Summary
يسمح زرع CTCs بتوصيف وظيفي أعمق للسرطان ، من خلال قياس تعبير علامة محددة ، وتقييم مقاومة الدواء والقدرة على استعمار الكبد من بين إمكانيات أخرى. وعموما، يمكن أن تكون ثقافة لجنة مكافحة الإرهاب أداة سريرية واعدة للطب الشخصي لتحسين نتائج المرضى.
Abstract
الانبثاث هو السبب الرئيسي للوفاة بالسرطان. على الرغم من التحسينات في استراتيجيات العلاج، فإن السرطان النقيلي لديه تشخيص ضعيف. وبالتالي فإننا نواجه حاجة ملحة لفهم الآليات الكامنة وراء تطور الانبثاث، وبالتالي اقتراح علاجات فعالة للسرطان المتقدم. من الصعب علاج السرطانات النقيلية ، حيث أن الخزعات غازية ولا يمكن الوصول إليها. في الآونة الأخيرة ، كان هناك اهتمام كبير في الخزعات السائلة بما في ذلك كل من حمض deoxyribonucleic المتداول الخالي من الخلايا (DNA) وتعميم الخلايا السرطانية من الدم المحيطي وأنشأنا العديد من خطوط الخلايا السرطانية المتداولة من مرضى سرطان القولون والمستقيم النقيلي للمشاركة في توصيفها. في الواقع، لوصف هذه الخلايا النادرة وغير الموصوفة بشكل جيد، فإن الخطوة الحاسمة هي توسيعها. بمجرد تأسيسها ، يمكن بعد ذلك زراعة خطوط الخلايا السرطانية المتداولة (CTC) في ظروف التعليق أو التمسك. وعلى المستوى الجزيئي، يمكن استخدام خطوط CTC لتقييم التعبير عن علامات محددة ذات أهمية (مثل التمايز أو الخلايا الجذعية الظهارية أو السرطانية) عن طريق التحليل المناعي أو تحليل قياس الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام خطوط CTC لتقييم حساسية الأدوية للعلاج الكيميائي القياسي الذهبي وكذلك للعلاجات المستهدفة. ويمكن أيضا اختبار قدرة خطوط لجنة مكافحة الإرهاب على بدء الأورام عن طريق الحقن تحت الجلد من CTCs في الفئران المناعية.
وأخيرا، من الممكن اختبار دور جينات محددة ذات أهمية قد تشارك في نشر السرطان عن طريق تحرير جينات CTC، عن طريق حمض ريبونوكليك دبوس الشعر القصير (shRNA) أو Crispr/Cas9. وبالتالي يمكن حقن CTCs المعدلة في طحال الفئران المناعية ، لمحاكاة جزء من عملية التطوير النقيلي في الجسم الحي.
في الختام، خطوط CTC هي أداة ثمينة للبحوث المستقبلية والطب الشخصي، حيث أنها سوف تسمح التنبؤ بكفاءة العلاج باستخدام الخلايا نفسها التي هي في الأصل مسؤولة عن الانبثاث.
Introduction
على الرغم من التحسينات الأخيرة في التشخيص المبكر للسرطان وفي الاستراتيجية العلاجية ، لا يزال أكثر من تسعين في المئة من مراضة السرطان بسبب الانبثاث1. العملية النقيلية هي سلسلة متعددة الخطوات تبدأ بالانفصال المحلي للخلايا عن الورم الأساسي ودخولها إلى مجرى الدم حيث تصبح خلايا ورم متداولة (CTCs) لاستعمار مواقع بعيدة في النهاية مثل الكبد والرئتين ، في حالة سرطان القولون والمستقيم (CRC)2. في الآونة الأخيرة ، كان هناك اهتمام متزايد بال خزعات السائل ، والتي هي أداة غير الغازية للكشف بشكل ملحوظ وعدد CTCs من عينات دم المريض. التغايرية الوراثية داخل الرحم هو سبب رئيسي لمقاومة المخدرات. وبالتالي، عزل الخلايا التمثيلية من مادة الورم يشكل أداة واعدة للطب الشخصي3.
على الرغم من انخفاض وتيرة CTCs في الدم (1 CTC لكل 106 -10 7 الكريات البيض)4، تم تطوير العديد من تقنيات الكشف والعزل على أساس اختلافات الممتلكات بين CTCs والمكونات الأخرى للدم5. عدد CTCs في عينات دم المريض، وحدها، يمكن أن توفر معلومات عن مرحلة الأورام الخبيثة، والاستجابة للعلاج وتطور المرض6،7. وبالتالي، فإن عزلة CTC هي أداة حاسمة للدراسات التحويلية لتقييم التغاير الوراثي أو إجراء فحص الأدوية، وكذلك للدراسات الأساسية لتوصيف هذه الخلايا الغازية، لأنها الجهات الفاعلة الرئيسية في الحث النقيلي8،9. في الواقع ، بالمقارنة مع خطوط الخلايا السرطانية الراسخة تجاريا التي تراكمت الآلاف من الطفرات مع مرور الوقت ، تشترك CTCs الطازجة في السمات الرئيسية للورم الأساسي الأصلي بما في ذلك القدرة القوية على الانبثاث ، وهي انعكاس أفضل للمرض. هذه الميزات تجعلها أداة قوية للدراسات الأساسية ، وخاصة في تجارب خروج المغلوب من العوامل الرئيسية المتوقعة المشاركة في الانبثاث. يمكن التحقق من نتائج هذه التجارب في الجسم الحي، على الفئران ، كما هو موضح أدناه.
بمجرد عزل CTCs ، يمكن توسيعها في ظروف الثقافة غير الملتزمة ومن ثم ، يمكن التلاعب بها تماما مثل أي خط خلايا سرطان متاح ، أي يمكن استزراعها على قدم المساواة في ظروف التمسك أو تضمينها في Matrigel ، اعتمادا على السؤال العلمي10. على سبيل المثال، لاختبار التعبير عن البروتين ذي الاهتمام وتوطينه، يمكن زراعة مجالات CTC في حالة تعليق وتضمينها في Histogel لأداء الفلورة المناعية على أقسام المجال. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان البروتين ميمبرانوس ، يمكن قياس تعبيره على الخلايا الحية عن طريق القياس الخلوي.
للدراسات الوظيفية، لاختبار دور البروتين من الفائدة التي قد تلعب دورا في استعمار الكبد، CTCs مع الجينات تحريرها، من قبل shRNA أو CRISPR/Cas9، يمكن حقنها في طحال الفئران المناعية. هذه التجربة الأخيرة هي نموذج قوي لمحاكاة استعمار انبثاث الكبد11.
يمكن تقييم قدرة CTCs على بدء الأورام عن طريق حقن عدد قليل جدا من الخلايا في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. كما بدء الورم هو السمة المميزة للخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) هذا الفحص سوف تشير إلى النسبة المئوية للCSCs داخل خطوط CTC. هذا النمط الظاهري للخلايا الجذعية يجعل خطوط الخلايا السرطانية المتداولة مقاومة لبعض علاجات السرطان ذات المعيار الذهبي. ولذلك يمكن استخدام أجهزة CTCs الموسعة لفحص الأدوية وتحديد أفضل علاج فعال محتمل للمريض؛ ويمكن اختبار استجابة لجنة مكافحة الإرهاب للعلاج في المختبر باستخدام اختبار قابلية البقاء على الاشتعال، على سبيل المثال.
ومن منظور طويل الأجل، يمكن استخدام فحص الأدوية على أجهزة CTCs المعزولة والمتضخمة حديثا كأداة جديدة للطب الشخصي للمساعدة في اختيار العلاج الأكثر كفاءة وتكييفا للمرضى.
في هذه الورقة، يتم تفصيل بروتوكولات لخطوط CTC الثقافة، لتلطيخ بروتينات محددة عن طريق التصبغ المناعي والقياس الخلوي، لإجراء اختبارات السمية الخلوية وكذلك في تجارب فيفو زينوغرافت مع CTC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الجسم الحي من قبل الوكالات الأخلاقية الحيوانية.
1. مكافحة الإرهاب التضخيم في ظروف الثقافة 3D
- زراعة CTCs في التعليق، CTCs البذور الأولى في آبار مرفق منخفض جدا (ULA) 24-جيدا لوحة في تركيز أقصى من 5 خلايا / ميكرولتر وإلى 1 مل من M12 المتوسطة (أي، متقدمة DMEM-F12 تستكمل مع 2 م ل الجلوتامين, 100 وحدة / مل البنسلين والستريبتوميسين, N2 الملحق, 20 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة و 10 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية10).
- للسماح بتشكيل الكرة وتوسيع الخلية، واحتضان الخلايا في ظروف نقص الأكز (2٪ O2) بين 6 إلى 10 أيام.
- مرة واحدة في المجالات كبيرة بما يكفي (100 ميكرومتر)، لمنع نخر، وتفكيك لهم لتضخيم.
- ضع تعليق الخلية في أنبوب سعة 2 مل أو أنبوب 15 مل ومطرد مركزي عند 300 × ز لمدة 5 دقائق.
- إزالة supernatant وإضافة 500 ميكرولتر من كاشف الفصام لطيف (على سبيل المثال، Accumax) إلى بيليه.
- دوامة بلطف واحتضان تعليق الخلية مع كاشف فصاشف لطيف لمدة 20 إلى 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: تجاوز وقت الحضانة في كاشف التفكك اللطيف (Accumax) قد يسبب زيادة غير طبيعية في وفيات الخلايا. - أضف 1.5 مل من ملح الفوسفات العازل (PBS) واطرد الأنبوب لمدة 5 دقائق عند 300 × ز.
- صب قبالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه في المتوسط M12 الطازجة للوصول إلى كثافة 1-5 خلايا لكل ميكرولتر.
- زرع تعليق الخلية في آبار جديدة من لوحة مرفق منخفضة للغاية: 10 مل لقوارير T75، و2 مل ل 6 لوحات بئر و100 ميكرولتر ل 96 لوحة بئر
2. Immuno-Fluorescence (IF) تلطيخ على أقسام كرة مكافحة الإرهاب
- الطارد المركزي CTC المجالات في أنبوب 15 مل في 300 × ز لمدة 5 دقائق، يستنشق supernatant، وغسل بيليه مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- إعادة إنفاق بيليه مع 500 ميكروغرام من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) واحتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد. الطرد المركزي تعليق في 300 × ز ويغسل مرتين مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
- Resuspend بيليه مع (أي 15 إلى 20 ميكرولتر) هيستوجيل الساخنة والسائلة. مع ماصة، واتخاذ كل تعليق وجعل قطرة على سطح مبردة مسبقا في 4 درجة مئوية والسماح لها البلمرة لمدة 5 إلى 10 دقائق.
ملاحظة: العمل بسرعة لتجنب بلمرة التعليق في تلميح. - فصل قطرة صلبة مع شفرة مشرط وإدراجه في كاسيت تضمين مجزأة.
- قم بتنفيذ الخطوات التالية: إدراج البارافين، وتقسم البارافين، والإماهة المقطعية، واسترجاع المستضد، واحتضان الأجسام المضادة. هذه الخطوات هي نفسها بالنسبة لأي ورم أو عضو جزءا لا يتجزأ من البارافين ومعالجتها لتلطيخ immunofluorescence12.
ملاحظة: يمكن تخزين الكاسيت في الإيثانول بنسبة 70٪ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى تضمين البارافين.
3. تحليل قياس الخلايا
- الطارد المركزي CTC المجالات في أنبوب 15 مل في 300 × ز لمدة 5 دقائق وغسل بيليه مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- يستنشق supernatant وإضافة 500 ميكرولتر من كاشف الفصام لطيف إلى بيليه.
- دوامة بلطف واحتضان تعليق الخلية مع كاشف الفصام لطيف لمدة 20 إلى 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: تجاوز 40 دقيقة من الحضانة في كاشف التفكك لطيف (Accumax) قد يؤدي إلى زيادة غير طبيعية في وفيات الخلايا. - الطرد المركزي تعليق الخلية لمدة 5 دقائق في 300 × ز، والقضاء على supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 5 مل من العازلة حجب (أي، PBS مع 1٪ ألبوم مصل البقر (BSA)).
- تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر للقضاء على المجالات المتبقية.
- بعد العد، ضع 200,000 خلية في ثلاثة أنابيب لفرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS)، والطرد المركزي على 300 × ز لمدة 5 دقائق وإزالة النافورة. استخدام واحد من أنبوب FACS الثلاثة كعنصر تحكم لن تتلقى أي الكواشف تلطيخ.
- وفقا لصحيفة البيانات، إضافة الأجسام المضادة المناسبة في اثنين من أنابيب FACS المتبقية (أي، واحد الأجسام المضادة المترافقة ضد البروتين من الفائدة، واحد التحكم متساوي النمط المترافق).
- بعد وقت الحضانة الموصى به، أضف 300 ميكرولتر من حاجز الحجب لغسل الخلايا، واطرد المركزي الأنابيب الثلاثة عند 300 × ز، ونسخ الناطور. كرر هذه الخطوة مرتين. ثم، إعادة إنفاق بيليه مع العازلة حجب مع كاشف تلطيخ صلاحية الخلية (باستثناء التحكم أنبوب FACS دون أي تلطيخ).
- إبقاء الأنابيب على الجليد حتى تحليل FACS. استخدم الأنبوب أولا دون تلطيخ لتحديد البوابة لعدم قدرة الخلية على البقاء وتلطيخ الأجسام المضادة. ثم تحليل أنبوب FACS مع الأجسام المضادة المقترنة ضد البروتين من الفائدة، لتحديد النسبة المئوية للجنة مكافحة الإرهاب التعبير عن البروتين من الفائدة. يجب ألا يشير أنبوب FACS مع التحكم المقترن بالنمط المتساوي إلى حدوث تحول. وهذا يؤكد أن التحول هو محدد للبروتين المستهدفة من الفائدة.
ملاحظة: إذا كان ذلك ممكنا، استخدم خط الخلية الذي يعبر عن مستوى عال من البروتين من الفائدة كعنصر تحكم إيجابي وخط الخلية التي لا تعبر عن البروتين كعنصر تحكم سلبي.
4. فحص قابلية البقاء على الاشتعال (CellTiter-Glo)
- إعادة التشبيه فصل CTCs (كما هو موضح في القسم 1.4.5) في M12 المتوسطة. عد الخلايا وتكييف تركيز الخلية إلى 200،000 خلية / مل.
- في لوحة ULA 96-well، البذور 10،000 CTCs فصل لكل بئر، في 50 ميكرولتر، واحتضان لوحة في نقص الأكسيجة (2٪ O2) لمدة 24 ساعة.
- في اليوم التالي، إضافة 50 ميكرولتر من المخدرات اختبارها إلى CTCs. من المستحسن سابقا إجراء المعايرة لتركيز الدواء ، لتحديد تركيز مثبط نصف الحد الأقصى (IC50). علاج بعض الآبار مع السيارة فقط لتحديد صلاحية الخلية القاعدية.
ملاحظة: قد يختلف عدد الخلايا المصنفة بين أسطر CTC، اعتمادا على وقت مضاعفة. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تزرع الخلايا في ثلاث نسخ لتقليل تقلب النتائج. - احتضان لوحات في نقص الأكسيا لمدة 48 ساعة أخرى.
- في اليوم 3، ضع اللوحات المستزرعة وحاجز قابلية بقاء الخلية التلألؤ والركيزة في درجة حرارة الغرفة وإعادة تشكيل الركيزة مع حجم مناسب من العازلة، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- إضافة 70 ميكرولتر من مزيج قابلية البقاء التلألؤ في كل لوحة مثقفة جيدا. ضع لوحات على شاكر مداري لمدة 20 دقيقة للحث على تحلل الخلية ثم نقل 100 ميكرولتر من المزيج إلى لوحة متعددة الآبار مبهمة الجدران ، متوافقة مع مقياس الإنارة.
- السماح للوح للراحة في درجة حرارة الغرفة، وتغطية ذلك مع رقائق الألومنيوم من أجل تحقيق الاستقرار في إشارة الإنارة.
ملاحظة: إشارة الإنارة مستقرة لمدة تصل إلى 3 ساعات. - سجل التلألؤ باستخدام قارئ microplate (أي، Tecan Infinite 200 برو).
- لتحليل البيانات، احسب متوسط وحدة الضوء النسبي ثلاثية الطبيعة RLU لكل حالة. لتقييم النسبة المئوية لقابلية البقاء وفقا لكل تركيز المخدرات اللازمة: (RLU من الخلايا المعالجة / RLU من الخلايا غير المعالجة) × 100.
5. الحقن تحت الجلد
- في أنبوب الطرد المركزي الدقيق، إعادة إنفاق الخلايا في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني معقم. إذا كان عدد الخلايا المحقونة منخفضا ، فإن خلايا إعادة الإنفاق في 1:1 PBS / Matrigel ، تنخفض في عوامل النمو ، لتركيز الخلايا معا وتعزيز بدء الورم.
ملاحظة: يمكن أن تكون كثافة الخلية من 10 خلايا (لتحدي قدرة بدء الورم) إلى مليون من الخلايا اعتمادا على السؤال العلمي والهدف من التجربة. - سحب ما يصل حجم كامل في حقنة الأنسولين.
- على فأرة تعاني من نقص المناعة، قم بقرص جلد الجناح بين السبابة وإصبع الخاتم وأدخل الإبرة برفق في قاعدة الجلد.
ملاحظة: هذا الإجراء ليس مؤلما ويتم على الفئران واعية. - حقن ببطء حجم في نفس المكان لمنع انتشار الخلايا. وهذا سيخلق بليب صغير تحت الجلد.
- تطبيق ضغط لطيف على موقع الحقن لمنع التدفق الخلفي للحجم.
- مراقبة نمو الورم، كل يومين، وذلك باستخدام الفرجار.
- التضحية بالحيوان إذا تجاوز الورم 1500 مم3. اعتمادا على توافر المواد، والقتل الرحيم الفئران عن طريق ثاني أكسيد الكربون أو استنشاق الغازات المخدرة أو عن طريق خلع عنق الرحم.
6. الحقن داخل الجنب
- قبل البدء، أوتوكلاف الأدوات الجراحية (مقص والمملقط) في 124 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وتنظيف جميع أسطح مساحة العمل مع الإيثانول 70٪.
- في أنبوب الطرد المركزي الدقيق، وإعادة إنفاق الخلايا في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عقيم وتخزينها على الجليد. يمكن أن ترتفع كثافة الخلايا من 0.5 إلى مليون خلية. وهناك عدد أكبر من الخلايا يمكن أن يسبب تطور جلطات في الدورة الدموية.
- قبل حقن الخلايا, حقن 100 μL من 0.015 ملغم / مل buprenorphine تحت الجلد, لتخفيف الألم.
- ضع الماوس في غرفة التعريفي، حيث يتم الحفاظ على isoflurane في 3٪، لمدة 2-3 دقائق. عندما لا يعود الحيوان متجاوبا مع الحركة، ضعه على جانبه الأيمن على وسادة تدفئة وحافظ على التخدير باستخدام قناع وجه دائرة التنفس الذي يقدم خليط غاز من O2 وisoflurane.
- ضعي مواد تشحيم العين على كل عين لتجنب جفاف العين أثناء الجراحة. تطهير منطقة الصدر بمحلول بوفيدوني اليود (أي بيتادين).
- على الجانب الظهري، قم بعمل شق صغير طوله 0.5 سم باستخدام مقص أسفل الضلع الزائف العاشر.
- رفع بلطف الطحال ووضعها على الشاش العقيم. باستخدام حقنة الأنسولين، قم بحقن 50 ميكرولتر من CTCs في طرف الطحال. تأكد من الحفاظ على حقنة تستقيم وانتظر 3-5 دقائق لتجنب التدفق الخلفي، ومن ثم إزالة الإبرة.
- Ligate الأوعية splenic من الجانبين (الشرايين والأوردة) وإزالة الطحال عن طريق قطع مباشرة فوق اثنين من الأربطة. تتم إزالة الطحال لمنع تكوين الورم غير المرغوب فيه في هذا الجهاز.
- غرزة في الصفاق البطني ثم الجلد باستخدام 5.0 الغرز المعقمة القابلة للتحلل.
- حافظ على دفء الفأر حتى يتعافى تماما من التخدير.
- مراقبة الماوس 3 أيام في الأسبوع لوظيفة الجسم غير طبيعية، وحركة غير طبيعية والموقف وفقدان الوزن.
- التضحية بالحيوان عندما تصل نقاط النهاية الإنسانية (حوالي 6 أسابيع بعد الجراحة) لتحليل انبثاث الكبد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كل من التعبيرات EpCAM و CD26 التي لاحظها IF (الشكل 1A لوحة الحق) و FACS ( الشكل1B) على التوالي، تشير إلى أن خط CTC هو الظهارية وعرض واحدة من السمات المميزة CSC10. يمكن أن تتميز هذه السمة الظهارية كذلك عن طريق تلطيخ مع الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات الظهارية والسمة الأخرى. وبالتالي، يمكن أن يكون من الممكن معرفة مكان خط لجنة مكافحة الإرهاب تقريبا على طول المحور الظهاري -الميكنشيمال. ويمكن أيضا اختبار التعبير عن علامات CSC الأخرى عن طريق كل من التخزين المناعي وقياس الخلايا. خلاف ذلك، يمكن للاختبارات الوظيفية ومقاومة الأدوية والورم بدء المقايسة في الجسم الحي التحقق من صحة هذا النمط الظاهري CSC10. هنا على سبيل المثال، يظهر فحص قابلية الاشتعال أن لجنة مكافحة الإرهاب IC50 يتم الوصول إليها فقط بتركيز المخدرات عالية تسليط الضوء على المقاومة العالية لهذه الخلايا(الشكل 2). وعلاوة على ذلك، يظهر حقن CTC تحت الجلد أن خط CTC هذا لديه قدرة الورم(الشكل 3A). وتؤكد هذه النتائج الأخيرة النمط الظاهري ل CSC لخط CTC هذا. تحدي قدرة بدء الورم عن طريق الحقن من 10 إلى 10،000 الخلايا يمكن صقل تقدير القدرة الورمية. وأخيرا، تشكيل الانبثاث الكبد عن طريق محاكاة نشر من خلال الحقن داخل الجنب يظهر أن هذا الخط CTC يمكن البقاء على قيد الحياة في جهاز بعيد ولها إمكانات النقيلي(الشكل 3B). يمكن مقارنة هذه الإمكانية النقيلية بخطوط الخلايا الأخرى أو تحديها عن طريق تثبيط التعبير الجيني المحدد أو عند إدارة العلاج الكيميائي في الفئران بعد الحقن داخل الجنب.
الشكل 1:يظهر التحليل المجهري وتحليل قياس التدفق الخلوي لمجالات CTC أنهما عبرا عن علامات ظهارية وCSC. (أ) لوحة اليسار: مجالات لجنة مكافحة الإرهاب مثقف لمدة 6 أيام قبل تضمين. اللوحة اليمنى: تحليل المجهر الضوئي للمجالات المضمنة في CTC في Histogel. 5 ميكرومتر من أجزاء من المجالات CTC جزءا لا يتجزأ كانت ملطخة بأجسام مضادة ضد علامة الظهارية جزيء الالتصاق الخلية الظهارية (EPCAM) (باللون الأحمر) ووصفت النواة مع DAPI (باللون الأزرق). مقياس شريط هو 20 ميكرومتر. (ب) تحليل تدفق قياس الخلايا من CTCs واحد على قيد الحياة. مؤامرة FACS اليسار العلوي يظهر CTCs دون وضع العلامات على الخلايا بوابة على أساس حجمها والحبيبة. تظهر مؤامرة FACS العلوية اليمنى CTCs مع علامة صلاحية لبوابة الخلايا الحية فقط. تظهر مؤامرة FACS السفلية اليسرى CTCs الموسومة بالتحكم في النمط المتساوي المقترن ب APC إلى الخلايا الموسومة بشكل إيجابي. تظهر مؤامرة FACS السفلية اليمنى CTCs التي تحمل علامة الأجسام المضادة CD26 المترافقة مع APC لتقييم النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن علامة CSC هذه (67٪). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:النتيجة التمثيلية لمقاايسة نمو الخلية باستخدام مقايسة قابلية الاشتعال للثبات. يتم الوصول إلى IC50 في x μM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: CTCs لديها إمكانات الورم والنقي. (أ) الحقن تحت الجلد من 200،000 CTCs على الجناح الأيمن من الفئران عارية. تم التقاط الصور بعد شهر واحد من قياس حجم الحقن والورم 3 مرات في الأسبوع. (ب)الحقن داخل الجنب من CTCs لمحاكاة استعمار النقيلي الكبد. لوحة الحق: صورة تمثيلية لكبد الماوس تشريح 4 أسابيع بعد الحقن داخل الجنب من 300،000 CTCs. لوحة اليسار: الكبد الماوس تشريح 4 أسابيع بعد الحقن داخل الجنب من برنامج تلفزيوني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم استخدام البروتوكول المذكور أعلاه في البداية لتوصيف وظيفي للجنة مكافحة الإرهاب القولون والمستقيم ، ولكن يمكن استخدامه لأنواع أخرى من السرطان مثل سرطان الثدي ويمكن تكييفه لنماذج الماوس.
العامل الحقيقي هو الحد من عدد من CTCs موجودة في عينة الدم وكفاءة التقنية المستخدمة لعزل وتوسيعها. وقد وصفت العديد من التقنيات العزل CTC على أساس خصائص CTC محددة مثل Parsortix، جهاز microfluidic، الذي يسمح لعزل CTCs على أساس حجم الخلية وضغطها13. وبالإضافة إلى ذلك، هناك CellSearch، وهو اختبار القائم على حبة المناعة التي هي الطريقة الوحيدة المعتمدة من ادارة الاغذية والعقاقير لتعداد CTCs في عينات الدم على أساس وضع العلامات CD45 السلبية للقضاء على الخلايا الليمفاوية الملوثة جنبا إلى جنب مع وضع علامات الظهارية إيجابية مثل EpCAM والسيتوكيراتين 8/18/1914. و iChip هو آخر حجم القائم على التكنولوجيا ولكنه يجمع أيضا بين تخصيب CTC باستخدام إما اختيار إيجابي EPCAM على أساس أو CD45 استنفاد سلبي15،16. وأخيرا، استخدمنا مؤخرا إجراء المناعة السريع والسهل، مجموعة روزيت sep، لعزل وتضخيم CTC من عينات دم مريض سرطان القولون والمستقيم10.
إذا كان العمل على نموذج الماوس، فمن الممكن أيضا لتجميع عينات دم الماوس من نفس الفوج لزيادة عدد CTCs وفرصة تضخيمها في الثقافة. في حالة المورفين CTCs ، ليس إلزاميا استخدام الفئران المناعية لاختبار استعمار الكبد عن طريق الحقن داخل الجنب. يمكن استخدام فئران التحكم ذات الخلفية الوراثية نفسها كلفئران المتلقية دون أي تأثير للاستجابة المناعية.
بمجرد تضخيم CTCs في التعليق ، يمكن مقارنتها بخطوط الخلايا السرطانية الأخرى من نفس النوع من السرطان باستخدام كل تقنية موضحة هنا. في هذه الحالة، يجب أن تزرع خطوط مختلفة من الخلايا السرطانية في نفس الظروف. يجب إيلاء اهتمام خاص للفلورة الذاتية الفطرية ، لتلطيخ immunofluorescence وتحليل قياس الخلايا. يجب اختبار CTCs وكل خط خلايا سرطانية مستخدم دون أي تلطيخ في القنوات الفلورية المختلفة.
إذا كان يمكن أن تلتصق CTCs قيد الدراسة وتتكاثر في ظروف معتنقة مثل أي خط خلايا كلاسيكي ، فيمكن تكييف التقنيات الموصوفة أعلاه للخلايا الموسعة في هذه الظروف. وبالتالي من المرجح أن تكون القراءات الناتجة أكثر أهمية عندما تكون الخلايا من مجموعات خلايا سرطانية أكثر تمايزا حيث تميل الخلايا إلى أن تكون أقل تمييزا في التعليق.
في الختام، خطوط CTC هي أدوات ثمينة جدا لتوصيف عميق للآليات المشاركة في العمليات النقيلية التي تؤدي إلى فتك السرطان، وفي المستقبل مع تحسن معدلات نجاح الثقافة، يمكن استخدام CTCs لاقتراح أفضل استراتيجية علاجية مكيفة مع كل مريض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا توجد مصالح متنافسة بين أصحاب البلاغ للكشف عنها.
Acknowledgments
هذا المشروع البحثي في مختبر Pannequin كان مدعوما بمنحة بحثية من SIRIC: منحة « INCa-DGOS-Inserm 6045 ». تم دعم أطروحات الدكتوراه لغيوم بلتيير وزيناب هومايد من قبل رابطة مكافحة السرطان / Ligue contre le Cancer. وتم تمويل راتب سيلين بوكلييه من قبل "منطقة أوكسيتاني". بفضل جوليان فينابلز للتحرير الإنجليزية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
References
- Wittekind, C., Neid, M.
- Eger, A., Mikulits, W.
- Palmirotta, R., et al. Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, (2018).
- Hong, B., Zu, Y. Detecting circulating tumor cells: current challenges and new trends. Theranostics. 3, 377-394 (2013).
- vander Toom, E. E., Verdone, J. E., Gorin, M. A., Pienta, K. J. Technical challenges in the isolation and analysis of circulating tumor cells. Oncotarget. 7, 62754-62766 (2016).
- Jin, L., et al. Evaluation of the diagnostic value of circulating tumor cells with CytoSorter® CTC capture system in patients with breast cancer. Cancer Medicine. 9, 1638-1647 (2020).
- Huang, X., et al. Relationship between circulating tumor cells and tumor response in colorectal cancer patients treated with chemotherapy: a meta-analysis. BMC Cancer. 14, 976 (2014).
- Yu, M., et al. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345, 216-220 (2014).
- Aceto, N., et al. Circulating Tumor Cell Clusters are Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis. Cell. 158, 1110-1122 (2014).
- Grillet, F., et al. Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture. Gut. 66, 1802-1810 (2017).
- Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. Comparison of Colorectal Cancer in Differentially Established Liver Metastasis Models. Anticancer Research. 34, 3321-3328 (2014).
- Giraud, J., et al. Progastrin production transitions from Bmi1+/Prox1+ to Lgr5high cells during early intestinal tumorigenesis. Translational Oncology. 14, (2020).
- Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10, 0138032 (2015).
- Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment. Cancer Treatment Reviews. 41, 144-150 (2015).
- Karabacak, N. M., et al. Microfluidic, marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nature Protocols. 9, 694-710 (2014).
- Ozkumur, E., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Science Translational Medicine. 5, (2013).
