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Biology

Pruebas rápidas de susceptibilidad antimicrobiana mediante imágenes de dispersión Raman estimuladas de la incorporación de deuterio en una sola bacteria

Published: February 14, 2022 doi: 10.3791/62398
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2,4,5
1Department of Electrical and Computer Engineering, Boston University, 2Boston University Photonics Center, Boston University, 3Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Department of Biomedical Engineering, Boston University, 5Department of Chemistry, Boston University

Summary

Este protocolo presenta un ensayo rápido de prueba de susceptibilidad antimicrobiana (AST) dentro de las 2,5 h mediante imágenes de dispersión Raman estimuladas por células individuales del metabolismo de D2O. Este método se aplica a las bacterias en la orina o en el entorno sanguíneo completo, que es transformador para la AST fenotípica unicelular rápida en la clínica.

Abstract

Para retrasar y prevenir la propagación de infecciones resistentes a los antimicrobianos, se necesitan urgentemente pruebas rápidas de susceptibilidad antimicrobiana (AST) para determinar cuantitativamente los efectos antimicrobianos sobre los patógenos. Por lo general, lleva días completar el AST mediante métodos convencionales basados en el cultivo a largo plazo, y no funcionan directamente para muestras clínicas. Aquí, informamos un método rápido de AST habilitado por imágenes de dispersión Raman estimulada (SRS) de la incorporación metabólica de óxido de deuterio (D2O). La incorporación metabólica deD2Oen la biomasa y la inhibición de la actividad metabólica tras la exposición a antibióticos a nivel de bacteria única se monitorean mediante imágenes SRS. La concentración de inactivación del metabolismo unicelular (SC-MIC) de las bacterias tras la exposición a antibióticos se puede obtener después de un total de 2,5 h de preparación y detección de la muestra. Además, este método rápido de AST es directamente aplicable a muestras bacterianas en entornos biológicos complejos, como orina o sangre total. Las imágenes metabólicas SRS de la incorporación de deuterio son transformadoras para la rápida AST fenotípica unicelular en la clínica.

Introduction

La resistencia a los antimicrobianos (RAM) es una amenaza mundial creciente para el tratamiento eficaz de las enfermedades infecciosas1. Se predice que la RAM causará 10 millones de muertes adicionales por año y una pérdida del PIB mundial de $ 100 billones para 2050 si no se toman medidas para combatir las bacterias resistentes a los antibióticos 1,2. Esto pone de relieve la necesidad urgente de métodos de diagnóstico rápidos e innovadores para las pruebas de sensibilidad a los antibióticos (AST) de las bacterias infecciosas para frenar la aparición de bacterias resistentes a los antibióticos y reducir la tasa de mortalidad relacionada3. Para garantizar el mejor resultado clínico posible, es crucial introducir una terapia efectiva dentro de las 24 h. Sin embargo, el método estándar de oro actual, como la difusión en disco o el método de dilución en caldo, generalmente requiere al menos 24 h para el procedimiento de preincubación para muestras clínicas y 16-24 h adicionales para obtener los resultados de concentración inhibitoria mínima (CMI). En general, estos métodos consumen demasiado tiempo para guiar una decisión inmediata para el tratamiento de enfermedades infecciosas en la clínica, lo que conduce a la aparición y propagación de resistencia a los antimicrobianos4.

Se han desarrollado métodos genotípicos de AST, como las técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)5, para la detección rápida. Tales técnicas miden las secuencias genéticas de resistencia específicas para proporcionar resultados rápidos de AST. No dependen del cultivo celular que consume mucho tiempo; Sin embargo, solo se prueban secuencias genéticas específicas conocidas con resistencia. Por lo tanto, su aplicación se limita a diversas especies bacterianas o diferentes mecanismos de resistencia. Además, no pueden proporcionar resultados de CMI para las decisiones terapéuticas 6,7. Además, se están desarrollando nuevos métodos fenotípicos para AST rápido para superar estas limitaciones8, incluidos los dispositivos microfluídicos 9,10,11,12,13, los dispositivos ópticos14,15,16, AST fenotípico que cuantifica la copia de ácidos nucleicosnúmero 17,18 y los métodos espectroscópicos Raman 19, 20,21,22,23,24. Estos métodos reducen el tiempo para guiar los resultados de AST, sin embargo, la mayoría de ellos solo son aplicables a aislados bacterianos, no directamente a muestras clínicas, y aún requieren una preincubación prolongada.

En este trabajo, presentamos un método para la determinación rápida de la susceptibilidad de las bacterias en la orina y la sangre total a través del monitoreo de la actividad metabólica celular mediante imágenes SRS. El agua (H2O) participa en la gran mayoría de los procesos esenciales de síntesis biomolecular en las células vivas. Como un isotopólogo del agua, a través de la reacción de intercambio H/D catalizada por enzimas entre el átomo de hidrógeno redox activo en NADPH y el átomo D en D2O, el deuterio puede incorporarse a la biomasa dentro de una celda25,26. Una reacción de síntesis de ácidos grasos deuterados está mediada por el NADPH marcado con deuterio. La incorporación deD2Oen reacciones de aminoácidos (AAs) resulta en la producción de proteínas deuteradas26 (Figura 1). De esta manera, las biomoléculas recién sintetizadas que contienen enlaces C-D en células microbianas individuales pueden emplearse como un marcador general de actividad metabólica para ser detectado. Para leer los enlaces C-D sintetizados de novo, la espectroscopia Raman, una herramienta analítica versátil que proporciona información química específica y cuantitativa de biomoléculas, se usa ampliamente para determinar la susceptibilidad antimicrobiana y reducir significativamente el tiempo de prueba a unas pocas horas27,28,29,30 . Sin embargo, debido a la baja eficiencia inherente del proceso de dispersión Raman, la espectroscopia Raman espontánea es de baja sensibilidad de detección. Por lo tanto, es difícil obtener resultados de imágenes en tiempo real utilizando espectroscopia Raman espontánea. La dispersión Raman coherente (CRS), incluida la dispersión Raman anti-Stokes coherente (CARS) y la dispersión Raman estimulada (SRS), ha alcanzado una alta sensibilidad de detección debido al campo de luz coherente para generar órdenes de magnitud mayores que la espectroscopia Raman espontánea, lo que representa imágenes químicas de alta velocidad, específicas y cuantitativas a nivel de una sola célula. 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.

Aquí, basándonos en nuestro trabajo más reciente40, presentamos un protocolo para la determinación rápida de la actividad metabólica y la susceptibilidad antimicrobiana mediante imágenes SRS C-D de femtosegundo de la incorporación de bacteriasD2Oen el medio normal, orina y ambiente de sangre total a nivel unicelular. La imagen SRS de femtosegundo facilita el monitoreo de la concentración de inactivación del metabolismo de una sola célula (SC-MIC) contra antibióticos a nivel de bacteria única dentro de las 2,5 h. Los resultados de SC-MIC se validan mediante una prueba MIC estándar mediante microdilución en caldo. Nuestro método es aplicable para determinar la susceptibilidad antimicrobiana de patógenos de infecciones del tracto urinario (ITU) e infecciones del torrente sanguíneo (BSI) con un tiempo de ensayo muy reducido en comparación con el método convencional, lo que abre la oportunidad de AST fenotípica rápida en la clínica a nivel de una sola célula.

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Protocol

El uso de muestras de sangre humana está de acuerdo con las pautas del IRB de la Universidad de Boston y los Institutos Nacionales de Salud (NIH). En concreto, los ejemplares proceden de un banco y están completamente desidentificados. Estos especímenes no son considerados sujetos humanos por la oficina de la junta de revisión institucional (IRB) de la Universidad de Boston.

1. Preparación de la solución madre de bacterias y antibióticos

  1. Preparar la solución madre de antibióticos (sulfato de gentamicina o amoxicilina) a una concentración de 1 mg/ml disuelta en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) o dimetilsulfóxido (DMSO) en microtubos de 1,5 ml. Disuelva el sulfato de gentamicina en una solución estéril de PBS y la amoxicilina en un disolvente DMSO estéril. A partir de entonces, conservar la solución antibiótica a 2-8 °C como se sugiere.
  2. Para hacer que los medios de caldo Mueller-Hinton (MHB) que contengan D 2 O ajustados en cationes, agregue 220 mg de base de caldo MHB a 10 ml de D 2 O para hacer un medio que contenga 100% de D2O. Esterilizar la solución filtrando con filtros de 200 nm de tamaño de poro.
    NOTA: Utilice este protocolo siempre para hacer y esterilizar soluciones medianas en pasos posteriores.
  3. Para preparar muestras bacterianas para imágenes de SRS, agregue 2 ml de medio MHB normal, que no contenga deuterio, a un tubo de cultivo estéril de fondo redondo y luego precaliéntelo a 37 ° C.
  4. Utilice un asa estéril para seleccionar una colonia bacteriana (Escherichia coli BW 25113 o Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085) del cultivo fresco en una placa tríptica de agar soja. Luego suspenda en el medio de cultivo precalentado y voltee suavemente para preparar la suspensión de bacterias.
  5. Incubar bacterias a 37 °C en un agitador a 200 revoluciones por minuto (rpm) hasta que alcance la fase logarítmica.

2. D2O tratamiento de incorporación en presencia de antibióticos (Figura 2a)

  1. Compruebe la concentración bacteriana midiendo la densidad óptica (OD) con un fotómetro a una longitud de onda de 600 nm.
  2. Diluir la solución bacteriana utilizando el medio MHB normal, que no contiene deuterio, para alcanzar una concentración celular final de 8 x 105 UFC/ml. Vórtice suavemente para mezclar las células bacterianas.
  3. Preparar 300 μL de alícuotas de la solución bacteriana en siete microtubos de 1,5 ml y 600 μL de alícuotas de la solución bacteriana en un microtubo de 1,5 ml.
  4. Añadir 4,8 μL de solución madre antibiótica (gentamicina o amoxicilina) (1 mg/ml) en el microtubo que contiene 600 μL de la solución bacteriana, para que la concentración final de antibióticos sea de 8 μg/ml.
  5. Tome 300 μL de solución de los 8 μg/ml de solución de bacterias que contienen antibióticos, y agregue a otros 300 μL de solución bacteriana, para hacer una solución doble diluida que contiene antibióticos diluidos (4 μg/ml) que contienen bacterias.
  6. Repita la dilución en serie doble de los antibióticos de prueba, gentamicina o amoxicilina, hasta que se alcance el microtubo con la concentración más baja (0,25 μg/ml) y deseche 300 μL del tubo. Tanto para la gentamicina como para la amoxicilina, las concentraciones seriadas oscilan entre 0,25 μg/ml y 8 μg/ml.
    1. Deje un tubo sin antibióticos para el control en blanco. Este será el control positivo para inspeccionar la actividad metabólica bacteriana sin tratamiento antibiótico pero con tratamientoD2O.
    2. Deje un tubo sin antibióticos y sinD2Opara el control negativo.
  7. Incubar la alícuota bacteriana con cierto antibiótico (gentamicina o amoxicilina) que contiene medio MHB durante 1 h.
  8. Durante la incubación, preparar una dilución seriada de antibióticos con medio que contenga 100% deD2Ocon el mismo gradiente de concentración de antibióticos preparados en el paso 2.6. Tanto para la gentamicina como para la amoxicilina, las concentraciones seriadas oscilan entre 0,25 μg/ml y 8 μg/ml.
  9. Después de 1 h de tratamiento antibiótico, añadir 700 μL de antibiótico diluido en serie y medio MHB 100% D 2 O a los 300 μL de bacterias pretratadas con antibióticos en la misma concentración de antibiótico (preparado en el paso2.6), respectivamente.
    1. Por ejemplo, agregue 700 μL de medio MHB 100% D2que contiene O (que contiene 8 μg/ml de antibiótico) a los 300 μL de 8 μg/ml de bacterias pretratadas con antibióticos 8 μg/ml. De la misma manera, transfiera a los tubos correspondientes de la siguiente concentración y homogeneice pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
    2. Añadir 700 μL de medio MHB 100% D 2 Osin antibióticos a 300 μL de bacterias libres de antibióticos (preparado en el paso 2.6.1) como control en blanco.
    3. Incubar a 37 °C en un agitador de incubación a 200 rpm durante 30 minutos adicionales.
      NOTA: En este paso, la concentración final deD2Oen el medio para la prueba es del 70%.
  10. Primero centrifugar 1 ml de antibiótico y muestra bacteriana tratada con D2O a 6200 x g durante 5 min a 4 °C, y luego lavar dos veces con agua purificada. Finalmente, fijar las muestras en una solución de formalina al 10% y almacenarlas a 4 °C.

3. Preparación de bacterias en el medio de la orina (Figura 2b)

  1. Para preparar E. coli BW 25113 en la fase logarítmica, siga los pasos de 1.4 y 1.5.
  2. Compruebe la concentración bacteriana midiendo el OD con un fotómetro a una longitud de onda de 600 nm.
  3. Para imitar las muestras clínicas de ITU 14,18,41, introduzca la solución de E. coli en 10 ml de orina desidentificada para alcanzar una concentración celular final de 10 6 UFC/ml.
  4. Filtrar la orina con E. coli con púas usando un filtro de 5 μm, y luego dividir la solución bacteriana en 300 μL alícuotas en siete microtubos de 1,5 ml y 600 μL de alícuotas de la solución bacteriana en un microtubo de 1,5 ml.
  5. Realizar el tratamiento de incorporación deD2Oen presencia de antibióticos y recogida de muestras como se describe en los pasos anteriores de 2,4 a 2,10.

4. Preparación de bacterias en el medio sanguíneo (Figura 2c)

  1. Para preparar Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 en la fase logarítmica, siga los pasos en 1.4 y 1.5.
  2. Para imitar las muestras clínicas de infecciones del torrente sanguíneo42,43, pico P. aeruginosa en 1 mL de sangre humana desidentificada para alcanzar una concentración de 107 UFC/mL.
  3. Agregue 9 ml de agua purificada estéril para lisar la sangre.
  4. Filtrar la sangre con púas de P. aeruginosa con un filtro de 5 μm. Luego cosechar bacterias a 1 ml de volumen por centrifugación a 6200 x g durante 5 min a 4 °C.  Agregue 9 ml de MHB normal precalentado en la solución de bacterias y vórtice suavemente. La concentración final de bacterias es de 106 UFC/ml
  5. Dividir la solución de sangre con púas de P. aeruginosa en alícuotas de 300 μL en siete microtubos de 1,5 ml y 600 μL de alícuotas de la solución bacteriana en un microtubo de 1,5 ml.
  6. Realizar el tratamiento de incorporación deD2Oen presencia de antibióticos y recogida de muestras como se describe en los pasos anteriores de 2,4 a 2,10.

5. Imágenes SRS de la incorporación metabólica deD2Oen una sola bacteria

  1. Lavar 1 ml de solución fija de bacterias con agua purificada y luego centrifugar a 6200 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante. Enriquecer la solución bacteriana a unos 20 μL.
  2. Deposite la solución bacteriana en un vidrio de cubierta recubierto de poli-L-lisina. Coloque la muestra en sándwich y selle la muestra para obtener imágenes SRS.
  3. Imagen de bacterias a la frecuencia vibratoria C-D a 2168 cm-1 usando un microscopio SRS.
    1. Ingrese y ajuste la longitud de onda de la bomba a 852 nm utilizando el software de control en una computadora.
    2. Mida la potencia del láser con un medidor de potencia. Ajuste la potencia del láser de la bomba en la muestra a ~8 mW y la potencia del láser Stokes en la muestra a ~40 mW ajustando la placa de media onda delante de la salida del láser.
      NOTA: En el microscopio SRS, un láser de femtosegundo sintonizable con una tasa de repetición de 80 MHz proporciona los láseres de excitación de bomba (680 a 1300 nm) y Stokes (1045 nm).
  4. Ajustando los tornillos de los espejos reflectantes, alinee espacialmente la bomba y los haces de Stokes y dirija los dos haces a un microscopio vertical equipado con un sistema de espejo galvo 2D para escaneo láser.
    1. Utilice un objetivo de inmersión en agua 60x para enfocar la bomba y los láseres Stokes en la muestra.
    2. Utilice un condensador de aceite para recoger las señales de la muestra en la dirección de avance.
    3. Use un filtro de paso de banda para filtrar el láser Stokes antes de dirigirlo a un fotodiodo.
    4. Extraiga la señal Raman estimulada mediante un amplificador de bloqueo y detecte las señales por el fotodiodo.
  5. Configure cada imagen SRS para que contenga 200 x 200 píxeles y el tiempo de permanencia de píxeles de 30 μs en el panel de control del software. El tiempo total de adquisición de una imagen es ~1.2 s. Establezca el tamaño de paso en 150 nm, de modo que el tamaño de la imagen sea de aproximadamente 30 x 30 μm2. Imagine al menos tres campos de visión para cada muestra.

6. Procesamiento de imágenes y análisis de datos ( Figura 3)

  1. Para obtener la intensidad media de la señal C-D, abra y procese imágenes SRS con el software ImageJ.
  2. Primero, convierta imágenes SRS en imágenes de tipo 8 bits con color invertido haciendo clic en Imagen | Tipo | 8 bits y, a continuación, Editar | Invertir botones en el software ImageJ.
  3. A continuación, filtre las imágenes con desenfoque gaussiano haciendo clic en Procesar | Filtros | Botones de desenfoque gaussiano y ajuste el Sigma (Radio) a 1.
  4. Utilice el ajuste del umbral de imagen para seleccionar el área bacteriana. Haga clic en | imagen Ajustar | Umbral para garantizar que los tamaños bacterianos seleccionados coincidan con los de las imágenes SRS originales. Elimine las partículas pequeñas ajustando el umbral de tamaño para determinar las partículas. Haga clic en Aplicar.
  5. Aplicar Analizar | Botones de análisis de partículas para etiquetar y determinar el área de bacterias.
  6. Al hacer clic en el botón Mostrar todo en el administrador de ROI a la imagen SRS original sin procesar, etiquete la misma área de bacterias, determine la intensidad promedio de cada punto de datos haciendo clic en el botón Medir en el administrador de ROI.
  7. Encierre en un círculo el área de fondo en la imagen SRS original y mida la intensidad media del fondo. Las intensidades C-D promedio de cada bacteria se obtienen deduciendo la intensidad de la señal de fondo.

7. Cuantificación de la susceptibilidad antimicrobiana a través de SC-MIC

NOTA: El valor de corte en 0,60 para determinar la CMI-SC se establece de acuerdo con el análisis estadístico de las intensidades SRS C-D de las condiciones de metabolismo activo e inhibido del metabolismo para bacterias en diversas concentraciones de exposición al fármaco40. Las intensidades C-D para los grupos susceptibles a los antibióticos y resistentes a los antibióticos se ajustaron con una distribución normal.

  1. Trazar la curva de características operativas del receptor (ROC) y evaluar el umbral de corte en 0,60. Sobre la base de este valor de corte, se puede definir la CMI SC como indicador de la eficacia de los antibióticos para determinar el grupo metabólicamente inactivo y metabólicamente activo.
  2. Para analizar cuantitativamente los datos de imágenes SRS, trace los histogramas de las intensidades de señal C-D para cada grupo de bacterias tratadas con la concentración de antibióticos diluidos en serie. Los puntos de datos coloreados representan diferentes bacterias individuales.
  3. Normalizar las intensidades C-D del grupo tratado con antibióticos a la intensidad media del grupo control sin tratamiento antibiótico. Determinar los resultados de SC-MIC de diferentes combinaciones de bacterias y antibióticos cuantificando las intensidades de señal SRS en la región C-D frente a varias concentraciones de antibióticos utilizando el valor de corte en 0.60.
  4. Valide y compare la lectura SC-MIC con la MIC determinada mediante un ensayo de microdilución en caldo convencional.
  5. Según el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI), la categoría de susceptibilidad basada en los resultados de imágenes metabólicas de SRS para cada cepa bacteriana probada se interpreta como "susceptible", "resistente" o "intermedia".

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Representative Results

El efecto del tiempo de incubación en la incorporación de deuterio se mide mediante microespectroscopia Raman espontánea en las regiones C-D (2070 a 2250 cm-1) y C-H (2.800 a 3.100 cm-1) (Figura 4a). Los espectros Raman unicelulares de lapso de tiempo de P. aeruginosa cultivados en medio que contiene 70% de D 2 O muestran un aumento de la intensidad de CD / CH durante el tiempo de incubación de 0 a 180 min. (Figura 4b) La creciente abundancia de C-D en células microbianas individuales revela que D2O se incorpora a biomoléculas deuteradas dentro de la célula.

El etiquetado D2O por encima del 50% afecta significativamente el metabolismo bacteriano durante un período de incubación de 23 h27. Observamos inhibición del crecimiento bacteriano cuando la concentración de marcado deD2Oes superior al 70% durante un período de incubación de 25 h (Figura S1). Se han realizado CMI mediante dilución de caldo patrón oro y se han obtenido resultados de SC-MIC en dos cepas de P. aeruginosa (P. aeruginosa ATCC 47085 y P. aeruginosa 1133) (Tabla S1). Nuestros resultados actuales muestran que el 70% deD2Ono afecta el rendimiento de nuestro método en P. aeruginosa. La concordancia de categoría de nuestro método SC-MIC con el método convencional basado en cultivo es del 100% para todas las combinaciones probadas de P. aeruginosa y antibióticos, como se muestra en la Tabla S1. Atribuimos esta buena concordancia a la toxicidad mínima del 70% deD2Osobre P. aeruginosa durante el período de incubación de 30 min en determinación de SC-MIC.

Siguiendo el protocolo, P. aeruginosa se incubó con gentamicina diluida en serie durante 1 h y luego 70% D2O durante 30 min adicionales. Se realizaron imágenes metabólicas SRS a ~2168 cm-1 (Figura 5a). Las intensidades C-D tras el tratamiento antibiótico se dividen por el valor medio del grupo control, que no tiene tratamiento antibiótico. El análisis estadístico cuantitativo (Figura 5b) mostró que las señales C-D de P. aeruginosa fueron significativamente menores a 2 μg/ml o mayor concentración de gentamicina que sin tratamiento con gentamicina (0 μg/mL). Utilizando el umbral de corte a 0,60, la P. aeruginosa se inhibió metabólicamente a 2 μg/ml y concentraciones más altas de gentamicina. La línea punteada muestra el valor de corte definido en 0,60 en la figura 5b. De esta manera, se determinó que la CMI SC para P. aeruginosa contra gentamicina en medio MHB normal era de 2 μg/mL. Se verifica que este valor de SC-MIC está dentro del rango de diferencia de un pliegue con la CMI (4 μg/ml) determinada por el método de microdilución en caldo (Figura 5c). En conjunto, SC-MIC determinado por nuestra tecnología permite cuantificar la susceptibilidad a los antimicrobianos.

Para explorar el potencial de la AST rápida mediante imágenes SRS de la incorporación metabólica de deuterio para aplicaciones clínicas, especialmente para la infección por ITU más prevalente, probamos una muestra de orina con bacterias utilizando E. coli, el patógeno más común que causa la infección por ITU44. Para imitar las muestras clínicas de ITU a una concentración bacteriana relavent, E. coli se agrega a la orina desidentificada a una concentración final de 106 UFC / ml. Después de la purificación de la muestra, las muestras de orina se incubaron con amoxicilina yD2O. El fondo limpio en las imágenes SRS mostró que el protocolo de preparación de muestras era aplicable para la medición rápida de AST (Figura 5d). Se determinó que la CMI-SC para la muestra de orina con E. coli contra amoxicilina era de 4 μg/ml (Figura 5e), que tiene la misma lectura de susceptibilidad que la CMI (8 μg/ml) por el método convencional de dilución en caldo para E. coli pura en medio MHB normal (Figura 5f). Estos resultados mostraron colectivamente que la AST rápida mediante imágenes SRS de la incorporación metabólica de deuterio es de gran potencial para el diagnóstico clínico de patógenos informativos de ITU.

En comparación con la infección por ITU, la AST rápida para los patógenos BSI es mucho más difícil para el estudio in situ de la actividad metabólica bacteriana, ya que muchas células sanguíneas se presentan en la sangre. Para investigar la aplicabilidad de AST rápido mediante imágenes SRS de la incorporación metabólica deD2Opara muestras clínicas de BSI, se detectó P. aeruginosa con un pinchazo en sangre humana no identificada. Como se muestra en la Figura 5g, la intensidad C-D de la imagen SRS a 2168 cm-1 estuvo dominada por señales bacterianas. Dado que los glóbulos rojos no tienen actividad metabólica para absorber D2O para una mayor biosíntesis, las señales C-D se originaron a partir de la incorporación metabólica de deuterio de bacterias vivas. La modulación de fase cruzada o señal fototérmica de especies de desechos o glóbulos rojos contribuyó a las señales de fondo débiles, sin afectar el análisis cuantitativo del SC-MIC. Se determinó que el resultado de la CMI SC para P. aeruginosa en sangre era de 2 μg/ml (Figura 5h), lo que concordaba bien con el resultado de la CMI estándar convencional para P. aeruginosa en medio de crecimiento normal (Figura 5i). Tomados en conjunto, estos resultados mostraron que las imágenes metabólicas SRS de la incorporación metabólica de deuterio pueden ser un método rápido de AST para determinar el SC-MIC para bacterias en infecciones BIS.

Figure 1
Figura 1: Esquema para la incorporación deD2Oen lípidos y proteínas deuterados25,26. El deuterio se puede incorporar a la biomasa dentro de una célula a través de una reacción de intercambio H/D catalizada por enzimas entre el átomo de hidrógeno redox activo en NADPH y el átomo D en D2O. La reacción de síntesis de ácidos grasos deuterados está mediada por el NADPH marcado con deuterio. La incorporación deD2Oen las reacciones de aminoácidos da como resultado la producción de proteínas deuteradas. Esta cifra ha sido modificada de ref.40. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Flujo de trabajo de AST rápida por imágenes metabólicas SRS de incorporación de deuterio. (a) Tratamiento de incorporación de D2O en presencia de antibióticos en medio MHB, y los siguientes procedimientos de imagen SRS. b) Preparación de bacterias en el medio de la orina. c) Preparación de bacterias en el medio sanguíneo. Esta cifra ha sido modificada de ref.40. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Procesamiento automatizado de imágenes e interpretación de datos. (a) Imagen SRS sin procesar. (b) Imagen después del ajuste del umbral de intensidad para determinar el área de las células bacterianas. c) Puntos de datos seleccionados después de la etapa de análisis de partículas. (d) Los puntos de datos correspondientes se seleccionan en la imagen en bruto. e) Resultados de los puntos de datos correspondientes en la imagen en bruto. f) Resultados estadísticos de la intensidad media de los puntos de datos después de restar los antecedentes. Barra de escala: 10 μm. Esta cifra ha sido modificada de ref.40. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Efecto del tiempo de incubación sobre la incorporación de deuterio en bacterias. a) Medición de lapso de tiempo en las regiones C-D (2070 a 2250 cm-1) y C-H (2.800 a 3.100 cm-1) mediante microespectroscopia Raman espontánea (promediada a partir de 20 espectros). (b) Diagrama de histograma de la relación de intensidad CD/CH durante el tiempo de incubación de D2O para bacterias en (a). Cada punto de color representa una medición de una sola bacteria. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5. Determinación de SC-MIC mediante imágenes SRS de la incorporación metabólica bacteriana deD2Ofrente a antibióticos en medio normal, orina y ambiente sanguíneo. a) Imágenes SRS a vibración C-D (2168 cm-1) y las correspondientes imágenes de transmisión de P. aeruginosa en presencia deD2O, con la adición de gentamicina diluida en serie en medio MHB normal. b) Análisis cuantitativo de la intensidad C-D de P. aeruginosa en (a). Los puntos de datos coloreados en el histograma representan las diferentes bacterias individuales. La línea punteada indica el valor de corte en 0,60. (c) La comparación de la lectura de SC-MIC con la CMI por el método de microdilución en caldo, y la categoría de susceptibilidad para P. aeruginosa según el CLSI. d) Imágenes SRS a vibración C-D (2168 cm-1) e imágenes de transmisión correspondientes de E. coli en orina después de la incubación enD2Ocon la amoxicilina diluida en serie. e) Análisis cuantitativo de la intensidad de la SRS C-D en d). f) La comparación de la lectura de la CMI-SC y la categoría de susceptibilidad para E. coli en MHB normal y en orina. g) Imágenes SRS a vibración C-D (2168 cm-1) e imágenes de transmisión correspondientes de P. aeruginosa en sangre después de la incubación enD2Ocon gentamicina diluida en serie. h) Análisis cuantitativo de la intensidad del SRS C-D en g). (i) La comparación de la lectura de SC-MIC y la categoría de susceptibilidad para P. aeruginosa en MHB normal y en sangre. S: sensible. Número de celdas N ≥ 10 por grupo. Las barras de error representan el SEM. Barra de escala: 10 μm. Esta cifra ha sido modificada de ref.40. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Problema Posible razón Solución
Poco o ningún número de células bacterianas en el campo de visión de imágenes La densidad bacteriana en la solución es demasiado baja Centrifugar durante más tiempo para enriquecer aún más las bacterias
Fotodaño de las células bacterianas durante la imagen de SRS La potencia del láser utilizada es demasiado alta Sintonizar la potencia del láser a un valor apropiado
No se detecta ninguna señal SRS La superposición espacial y temporal de la bomba y el haz de Stokes no está optimizada Alinee la bomba y las vigas de Stokes utilizando una muestra estándar de dimetilsulfóxido deuterado

Tabla 1: Tabla de solución de problemas.

Figura S1: Ensayo de toxicidadD2Oen P. aeruginosa cultivada en medio Lauria-Bertani (LB) con diferentes concentraciones deD2O. Las barras de error indican valores de desviación estándar (número de mediciones = 5). Haga clic aquí para descargar esta figura.

Cuadro S1. Comparación de SC-MICs y MICs en MHB normal de P. aeruginosa tras tratamiento antibiótico. S: sensible; R: resistente; I: Intermedio. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

Se puede obtener AST rápida evaluando la respuesta de la actividad metabólica bacteriana al tratamiento con antibióticos utilizando imágenes metabólicas SRS de una sola célula dentro de las 2,5 h desde la muestra hasta los resultados de SC-MIC. La respuesta de la actividad metabólica bacteriana y la susceptibilidad antimicrobiana se pueden detectar mediante la monitorización de la incorporación metabólica deD2Opara la síntesis de biomoléculas utilizando imágenes SRS de enlaces C-D. Dado que el agua se usa ubicuamente en las células vivas, las imágenes metabólicas SRS proporcionan un método universal para un AST rápido. El método AST rápido es aplicable para detectar bacterias en entornos biológicos complejos, como orina o sangre total a un solo nivel de bacteria. La SC-MIC se puede determinar después de 1,5 h de cultivo de bacterias en orina y sangre, lo que se considera transformador para cambiar el paradigma del diagnóstico de ITU y BSI de un procedimiento dependiente del cultivo que consume mucho tiempo a un enfoque in situ independiente del cultivo. Por lo tanto, significa una enorme reducción en el tiempo de diagnóstico en comparación con el método convencional de microdilución en caldo, lo que allana el camino hacia la traducción clínica que permite la identificación a tiempo de los agentes antimicrobianos apropiados para un tratamiento preciso.

Los protocolos para el tratamiento con antibióticos descritos aquí siguen las pautas del CLSI, en el que el medio MHB sugerido se puede utilizar generalmente para el cultivo de una amplia variedad de microorganismos. Un parámetro clave es que el número de células bacterianas utilizadas para las pruebas de sensibilidad antimicrobiana se mantiene en aproximadamente 5 x 105 UFC/ml como se recomienda en CLSI. Esto es de vital importancia para obtener resultados precisos y reproducibles. En experimentos de tratamiento con antibióticos, la concentración de bacterias se establece en 8 x 105 UFC/ml. Una mayor concentración de bacterias puede conducir a un aumento en los resultados de la CMI. Una vez que se ajusta la suspensión bacteriana, debe usarse dentro de los 30 minutos para evitar cambios en la concentración de células bacterianas.

Para las pruebas de susceptibilidad de un antibiótico como la daptomicina, se recomienda complementar 50 mg / L de calcio en los medios. El medio MHB ajustado al catión contiene 20-25 mg/L deCa2+. Por lo tanto, asegúrese de que el medio se complemente con Ca2+ adicional (solubilizado en agua y filtrado esterilizado) en la concentración de 30 mg / L.

Otro paso crítico en el método presentado es el tiempo de incubación de las bacterias tras la exposición a antibióticos y la incorporación deD2O. Debido a que el tiempo de generación del ciclo de vida bacteriano es de aproximadamente 30 a 60 minutos, es importante influir en la actividad metabólica bacteriana tras la exposición a antibióticos durante un cierto tiempo. Esta prueba se ha evaluado para una variedad de combinaciones de bacterias y antibióticos a la exposición a antibióticos durante 1 h antes del tratamiento con 0,5 h D2O. El primer paso de tratamiento antibiótico de 1 h es esencial para influir en la actividad metabólica bacteriana. A continuación, las bacterias se incuban con D2O y medio que contiene antibióticos durante 30 minutos adicionales. Las concentraciones finales de antibióticos se mantienen en el mismo nivel, y la concentración final deD2Ose ajusta al 70%. En general, después de 1 h de precultivo antibiótico y después de 0,5 h deD2Oy la incorporación de antibióticos, los resultados de SC-MIC se determinan mediante imágenes metabólicas SRS de la actividad metabólica bacteriana. Este diseño minimiza el impacto de la influenciaD2Ode la actividad antimicrobiana a las bacterias y también conduce a una lectura comparable de los resultados de SC-MIC con los CMI por el método convencional.

En las mediciones SC-MIC, preparamos en paralelo 40 muestras, incluyendo 5 antibióticos diferentes, cada uno con 8 concentraciones al mismo tiempo. Sin embargo, debido a que hay muchos procedimientos de operación manual, el tiempo total de ensayo para detectar el AST para cinco combinaciones diferentes de bacterias y antibióticos es superior a 2,5 h. En nuestro método, cada imagen SRS que contiene ~ 20 células bacterianas individuales se obtuvo dentro de ~ 1.0 s en una sola toma a 30 μs píxeles de tiempo de permanencia. Estimamos que el tiempo total del ensayo AST para estudiar 10 antibióticos para una cepa bacteriana sería inferior a 2,5 h desde la muestra hasta la lectura de SC-MIC, lo que tiene una gran posibilidad de realizar mediciones de alto rendimiento. En trabajos futuros, se empleará un método automatizado de preparación de muestras y adquisición de datos de imágenes para mejorar aún más el rendimiento. Los detalles de la solución de problemas se proporcionan en la Tabla 1.

En los métodos convencionales de AST basados en cultivo, para obtener aislados bacterianos para mediciones adicionales, es necesario preincubar muestras clínicas durante horas. Se han desarrollado métodos avanzados de AST para muestras clínicas de ITU, como la espectroscopia Raman29, la matriz de nanolitros6 y la cuantificación digital de ácidos nucleicos18, para eliminar la preincubación a largo plazo. En comparación con la infección por ITU, la BSI o sepsis es mucho más potencialmente mortal18,45, donde se necesita urgentemente AST rápida para diagnósticos precisos en la clínica. Se ha informado que un método de imagen microscópica para medir la formación de colonias bacterianas a partir de hemocultivos positivos proporciona resultados de CMI46. Sin embargo, se necesitan al menos 6 h para que las bacterias crezcan para realizar el ensayo AST. Además, las estrategias de sistemas automáticos comerciales47 y espectrometría de masas48,49 pueden proporcionar una lectura de AST a partir de hemocultivos positivos. Sin embargo, no se pueden proporcionar los resultados de la CMI para la decisión clínica. Los resultados de AST y la lectura de CMI son significativos para evitar el exceso de dosis de antibióticos a los pacientes para causar posibles efectos secundarios en las clínicas, para retrasar y prevenir la propagación de las infecciones resistentes a los antimicrobianos50,51. En comparación con los métodos AST basados en microscopía Raman espontánea existentes, nuestra tecnología reduce enormemente el tiempo de adquisición de datos (aproximadamente 600 veces menos) debido a la mejora de la señal de órdenes de magnitud. En este trabajo, demostramos AST rápido por imágenes SRS del metabolismo del deuterio en bacterias individuales a una concentración bacteriana clínicamente relevante (105 ~ 106 UFC / ml) en orina o en todo el entorno sanguíneo. Como se muestra en resultados anteriores, los resultados de la CMI se determinan después de 1 h de tratamiento antibiótico y 30 min de mezcla deD2Oy antibióticos de incubación en bacterias en orina y sangre. Nuestro método puede proporcionar CMI y clasificación de susceptibilidad para cada combinación de cepa-antibiótico dentro de las 2,5 h y, por lo tanto, abre una nueva vía para la traducción clínica. En resumen, sin necesidad de precultivo y división bacteriana, nuestro método tiene un enorme potencial en el campo de AST rápido y de alto rendimiento en enfermedades infecciosas.

Nuestro método SC-MIC por imágenes metabólicas SRS es aplicable para detectar CMI y proporcionar clasificación de susceptibilidad para patógenos infecciosos cuando se trata de abundantes variedades de combinaciones de cepas-antibióticos para uso clínico. La SC-MIC se determina después de 30 minutos de incorporación deD2Oen bacterias en orina y sangre, lo que significa una tremenda reducción en el tiempo de diagnóstico en comparación con el método convencional de dilución de caldo que cuesta de 16 a 24 h para la preincubación. Para proporcionar información de identificación de patógenos para la toma de decisiones clínicas, la tecnología de imágenes metabólicas SRS se puede integrar aún más con plataformas de diagnóstico capaces de identificar rápidamente patógenos, como la espectrometría de masas de tiempo de vuelo por ionización por desorción láser asistida por matriz 49,52,53. La combinación de la identificación in situ de patógenos y el diagnóstico rápido de AST podría ser de gran potencial para la traducción a la clínica que permita la identificación a tiempo de los agentes antimicrobianos apropiados para un tratamiento preciso.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por NIH R01AI141439 a J.-X.C y M.S, y R35GM136223 a J.-X.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acousto-optic modulation Gooch&Housego R15180-1.06-LTD Modulating stokes laser beam
Amoxicillin Sigma Aldrich A8523-5G
Bandpass filter Chroma HQ825/150m Block the stokes laser beam before the photodiode
Calcium chloride Sigma Aldrich C1016-100G Cation adjustment
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth Fisher Scientific B12322 Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods
Centrifuge Thermo Scientific 75002542
Cover Glasses VWR 16004-318
Culture tube with snap cap Fisher brand 149569B
Daptomycin Acros A0386346
Deuterium oxide 151882 Organic solvent to dissolve antibiotics
Deuterium oxide-d6 Sigma Aldrich 156914 Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system
Escherichia coli BW 25113 The Coli Genetic Stock Center 7636
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher brand 05-408-129
Gentamicin sulfate Sigma Aldrich G4918
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters Millipore-Sigma SLSV025NB pore size 5 µm
ImageJ software NIH Version: 2.0.0-rc-69/1.52t Image processing and analysis
Incubating orbital shaker set at 37 °C VWR 97009-890
Inoculation loop Sigma BR452201-1000EA
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser Spectra-Physics Model: insight X3 Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI Demodulate the SRS signals
Oil condenser Olympus U-AAC NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) American Type Culture Collection ATCC 47085
Photodiode Hamamatsu S3994-01 Detector
Polypropylene conical tube 15 mL Falcon 14-959-53A
Polypropylene filters Thermo Scientific 726-2520 pore size 0.2 µm
Sterile petri dishes Corning 07-202-031
Syringe 10 mL Fisher brand 14955459
UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter Model: DU 530 Measuring optical density at wavelength of 600 nm
Vortex mixer VWR 97043-562
Water objective Olympus UPLANAPO/IR 60×, NA 1.2

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Biología Número 180
Pruebas rápidas de susceptibilidad antimicrobiana mediante imágenes de dispersión Raman estimuladas de la incorporación de deuterio en una sola bacteria
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Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J.… More

Zhang, M., Seleem, M. N., Cheng, J. X. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (180), e62398, doi:10.3791/62398 (2022).

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