקוי בין הרקמה לאגרוזה במהלך שלב זה. במהלך התמצקות גושי אגרוז, מניחים את צלחת הפטרי בצורה אופקית, ומונעים מגע בין רקמת הלבלב לתחתית צלחת הפטרי. אם הלבלב אינו מוזרק במלואו, תהליך החיתוך יהיה מאתגר. לכן, נסו להפחית את מהירות החיתוך כדי להשיג פרוסות טישו. כדי למזער את הנזק לתאים במהלך חיתוך ויברטום, החליפו את ה-ECS (ואת קוביות הקרח העשויות מ-ECS) בתא החיתוך באופן קבוע. זה האחרון יפחית את הפעילות של אנזימי הלבלב המשתחררים מרקמת acinar במהלך חיתוך. גם לעובי הפרוסות יש חשיבות מכרעת. עבור דינמיקת סידן וניסויים אלקטרופיזיולוגיים, פרוסות 140 מיקרומטר נחתכות בדרך כלל; עם זאת, על פי מטרת המחקר, עובי פרוסה יכול לנוע בין 90 מיקרומטר ל 200 מיקרומטר. יש לזכור כי בפרוסות עבות יותר, פיזור החמצן והחומרים המזינים יהיה מוגבל, אך הם יכללו יותר רקמות. בנוסף, ייתכן ששיעור האיים הלא חתוכים יגדל עם הגדלת עובי הפרוסה. ניתן לאחסן פרוסות ב- ECS שהוחלף באופן קבוע בטמפרטורת החדר במשך מספר שעות או אפילו לטפח אותן במדיום תאים מתאים במשך מספר ימים; עם זאת, הדבר עשוי להשפיע בסופו של דבר על הפיזיולוגיה הרגילה של תאי האי 3,22.

בעת הכנת תמיסת הצבע, הקפידו על ערבוב זהיר של כל הרכיבים, והימנעו מחשיפה לאור הסביבה. פרוסת הלבלב מורכבת משכבות תאים רבות, וספיגת צבע הסידן מוגבלת לשכבות הראשונות של התאים השטחיים ביותר, כפי שתואר קודם לכן עבור איים מבודדים58,68, ופרוסות יותרת המוח69. עם זאת, בניגוד לאיים מבודדים שבהם הקפסולה הסובבת ושכבות התאים החיצוניים מעכבות את חדירת הצבע לשכבות עמוקות יותר, פרוסות הרקמות מאפשרות גישה לכל משטח החתך של האיון, ומאפשרות מדידה סימולטנית של דינמיקת הסידן במאות תאים מכל שכבות האי. אינדיקטורים פלואורסצנטיים Ca2+ הם הנפוצים ביותר למדידת דינמיקת סידן, ויחד עם CLSM, הם מאפשרים הקלטות עם רזולוציה טמפורלית גבוהה, המגיעים לכמה מאות הרץ. בעת בחירת מחוון Ca2+ הפלואורסצנטי המתאים ביותר, שקול גורמים שונים, כולל צורת המחוון, המשפיעה על שיטת טעינת התא, מצב המדידה (איכותי או כמותי), וקבוע דיסוציאציה (Kd) שצריך להיות בטווח הריכוז Ca2+ ותלוי ב- pH, טמפרטורה, נוכחות של Mg2+ ויונים אחרים, כמו גם קשירת חלבון. מכיוון שאותות Ca2+ תאיים הם בדרך כלל ארעיים, יש לקחת בחשבון גם את קבוע קצב הקישור של Ca2+. למדידת הדינמיקה של [Ca2+] IC בתאי הלבלב, קבוצה זו משתמשת בעיקר בצבע מחוון Ca2+ החדיר לתאים המתואר בפרוטוקול זה (טבלת חומרים) מכיוון שהוא מחוון אורך גל ארוך עם אורכי הגל של הפליטה בספקטרום שבו האוטו-פלואורסצנציה התאית היא בדרך כלל פחות בעייתית, והאנרגיה של אור העירור נמוכה, מה שמקטין את הפוטנציאל לצילום תאי. מכיוון שצבע זה הוא פלואורסצנטי בריכוזי Ca2+ נמוכים, הדבר מקל על קביעת הבסיס [Ca2+]IC ומגביר את הנראות התאית לפני הגירוי. לאחר קשירת Ca2+, עוצמת הפלואורסצנציה של הצבע גדלה פי 14, מה שמאפשר זיהוי של שינויים קלים אפילו ב-[Ca2+]IC.

להדמיית סידן מוצלחת של תאים חיים, יש לקחת בחשבון מספר פרמטרים חיוניים של חומרה, כמתואר בסעיף הפרוטוקול. עבור הדמיה של תאים חיים, שבה משרעת האות נמוכה והסיכויים לפוטוטוקסיות גבוהים, מטרות עם NA גבוה יותר עדיפות לשמש לאיסוף יותר אור מהדגימה. אם יש לרשום דינמיקת סידן ברזולוציה טמפורלית גבוהה, השתמש בסורק התהודה במקום בגלוונומטרים ליניאריים. מלבד בחירת המטרה הנכונה, השימוש בגלאים רגישים ביותר - כגון גלאים היברידיים הדורשים פחות כוח לייזר - מונע פוטוטוקסיות ומול הלבנת תמונות. יש לכך חשיבות מיוחדת להדמיית סידן לאורך זמן. שלבים חשובים אחרים בהדמיית סידן הם הגדרות פרמטרים של איכות תמונה לרכישות סדרות זמן. החשובים ביותר הם הרזולוציה הטמפורלית והמרחבית. מכיוון שדינמיקת הסידן כשלעצמה קובעת את הרזולוציה הטמפורלית המקובלת הנמוכה ביותר, קצב הדגימה צריך להיות גבוה לפחות פי שניים מתדר האות הצפוי כדי לזהות את האות או אפילו גבוה פי 10 כדי לזהות את צורת האות באופן אמין. בפרוסות רקמת לבלב חריפות, ניתן למדוד את הדינמיקה של הסידן במאות תאים בו זמנית ולכן גם הרזולוציה המרחבית חשובה. ניתן לשפר זאת על ידי הגדלת מספר הפיקסלים או על ידי הגדלת ממוצע הקו במהלך רכישה חיה. עם זאת, בגלל הקשר ההופכי בין הרזולוציה המרחבית לרזולוציה הזמנית, יש צורך בפשרה בין שתי ההגדרות.

אם הדמיית סידן צריכה להתבצע באוכלוסיית תאים מסוימת בתוך הלבלב, יש צורך בגירוי המסוגל להבדיל את התאים בתוך הפרוסה באופן פונקציונלי. גלוקוז גבוה באופן אמין ומפעיל במהירות תאי בטא לתבנית מתנדת שמונחת על גבי רמת סידן גבוהה ומסונכרנת מאוד בין כל התאים בתוך איון 32,58,70. תאי הבטא הם סוג התאים הרב ביותר בתוך איון והם ממוקמים בעיקר בליבת האי בעכברים. אותו פרוטוקול גירוי פוחת ולעיתים אינו משנה באופן ניכר את ההתפוצצות בתאי אלפא 30,32,58,70,71,72. כדי להבחין בין תאי אלפא באופן פונקציונלי, ניתן להשתמש בגלוקוז נמוך (3 מ"מ), גלוטמט או אדרנלין כדי להגביר את התדירות או הבסיסית שלהם [Ca2+]IC 21,72,73,74,75. הם מייצגים 10-20% מתאי האיון ויזוהו בפריפריה של האי1. תאי דלתא נמצאים גם בפריפריה. הם מהווים רק כ-5% מהמספר הכולל של תאים אנדוקריניים באיון, ובדרך כלל פעילים ב-6 mM גלוקוז ומגיבים לגירוי גלוקוז עם פעילות מוגברת של התפרצויות לא סדירות מהבסיס או רמת סידן מעט גבוההיותר 1,32,71,76. גרלין יכול לשמש לגירוי ספציפי של תאי דלתא 21,77,78,79 בניסויי הדמיית סידן. עם זאת, פרוטוקולים לזיהוי תפקודי ספציפי של תאי PP ואפסילון נותרו להגדרה. יתר על כן, אצטילכולין 25 ננומטר מפעיל באופן אמין תאים אצינריים לפעילות מתפוצצת 35,80,81. בנוסף, ניתן להשתמש במספר הפרשות אחרות, כגון סרולין, כולציסטוקינין וקרבמילכולין, כדי לעורר תגובות סידן בתאי אצינר 22,40,82,83.

לבסוף, 1 mM חומצה chenodeoxycholic מעורר באופן אמין תגובות סידן בתאים ductal בפרוסות רקמה; אנגיוטנסין II, ATP, וכמה סודות אחרים יכולים לשמש גם 11,23,84,85. בכל פעם שזיהוי פונקציונלי המבוסס על תגובות אופייניות להפרשים ומעכבים ספציפיים אינו מספיק, ניתן להשתמש בבעלי חיים המסומנים גנטית31, תאים שעברו טרנספקטציה73 או אימונוציטוכימיה לזיהוי סוגי תאים שונים 9,22,71,86 . במהלך השנתיים האחרונות, שיטת פרוסת הרקמה הותאמה בהצלחה לרקמות אנושיות, ופתחה אפיקי מחקר חשובים רבים הן באקסוקרינית41 והן בפיזיולוגיה האנדוקרינית 9,36,37,39. באופן מעניין, הערכה מפורטת של דינמיקת הסידן באיים האנושיים הייתה ידועה לשמצה כקשה ונותרה להיחקר בפירוט רב יותר87. בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית מתקדמת, שיטת פרוסת רקמת הלבלב אפשרה תובנות חדשות רבות על דינמיקת הסידן בעכברים, ובתקווה תעשה את אותו הדבר עבור רקמה אנושית.

Disclosures

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר כל אינטרס מסחרי או כספי.

Acknowledgments

העבודה שהוצגה במחקר זה נתמכה כספית על ידי סוכנות המחקר הסלובנית (מס' מימון ליבה למחקר). P3-0396 ו- I0-0029, כמו גם פרויקטים מחקריים. J3-9289, N3-0048 ו- N3-0133) ועל ידי קרן המדע האוסטרית / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (מענקים דו-צדדיים I3562--B27 ו- I4319--B30). אנו מודים למרושה רושר, למאשה צ'טר ולרודי מלקאר על סיוע טכני מצוין.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Analytical balance KERN ALJ 120-4 KERN & SOHN GmbH ALJ 160-4A
Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup Leica 5100001578
Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup Leica
Cork pad 15 cm x 15 cm
Corning 15 mL centrifuge tubes Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430790
Corning Round Ice Bucket with Lid, 4 L Fischer Scientific, Leicestershire, UK 432124
Double edge razor blade Personna, USA
Dumont #5 - Fine Forceps FST, Germany 11254-20
Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL Eppendorf 0030 121.023
Erlenmeyer flask 200 mL IsoLab, Germany 027.01.100
Fine Scissors - ToughCut FST, Germany 14058-11
Flat orbital shaker  IKA KS 260 basic IKA Ident. No.: 0002980200
Glass lab bottle 1000 mL IsoLab, Germany 091.01.901
Hartman Hemostat, curved FST, Germany 13003-10
HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0) Leica 15507701
Measuring cylinder 25 mL IsoLab, Germany 015.01.025
Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7 Luigs & Neumann  200-100 900 7311, 200-100 900 9050
Microwave owen Gorenje, Slovenia MO20MW
Osmometer Gonotec 010 Gonotec, Berlin, Germany OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20
Paint brush Faber-Castell, No.2 Any thin soft round paint brush No.2, preferably black
Paper towels
Perifusion pumps Ismatec ISM 827 Reglo Analog MS - 4/8
Petri dish 100/20 mm Sarstedt 83.3902
Petri dish 35/10 mm Greiner bio-one 627102
Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA 153066 NON-STICKY for agarose blocks
pH meter inoLab pH Level 1 WTW, Weilheim, Germany E163694
Pipette 1000 mL Eppendorf 3121 000.120
Pipette 50 mL Eppendorf 3121 000.066
Push pins 23 mm Deli, Ningbo, China E0021
Screw cap tube, 15 mL Sarstedt 62.554.502
Semken Forceps FST, Germany 11008-13
Stabilizing ring for Erlenmeyer flask IsoLab, Germany 027.11.048
Stereomicroscope Nikon SMZ 745 Nikon, Melville, NY USA
Syringe Injekt Solo 5 mL Braun, Melsungen, Germany 4606051V
Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2") Braun, Melsungen, Germany 4656300
Temperature controller Luigs & Neumann 200-100 500 0150, 200-150-500-145 Slice mini chamber, Temperature controller TC 07
Tubings for perifusion system Ismatec SC0310 Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)
Ultrasonic bath Studio GT-7810A Globaltronics
Vibrotome Leica VT 1000 S Leica, Nussloch, Germany 14047235613
Volumetric flask 1000 mL IsoLab, Germany 013.01.910
Vortex mixer Neolab 7-2020 Neolab  7-2020
Water bath Thermo Haake open-bath circulator Thermo Fisher Scientific Z527912
Material/Reagent
Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O Sigma Aldrich, Germany C5080-500G
D-(+)-glucose Sigma Aldrich, Germany G8270-1KG
Dimethyl sulfoxide Sigma Aldrich D4540-100ML
DL-lactic acid Sigma Aldrich, Germany L1250-500ML
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Merck KGaA, Darmstadt, Germany D8662-500ML
Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure
Glue Wekem sekundenkleber WK-110 Wekem GmbH, Bergkamen, Germany WK 110-020
HEPES Sigma Aldrich, Germany H3375-250G
L-(+)-ascorbic acid Sigma Aldrich, Germany A9,290-2
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA L3224
Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O Sigma Aldrich, Germany M2670-500G
Myo-inositol Sigma Aldrich, Germany I5125-100G
Oregon Green 488 BAPTA-1, AM Invitrogen (Thermo FisherScientific) O6807 cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) P3000MP polaxamer: nonionic triblock copolymer
Potassium chloride - KCl Sigma Aldrich, Germany 31248
SeaPlaque GTG agarose Lonza, Rockland, USA 50111
Sodium bicarbonate - NaHCO3 Honeywell, Germany 31437-500G
Sodium chloride - NaCl Honeywell, Germany 31434-1KG
Sodium hydroxide - NaOH Sigma Aldrich, Germany 30620
Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4 Sigma Aldrich, Germany S0751-500G
Sodium pyruvate Sigma Aldrich, Germany 15990-100G
Software
FIJI FIJI is an open source project
LASAF Leica microsystems, Inc.
Matlab Mathworks
Python Python Software Foundation Python is an open source project

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e1024405 (2015).
  2. Meneghel-Rozzo, T., Rozzo, A., Poppi, L., Rupnik, M. In vivo and in vitro development of mouse pancreatic ß-cells in organotypic slices. Cell and Tissue Research. 316 (3), 295-303 (2004).
  3. Rozzo, A., Meneghel-Rozzo, T., Delakorda, S. L., Yang, S. B., Rupnik, M. Exocytosis of insulin: in vivo maturation of mouse endocrine pancreas. Annals of the New York Academy of the Sciences. 1152, 53-62 (2009).
  4. Dolenšek, J., Pohorec, V., Rupnik, M. S., Stožer, A. Pancreas physiology, challenges in pancreatic pathology. IntechOpen. Seicean, A. , (2017).
  5. Williams, J. A. The nobel pancreas: a historical perspective. Gastroenterology. 144 (6), 1166-1169 (2013).
  6. Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
  7. Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. American Journal of Physiology. 235 (5), 517-524 (1978).
  8. Peikin, S. R., Rottman, A. J., Batzri, S., Gardner, J. D. Kinetics of amylase release by dispersed acini prepared from guinea pig pancreas. American Journal of Physiology. 235 (6), E743-E749 (1978).
  9. Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
  10. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. Altex-Alternatives to Animal Experimentation. 27 (2), 105-113 (2010).
  11. Molnar, R., et al. Mouse pancreatic ductal organoid culture as a relevant model to study exocrine pancreatic ion secretion. Laboratory Investigation. 100 (1), 84-97 (2020).
  12. Rupnik, M. The physiology of rodent beta-cells in pancreas slices. Acta Physiologica (Oxford, England). 195 (1), 123-138 (2009).
  13. Blinman, T. A., et al. Activation of pancreatic acinar cells on isolation from tissue: cytokine upregulation via p38 MAP kinase. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 279 (6), C1993-C2003 (2000).
  14. Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic ß-cells. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. 446 (5), 553-558 (2003).
  15. Gilon, P., Jonas, J., Henquin, J. Culture duration and conditions affect the oscillations of cytoplasmic calcium concentration induced by glucose in mouse pancreatic islets. Diabetologia. 37 (10), 1007-1014 (1994).
  16. Huang, C., Gu, G. Effective isolation of functional islets from neonatal mouse pancreas. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (119), e55160 (2017).
  17. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (7), e255 (2007).
  18. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1125 (2009).
  19. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1343 (2009).
  20. Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4137 (2012).
  21. Hamilton, A., Vergari, E., Miranda, C., Tarasov, A. I. Imaging calcium dynamics in subpopulations of mouse pancreatic islet cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (153), (2019).
  22. Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS ONE. 8 (11), e78706 (2013).
  23. Gal, E., et al. A Novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).
  24. Speier, S., Yang, S. B., Sroka, K., Rose, T., Rupnik, M. KATP-channels in beta-cells in tissue slices are directly modulated by millimolar ATP. Molecular and Cellular Endocrinology. 230 (1-2), 51-58 (2005).
  25. Speier, S., Gjinovci, A., Charollais, A., Meda, P., Rupnik, M. Cx36-mediated coupling reduces β-cell heterogeneity, confines the stimulating glucose concentration range, and affects insulin release kinetics. Diabetes. 56 (4), 1078-1086 (2007).
  26. Rose, T., Efendic, S., Rupnik, M. Ca2+-secretion coupling is impaired in diabetic Goto Kakizaki rats. The Journal of General Physiology. 129 (6), 493-508 (2007).
  27. Paulmann, N., et al. Intracellular serotonin modulates insulin secretion from pancreatic β-cells by protein serotonylation. PLoS Biology. 7 (10), e1000229 (2009).
  28. Mandic, S. A., et al. Munc18-1 and Munc18-2 proteins modulate β-cell Ca2+ sensitivity and kinetics of insulin exocytosis differently. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 28026-28040 (2011).
  29. Dolensek, J., Skelin, M., Rupnik, M. S. Calcium dependencies of regulated exocytosis in different endocrine cells. Physiological Research. 60, S29-S38 (2011).
  30. Huang, Y. C., Rupnik, M., Gaisano, H. Y. Unperturbed islet α-cell function examined in mouse pancreas tissue slices. Journal of Physiology. 589 (2), 395-408 (2011).
  31. Huang, Y. C., et al. In situ electrophysiological examination of pancreatic α cells in the streptozotocin-induced diabetes model, revealing the cellular basis of glucagon hypersecretion. Diabetes. 62 (2), 519-530 (2013).
  32. Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS ONE. 8 (1), e54638 (2013).
  33. Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), e1002923 (2013).
  34. Dolenšek, J., Stožer, A., Skelin Klemen, M., Miller, E. W., Slak Rupnik, M. The relationship between membrane potential and calcium dynamics in glucose-stimulated beta cell syncytium in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS ONE. 8 (12), e82374 (2013).
  35. Perc, M., Rupnik, M., Gosak, M., Marhl, M. Prevalence of stochasticity in experimentally observed responses of pancreatic acinar cells to acetylcholine. Chaos. 19 (3), 037113 (2009).
  36. Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265-3265 (2020).
  37. Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), e134525 (2020).
  38. Cohrs, C. M., et al. Vessel network architecture of adult human islets promotes distinct cell-cell interactions in situ and is altered after transplantation. Endocrinology. 158 (5), 1373-1385 (2017).
  39. Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting beta cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).
  40. Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
  41. Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
  42. Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
  43. Klemen, M., Dolenšek, J., Stožer, A., Rupnik, M. Exocytosis Methods. Thorn, P. 7, Humana Press. 127-146 (2014).
  44. Speier, S. Experimental approaches for high-resolution in vivo imaging of islet of Langerhans biology. Current Diabetes Reports. 11 (5), 420-425 (2011).
  45. Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Intraocular in vivo imaging of pancreatic islet cell physiology/pathology. Molecular Metabolism. 6 (9), 1002-1009 (2017).
  46. Reissaus, C. A., et al. A Versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Scientific Reports. 9 (1), 8449 (2019).
  47. Jacob, S., et al. In vivo Ca(2+) dynamics in single pancreatic beta cells. FASEB Journal. 34 (1), 945-959 (2020).
  48. Fernandez, J., Valdeolmillos, M. Synchronous glucose-dependent [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans recorded in vivo. FEBS Letters. 477 (1-2), 33-36 (2000).
  49. Almaca, J., Weitz, J., Rodriguez-Diaz, R., Pereira, E., Caicedo, A. The pericyte of the pancreatic islet regulates capillary diameter and local blood flow. Cell Metabolism. 27 (3), 630-644 (2018).
  50. Weitz, J. R., et al. Mouse pancreatic islet macrophages use locally released ATP to monitor beta cell activity. Diabetologia. 61 (1), 182-192 (2018).
  51. Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in α- and β-cells within intact pancreatic islets. Diabetes. 60 (5), 1535-1543 (2011).
  52. Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet. Biophysical Journal. 95 (11), 5048-5061 (2008).
  53. Santos, R. M., et al. Widespread synchronous Ca oscillations due to bursting electrical activity in single pancreatic islets. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. 418 (4), 417-422 (1991).
  54. terk, M., et al. Assessing the origin and velocity of Ca2+ waves in three-dimensional tissue: Insights from a mathematical model and confocal imaging in mouse pancreas tissue slices. Communications in Nonlinear Science and Numerical Simulation. 93, 105495 (2021).
  55. Gosak, M., et al. Critical and supercritical spatiotemporal calcium dynamics in beta cells. Frontiers in Physiology. 8, 1106 (2017).
  56. Satin, L. S., Butler, P. C., Ha, J., Sherman, A. S. Pulsatile insulin secretion, impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Molecular Aspects in Medicine. 42, 61-77 (2015).
  57. Tengholm, A., Gylfe, E. Oscillatory control of insulin secretion. Molecular and Cellular Endocrinology. 297 (1-2), 58-72 (2009).
  58. Quesada, I., et al. Glucose induces opposite intracellular Ca2+ concentration oscillatory patterns in identified α- and β-cells within intact human islets of Langerhans. Diabetes. 55 (9), 2463-2469 (2006).
  59. Ferguson, J., Allsopp, R. H., Taylor, R. M., Johnston, I. D. Isolation and long term preservation of pancreatic islets from mouse, rat and guinea pig. Diabetologia. 12 (2), 115-121 (1976).
  60. Andersson, A. Isolated mouse pancreatic islets in culture: effects of serum and different culture media on the insulin production of the islets. Diabetologia. 14 (6), 397-404 (1978).
  61. Ramirez-Dominguez, M. Isolation of mouse pancreatic islets of Langerhans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 938, 25-34 (2016).
  62. Carter, J., Dula, S., Corbin, K., Wu, R., Nunemaker, C. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11 (1), 3-31 (2009).
  63. Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplantation. 19 (12), 1523-1535 (2010).
  64. Zawalich, W. S., Yamazaki, H., Zawalich, K. C. Biphasic insulin secretion from freshly isolated or cultured, perifused rodent islets: comparative studies with rats and mice. Metabolism. 57 (1), 30-39 (2008).
  65. Roe, M. W., et al. Absence of effect of culture duration on glucose-activated alterations in intracellular calcium concentration in mouse pancreatic islets. Diabetologia. 38, 876-877 (1995).
  66. Shuai, H., Xu, Y., Yu, Q., Gylfe, E., Tengholm, A. Fluorescent protein vectors for pancreatic islet cell identification in live-cell imaging. Pflügers Archive. European Journal of Physiology. 468 (10), 1765-1777 (2016).
  67. Dolenšek, J., et al. Glucose-dependent activation, activity, and deactivation of beta cell networks in acute mouse pancreas tissue slices. bioRxiv. , (2020).
  68. QZhang, Q., et al. Cell coupling in mouse pancreatic beta-cells measured in intact islets of Langerhans. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical, and Engineering Sciences. 366 (1880), 3503-3523 (2008).
  69. Sánchez-Cárdenas, C., Hernández-Cruz, A. GnRH-induced Ca2+-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
  70. Asada, N., Shibuya, I., Iwanaga, T., Niwa, K., Kanno, T. Identification of alpha- and beta-cells in intact isolated islets of Langerhans by their characteristic cytoplasmic Ca2+ concentration dynamics and immunocytochemical staining. Diabetes. 47 (5), 751-757 (1998).
  71. Nadal, A., Quesada, I., Soria, B. Homologous and heterologous asynchronicity between identified α-, β- and δ-cells within intact islets of Langerhans in the mouse. Journal of Physiology. 517 (1), 85-93 (1999).
  72. Shuai, H., Xu, Y., Yu, Q., Gylfe, E., Tengholm, A. Fluorescent protein vectors for pancreatic islet cell identification in live-cell imaging. Pflugers Archive: European Journal of Physiology. 468 (10), 1765-1777 (2016).
  73. Cabrera, O., et al. Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release. Cell Metabolism. 7 (6), 545-554 (2008).
  74. Li, J., et al. Submembrane ATP and Ca2+ kinetics in α-cells: unexpected signaling for glucagon secretion. FASEB Journal. 29 (8), 3379-3388 (2015).
  75. Hamilton, A., et al. Adrenaline stimulates glucagon secretion by Tpc2-dependent Ca(2+) mobilization from acidic stores in pancreatic α-cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
  76. Arrojo, E. D. R., et al. Structural basis for delta cell paracrine regulation in pancreatic islets. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  77. DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
  78. Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
  79. Rorsman, P., Huising, M. O. The somatostatin-secreting pancreatic δ-cell in health and disease. Nature reviews. Endocrinology. 14 (7), 404-414 (2018).
  80. Petersen, C. C., Toescu, E. C., Petersen, O. H. Different patterns of receptor-activated cytoplasmic Ca2+ oscillations in single pancreatic acinar cells: dependence on receptor type, agonist concentration and intracellular Ca2+ buffering. The EMBO journal. 10 (3), 527-533 (1991).
  81. Thorn, P., Lawrie, A. M., Smith, P. M., Gallacher, D. V., Petersen, O. H. Local and global cytosolic Ca2+ oscillations in exocrine cells evoked by agonists and inositol trisphosphate. Cell. 74 (4), 661-668 (1993).
  82. Behrendorff, N., Floetenmeyer, M., Schwiening, C., Thorn, P. Protons released during pancreatic acinar cell secretion acidify the lumen and contribute to pancreatitis in mice. Gastroenterology. 139 (5), e1711-e1715 (2010).
  83. Criddle, D. N., et al. Cholecystokinin-58 and cholecystokinin-8 exhibit similar actions on calcium signaling, zymogen secretion, and cell fate in murine pancreatic acinar cells. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (6), G1085-G1092 (2009).
  84. Venglovecz, V., et al. Effects of bile acids on pancreatic ductal bicarbonate secretion in guinea pig. Gut. 57 (8), 1468-3288 (2008).
  85. Maleth, J., Hegyi, P. Calcium signaling in pancreatic ductal epithelial cells: an old friend and a nasty enemy. Cell Calcium. 55 (6), 337-345 (2014).
  86. Nadal, A., Quesada, I., Soria, B. Homologous and heterologous asynchronicity between identified alpha-, beta- and delta-cells within intact islets of Langerhans in the mouse. Journal of Physiology. 517 (Pt 1), 85-93 (1999).
  87. Skelin Klemen, M., Dolenšek, J., Slak Rupnik, M., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).

Tags

ביולוגיה גיליון 170 לבלב אגרוז פרוסת רקמה הכנת in situ מיקרוסקופיה לסריקת לייזר קונפוקלית הדמיית סידן רזולוציית תא יחיד 3R
מיקרוסקופיה לסריקת לייזר קונפוקלית של דינמיקת סידן בפרוסות רקמת לבלב חריפה של עכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stožer, A., Dolenšek, J.,… More

Stožer, A., Dolenšek, J., Križančić Bombek, L., Pohorec, V., Slak Rupnik, M., Klemen, M. S. Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices. J. Vis. Exp. (170), e62293, doi:10.3791/62293 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter