Summary
Denne protokollen beskriver bruken av en forbedret ultralydteknikk for ikke-invasivt observere og kvantifisere levervevsendringer i gnagermodeller av ikke-alkoholholdig fettleversykdom.
Abstract
Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH) er en tilstand innenfor spekteret av alkoholfri fettleversykdom (NAFLD), som er preget av leverfettakkumulering (steatose) og betennelse som fører til fibrose. Prekliniske modeller som nøye recapitulerer human NASH/NAFLD er avgjørende for narkotikautviklingen. Mens leverbiopsi for tiden er gullstandarden for måling av NAFLD/ NASH-progresjon og diagnose i klinikken, i det prekliniske rommet, er det nødvendig med enten innsamling av hele leverprøver på flere tidspunkter under en studie eller biopsi av leveren for histologisk analyse for å vurdere sykdomsstadiet.
Å gjennomføre en leverbiopsi midt i studien er en invasiv og arbeidsintensiv prosedyre, og innsamling av leverprøver for å vurdere sykdomsnivå øker antall forskningsdyr som trengs for en studie. Dermed er det behov for en pålitelig, overførbar, ikke-invasiv bildebiomarkør for å oppdage NASH / NAFLD i disse prekliniske modellene. Ikke-invasive ultralydbaserte B-modusbilder og Shear Wave Elastography (SWE) kan brukes til å måle steatose samt leverfibrose. For å vurdere nytten av SWE i prekliniske gnagermodeller av NASH, ble dyr plassert på et pro-NASH-kosthold og gjennomgikk ikke-invasiv ultralyd B-modus og skjærbølgeelastografiavbildning for å måle hepatoral (HR) indeks og leverelastisitet, og målte progresjon av henholdsvis leverfettakkumulering og vevsstivhet, på flere tidspunkter i løpet av en gitt NAFLD / NASH-studie.
HR-indeksen og elastisitetstallene ble sammenlignet med histologiske markører av steatose og fibrose. Resultatene viste sterk sammenheng mellom HR-indeksen og prosentandelen av oljerød O (ORO) farging, samt mellom elastisitet og Picro-Sirius Rød (PSR) farging av leveren. Den sterke sammenhengen mellom klassiske ex vivo-metoder og in vivo-bilderesultater gir bevis på at skjærbølgeelastografi/ultralydbasert avbildning kan brukes til å vurdere sykdomsfenotype og progresjon i en preklinisk modell av NAFLD/NASH.
Introduction
Alkoholfri fettleversykdom (NAFLD) er en metabolsk tilstand preget av overdreven opphopning av fett i leveren og blir raskt en ledende leversykdom over hele verden med en nylig rapportert global prevalens på 25%1. Alkoholfri steatohepatitt (NASH) er et mer utviklet stadium av NAFLD-spekteret, preget av overflødig leverfett med progressiv cellulær skade, betennelse og fibrose. Disse plagene er ofte stille, uoppdaget via blodprøver eller rutinemessige undersøkelser, til det allerede har oppstått betydelig skade på pasientens lever. For tiden er gullstandarden for å diagnostisere NASH hos pasienter gjennom histologisk undersøkelse av pasientavledede leverbiopsiprøver. På samme måte er prekliniske forskere som arbeider for å forstå patogenesen til NASH /NAFLD, samt legemiddelutviklingsindustrien, avhengige av in vivo kilebiopsi av leverprøver eller terminal eutanasi av satellittkohorter for histologi for å måle steatose, betennelse og fibrose.
For eksempel har leverkilebiopsi vært en standard teknikk for å vurdere steatohepatitt og fibrose mens du bruker GUBRA NASH-modellen2. Leveren kile biopsi metoden er invasiv og arbeidskrevende hos små dyr3. Bruken av kileleverbiopsi midt i en studie representerer en ekstra eksperimentell variabel i en sykdomsmodell, noe som ofte øker antall dyr som trengs. Med disse faktorene i tankene viser ikke-invasive avbildningsteknikker som kan brukes til pålitelig vurdering av steatose og fibrose i NASH / NAFLD dyremodeller på tidlige tidspunkter, verdifulle. Skjærbølgeelastografi (SWE) er en ultralydbasert metode som brukes til å måle elastisiteten til bløtvev. Teknikken måler forplantning av skjærbølger skapt av supersoniske ultralydpulser rettet mot et vevsmål, og beregner deretter en verdi som heter E modulus4. Hastigheten på skjærbølgen er proporsjonal med graden av vevstivhet.
Figur 1 og figur 2 viser oppsettet av bildeområdet og SWE-instrumentet. SWE-instrumentet er en enkelt, hjulenhet med to skjermer og et kontrollpanel vist i figur 2A. Den øvre skjermen (figur 2B) fungerer som dataskjerm og viser bilder og pasientkataloger. Kontrollpanelet (Figur 2C) er en rekke knapper og ringer som styrer generelle aspekter ved bildeopptak: frysing av skjerm, lagring av bilder, endring fra en modus til en annen. Den nedre skjermen (Figur 2D) er en berøringsskjerm med tilleggskontroller for å endre innstillinger og fungerer som et tastatur for å legge inn data etter behov. Instrumentet er utstyrt med en pekepenn som kan brukes på berøringsskjermen om ønskelig. Ultralydprober festes til enhetens nedre frontpanel. For B-modus og SWE-avbildning hos gnagere ble den supers lineære 6 til 20 MHz-svingeren brukt. Denne evnen til ikke-invasivt å måle vevsstivhet gjør SWE til et verdifullt verktøy for identifisering og iscenesettelse av leverfibrose5 hos NASH-pasienter, noe som reduserer behovet for mer invasive metoder. SWE har faktisk blitt brukt til å måle leverfibrose hos pasienter og er en FDA-godkjent metode for å score fibrose i klinikken6. Å bruke SWE til å overvåke NASH-progresjon i dyremodeller av sykdommen ville gi et oversettelsesverktøy for utvikling av behandlinger og samtidig forbedre dyrevelferden gjennom reduksjon av dyrepersonstall og raffinering av in vivo-prosedyrer for å minimere smerte og nød.
SWE-avbildning hos menneskelige pasienter bruker en lavfrekvent ultralydtransduser4, som ikke er ideell for små dyr. Spesielt har høyfrekvente SWE-teknikker blitt brukt til å evaluere effekten av acetyl-CoA karboksylaseinhibering på patogenese av NASH i en rottemodell7, og nytten av denne teknikken er beskrevet i karbontetraklorid rottemodeller av leverfibrose med vellykkede resultater sammenlignet med tradisjonelle METAVIR histologiske skåringsmetoder8. Eksisterende litteratur mangler imidlertid detaljert teknikk- og metodeinformasjon om anvendelsen av SWE-avbildning i prekliniske modeller av NASH. Som beskrevet ovenfor er leversteatose en av hovedtrekkene i NAFLD / NASH-tilstanden og er et viktig stadium der intervensjon kan vurderes. Dermed er vurdering av leverfettakkumulering ved hjelp av en avbildningsmodalitet like viktig som å vurdere leverfibrose i prekliniske modeller av NASH / NAFLD.
En ultralydteknikk kjent som HR-indeksen, et forhold mellom vevslysstyrke i leveren sammenlignet med nyrebarken, har blitt brukt som surrogatmarkør for steatose i klinikken9,10. Denne tilnærmingen har imidlertid ikke blitt mye brukt i prekliniske dyremodeller av NAFLD/NASH. Denne artikkelen beskriver en metode for måling av elastisitet samt HR-indeksen som surrogatmarkør for henholdsvis leverfibrose og steatose i en kolinmangel, fettfattig diett (CDAHFD) rottemodell av NAFLD/NASH. Denne modellen induserer rask steatose, leverbetennelse og fibrose, som er målbar innen 6 uker hos mus11. Tilsetningen av kolesterol (1%) til denne dietten har vist seg å fremme fibrogenese hos rotter12, noe som gjør denne modellen til en passende kandidat for valideringsstudier som involverer skjærbølgeavbildning. Samlet sett kan denne bildeteknologien også brukes på et bredt spekter av NASH-modeller / dietter der steatose og / eller fibrose er et endepunkt av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrerelaterte prosedyrer ble gjennomgått og godkjent av Pfizer's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og gjennomført i et AAALAC (Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) International akkreditert anlegg.
1. Sykdomsinduksjon
- Bruk mannlige Wister Han rotter (150-175 g; ~ 6-7 uker gammel; totalt 40 rotter) som er fri for kjente rotte adventitial patogener. Hus rottene i par i individuelt ventilert caging med papir sengetøy (se materialtabellen) og opprettholde dem ved 22 ± 1 °C, 40-70% relativ fuktighet med en 12:12 h lys-mørk syklus.
- Plasser rottene som veier 150-175 g (~ 6-7 uker gamle) på et kolinmangel, fettfattig kosthold med 1% kolesterol (n = 20) eller en standard lab gnager chow (n = 20) avhengig av studiedesignet.
MERK: I denne studien ble totalt 40 rotter registrert med 20 dyr per gruppe. I slutten av den sjetteuken ble halvparten av kohorten fra hver gruppe nekropsiert for midtstudie histologisk analyse av leverprøver. Dermed var utvalgsstørrelsen 10 dyr per gruppe for9 th og 12th uke tidspoeng.
2. Instrumentoppsett
- Sett opp bildeområdet på følgende måte: Inkluder en oppvarmet overflate for å holde dyret varmt under avbildning (c i figur 1), og en sikret anestesi nesekjegle for å levere anestesi for å opprettholde et anestesiplan gjennom hele prosedyren (b i figur 1).
- Bruk en ultralydsondeholder for å lette flyttingen av ultralydsonden til ønsket sted og for å forhindre at sonden hviler på dyret.
- Bruk oppvarmet ultralydgel på huden der ultralydbildet er anskaffet.
- Oppretthold følgende innstillinger gjennom hele prosedyren, som kan justeres på berøringsskjermen: Acoustic Power 0.0 dB; Vev Tuner 1540 m/s; Dynamisk område 60 dB; Elastisitetsområde (for SWE-modus) < 30 kPa.
- Fest ultralydsonden til skinnesystemet i den spesialiserte holderen (a i figur 1).
- Slå på instrumentet og la det starte opp. Når skjermen er slått på, noterer du deg B-modusbildet med tilkoblede svingerdetaljer.
3. Fagforberedelse
- Pass på at dyrene er fastet minst 4 timer før bildebehandlingsprosedyren for å forhindre at tarminnhold forstyrrer bildeanskaffelsen.
- Etter minst 4 timers faste, plasser en rotte i et isofluran bedøvelsesinduksjonskammer til et passende nivå av anestesi nås, bekreftet uten respons på tåklemme. Utsett dyrene for 3-5% isofluran i 3-5 min for å indusere anestesi.
- For vedlikehold anestesi, hold dyrene under 2-3% isofluran under bildeoppkjøp. Påfør oftalmisk salve for å beskytte øyet mot tørking under anestesi.
- Når anestesi er oppnådd, fjern et dyr fra induksjonskammeret og legg det på et varmt varmt vann sirkulerende teppe. Legg en bedøvelses nesekjegle over snuten, og barber dyret på høyre side, fra ribbein til bekken. Bruk kjemisk depileringskrem for å fjerne alt gjenværende hår i dette området.
- Når håret er fjernet, plasserer du et dyr i venstre lateral liggende med øvre poter teipet over hodet på en varm bildeplattform (Figur 3A).
- Trykk pasienttasten på instrumentets kontrollpanel, og identifiser motivet i henhold til studiedesignet.
- Åpne Tastatur-funksjonen på instrumentet ved å trykke på ikonet på berøringsskjermen. Skriv inn navnene etter behov.
- Trykk på Avslutt for å gå ut av skjermbildet for pasientnavn. Vær oppmerksom på at B-modus åpnes på nytt på skjermen.
4. Bildeanskaffelse for hepato-nyre (HR) indeksmåling
- Påfør en liten mengde oppvarmet ultralydgel på den depilerte hudregionen på dyret.
- Beveg ultralydsonden for å berøre det geldekkede området av motivet (Figur 3B). Når et levende B-modusbilde av motivets indre organer vises på skjermen, flytter du ultralydsonden til området litt over hoften, bare parallelt med lumbale ryggvirvler (sagittalplan).
- Bruk B-modusdisplayet på skjermen til å finne riktig nyre ved å identifisere den store nyrearterien og cortex/medulla-separasjonen (figur 4A). I tillegg observere en del av leveren i et enkelt plan av bildet.
- Kontroller at det er lite eller ingen bildeartefakter, for eksempel skygger og luftbobler.
- Mål et B-modusforhold for å få tak i PULS-indeksen.
- Sørg for at både nyrebark og leverparenchyma er i samme fokusplan. Juster om nødvendig fokus og få kontroll for å få et klart bilde.
- Juster fokuset ved å dreie fokusknappen på kontrollpanelet. Juster forsterkningen ved å trykke én gang på Auto TGC-knappen.
- Trykk Frys-tasten på kontrollpanelet. Forsikre deg om at dyret er mellom pusten når du fryser skjermen for å unngå uskarpe bilder.
- Når skjermen er frosset, trykker du på Måleverktøy på berøringsskjermen. Velg B-modus Ratio, et innebygd verktøy som måler relativ lysstyrke i et vev fra et valgt interesseområde. Opprett en sirkel på 2 mm for å velge et interesseområde (ROI). Juster sirkelstørrelsen ved å flytte en finger langs ytterkanten av styrekulen på kontrollpanelet.
- Plasser 2 mm sirkelen på leverbildet AVKASTNING, som skal være plassert til høyre for nyrene. Identifiser levervev basert på homogen ekkogenisitet og glatt kontur.
- Når sirkelen er på plass, trykker du på Velg-knappen på kontrollpanelet og observerer den nye sirkelen som vises.
- Juster størrelsen på den nye sirkelen til 2 mm, og plasser den på bildet av nyrebarken. Pass på å holde dybden av sirklene på leveren og nyrebarken den samme. Når du er på plass, trykker du på Velg-knappen på kontrollpanelet. Vær oppmerksom på at det innebygde systemverktøyet viser PULS-indeksen som et B-modusforhold.
- Trykk Lagre bilde for å lagre bildet, og se de lagrede bildene som vises som miniatyrbilder på høyre side av skjermen.
- Trykk frys-knappen på kontrollpanelet for å frigi bildet og gå tilbake til et bilde i B-modus.
- Sørg for at både nyrebark og leverparenchyma er i samme fokusplan. Juster om nødvendig fokus og få kontroll for å få et klart bilde.
- Gjenta B Mode ratio-målingen 3 ganger på forskjellige dybder og vevsplan. Beregn gjennomsnittet av disse tre B-modusforholdene for hvert dyr og hvert tidspunkt.
5. Bildeoppkjøp for Shear Wave Elastography
- Beveg sonden tverrgående i høyre subkostalområde for å finne leveren ved hjelp av B-modus. Finn et område av leveren som for det meste er parenchyma og fri for store blodkar som portalvenen og leverarterien. Når et klart område av leveren er funnet, generer et skjærelastisitetskart over vevet ved å trykke på SWE-knappen på kontrollpanelet.
- Juster størrelsen og posisjonen til SWE-boksen under leverkapselen i et område som er fritt for skygger. Identifiser kapselen som en lys ekkogen linje nær toppen av leveren.
- Vær oppmerksom på at SWE-boksen går over til et fargekart innen 5-10 s. Når boksen er full og stabil, trykker du på Frys-knappen på kontrollpanelet når dyret er mellom pustene.
MERK: Minimumsmengden av boksdekning bør være 60-80% for å nøyaktig vurdere leverens elastisitet. - Trykk QBoxpå berøringsskjermen, et innebygd systemverktøy som beregner elastisitet fra en avkastning på saksens elastisitetskart. Vær oppmerksom på sirkelen og databoksen som vises på skjermen. Juster posisjonen til QBox ved å trykke på posisjonsikonet på berøringsskjermen til ønsket oppsett.
- Juster størrelsen på sirkelen til 3 mm ved å bevege en finger langs ytterkanten av styrekulen på kontrollpanelet. Bruk styrekulen til å plassere sirkelen i et område uten skygge med ensartede farger (Figur 5A, B). Pass på å unngå kjente stivhetsområder som blodårer eller leverkapselen, samt utfall fra disse strukturene.
- Når du finner et tilstrekkelig område, trykker du Lagre bilde på kontrollpanelet for å lagre bildet. Gjenta denne prosedyren 3 ganger i forskjellige områder av leveren. Flytt sonden opp og ned eller sidelengs på magen for å samle SWE-kartlagte bilder fra forskjellige områder av leveren.
- Når alle bildene er samlet inn, trykker du avslutt eksamen på kontrollpanelet og noterer deg skjermbildet for pasientinformasjon som vises på skjermen.
- Fjern båndet fra dyrets poter, tørk overflødig gel bort, og fjern dyret fra bildestadiet. La det komme seg fra anestesi i et varmt, tørt bur av seg selv til det er helt gjenopprettet. Overvåk hvert dyr for å sikre full gjenoppretting fra anestesi, indikert av dets evne til å opprettholde sternal liggende
- Gjenta trinn i avsnitt 4-5 for hvert dyr i kohorten som skal avbildes.
6. Henting og analyse av bildedata
- Når bilder for alle dyr er samlet inn, slå av anestesi.
- Hvis du vil hente bildedata fra maskinen, trykker du på Se gjennom-knappen på kontrollpanelet og ser alle skanningene som er utført på det instrumentet som vises på skjermen. Søk etter de ønskede skanningene ved hjelp av søkevinduet øverst på skjermen.
- Velg alle skanninger som trengs for dataanalyse ved å merke av i boksen ved siden av navnet på pasienten via trackball- og Select-knappen. Når alle nødvendige skanninger er uthevet, velger du Eksporter JPEG-filer på berøringsskjermen. Eksporter data til en nettverksstasjon eller en bærbar USB-stasjon (Universal Serial Bus). Finn USB-portene på baksiden av instrumentet.
- Når filene er eksportert, åpner du individuelle JPG-filer for hver skanning på en arbeidsstasjonsdatamaskin. Vær oppmerksom på alle dataene på høyre side av bildet: B Mode Ratio-collect the B Ratio number; Q Box-samle gjennomsnittlig elastisitet (kPa) verdi.
- Skriv inn alle data i et regneark eller annen programvare for databaseadministrasjon, og utfør de ønskede statistiske analysene.
7. Histologisk analyse av leverprøver
- I slutten av den sjette uken, utfør nekropsi på halvparten av kohorten fra hver gruppe for midtstudie histologisk analyse av leverprøvene. På samme måte euthanize resten av kohorten av dyr, og samle leverprøver for histologisk analyse på 12th uke tidspunkt.
- For ORO-farging, fikse leverseksjoner i 10% nøytral-bufret formalin, og kryopreservere dem med sukrose ved hjelp av en nedkjølt 30% sukroseløsning over natten på et minimum. Cryo-embed seksjonene i optimal skjæretemperaturforbindelse, og kryo-del dem på ladede lysbilder for å forberede ORO-farging.
- Plasser kryo-seksjonene i 100% propylenglykol i 2 min etterfulgt av en nattinkubasjon i 0,5% ORO-løsning. Etter fjerning fra ORO-løsningen skiller du seksjonene i 85% propylenglykol i 1 min, skyll i deionisert vann og motstain med Mayers Hematoxylin-Lillie modifikasjon i 1 min.
- Plasser deksler på lysbildene ved hjelp av et vandig monteringsmedium og tørk dem ved romtemperatur.
- For PSR, deparaffinize formalin-fast, paraffin-innebygd lever delen lysbilder, plassere dem over natten i Bouin Fluid, og deretter farge dem ved hjelp av en automatisert lysbilde flekker i henhold til produsentens protokoll med noen optimaliserte trinn (1% fosfomolybdic syre i 5 min; 0,1% Sirius Red i mettet picric acid i 90 min; 2 x 30 s vask i 0.5% eddiksyre i 90 min; 2 x 30 s vask i 0.5% eddiksyre). Dehydrer lysbildene automatisk, og monter dem deretter med et permanent monteringsmedium.
- Ta bilder av oro- og PSR-fargede lysbilder ved hjelp av den digitale mikroskopiskanneren ved 20x forstørrelse, lagre dem i SVS-format og lagre dem i bildedatabasen for lysbildebehandling.
- Analyser bildene ved hjelp av tilpassede algoritmer opprettet i programvare for digital patologi. Bruk ensartet digital patologi programvare med terskelparametere for å identifisere og kvantifisere leverseksjonene området samt ORO- og PSR-farget områder. Eksporter målene til et regneark for beregning av arealprosent.
8. Statistisk analyse
- Utfør statistisk analyse av bildedataene med toveis ANOVA ved hjelp av Sidaks multippel sammenligningstest for å vurdere forskjellen mellom grupper på forskjellige tidspunkter. Anta signifikante forskjeller mellom grupper for sannsynlighetsverdier p ≤ 0,001. I tillegg kan du utføre korrelasjoner mellom avbildningsavlesninger og histologiske analyser.
- Bruk ikke-parametrisk statistikk for å analysere de histologiske analyseresultatene fra denne studien. Rapporter gruppeverdiene som median ± halvt interkvartilt område (sIQR). Anta signifikante forskjeller mellom grupper for sannsynlighetsverdier p ≤ 0,001. Bruk en Mann-Whitney-test for å sammenligne mengden PSR og ORO histokjemisk flekk mellom ulike grupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et kjennetegn på dyr matet CDAHFD er steatose. Akkumulering av fett i leveren endrer vevets ekkogene egenskaper, som kan kvantifiseres ved å måle leverens lysstyrke og normalisere den til lysstyrken til nyrebarken fra et B-modusbilde tatt i samme plan. Den kvantifiserte verdien uttrykkes som en HR-indeks, som er et indirekte mål på steatose. I figur 4Aviser et representativt leverbilde fra et kontrolldyr omtrent lik eller mindre lysstyrke (ekkogenisitet) sammenlignet med nyrebarken. Dermed er HR-indeksen til normale dyr <1. I denne studien er den gjennomsnittlige HR-indeksen for kontrolldyr ved 3-ukers tidspunktet 0,645 ± 0,03. I motsetning viser et representativt B-modusbilde av et CDAHFD-matet dyr (figur 4A) økt lysstyrke i leveren sammenlignet med nyrebarken. Som et resultat var HR-indeksene for representative bilder fra CDAHFD-diettdyrene henholdsvis 1,91 og 1,79 på 6- og 12-ukers tidspunktene.
Figur 4C viser en tomt med HR-indekser over tid fra kontroll- og CDAHFD-dyr. Kontroll-diett-matede dyr viser liten bevegelse i HR-indeksverdier fra baseline, mens CDAHFD-dyr stiger raskt i løpet av de første 3-6 ukene av studien før de når et platå. Den gjennomsnittlige HR-indeksen for dyr som var på et CDAHFD-kosthold er 1,861 ± 0,06 sammenlignet med 0,328 ± 0,03 i kontrolldyr ved 12 uker etter sykdomsinduksjon. Som forventet viste leveren et betydelig høyere positivt prosentområde for ORO-farging i CDAHFD-gruppen sammenlignet med kontrolldiettgruppen ved 6- (34,81 ± 4,66 vs. 0,49 ± 0,11) og 12- (30,08 ± 2,64 vs. 1,17 ± 0,44) uketidspunkter (Figur 4B,D). Det var også utmerket korrelasjon (Pearson r = 0,78) mellom prosentarealet av ORO-farging med HR-indeksen på 6- og 12-ukers tidspunktene (Figur 4E). Disse resultatene tyder på at HR-indeksen kan være en verdifull bildeavlesning for å kvantifisere steatose i prekliniske modeller av NAFLD/NASH.
Et av nøkkelelementene for å måle leverstivhet via SWE er riktig plassering av avkastningen (figur 5). Det venstre panelet (Figur 5A) viser et representativt bilde med B-modus og SWE-kartlegging av lever fra et kontrolldiettdyr. Riktig ROI-plassering bør være over et område som er stabilt i fargekartet og representerer den delen av leveren som måles, med et signal som ikke påvirkes av tilstøtende strukturer som leverkapsel og blodkar. Vevsstivhet rapporteres som E-modulus, som er en beregning basert på skjærbølgehastighet og en bestemt konstant og uttrykkes i kilopascals (kPa). For kontrolldyr faller E-modulen mellom 3,5 kPa og 6 kPa. Gjennomsnittlig kPa for ROIene som ble rapportert i figur 5A for kontrolldyr var henholdsvis 4,6 og 5,5 kPa ved 6- og 12-ukers tidspunktene, som faller innenfor forventet normalområde. Figur 5A viser et representativt bilde av SWE-modus fra et CDAHFD-dyr etter 6 og 12 uker. Her har avkastningen igjen blitt plassert nær midten av Q Box (skjærbølgekart), basert på den fargede referansen på toppen av bildet.
Som forventet med denne modellen er E-modulen mye høyere i det CDAHFD-matede dyret. I disse representative bildene var gjennomsnittlig kPa 10,5 ved 6 uker og 23,1 kPa ved 12 uker, noe som indikerer betydelig vevsstivhet. En typisk NASH-diettstudie som bruker CDAHFD og kontroll chow bør avsløre en jevn progresjon av leverstivhet på grunn av fibrose hos CDAHFD-matede dyr, mens kontrolldyr forblir de samme. Figur 5C viser en gradvis økning i elastisiteten i leveren hos CDAHFD-dyr sammenlignet med stabil elastisitet hos kontrolldyr over en 12-ukers periode. Kontroll diett elastisitet starter på 5.80 ± 0.99 kPa på 3-ukers tidspunktet og viser ikke mye endring (6.14 ± 0.59) i løpet av 12-ukers studien. Det kolinmangel dietten viser imidlertid en betydelig økning ganske tidlig, og når 12,07 ± 2,37 kPa innen uke 6. Trenden i økt elastisitet fortsetter i CDAHFD-dietten etter hvert som studien utvikler seg, og når 24,43 ± 9,29 kPa ved 12 uker etter spesiell diettinitiering.
Leverprøver ble farget med PSR for å lokalisere kollagen som en korrelasjon av fibrose. Som forventet med denne modellen er det en betydelig høyere prosentandel av leveren PSR-positiv farging observert hos CDAHFD dyr sammenlignet med kontroll dietten på både 6- og 12-ukers tidspunkter (Figur 5D). For å etablere nytten av skjærbølgen som en surrogatmetode for å eks vivofarging, ble skjærbølge E Modulus-tall plottet mot PSR-farget område i CDAHFD-rotter i figur 5E for å bestemme korrelasjonen. Analyse av plottet avslørte en tett klynge med en Pearson 'r' verdi på 0,88, noe som indikerer sterk korrelasjon. Det skal bemerkes at resultatene som rapporteres her er representative for hva som forventes i en studie ved hjelp av et kolinmangel, fettfattig kosthold for å indusere NASH. Denne metoden kan også brukes med andre prekliniske NASH-modeller; Det vil imidlertid gi forskjellige resultater og avskjæringsverdier avhengig av sykdomsinduksjonsprotokollen. I likhet med rotte NASH-modellen viste SWE-bildet i den CDAHFD-induserte NASH-musemodellen utmerket sammenheng mellom leverelastisitetsverdier og prosentandelen psr-positivt farget område ileveren 13. Dermed kan SWE være et verdifullt verktøy for å vurdere leverfibrose i prekliniske modeller av NAFLD / NASH.
Figur 1: Bildeoppsett. Ultralydtransduseren (a) holdes av den synkende armen. Bildetrinnet (b) har et område for å klemme anestesislangen og sette opp en nesekegle (c) for kontinuerlig anestesi under avbildning. Scenen er også oppvarmet og utstyrt med sonder for å overvåke kroppstemperaturen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjærebølge-elastografiinstrumentet. (A) Skjærbølgeelastografiinstrumentet er en enkelt, hjulenhet med festeporter for opptil 4 ultralydsonder. (B) Den øvre skjermen fungerer som den visuelle utgangen for sanntidsvisning av bilder, i tillegg til å vise pasientdata og systembeholdning. (C) Det sentrale kontrollpanelet inneholder de fleste knappene og knottene som trengs for å justere skjermen og hente bilder. (D) Den nedre skjermen er en berøringsskjerm med tilleggskontroller og kommandoer for bildeanskaffelse og justering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Plassering av dyreposisjonering og riktig svinger. (A) Når et dyr er riktig plassert på scenen og begrenset med tape-in venstre lateral recumbency (B) senkes ultralydsonden på rotten og berører gelen som er plassert på magen / siden. Når sonden berører gelen i stillingen i panel B, kan nyre og lever ses i sammenstilling på skjermen. Dette er en optimal posisjon til å samle hepato-nyreindeksen, og i noen tilfeller skjærbølgetallene også. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Resultater avhepato-nyreindeks. (A) Representativt bilde av HR-indekser fra kontroll og CDAHFD-diettrotter ved 6- og 12-ukers tidspoeng. ROIer (rød) ble trukket i nyrene (venstre sirkel) og leveren (høyre sirkel), så ble et forhold mellom signalene bestemt (B Ratio, høyre datatabell). (B) Representative ORO-fargede histologiske deler av leverprøver fra kontroll og CDAHFD diettrotter ved 6- og 12-ukers tidspunkter. Skalastenger = 300 μm. (C) Grafisk fremstilling av HR-indeksen over et sykdomsinduserende kostholdstidskurs. Kontrollrottedata er representert i blå CDAHFD rottedata i rødt. Grafen viser gjennomsnittsverdier med standardfeil i gjennomsnittet (n = 20 ved 3-ukers tidspunktet og n = 20 for kontroll og n= 19 for CDAHFD ved 6 uker, n = 10 ved 9- og 12-ukers tidspunkter (sammenligning av kontroll versus CDAHFD på hvert tidspunkt *, **, ***, ****p < 0,001). (D) Lever ORO beregninger plottet for hvert tidspunkt (n = 10). Grafen viser medianverdier med interkvartilt område (*, ** p < 0,001). (E) Korrelasjonsdiagram som sammenligner prosent lever-ORO-positivt område sammenlignet med HR-indeksen. Forkortelser: HR = hepato-nyre; CDAHFD = kolinmangel, fettfattig diett; ROIer = interesseområder; ORO = Olje rød O. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Resultater av skjærbølgeelastografi. (A) Representativt bilde av SWE kart fra kontroll og CDAHFD diett rotter på 6- og 12-ukers tidspunkter. ROIer (rød) ble trukket i nyrene (venstre sirkel) og leveren (høyre sirkel), så ble et forhold mellom signalene bestemt (B Ratio, høyre datatabell). (B) Representative ORO-fargede histologiske deler av leverprøver fra kontroll og CDAHFD diettrotter ved 6- og 12-ukers tidspunkter. Skalalinjen på histologiske seksjoner er 300 μm. (C) Grafisk representasjon av levervevsstivhet i en 12-ukers diettindusert NASH-rottemodell. Grupper ble matet normal chow (blå) eller kolinmangel, fettfattig diett (rød) (n = 20 ved 3 og 6 uker, n = 10 ved 9- og 12-ukers tidspoeng). Grafen viser gjennomsnittsverdier med standardfeil i gjennomsnittet (n = 20 ved 3 og 6 uker, n = 10 ved 9- og 12-ukers tidspunkter (sammenligning av kontroll kontra CDAHFD ved hvert tidspunkt *, **, *** p < 0,001). (D) Grafisk fremstilling av kollagenfordeling i eks vivo histologiske leverprøver ved hjelp av kollagenspesifikk PSR-flekk (n = 10). Grafen viser medianverdier med interkvartilt område (*, ** P < 0,001) (E) Korrelasjonsgraf som sammenligner prosent positivt lever-PSR-fargeområde kontra SWE-elastisitet. SWE = skjærbølge elastografi; CDAHFD = kolinmangel, fettfattig diett; ROIer = interesseområder; ORO = Olje rød O; NASH = nonalcoholic steatohepatitis; PSR = Picro Sirius Rød. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ultralydbasert avbildning, inkludert SWE, kan være et uvurderlig verktøy for langsgående vurdering av leversteatose og stivhet i prekliniske modeller av NAFLD/NASH. Dette dokumentet beskriver detaljerte metoder for hvordan du skaffer deg B-modus av høy kvalitet, samt SWE-bilder av lever for måling av HR-indeksen og elastisitet ved hjelp av en CDAHFD-diettindusert rottemodell av NASH. Videre viser resultatene utmerket korrelasjon mellom HR-indeksen og elastisiteten med gullstandarden for evaluering-histologisk vurdering av levervev. Selv om selve prosedyren ser ut til å være ukomplisert, er det noen kritiske aspekter ved protokollen som vil sikre vellykkede resultater.
Plasseringen av svingeren er nøkkelen, spesielt når du leter etter nyrene for å måle HR-indeksen i B-modus. Plassering av sonden for nær ribbeina kan resultere i ribbeskygge, noe som skaper falske mål på ultralyddemping. Videre er fjerning av alt hår ved hjelp av både barberings- og depileringskrem viktig, da gjenværende hår kan fange luftbobler, noe som vil kaste skygger på B-modusbilder. Til slutt, da tilstedeværelsen av mat i mage og tarm kan skjule leveren, spesielt i normale chow-matede dyr, er tilstrekkelig faste av alle dyr avgjørende for vellykket avbildning av leveren.
Selv om leverelastisitetsmålinger fra SWE og HR-indeksen er verdifulle avlesninger for å vurdere leverfibrose og steatose i prekliniske modeller av NASH, har teknikken noen begrensninger. Faktorer som betennelse, leverbelastning, kolestase og utstrømningskanalobstruksjon påvirker leverstivheten og kan dermed påvirke den generelle spesifisiteten til denne teknikken ved måling av leverfibrose8,14,15,16. På samme måte kan lysstyrken i leveren i B-modus ultralydbilder påvirkes av fibrose og kan dermed påvirke nøyaktigheten av HR-indeksen ved måling av steatose. Det er behov for flere studier for å avklare bidraget fra disse påvirkningsfaktorene på elastisitet og steatose og etablere avskjæringsverdier for disse avlesningene i ulike prekliniske modeller av NASH. Videre vurderte ikke denne studien følsomheten til HR-indeksen som biomarkør for å vurdere leversteatose i en preklinisk effektstudie.
Måling av leverstivhet ved bruk av SWE har potensial til å bli et verdifullt verktøy for å forstå patofysiologien til NASH / NAFLD, samt for å utvikle nye behandlinger for denne tilstanden. Ved å la forskeren bestemme både leversteatose og vevsstivhet uten behov for en invasiv biopsi, kan dyr i prekliniske studier overvåkes langsgående, og legemiddeleffekter på enkelte personer kan kvantifiseres over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere er ansatte i Pfizer, Inc.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Pfizer Comparative Medicine Operations Team for deres harde arbeid med å ta vare på og sikre helsen til studiedyrene, samt bistå med noen av teknikkene. Takk skyldes også Danielle Crowell, Gary Seitis og Jennifer Ashley Olson for deres hjelp med vevsbehandling for histologiske analyser. I tillegg vil forfatterne takke Julita Ramirez for å ha gjennomgått og gitt verdifulle tilbakemeldinger under utarbeidelsen av dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aixplorer | Supersonic Imagine | Shear Wave Elastography Instrument | |
| Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer | Supersonic Imagine | Transducer for Shear Wave Elastography | |
| Alpha-dri bedding | rat cages | ||
| Aperio AT2 scanner | Leica Biosystems | Digital Pathology Brightfield Scanner | |
| Compac 6 Anesthesia System | VetEquip | Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however. | |
| Manage Imager Database | Leica Biosystems | Digital Pathology | |
| Mayer's Hematoxilin | Dako/Agilent | H&E Staining/Histology | |
| Nair | Church & Dwight | Hair remover | |
| Oil Red O solution | Poly Scientific | Lipid Staining/Histology | |
| Picrosirius Red Stain (PSR) | Rowley Biochemical | F-357-2 | Collagen Stain/Histology |
| Puralube Opthalmic ointment | Dechra Veterinary Product | Lubrication to prevent eye dryness during anesthesia | |
| Tissue-Tek Prisma Plus | Sakura Finetek USA | Automated slide stainer | |
| VISIOPHARM software | Visiopharm | Digital pathology software | |
| Research Diets | A06071309i | NASH inducing diet | |
| Purina | 5053 | Control animal chow | |
| Vevo imaging station | Fujifilm VisualSonics | The Vevo imaging station is used for holding the ultrasound transducer during imaging. | |
| Wistar Han rats | Charles River Laboratories |
References
- Younossi, Z. M., et al. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes. Hepatology. 64 (1), 73-84 (2016).
- Boland, M. L., et al. Towards a standard diet-induced and biopsy-confirmed mouse model of non-alcoholic steatohepatitis: Impact of dietary fat source. World Journal of Gastroenterology. 25 (33), 4904-4920 (2019).
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- Bercoff, J., Tanter, M., Fink, M. Supersonic shear imaging: a new technique for soft tissue elasticity mapping. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 51 (4), 396-409 (2004).
- Bavu, E., et al. Noninvasive in vivo liver fibrosis evaluation using supersonic shear imaging: a clinical study on 113 hepatitis C virus patients. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1361-1373 (2011).
- Ferraioli, G., et al. Accuracy of real-time shear wave elastography for assessing liver fibrosis in chronic hepatitis C: a pilot study. Hepatology. 56 (6), 2125-2133 (2012).
- Ross, T. T., et al. Acetyl-CoA carboxylase inhibition improves multiple dimensions of NASH pathogenesis in model systems. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 829-851 (2020).
- Gu, L. H., Gu, G. X., Wan, P., Li, F. H., Xia, Q. The utility of two-dimensional shear wave elastography and texture analysis for monitoring liver fibrosis in rat model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 20 (1), 46-52 (2020).
- Marshall, R. H., Eissa, M., Bluth, E. I., Gulotta, P. M., Davis, N. K. Hepatorenal index as an accurate, simple, and effective tool in screening for steatosis. American Journal of Roentgenology. 199 (5), 997-1002 (2012).
- Webb, M., et al. Diagnostic value of a computerized hepatorenal index for sonographic quantification of liver steatosis. American Journal of Roentgenology. 192 (4), 909-914 (2009).
- Tous, M., Ferre, N., Camps, J., Riu, F., Joven, J. Feeding apolipoprotein E-knockout mice with cholesterol and fat enriched diets may be a model of non-alcoholic steatohepatitis. Molecular and Cellular Biochemistry. 268 (1-2), 53-58 (2005).
- Kirsch, R., et al. Rodent nutritional model of non-alcoholic steatohepatitis: species, strain and sex difference studies. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (11), 1272-1282 (2003).
- Journal of Ultrasound in Medicine.
- Engelmann, G., Quader, J., Teufel, U., Schenk, J. P. Limitations and opportunities of non-invasive liver stiffness measurement in children. World Journal of Hepatology. 9 (8), 409-417 (2017).
- Piscaglia, F., Salvatore, V., Mulazzani, L., Cantisani, V., Schiavone, C. Ultrasound shear wave elastography for liver disease. a critical appraisal of the many actors on the stage. Ultraschall in der Medizin. 37 (1), 1-5 (2016).
- Singh, S., Loomba, R. Role of two-dimensional shear wave elastography in the assessment of chronic liver diseases. Hepatology. 67 (1), 13-15 (2018).
