Summary
Белковое аргининовое (R)-метилирование является широко распространенной посттрансляционной модификацией, регулирующей несколько биологических путей. Масс-спектрометрия является лучшей технологией для глобального профилирования R-метил-протеома в сочетании с биохимическими подходами к обогащению модифицированными пептидами. Рабочий процесс, предназначенный для высокой достоверности идентификации глобального R-метилирования в клетках человека, описан здесь.
Abstract
Белковое аргининовое (R)-метилирование является широко распространенной посттрансляционной модификацией белка (PTM), участвующей в регуляции нескольких клеточных путей, включая обработку РНК, трансдукцию сигналов, реакцию на повреждение ДНК, биогенез микроРНК и трансляцию.
В последние годы, благодаря биохимическим и аналитическим разработкам, протеомика на основе масс-спектрометрии (МС) стала наиболее эффективной стратегией для характеристики клеточного метилпротеома с односайтовым разрешением. Однако идентификация и профилирование R-метилирования белка in vivo при РС остается сложным и подверженным ошибкам, главным образом из-за субстохиометрического характера этой модификации и наличия различных замен аминокислот и химической метилэтерификации кислотных остатков, которые являются изобарическими к метилированию. Таким образом, необходимы методы обогащения для улучшения идентификации R-метилпептидов и ортогональные стратегии валидации для снижения коэффициентов ложного обнаружения (FDR) в исследованиях метилпротеомики.
Здесь описан протокол, специально разработанный для идентификации и количественного определения R-метилпептидов с высокой степенью достоверности из клеточных образцов, который связывает метаболическую маркировку клеток с тяжелым изотоп-кодированным метионином (hmSILAC) и двойным перевариванием протеазы в растворе цельноклеточного экстракта, за которым следует оффлайн-фракционирование хроматографии с высоким рН (HpH-RP) и аффинное обогащение R-метил-пептидов с использованием анти-пан-R-метиловых антител. При анализе MS с высоким разрешением необработанные данные сначала обрабатываются с помощью программного пакета MaxQuant, а затем результаты анализируются hmSEEKER, программным обеспечением, предназначенным для углубленного поиска пиковых пар MS, соответствующих легким и тяжелым метил-пептидам в выходных файлах MaxQuant.
Introduction
Аргинин (R)-метилирование представляет собой посттрансляционную модификацию (PTM), которая украшает около 1% протеома млекопитающих1. Белковые аргининметилтрансферазы (PRMT) представляют собой ферменты, катализирующие реакцию R-метилирования путем осаждения одной или двух метильных групп к атомам азота (N) группы гуанидино боковой цепи R симметричным или асимметричным образом. У млекопитающих PRMT могут быть сгруппированы в три класса - тип I, тип II и тип III - в зависимости от их способности депонировать как монометилирование (ММА), так и асимметричное диметилирование (ADMA), ММА и симметричное диметилирование (SDMA) или только ММА, соответственно 2,3. PRMT в основном нацелены на остатки R, расположенные в богатых глицином и аргинином регионах, известных как мотивы GAR, но некоторые PRMT, такие как PRMT5 и CARM1, могут метилировать пролин-глицин-метионин-богатые (PGM) мотивы4. R-метилирование появилось как модулятор белка нескольких биологических процессов, таких как сплайсинг РНК5, репарация ДНК6, биогенез миРНК7 и трансляция2, способствуя исследованиям этого ПТМ.
Масс-спектрометрия (МС) признана наиболее эффективной технологией для систематического изучения глобального R-метилирования при разрешении белка, пептида и сайта. Тем не менее, этот PTM требует некоторых особых мер предосторожности для его высокой достоверности идентификации по РС. Во-первых, R-метилирование является субстохиометрическим, причем немодифицированная форма пептидов гораздо более распространена, чем модифицированные, так что масс-спектрометры, работающие в режиме Data Dependent Acquisition (DDA), будут фрагментировать высокоинтенсивные немодифицированные пептиды чаще, чем их метилированные аналоги с более низкой интенсивностью8. Кроме того, большинство рабочих процессов на основе МС для идентификации R-метилированных участков страдают от ограничений на уровне биоинформационного анализа. Действительно, вычислительная идентификация метилпептидов подвержена высоким показателям ложного открытия (FDR), потому что этот PTM является изобарическим для различных аминокислотных замен (например, глицин в аланин) и химической модификации, такой как метилэтерификация аспартата и глутамата9. Следовательно, методы, основанные на изотопной маркировке метильных групп, такие как Heavy Methyl Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell culture (hmSILAC), были реализованы в качестве ортогональных стратегий для уверенной MS-идентификации метилирования in vivo , значительно снижая частоту ложноположительных аннотаций10.
В последнее время были оптимизированы различные протоколы для изучения R-метилированных белков. Разработка основанных на антителах стратегий иммуноаффинного обогащения R-метилпептидов привела к аннотированию нескольких сотен R-метилированных участков в клетках человека11,12. Кроме того, во многих исследованиях 3,13 сообщалось, что соединение обогащения на основе антител с методами разделения пептидов, такими как фракционирование хроматографии HpH-RP, может увеличить общее количество идентифицированных метилпептидов.
В данной статье описывается экспериментальная стратегия, предназначенная для систематической и высокодостоверной идентификации R-метилированных участков в клетках человека, основанная на различных биохимических и аналитических этапах: экстракция белка из клеток, меченых hmSILAC, параллельное двойное ферментативное пищеварение протеазами трипсина и лисаргиназы с последующим хроматографическим фракционированием HpH-RP переваренных пептидов в сочетании с иммуноаффинным обогащением на основе антител MMA-, SDMA-, и ADMA-содержащие пептиды. Все обогащенные аффинностью пептиды затем анализируются методом жидкостной хроматографии высокого разрешения (LC)-MS/MS в режиме DDA, а необработанные данные MS обрабатываются алгоритмом MaxQuant для идентификации R-метилпептидов. Наконец, выходные результаты MaxQuant обрабатываются с помощью hmSEEKER, собственного инструмента биоинформатики для поиска пар тяжелых и легких метилпептидов. Вкратце, hmSEEKER считывает и фильтрует идентификацию метилпептидов из файла msms, затем сопоставляет каждый метилпептид с соответствующим пиком MS1 в файле allPeptides и, наконец, ищет пик тяжелого/ легкого пептидного аналога. Для каждой предполагаемой пары тяжелых легких вычисляются коэффициент Log2 H/L (LogRatio), разность времени удержания (dRT) и параметры mass error (ME), а дублеты, расположенные в пределах заданных пользователем отсечек, помечаются как истинные положительные значения. Рабочий процесс биохимического протокола описан на рисунке 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культивирование клеток и экстракция белка (требуется время: 3 - 4 недели)
- Выращивайте клетки HeLa параллельно в средах, снабженных либо легким (L), либо тяжелым (H) метионином соответственно (см. Таблицу 1 для композиции среды). По крайней мере, после восьми делений клеток соберите аликвоту клеток из каждого канала SILAC и выполните тест на инкорпорацию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить эффективность включения, проверьте с помощью анализа LC-MS / MS, что процент тяжелого метионина (Met-4) в тяжелом канале максимально близок к 100%. Проанализируйте аликвоту тяжело меченых ячеек LC-MS/MS (настройки см. в таблице 2), затем обработайте данные MS с помощью MaxQuant с использованием параметров, указанных в таблице 3. Для проверки включения Met-4 на сайте https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/ доступен собственный сценарий. - Считать тяжелое включение метионина полным, когда оно достигает >97%. Когда каждый канал достигает общего числа около 60 х 106 клеток (соответствующих примерно 40 чашкам по 15 см каждая при 85% слиянии для клеток HeLa, с вариациями в зависимости от типа клетки) собирают их. Тщательно пересчитать, перемешать в пропорции 1:1 и гранулировать центрифугированием при 335 х г в течение 5 мин при 4 °С.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы оценить правильное смешивание 1: 1 л / ч, сохраните аликвоту и запустите ее на срезе геля, который, как известно, содержит большое количество и сильно R-метилированный белок (например, фибрилларин). Если маркировка прошла успешно и было достигнуто смешивание 1:1, то в образце должно быть соотношение легких и тяжелых версий R-метилированных пептидов, присутствующих в 1:1. В качестве альтернативы, сохраните аликвоту смешанного образца для анализа LC-MS/MS, затем обработайте данные MS с помощью MaxQuant, используя параметры, указанные в таблице 3 , и постройте график распределения соотношения Log2 H/L, как показано на рисунке 2C. Протокол здесь можно остановить, заморозив гранулу и сохранив ее при -80 °C. - Повторно суспендировать ячейку гранулы в четырех объемах буфера лизиса (см. Таблицу 1 для композиции Lysis Buffer) по отношению к объему гранул ячейки. Например, используйте 6 мл лизисного буфера для гранулы из 120 x 106 клеток Hela (60 x 106 Light + 60 x 106 Heavy), соответствующих объему 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракция белка должна выполняться при комнатной температуре (RT), поскольку буфер лизиса содержит хаотропный агент 9 М мочевины, который выпадает в осадок при температуре льда; Поэтому добавление широкого спектра ингибиторов сериновой и цистеиновой протеазы имеет важное значение, а также ингибиторов фосфатаз, для одновременной защиты белков от протеолитической деградации и дефосфорилирования, коктейль из ингибиторов протеазы и фосфатазы коммерчески доступен в виде небольших таблеток, см. Таблицу 1 и Таблицу материалов. - Обрабатывайте образец ультразвуком с помощью ультраконтактного разрушителя клеток в течение не менее пяти циклов 15 с ON и 30 s OFF, чтобы обеспечить эффективный разрыв клеточных мембран и высвобождение и сдвиг ДНК. Проверьте вязкость экстракта, пипетируя раствор вверх и вниз. Если он слишком вязкий из-за неполной сдвига ДНК и солюбилизации мембраны, повторите циклы обработки ультразвуком.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что образец не перегревается во время обработки ультразвуком, потому что высокая температура может повредить белки. Однако невозможно поместить образец на лед между циклами обработки ультразвуком из-за наличия мочевины 9M; следовательно, желательно сделать паузу на 60 с OFF между различными циклами обработки ультразвуком. Кроме того, избегайте образования пузырьков воздуха во время обработки ультразвуком, потому что они снижают эффективность обработки ультразвуком. - Центрифугируйте экстракт при 3000 х г в течение 10 мин при РТ, чтобы гранулировать мусор и перенести супернатант в новую трубку объемом 15 мл.
- Измерьте содержание белка в экстракте с помощью колориметрического анализа, такого как Брэдфорд или бицинхониновая кислота (BCA)14,15. Оптимальное начальное количество белкового экстракта для этого протокола составляет 20-30 мг.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буферы лизиса, содержащие мочевину с высокой концентрацией, совместимы как с количественной оценкой Брэдфорда, так и с анализом количественной оценки BCA; другие типы буфера лизиса, такие как те, которые включают высокую концентрацию додецилсульфата натрия (SDS), не совместимы с Брэдфордом.
2.Переваривание лизата (ориентировочное время требуется 2 часа)
- Выполняют восстановление тиольной группы (-SH) белков с помощью исходного раствора дитиотрейтола (ДТТ), растворенного в сверхчистой воде в конечной концентрации 4,5 мМ, и отпускают реакцию в течение 30 мин при 55 °С.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно приготовить 1 млн раствора DTT и хранить его при -20 °C до 1 месяца, размораживая только аликвоты, необходимые для каждого эксперимента. Альтернативно, сульфгидрилредуктант трис-(2-карбоксиэтил)-фосфин (TCEP) может быть использован для выполнения восстановления -SH групп; особенно для длительного хранения белков, TCEP значительно более стабилен, чем DTT без хелатов металлов, таких как EGTA в буфере, тогда как DTT более стабилен, если присутствуют хелаты металлов16. - Выполняют алкилирование тиольной группы (-SH) белков путем добавления йодоацетамида (ИАА) в концентрации 10 мМ и инкубации в течение 15 мин при РТ в темноте. Выполняйте инкубацию экстрагированных белков раствором IAA в темноте, потому что IAA светочувствительна.
ПРИМЕЧАНИЕ: Исходный раствор IAA при 100 мМ следует готовить свежим перед каждым экспериментом. Альтернативно, хлорацетамид может быть использован для выполнения алкилирования групп -SH, особенно если целью эксперимента является анализ перекрестных помех между метилированием и убиквитинированием, поскольку артефакт, индуцированный IAA, имитирует убиквитинирование17. - Прежде чем приступить к этапу переваривания белка, сохраните аликвоту белкового экстракта (1/1000 исходного непереваренного лизата) для последующего анализа на геле SDS-PAGE Coomassie и сравнения с соответствующим количеством образца при пищеварении; этот тест служит для проверки эффективности протеолиза (см. пункт 4).
- Разбавляют оставшийся белковый экстракт четырьмя объемами 20 мМ HEPES pH 8,0, чтобы достичь конечной концентрации мочевины 2 М (что является концентрацией, совместимой с ферментативной активностью протеаз). Разделите образец на две части: в первой добавляют модифицированный трипсин секвенирования, а во второй добавляют протеазу лисаргиназы (см. Таблицу материалов) в пропорции 1:100 (ш/ж) относительно мг исходного материала. Оставить на ночь при 37 °C в термомиксоре при 600 об/мин, чтобы обеспечить ферментативное сбраживание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трипсин, наиболее распространенный фермент пищеварения в протеомике, расщепляется на С-конце R и лизина (K), генерируя пептиды с распределением заряда, которое приводит к спектрам фрагментации, в которых доминируют ионы Y-типа при диссоциации, вызванной столкновением (CID). Таким образом, лисаргиназа расщепляется на N-конце R и K, отражая специфичность расщепления трипсина и генерируя пептиды, которые высвобождают в основном ионы b-типа при фрагментации CID. Этот комбинированный анализ приводит к значительному увеличению охвата пептидных последовательностей и повышению уверенности в идентификации R-метилированияR-метилирования 18.
3. Пептидная очистка (ориентировочное время требуется 1 час)
- Сохраните аликвоту переваренных пептидов от обеих реакций, собирая те же объемы, что и в пункте 2.3 для сравнения на SDS-PAGE Coomassie-окрашенном гелем для оценки эффективности пищеварения протеазы (см. пункт 4).
- Остановить пищеварение путем подкисления образцов добавлением трифторуксусной кислоты (ТФА) до конечной концентрации 5%. Хорошо перемешайте и измерьте pH образцов лакмусовой бумагой (pH должен быть около 3). Вихрь ненадолго и раскрутите подкисленные образцы, прежде чем перенести их в новые 15 мл пробирки.
- Очистите образцы через два вакуумных картриджа C18 (масса сорбента 1 г, см. Таблицу материалов), один для образца, переваренного трипсином, а другой для образца, переваренного лисаргиназой. Приготовьте растворитель А, растворитель В и буфер для промывки (см. Таблицу 1 для буферной композиции).
- Используя стеклянные пипетки, регидратируйте каждый картридж 6 мл ACN 100% в течение 3 раз. После этого уравновешивайте каждый картридж последовательно 3-9-18 мл растворителя А. Загрузите образцы (смолы должны стать желтыми). Снова последовательно вымойте 3-9-18 мл растворителя А, а затем добавьте 6 мл буфера для стирки. Переложите каждую колонну в чистые пробирки по 15 мл и элюируйте образцы 7 мл растворителя B. Повторите стадию элюирования с 7 мл растворителя B для окончательного объема 14 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все эти шаги, позволив буферам и раствору пройти через колонны под действием силы тяжести. Чтобы облегчить поток буферов через колонну, медленно толкайте каждый раствор шприцем, чтобы имитировать вакуум. - Сохраните 50 мкл элюированных пептидов, 50 мкл проточной (FT), 50 мкл промывки растворителем А и 50 мкл последней промывки для последующей оценки пептидов SDS-PAGE (см. пункт 4).
4. Окрашенный Coomassie гель SDS-PAGE (ориентировочное время требуется 2 часа)
- Запустите собранные аликвоты на 17,5% геле SDS-PAGE и окрашивании с окрашиванием Instant-Blu Coomassie (см. Таблицу материалов). Ожидаемый результат представлен на рисунке 2A.
5. Пептидная лиофилизация (ориентировочное время 2 дня)
- Накройте пробирки объемом 15 мл, содержащие элюированные пептиды, парафиновой пленкой, которую затем пробивают иглой 20 г для создания 3-5 отверстий. Поместите пробирки в сухой лед не менее чем на 30 минут, пока образцы полностью не замерзнут.
- Лиофилизируйте замороженные фракции в течение 48 ч, интервал времени, обычно достаточный для обеспечения полной лиофилизации образцов, даже если может возникнуть некоторая изменчивость, из-за производительности сублимационной сушилки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь эксперимент можно приостановить, сохраняя лиофилизированные образцы при -80 °C.
6. Автономное хроматографическое фракционирование пептидов HpH-RP (индикативное время 4 дня)
- Для фракционирования пептидов на 60 фракций используют жидкостную хроматографию HpH-RP, используя систему ВЭЖХ, оснащенную колонкой C12-RP HPLC (250 x 4,6 мм, 4 мкм Proteo 90A).
- Перед запуском подготовьте свежие Buffer A и Buffer B (состав Buffers описан в таблице 1).
- Процедите весь раствор фильтром 0,22 мкм и дегазируйте их в ванне с ультразвуком в течение не менее 30 мин.
- Растворите лиофилизированные пептиды в 1 мл буфера А. Фильтруйте пептиды через фильтр из политетрафторэтилена (PTFE) 0,45 мкм с помощью шприца.
- Устанавливают скорость фракционирования при расходе 1 мл/мин и собирают 1 мл фракций, используя следующий хроматографический градиент: от 5% В до 30% В за 60 мин; от 30% В до 60% - через 2 мин; 70% B в течение 3 мин.
- Установите ВЭЖХ таким образом, чтобы в этот момент сбор фракций был остановлен, а градиент удерживался на уровне 70% буфера B в течение 5 минут перед обширной промывкой колонны с быстрым градиентом до 100% буфера B с последующей окончательной промывкой (100% buffer B в течение 10 мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: В конце каждого хроматографического прогона всегда уравновешивайте столбец со 100% буфером A в течение 20 минут. - Фракционировать оба образца, отдельно переваренные трипсином и лисаргиназой, с помощью хроматографических градиентов Off-Line HpH RP, как описано в точке 6.5.
- Для каждого хроматографического градиента соберите все фракции в глубокую 96-луночную пластину.
- Объедините дроби, собранные перед градиентом, в одну единственную дробь с именем PRE. Объедините 60 фракций из жидкого хроматографического (LC) градиента HpH-RP, объединив их несмежным образом в 14 конечных фракций. Чтобы получить такую несмежную конкатенацию, объедините фракции HpH-RP по следующей схеме.
- Фракция 1 (конечный объем 5 мл): Бассейн 1-15-29-43-57
- Фракция 2 (конечный объем 5 мл): Бассейн 2-16-30-44-58
- Фракция 3 (конечный объем 5 мл): Бассейн 3-17-31-45-59
- Фракция 4 (конечный объем 5 мл): Бассейн 4-18-32-46-60
- Фракция 5 (конечный объем 4 мл): Бассейн 5-19-33-47
- Фракция 6 (конечный объем 4 мл): Бассейн 6-20-34-48
- Фракция 7 (конечный объем 4 мл): Бассейн 7-21-35-49
- Фракция 8 (конечный объем 4 мл): Бассейн 8-22-36-50
- Фракция 9 (конечный объем 4 мл): Бассейн 9-23-37-51
- Фракция 10 (конечный объем 4 мл): Бассейн 10-24-38-52
- Фракция 11 (конечный объем 4 мл): Бассейн 11-25-39-53
- Фракция 12 (конечный объем 4 мл): Бассейн 12-26-40-54
- Фракция 13 (конечный объем 4 мл): Бассейн 13-27-41-55
- Фракция 14 (конечный объем 4 мл): Бассейн 14-28-42-56
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмежное конкатенирование заключается в объединении фракций раннего, среднего и позднего элюирования, что позволяет увеличить неоднородность пептидного состава в пределах объединенных фракций. Следовательно, пептидная смесь каждой объединенной фракции эффективно разделяется с ограниченным соэлюированием в последующей нанопоточной низкопоточной хроматографии pH-RP-LC, непосредственно связанной с масс-спектрометром.
- Объедините дроби, собранные после градиента, в уникальную дробь с именем POST.
ПРИМЕЧАНИЕ: Путем включения фракций градиента PRE и POST получается в общей сложности 16 фракций в пробирках по 15 мл (см. Рисунок 3A). - Накройте трубки объемом 15 мл парафиновой пленкой и пробьете их иглой 20 г, чтобы создать 3-5 отверстий. Заморозьте их, инкубируя трубки центрифуги в сухом льду до тех пор, пока каждая фракция не будет полностью заморожена.
- Лиофилизируют фракции в течение примерно 48 ч. Убедитесь, что каждый образец полностью высушен перед остановкой сублимационной сушилки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь эксперимент можно приостановить, сохраняя лиофилизированные образцы при -80 °C.
7. Иммуноаффинное обогащение R-метилированным пептидом (ориентировочное время 2 дня)
- Проводят последовательное иммуноаффинное обогащение модифицированного пептида антипан-R-метилирующими антителами параллельно, но отдельно для двух образцов из диверсий Трипсина и ЛисаргиНазы соответственно. Буфер иммуноаффинной очистки (IAP) предоставляется компанией, закупающей антипан-R-метиловые антитела для обогащения модифицированного пептидного сродства (подробности приведены в Table Material and Reagents). Буфер IAP концентрируется 10x и должен быть разбавлен 10 раз перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер IAP 1x может храниться при температуре от -20 °C до 1 года. - Центрифугируйте лиофилизированные пептиды при 2000 х г в течение 5 мин на RT, чтобы раскрутить пептиды до дна трубки объемом 15 мл. Повторно суспендировать лиофилизированные пептиды с 250 мкл 1x IAP Buffer на 15 мл трубки и переносить в низкосвязанную трубку объемом 1,5 мл. Проверьте с помощью лакмусовой бумаги, составляет ли рН >6.
- Держите небольшую аликвоту (около 5% от объема) каждой фракции в качестве входных данных для последующего анализа МС.
- Разделите каждую фракцию на две аликвоты, чтобы параллельно выполнить иммунообогащение асимметрично-диметилированными (ADMA) и симметрично-диметилированными (SDMA) пептидами.
- Используйте три флакона с выбранными антипан-R-метилированными антителами, конъюгированными с белком А агарозными шариками на 10 мг исходного белкового экстракта.
- Подготовьте правильное количество антител, конъюгированных с шариками агарозы, центрифугируя каждый флакон по 2000 х г в течение 30 с и удаляя буфер из шариков. Мойте бусины три раза с 1 мл 1x PBS, всегда центрифугируя их при 2000 x g в течение 30 с.
- После последней промывки повторно суспендировать шарики по 40 мкл 1x PBS для каждого флакона; объединить их и окончательно разделить поровну на 16 фракций (так, чтобы к каждой фракции добавлялось 2,5 мкл бусин антител).
- Добавьте 250 мкл 1x IAP Buffer в каждую трубку, перемешайте путем инвертирования и дайте ему инкубироваться на вращающемся колесе в течение 2 ч при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смешайте образцы, перевернув трубки объемом 1,5 мл, а не пипетируя их микрокончиками, которые могут повредить шарики или привести к их потере. - После 2-часовой инкубации центрифугируют пробирки объемом 1,5 мл, содержащие пептиды и пан-R-метил-антитело-конъюгированные шарики по 2000 х г в течение 30 с, чтобы гранулировать шарики; переложить FT из каждой фракции в чистые трубки с низким связыванием объемом 1,5 мл.
- Добавьте шарики, конъюгированные с антителами против R-монометилирования (ММА) к FT и повторите шаги с 7,7 по 7,9.
- Во время инкубации пептидных образцов с MMA-шариками промывайте в два раза фракции, которые ранее были иммуноосаждены анти-ADMA и SDMA с буфером IAP 250 мкл (инвертируя, а не пипетирование), и выбрасывайте супернатант при каждой промывке.
- Повторите стирку с ЛК-МС степениН2О трижды.
- Элюируют аффинно-обогащенные симметрично и асимметрично R-диметилированные пептиды из шариков агарозы путем добавления 50 мкл 0,15% TFA в каждую трубку (сильные кислотные условия, по сути, денатурируют эпитоп, что приводит к высвобождению антигенов из антител). Оставьте этот раствор на 10 мин при РТ, переворачивая трубки каждые 2-3 мин.
- Переложить первое элюирование в чистые низкосвязующие пробирки объемом 1,5 мл и повторить элюирование с 50 мкл 0,15% TFA; объединить 2 фракции в одну трубку.
- Повторите шаги с 7.11 по 7.14 для R-монометилированных пептидов, которые инкубировали с анти-ММА антителами-шариками.
8. Обессоливание и концентрация обогащенных аффинностью метилпептидов микроколонками C18 (ориентировочное время требуется 30 минут)
- Уравновешивайте метанолом микроколонки C18-RP, изготовленные с помощью 3M твердофазных экстракционных картриджей для обессоливания и концентрации пептидов до анализаMS 19.
- Загружают образцы (соответствующие отдельным иммуноаффинным обогащенным фракциям и входным фракциям) на микроколонки C18 в два этапа (50 мкл + 50 мкл на каждую микроколонку C18) путем центрифугирования при 600 х г в течение 6 мин.
- Промывайте микроколонки буфером А 55 мкл (см. Таблицу 1 для буферного состава), всегда центрифугированием при температуре около 900 х г в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент здесь можно приостановить, оставив микроколонки C18-RP при 4 °C, где они могут храниться до 2 недель.
9. Повторное ферментативное сбраживание (ориентировочное время требуется 3 часа)
- Промыть микроколонки C18-RP 55 мкл буфера А (см. Таблицу 1 для буферной композиции) в течение двух раз, центрифугированием при температуре около 850 х г в течение 5 мин.
- Элюируют пептиды дважды с 20 мкл буфера В (см. Таблицу 1 для буферного состава) и объединяют две фракции.
- Высушите элюированные пептиды в вакуумном концентраторе (подробнее см. Таблицу Материал и реагенты ). Тем временем готовят раствор для пищеварения, состоящий из бикарбоната аммония 50 мМ, который разбавляют из свежеприготовленного 1 М запасного раствора (см. Таблицу 1).
- Добавьте трипсин или лисаргиназу к соответствующим образцам до конечной концентрации 25 нг/мкл. Инкубируйте каждый образец при 37 °C в течение 2 ч.
- Добавьте 1 мкл 5% TFA для остановки пищеварения; вихрь и вращение вниз образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ферментативное расщепление трипсином может ингибироваться на С-конце метилированных R и K, вызывая пропущенные расщепления, которые увеличивают длину и заряд пептида, которые, в свою очередь, производят сложные и неполные спектры фрагментации, препятствующие идентификации пептидов и сайт-специфической атрибуции участков метилирования. Было показано, что второе ферментативное сбраживание может снизить частоту таких пропущенных расщеплений с улучшенным охватом последовательностей и атрибуцией сайта20.
10. Обессоливание пептидов (ориентировочное время требуется 30 минут)
- Загрузите подкисленные пептидные растворы в новые микроколонки C18-RP, которые были ранее уравновешены, следуя тем же шагам, описанным в пункте 8.
- Пептид, загруженный на микроколонки C18-RP, может храниться при 4 °C до элюирования для анализа LC-MS/MS.
11. Анализ жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS) (индикативное время 5 дней)
- Элюируют пептиды из микроколонок C18-RP, пропуская 10 мкл буфера B, центрифугируя при 615 х г в течение 5 минут при RT. Повторите этот шаг дважды и объедините элюаты.
- Уменьшите объем элюатов в вакуумном концентраторе до тех пор, пока они не станут почти сухими, избегая чрезмерного высыхания.
- Повторно приостановить пептиды в 10 мкл буфера А для анализа LC-MS/MS.
- Анализ каждой фракции R-метилпептидов методом жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS) в масс-спектрометре высокого разрешения (см. Таблицу материалов) в сочетании с системой нанопоточной сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии (UHPLC). Задайте параметры прибора, как описано в таблице 2.
- Загрузите 2 мкл каждого образца на наноаналитическую колонну (легкая распылительная колонна внутреннего диаметра 75 мкм, длина 25 см), упакованную смолой C18-RP (размер частиц 2 мкм).
- Образцы пропускают через наноколонку C18 RP со скоростью потока 300 нЛ/мин, со следующим линейным градиентом: 3%-30% B в течение 89 мин, 30%-60% B в течение 5 мин, 60%-95% B в течение 1 мин и 95% B в течение 5 мин.
- Масс-спектрометр работает в режиме data-dependent acquisition (DDA) для автоматического переключения между полным сканированием MS и MS/MS acquisition. Установите обзор полного сканирования МС для анализа в спектрометрическом детекторе с разрешением R = 70 000. Пятнадцать наиболее интенсивных пептидных ионов последовательно выделяются до целевого значения 3 х 106 и фрагментируются относительной энергией столкновения 28%. Установите максимально допустимое время накопления ионов равным 20 мс для полного сканирования и 50 мс для MS/MS и установите целевое значение для MSMS равным 1 x 106. Время динамического исключения установлено равным 20 с.
12. Выполнение анализа данных MaxQuant и hmSEEKER
- По завершении запусков LC-MS/MS импортируйте необработанные данные MS в поисковую систему пептидов для идентификации метилпептидов с помощью вероятностного подхода по справочной базе данных. В этом протоколе для нашего анализа использовался MaxQuant версии 1.6.2.10. MaxQuant требует минимум 2 ГБ ОЗУ для запуска, а также достаточно места на диске для хранения всех необработанных данных и всех выходных файлов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к официальной документации по адресу https://www.maxquant.org для получения всех подробностей об установке и требованиях к оборудованию и программному обеспечению. - Дублируйте каждый файл необработанных данных. Переименуйте оригиналы, добавив «_light» к их имени, а затем переименуйте копии, добавив «_heavy».
ПРИМЕЧАНИЕ: hmSEEKER, скрипт для последующего анализа, чувствителен к регистру. - Запустите поиск MaxQuant/Andromeda для идентификации пептидов с настройками, указанными в таблице 3. Из нескольких выходных данных, полученных MaxQuant, для этапа постобработки требуются только файлы allPeptides.txt и msms.txt (расположенные во вложенной папке combined/txt).
- Постобработка выходных данных MaxQuant осуществляется алгоритмом hmSEEKER. Скачать hmSEEKER с: https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. Скрипт доступен в виде записной книжки Jupyter, написанной на Python 3.7, и поставляется с образцом набора данных для тестирования. Для новых пользователей желательно скачать и установить платформу Anaconda (https://www.anaconda.com/products/individual). Последняя версия включает в себя по умолчанию Python 3.8, Jupyter и все пакеты, необходимые для запуска hmSEEKER (например, Scikit-learn 0.23.1).
- Создайте папку и сохраните в ней файлы allPeptides.txt и msms.txt из выходных данных MaxQuant.
- Запустите Jupyter (из командной строки или из навигатора Anaconda).
- Перейдите в папку hmSEEKER и откройте файл hmSEEKER.ipynb.
- В разделе Входные параметры записной книжки укажите пути к базе данных FASTA и к папкам, содержащим текстовые файлы MaxQuant.
- Запустите код внутри каждой ячейки, выбрав ячейку и нажав кнопку Play в верхней части интерфейса Jupyter.
- Сценарий создает выходной файл с разделителями-запятыми для каждого анализируемого набора данных, а также объединенный файл. Окончательный список дублетов можно найти в файле с именем "[дата]-[время]-combined_hmSILAC_doublets_HxL_summary.csv"
(Таблица 4 содержит краткое описание столбцов в выходной таблице).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В статье описан рабочий процесс для высокодоверной идентификации глобального R-метилирования белка, который основан на сочетании ферментативного переваривания белкового экстракта с двумя различными протеазами параллельно, с последующим фракционированием жидкой хроматографии HpH-RP протеолитических пептидов и иммуноаффинным обогащением R-метил-пептидов анти-пан-R-метиловыми антителами (рисунок 1).
Клетки выращивали в присутствии метионина, либо природного (Light, L, Met-0), либо изотопно меченого (Heavy, H, Met-4). После полной изотопной маркировки, которая была проверена анализом MS на небольшой аликвоте экстракта Met-4, тяжелые и легкие клетки были собраны и смешаны в пропорции 1: 1 л / ч, как показано на рисунке 1A. После метаболической маркировки 13CD 3-метионина метильные группы добавляются к белковой основе из метил-донора S-аденозил-метионина (SAM) и будут присутствовать либо в легкой, либо в тяжелой изотопной форме21. На фиг.1В описана реакция метилирования аргинина, осуществляемая семейством белковых аргининметилтрансфераз (PRMT), которые катализируют перенос метильной группы из S-аденозилметионина (SAM) в гуанидиновый азот аргинина. Если поместить одну метильную группу на один из концевых атомов азота аргинина, получают монометилированный аргинин (ММА). Если к одному и тому же атому азота группы гуанидино добавляют две метильные группы, образуется асимметричный диметилированный аргинин (ADMA), в то время как если две метильные группы помещают на два разных атома азота, образуется симметричный диметилированный аргинин (SDMA).
После смешивания в соотношении 1:1 легко- и тяжело меченых клеток белки экстрагировали и подвергали перевариванию трипсином и лисаргиназой параллельно. Как показано на рисунке 2, окрашенный гелем SDS-PAGE Coomassie использовался для проверки эффективного ферментативного сбраживания общих белков в пептидах (сравните полосы I и II). Кроме того, оценивали эффективность этапа очистки, выполненного колонной C18 Sep-Pak, подтверждая отсутствие пептидов в проточной колонне C18 (Рисунок 2, полоса III) и в первой и второй промывке (Фиг.2 полосы IV и V соответственно), с их ожидаемым присутствием в элюате (Фиг.2, полоса VI). Оценивалось правильное включение Met-4 в тяжелый канал (рисунок 2B) и правильное смешивание 1:1 H/L (рисунок 2C).
На фиг.3 показана хроматограмма из автономного hpH-RP жидкостного хроматографического фракционирования пептидов и последующего несмежного конкатенирования фракций. Пептиды были обнаружены 215 нм УФ, в то время как непереваренные белки, потенциально оставшиеся, были оценены 280 нм УФ. Под хроматограммой схематизирована стратегия объединения фракций, чтобы уменьшить 70 начальных фракций до конечных 16, включая фракции градиента PRE и POST.
Антипан-R-метиловые антитела использовали для обогащения R-метил-пептидов. Эти антитела распознают три типа R-метилирования (MMA, SDMA и ADMA), и они коммерчески доступны как непосредственно конъюгированные с шариками агарозы (см. Таблицу материал и реагенты для деталей). В таблице 1 перечислены все буферы и решения, используемые в этом протоколе.
После получения каждые необработанные данные MS были проанализированы дважды с помощью MaxQuant, чтобы идентифицировать легкие и тяжелые метилирования в разных поисковых группах, с обоснованием, что метилпептиды (тяжелые и легкие) будут идентифицированы только в определенной группе. Поиск тяжелых и легких метилирования по отдельности улучшает анализ за счет уменьшения числа вводимых переменных модификаций и снижения риска ложноположительных смешанных меченых пептидов. После того, как MaxQuant назначил метил-сайты, hmSEEKER анализирует свою выходную таблицу для реконструкции возможных пар пиков тяжелого света13.
Рисунки 4 и 5 иллюстрируют полные спектры MS пептидов FELTGIPPAPR(me) (4) и NPPGFAFVEFEDPR(me) (5), которые представляют собой истинно положительную и ложноположительную метилпептидную аннотацию соответственно. На фиг.4 различия m/z, наблюдаемые между тремя пиками, согласуются с наличием ферментативно метилированного остатка (7,0082 Th между немодифицированным и легкометилированным; 2,0102 Th между легкой и тяжелой формами метил-пептида). Полученные дублеты hmSILAC имеют ME 0,40 ppm, dRT 0,00 мин и LogRatio -0,41; эти значения ниже пороговых значений по умолчанию, используемых hmSEEKER для различения истинных и ложных дублетов, которые ранее оценивались следующим образом: | Я| < 2 стр/мин, |дРТ| < 0,5 мин, и | ЛогРатио| < 1. Во втором случае, показанном на фиг.5, разница m/z, наблюдаемая между легкометилированным пептидом и его предполагаемым тяжелым аналогом, отклоняется от ожидаемого значения на 0,0312 Th (ME = -37,28 ppm). Кроме того, этот дублет имеет LogRatio 2,50, что находится за пределами интервала прогнозирования LogRatio по умолчанию (эти пороговые значения были определены и обсуждены в13). Фактически, в спектре MS/MS последовательность пептида NPPGFAFVEFEDPR(me) оказалась не полностью покрытой, и назначенное R-метилирование может быть интерпретировано также как метилэтерификация на глутамате или аспартате, близком к R.
Рабочий процесс hmSEEKER схематизирован на рисунке 6, тогда как в таблице 4 приводится описание выходной таблицы, полученной с помощью этого инструмента, чтобы помочь интерпретации результатов: пептиды, которые несут несколько модификаций, появляются несколько раз, каждая запись соответствует другому событию метилирования на данном пептиде; наконец, пиковые дублеты делятся на три класса: подобранные дублеты являются наиболее уверенными, так как пептид был фрагментирован и идентифицирован как в тяжелой, так и в легкой форме.
Рисунок 1: Схема экспериментального рабочего процесса и ферментативных белково-R-метилирующих реакций. (A) Схема рабочего процесса биохимического протокола. Клетки выращивают в легкой (Мет-0) и тяжелой (Мет-4) метионинсодержащей среде не менее 8 удвоений, а легкие и тяжелые каналы смешивают в пропорции 1:1. Белки экстрагируют и подвергают перевариванию трипсином или лисаргиназой параллельно и фракционируют с помощью автономной жидкой хроматографии HpH-RP путем сбора 70 фракций, окончательно объединенных в 16 фракций. R-метилпептиды обогащены антипан-R-метиловыми антителами, конъюгированными с шариками агарозы, которые подверглись второму ферментативному перевариванию (трипсин или лисаргиназа соответственно), и анализируются LC-MS/MS. Исходные данные MS обрабатываются алгоритмом MaxQuant для идентификации пептидов и PTM. Выходные данные MaxQuant затем представляются для анализа биоинформационным инструментом hmSEEKER, разработанным собственными силами для тяжелой и легкой метилпептидной ассоциации. (B) Схема реакции R-метилирования. Гуанидиновая группа аргинина может быть модифицирована добавлением одной метильной группы, продуцирующей монометилированный аргинин (ММА), или добавлением двух метильных групп, продуцирующих либо симметричный (SDMA), либо асимметричный (ADMA) диметилированный аргинин. Реакция катализируется ферментами семейства белков аргининметилтрансфераз (PRMTs), которые переносят эти метильные группы из S-аденозил-метионина (SAM). После переноса метильной группы SAM восстанавливается до S-аденозилгомоцистеина (SAH). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Управление критическими шагами протокола. (А) SDS-PAGE Гель, окрашенный Кумасси, для оценки эффективности протеолитического пищеварения. MW: молекулярно-весовые маркеры. I) 20 мкг общего H/L белкового экстракта до переваривания, количественно определяемого BCA; II) переваренные пептиды, загруженные в той же пропорции, что и в I; III) Проточный картридж C18, заряженный в той же пропорции, что и полоса I; IV-V) первая и вторая промывка картриджа C18 с буфером A, загруженным в той же пропорции, что и I; VI) элюируется из патрона C18, заряженного в той же пропорции, что и I. (B) Анализ скорости включения Met-4. Включение Мет-4 в тяжелый канал оценивается по собственному сценарию (доступен на https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/); rate = 1 указывает на полное включение (C) гауссовского распределения соотношений H/L для оценки смешивания 1:1. Нормальное распределение соотношения Log2 H/L построено с учетом ±2σ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Схема конкатенации фракций HpH и оценка обогащения репрезентативных R-метилированных пептидов. (A) Хроматограмма фракционирования с обратной фазой с высоким рН и схема конкатенации несмежной фракции. Хроматограмма представляет собой профиль разделения HpH-RP пептидов, обнаруженных при 215 нм УФ (синяя линия), в то время как присутствие непереваренных белков отслеживалось в УФ-канале 280 нм (красная линия). Светло-зеленая линия представляет концентрацию буфера B вдоль хроматографического пробега. Представлена схема объединения дробей, изображающая стратегию несмежной конкатенации ранних, средних и поздних элюирующих фракций от 70 до 16, включая фракции градиента PRE и POST. (B) Репрезентативная таблица, содержащая краткую информацию об обогащении R-метилированных пептидов. В таблице резюмируется общее количество пептидов и относительный процент обогащения R-метилированием, сравнивая каждый IP на его входе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Пример истинного дублета hmSILAC. Масс-спектр истинного положительного дублета. Показанные пики соответствуют пептиду FELTGIPPAPR в немодифицированной, легкой монометилированной (CH3) и тяжелой монометилированной (13CD3) формах, с зарядом 2+. Различия в m/z, наблюдаемые между тремя пиками, согласуются с наличием ферментативно метилированного остатка. Таблица под массовым спектром представляет выход hmSEEKER и содержит параметры LogRatio, ME и dRT дублета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Пример ложного дублета hmSILAC. Массовый спектр отрицательного in vivo метилпептидного назначения. Пики при 811,3849 м/з и 818,3927 м/з соответствуют немодифицированным и легким монометилированным формам пептида NPPGFAFVEFEDPR, с зарядом 2+. Третий пик может быть назначен тяжелым метильным аналогом легкого метилированного пептида, но наблюдаемый сдвиг m/z отличается от ожидаемого сдвига на 0,0312 Th, что исключает эту возможность. Таблица под массовым спектром представляет выход hmSEEKER и содержит параметры LogRatio, ME и dRT дублета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Схематическое представление рабочего процесса анализа данных. (A) MaxQuant обнаруживает пики MS1 в необработанных данных. (B) Пики со связанным спектром MS2 обрабатываются поисковой системой базы данных Andromeda для получения пептидной идентификации. (C) hmSEEKER считывает идентификацию пептидов MaxQuant и извлекает метилпептиды с оценкой Андромеды > 25, дельта-оценкой > 12 и модификациями с вероятностью локализации > 0,75. (D) Для каждого метилпептида, который проходит фильтрацию качества, hmSEEKER находит соответствующий ему пик MS1 в таблице MaxQuant allPeptides, а затем ищет его аналог в той же таблице. E) дублет пиков определяется разницей во времени их удержания (RT), коэффициенте их интенсивности (LogRatio) и отклонении между ожидаемой и наблюдаемой дельта-массой (ME); эти три параметра используются hmSEEKER для отличия истинных положительных результатов от ложных срабатываний, как обсуждалось13. F) наконец, hmSEEKER составляет списки избыточных и неизбыточных дублетов; первый включает прогнозы для всех метилпептидов, в то время как второй фильтруется таким образом, что при многократном выявлении пептида сообщается только о лучшем баллообразующем дублете. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Буфер | Том | Состав |
| Раствор L-метионина (L) | 10мл | 30 мг/мл лайт-метионина в сверхчистой воде |
| Раствор L-метионина (H) | 10мл | 30 мг/мл тяжелого метионина в сверхчистой воде |
| Среда для клеточной культуры | 500мл | DMEM со стабилизированным глютамином и без метионина, 10% (v/v) диализированный FBS, 1% (v/v) P/S, 1:1000 (v/v) раствор L-метионина |
| Буфер лизиса | 50мл | 9M мочевина, 20mM HEPES pH 8,0;1% (v/v) ингибитор протеазы; 1% (v/v) ингибитор фосфатазы в сверхчистой воде |
| Раствор бикарбоната аммония (AMBIC) | 50мл | 1M (NH4)2CO3 в сверхчистой воде |
| Решение DTT | 10мл | 1,25 М DTT в сверхчистой воде |
| Решение IAA | 5мл | 109mM в сверхчистой воде |
| Растворитель А для Sep-Pak C18 | 50мл | 0,1% TFA в сверхчистой воде |
| Растворитель B для Sep-Pak C18 | 50мл | 0,1% TFA + 40% ACN в сверхчистой воде |
| Моющий раствор для Sep-Pak C18 | 50мл | 0,1% TFA + 5% ACN в сверхчистой воде |
| Буфер A для фракционирования HpH | 500мл | 25 мМ NH4OH в сверхчистой воде |
| Буфер B для фракционирования HpH | 500мл | 25 мМ NH4OH+ 90% ACN в сверхчистой воде |
| Буфер привязки IP 1x | 5мл | дилюит 1:10 (v/v) в сверхчистой воде из 10x коммерчески складского раствора |
| Буфер элюирования IP | 50мл | 0,15% TFA в сверхчистой воде |
| Буфер A для подсказок рабочей области | 50мл | 0,1% TFA в сверхчистой воде |
| Буфер B для каскадных подсказок | 50мл | 0,1% TFA + 40% ACN в сверхчистой воде |
| Буфер C для каскадных подсказок | 50мл | 0,1% TFA + 50% ACN в сверхчистой воде |
| MS Растворитель А | 250мл | 0,1% FA в сверхчистой воде |
| MS Растворитель B | 250мл | 0,1% FA + 80% ACN в сверхчистой воде |
| Коктейль ингибиторов протеазы | 5 мл | cУплетовые таблетки ингибитора протеазы без ЭДТА (ROCHE), растворенные в сверхчистой воде в соответствии с инструкцией по изготовлению |
| Коктейль ингибиторов фосфатазы | 5 мл | Таблетки ФосСТОП (РОШ), растворенные в сверхчистой воде в соответствии с инструкцией по изготовлению |
Таблица 1: Состав буферов и растворов. Списки буферов и решений, используемых в этом протоколе.
| Параметры | Ценность |
| Загрузка образцов (uL) | 2 |
| Расход загрузки (мкл/мин) | 10 |
| Градиентный расход (нл/мин) | 300 |
| Линейный градиент | 3-30% B в течение 89 мин, 30-60% B в течение 5 мин, 60-95% B в течение 1 мин, 95% B в течение 5 мин |
| Полное разрешение сканирования | 70,000 |
| Количество отобранных наиболее интенсивных ионов | 15 |
| Относительная энергия столкновения (%) (CID) | 28 |
| Динамическое исключение (ы) | 20.0 |
Таблица 2: Настройка LC-MS/MS. Параметры, применяемые для анализа LC-MS/MS R-метилпептидов на масс-спектрометре высокого разрешения Quadrupole-Orbitrap, соединенном с нанопоточной сверхвысокоэффективной системой жидкостной хроматографии (UHPLC).
| Настройки параметров MQ (версия 1.6.2.10) | |||
| Оправа | Действие | ||
| Конфигурация | |||
| Изменения | Мет4 | Добавьте новую модификацию. Установите для параметра Композиция значение H(-3) Hx(3) Cx C(-1) и выберите M в качестве специфики. | |
| Метил4 (KR) | Продублируйте "Метил (KR)", переименуйте его и измените состав на Cx H(-1) Hx(3) | ||
| Диметил4 (KR) | Дублируйте "Диметил (KR)", переименуйте его и измените состав на H(-2) Hx(6) Cx(2) | ||
| Триметил4 (К) | Продублируйте "Триметил (K)", переименуйте его и измените состав на Cx(3) H(-3) Hx(9) | ||
| ОксМет4 | Продублируйте "Окисление (М)" и переименуйте его. | ||
| Протеаз | Лисаргиназа | Добавьте новую протеазу. Выберите столбцы 'R' и 'K'. | |
| При создании нового PTM или протеазы нажмите «Изменить таблицу», чтобы изменить настройки MaxQuant, а затем «Сохранить изменения», чтобы подтвердить изменения. Перезапустите MaxQuant, и новые параметры будут видны. | |||
| Вкладка "Необработанные файлы" | |||
| Группа параметров | Разделите необработанные файлы на 2 группы (0 и 1) | ||
| Параметры, специфичные для группы | |||
| Тип | Тип | Стандарт | |
| Многочисленность | 1 | ||
| Пищеварение | Фермент | Трипсин или лисаргиназа | |
| Макс. Пропущенные декольте | Установите значение 3 | ||
| Изменения | Изменения переменных | Группа 0 | Окисление (M), метил (KR), диметил (KR), триметил (K) |
| Группа 1 | OxMet4, метил4 (KR), диметил4 (KR), триметил4 (K) | ||
| Исправлены изменения | Группа 0 | Карбамидометилирование | |
| Группа 1 | Карбамидометилирование и Met4 | ||
| Глобальные параметры | |||
| Последовательности | Файлы Fasta | Загрузить файл FASTA | |
| Идентификация | ПСМ Рузвельт | Установите значение 0,01 | |
| Минимальный балл для модифицированных пептидов | Установите значение 1 | ||
| Минимальная дельта-оценка для модифицированных пептидов | Установите значение 1 | ||
| Расширенная идентификация | Второй поиск пептидов | Отметьте | |
| Таблицы | Запишите всю таблицу Peptides | Проверка | |
| Продвинутый | Вычисление пиковых свойств | Проверка | |
| Если он не указан, оставьте параметр по умолчанию. | |||
| Настройки параметров MQ для теста включения | |||
| Параметры, специфичные для группы | |||
| Тип | Тип | Стандарт | |
| Многочисленность | 2 | ||
| Макс Маркированный | 5 | ||
| Тяжелая этикетка | Выберите Met4 | ||
| Пищеварение | Фермент | Трипсин или лисаргиназа | |
| Макс. Пропущенные декольте | Установите значение 3 | ||
| Изменения | Изменения переменных | Окисление (М) | |
| Исправлены изменения | Карбамидометилирование | ||
| Если он не указан, оставьте параметр по умолчанию. | |||
Таблица 3: Параметры обработки MaxQuant. Перечислены групповые и глобальные параметры, адаптированные к конкретному описанному эксперименту. Все остальные параметры установлены по умолчанию, в зависимости от используемой версии программы.
| Имя столбца | Приметы:__________ |
| Необработанный файл | Файл необработанных данных, в котором был идентифицирован дублет |
| H-сканирование | Номер сканирования тяжелого аналога |
| L-сканирование | Номер сканирования светового аналога |
| .CLASS | Может иметь 3 значения: |
| Matched = Тяжелые и легкие пептиды идентифицируются с одной и той же последовательностью | |
| Несоответствие = Тяжелые и легкие пептиды имеют одинаковую последовательность aa, но существует несоответствие в локализации метилированного сайта | |
| Спасено = идентифицирован только один пептид в дублете; его аналогом является неопознанный пик. | |
| ПЕПТИД | Пептидная последовательность |
| СЧЁТ | Пептид Андромеды Оценка |
| ВИЭ | Модифицированный остаток |
| POS | Положение модифицированного остатка |
| МОДУЛЬ | Модификация |
| СВИНЦОВЫЙ БЕЛОК | Белок, к которому относится пептид |
| ГЕН | Название гена, соответствующее белку |
| PROBABILITY_TRUE | Вероятность того, что дублет является истинным дублетом hmSILAC, вычисляемая по модели логистической регрессии |
| ПРЕДСКАЗАНИЕ | 1, если дублет является предполагаемым истинным, 0, если он ложный |
| H/L LOGRATIO | Log2 соотношения интенсивности света и тяжелой нагрузки |
| МЕНЯ | Отклонение между ожидаемой и наблюдаемой разницей масс |
| ДРТ | Разница во времени хранения |
Таблица 4: Описание выходных результатов hmSEEKER. Список записей столбцов в выходной таблице hmSEEKER с кратким описанием их содержимого.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Высоконадежная идентификация метилирования белка/пептида in vivo глобальной протеомикой на основе РС является сложной задачей из-за риска высокого FDR, с несколькими аминокислотными замещениями и метилэтерификацией, происходящими во время подготовки образца, которые являются изобарическими для метилирования и могут вызвать неправильные назначения в отсутствие ортогональных стратегий валидации РС. Субстохиометрический характер этого ПТМ еще больше усложняет задачу глобальной метилпротеомики, но может быть преодолен селективным обогащением модифицированными пептидами10.
Здесь представлен биохимический и аналитический рабочий процесс, который призван повысить эффективность и надежность глобального MS-анализа R-метил-пептидов за счет применения стратегии hmSILAC в сочетании с фракционированием пептидов хроматографии HpH-RP и аффинно-обогащением анти-пан-R-метил-пептидными наборами антител. Первая стратегия позволяет ортогональную валидацию метилпептидов и значительно снижает FDR идентификации, в то время как второй протокол повышает их обнаруживаемость на фоне немодифицированных пептидов22. Однако ограничением этого протокола является требование очень большого количества исходного белкового экстракта (в диапазоне 20-40 мг) в качестве входа для последующего фракционирования пептидов и обогащения аффинности, что ограничивает применение метода увековеченными, быстрорастущими клеточными линиями, которые могут быть широко расширены. Вместо этого текущая установка не применима к первичным клеткам или тканям, полученным от пациента. Будущие исследования должны быть направлены на совершенствование протокола в этом направлении: дополнительные стратегии биохимического обогащения метилированного пептида над немодифицированными могли бы позволить обойти использование антител, что позволило бы сократить масштабы экспериментов. Еще одна интересная разработка может быть представлена сочетанием современных методов с химической модификацией протеолитических пептидов с изобарическими или тандемными масс-метками, с двойными потенциальными преимуществами: с одной стороны, возможность объединения нескольких условий в одном эксперименте, таким образом мультиплексируя относительную количественную оценку метилпротеомных изменений при различных возмущениях; с другой стороны, объединение различных образцов в один до хроматографического фракционирования и аффинного обогащения может позволить уменьшить масштаб отдельных экспериментов.
Этот протокол опирается на два отдельных переваривания цельноклеточного экстракта параллельно с трипсином и лисаргиназой. Трипсин расщепляет пептидную связь на С-концевой стороне остатков K и R, генерируя пептиды, которые представляют собой положительно заряженный остаток на С-конце, в дополнение к N-концевому положительному заряду от α-амина23. Фермент LysargiNase селективно гидролизует пептидил-K и -R-связи, генерируя пептиды, которые несут K или R на N-концевом участке, который может включать K-метилированные формы. Использование обеих протеаз увеличивает общий охват протеомов при крупномасштабном РС-анализе, что приводит к идентификации пептидов, в конечном итоге пропущенных при одном триптическом пищеварении18. Двойное ферментативное сбраживание, вместо этого, проводится для уменьшения количества возможных пропущенных ферментативных расщеплений. На самом деле, метилирование K и R сильно снижает эффективность расщепления белка трипсином. Несмотря на эту меру предосторожности, метилированные пептиды по-прежнему являются более длинными и содержат пропущенные расщепления, которые приводят к плохой фрагментации CID.
Использование другого типа фрагментации, такого как диссоциация переноса электронов (ETD), может решить эту проблему. На самом деле, ETD обычно не фрагментирует дважды заряженные пептидные ионы эффективно, как это делает CID, но он обеспечивает довольно равномерное расщепление предшественников пептидов с более высокими зарядовыми состояниями (≥3). Это может быть преимуществом в случае R-метилирования, поскольку оно часто происходит в богатых аргинином доменах, которые содержат множественные и соседние R-остатки. Однако ETD имеет более низкую скорость сканирования, чем CID, поэтому общее количество идентификаций пептидов снижаетсяна 24,25,26.
В последнее время несколько протоколов, которые включают обогащение посттрансляционно модифицированных пептидов, были соединены с различными стратегиями разделения хроматографии, которые помогают снизить сложность пептидной смеси, тем самым повышая общую эффективность обнаружения модифицированных пептидов при РС. Здесь применяется хроматографическое фракционирование HpH-RP в сочетании с несмежной конкатенцией фракций. Оффлайн-фракционирование пептидов, основанное на хроматографии с обратной фазой с высоким рН, отображает разделение с высокой разрешающей способностью, которое ортогонально онлайн-разделению RP с низким рН, осуществляемому вниз по потоку во время запуска LC-MS/ MS27. Кроме того, стратегия несмежной конкатенации имеет два основных преимущества: во-первых, она увеличивает белковый покров за счет объединения ранних, средних и поздних элюирующих фракций в отдельные сцепленные фракции, сохраняя неоднородность пептидной смеси. Во-вторых, конкатенация уменьшает последующий анализ времени выполнения MS, получая меньшее количество фракций выборки28.
Из-за субстохиометрической природы R-метилирования необходима стадия обогащения, чтобы облегчить обнаружение метилпептидов в глобальном MS-анализе модификационных протеомов. В этом протоколе метилпептиды обогащаются иммуноаффинным осаждением (IAP) с использованием антител anti-SDMA и anti-ADMA параллельно, в то время как иммунопреципитация монометилпептидов с использованием анти-MMA антител проводится на FT из предыдущих экспериментов IAP. Этот порядок отражает различную эффективность этих антител: анти-SDMA и анти-ADMA антитела имеют более низкую эффективность связывания по сравнению с анти-ММА антителами. Примечательно, что эта различная эффективность может также вызывать смещения в представлении различных степеней R-метилирования в модификационных протеомах, экспериментально аннотированных29.
До коммерческой доступности антипан-R-метилирующих антител применялись другие стратегии разделения для повышения обнаружения R-метилированных пептидов с помощью MS, такие как хроматография сильного катионного обмена (SCX) и гидрофильного взаимодействия (HILIC). Несмотря на то, что эти методы могли снизить сложность пептидной смеси, анализируемой при РС, они существенно не улучшили идентификацию метилпептидов 30,31,32,33.
Несмотря на все эти технические и аналитические решения, направленные на увеличение разделения, обнаружения, фрагментации и аннотации последовательностей метилпептидов, охват метилпротеома по-прежнему ограничен и смещен в сторону более распространенных метилированных белков, таких как рибонуклеопротеин, РНК-связывающие геликазы, в то время как несколько известных низкообильных модифицированных белков (например, TP53BP1, CHTF8, MCM2) обнаруживаются только случайно и ненадежно в ходе нескольких глобальных экспериментов34 . Субклеточное фракционирование, применяемое до текущего рабочего процесса, может улучшить обнаружение таких белков; однако требуемая в настоящее время экспериментальная шкала не делает это жизнеспособной альтернативой.
При MS необработанные данные анализируются с помощью алгоритма MaxQuant для идентификации пептидов и PTM. Анализ данных экспериментов hmSILAC, однако, не является простым со стандартными алгоритмами поиска. Например, в то время как MaxQuant может эффективно анализировать стандартные эксперименты SILAC на основе метаболической маркировки с изотопно кодированными K и R, он не работает эффективно, когда изотопная маркировка кодируется в переменную PTM, как в случае тяжелой метильной маркировки, которая приводит к тяжелому метилированию. Поэтому стратегия, принятая здесь, заключается в том, чтобы сначала проанализировать данные hmSILAC с помощью MaxQuant без использования встроенной функциональности поиска дублетов, чтобы легкие и тяжелые пептиды могли быть идентифицированы независимо; затем они сопоставляются с программным обеспечением для постобработки. Этот биоинформатический рабочий процесс также имеет свои подводные камни, так как необходимо указать метилирования как в тяжелой, так и в легкой формах на панели Variable Modifications MaxQuant, в результате чего также включено в общей сложности восемь переменных модификаций, когда также включено окисление метионина (тяжелое и легкое). Поиск слишком большого количества PTM с помощью поисковой системы базы данных, такой как MaxQuant /Andromeda, непрактичен, поскольку это приводит к экспоненциальному увеличению теоретических пептидов, которые алгоритм должен тестировать: наше решение состояло в том, чтобы проанализировать каждые необработанные данные MS дважды, с различными наборами переменных PTM (через функцию групп параметров MaxQuant). После поиска пептидов используется собственный инструмент hmSEEKER для поддержки назначения пар пептидов тяжелого-легкого света из выходных таблиц, полученных MaxQuant. Первый релиз алгоритма hmSEEKER был недавно опубликован13, где было показано, что hmSEEKER может идентифицировать дублеты hmSILAC с FDR < 1%. Ложные срабатывания все еще могут возникать из пар пиков, которые случайно имеют разность масс, кратную 4,02 Да, но это очень маловероятно для дублетов, классифицированных как совпадающие или несоответствующие, в свете следующих фактов: чтобы сопоставленный или несоответствующий дублет был ложным, Андромеда должна неправильно определить последовательность как тяжелого, так и легкого аналога. Предполагая, что поисковая система была запущена с параметрами по умолчанию, каждая идентификация имеет 1% вероятность быть неправильной. Таким образом, вероятность того, что аналог hmSILAC также будет некорректным, составляет 0,01%.
Одна из ловушек hmSILAC заключается в том, что пептиды, содержащие метионин в их позвоночнике, также генерируют дублеты, которые неотличимы от тех, которые генерируются метилпептидами. Тем не менее, по нашему опыту, это не должно представлять собой серьезную проблему, во-первых, потому что пептиды без метилирования могут быть просто выброшены из выхода MaxQuant и, во-вторых, потому что hmSEEKER автоматически учитывает любой остаток метионина в метилпептиде при расчете ожидаемой разницы масс; Наконец, этот риск также исключается тем фактом, что тяжелые и легкие модификации ищутся в отдельных группах параметров, так что поисковая система не может разделить тяжелое монометилирование (+18,03 Да) на легкое монометилирование плюс тяжелый метионин (14,01 + 4,02 Да).
Более формальное и экспериментальное решение этой проблемы было предложено Оресте Акуто и его сотрудниками, которые разработали вариант hmSILAC, названный изометионин метил-SILAC (iMethyl-SILAC)22. В этом альтернативном протоколе метаболической маркировки метионин естественного света заменяется [13C4]-метионином, который имеет ту же массу, что и [13CD3]-метионин (Met-4), но он не производит стабильные изотопно-кодированные метил-группы из-за различного распределения тяжелых изотопов внутри молекулярной метки. Таким образом, в экспериментах iMethyl-SILAC немодифицированные метионинсодержащие пептиды не генерируют дублеты. Однако следует отметить, что когда Acuto и его коллеги сравнивали производительность iMethyl-SILAC и традиционного hmSILAC, эти два метода по-прежнему отображали очень похожие FDR.
Возможным ограничением hmSEEKER является то, что он предназначен для работы непосредственно с выходными таблицами MaxQuant, так что его исходный код не совместим с другими поисковыми системами, чьи выходные файлы структурированы по-разному; в этом смысле MethylQuant35 предоставляет хороший альтернативный биоинформационный инструмент, который специально разработан для прямого анализа необработанных данных MS из экспериментов типа hmSILAC и является более гибким с точки зрения предоставляемых входных файлов. В настоящее время разрабатывается модель машинного обучения, позволяющая различать истинные и ложные метилпептидные дублеты H/L, не полагаясь на определяемые пользователем пороговые значения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
MM и EM являются аспирантами Европейской школы молекулярной медицины (SEMM). EM является получателем 3-летней стипендии FIRC-AIRC (Код проекта: 22506). Глобальные анализы R-метил-протеомов в группе туберкулеза поддерживаются грантом AIRC IG (Код проекта: 21834).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate (AMBIC) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 497363 | |
| C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) | Waters | WAT036905 | |
| Colloidal Coomassie staining Instant | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
| cOmplete Mini, EDTA-free | Roche-Sigma Aldrich | 11836170001 | Protease Inhibitor |
| Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
| DMEM Medium | GIBCO ThermoFisher | requested | with stabile glutamine and without methionine |
| EASY-nano LC 1200 chromatography system | ThermoFisher | ||
| EASY-Spray HPLC Columns | ThermoFisher | ES907 | |
| Glycerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | 144-48-9 | |
| Jupiter C12-RP column | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M5308 | Light (L) Methionine |
| L-Methionine-(methyl-13C,d3) | Sigma-Aldrich | 299154 | Heavy (H) Methionine |
| LysargiNase | Merck Millipore | EMS0008 | |
| Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 | Branson | ||
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
| PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | 4906837001 | Phosphatase Inhibitor |
| Pierce C18 Tips | ThermoFisher | 87782 | |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85175 | LC-MS Solvent B |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85170 | LC-MS Solvent A |
| Pierce Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade | ThermoFisher | 51101 | |
| Pierce Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 51140 | |
| Polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 92560 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610373 | |
| PTMScan antibodies α-ADMA | Cell Signaling Technology | 13474 | |
| PTMScan antibodies α-MMA | Cell Signaling Technology | 12235 | |
| PTMScan antibodies α-SDMA | Cell Signaling Technology | 13563 | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | ||
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf | Speed vac |
References
- Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
- Blanc, R. S., Richard, S.
- Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
- Yang, Y., Bedford, M. T.
- Bezzi, M., et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes & Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).
- Auclair, Y., Richard, S. The role of arginine methylation in the DNA damage response. DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).
- Spadotto, V., et al. PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).
- Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
- Ong, S. -E., Mittler, G., Mann, M. Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC. Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).
- Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
- Larsen, S. C., et al. Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells. Science Signaling. 9 (443), (2016).
- Massignani, E., et al. hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data. Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al.
- Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry. Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
- Huesgen, P. F., et al. LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification. Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).
- Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
- Bremang, M., et al. Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome. Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).
- Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling. Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).
- Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides. Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).
- Swaney, D. L., et al. Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors. Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).
- Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
- Uhlmann, T., et al. A method for large-scale identification of protein arginine methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).
- Wang, K., et al. Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation. Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).
- Moore, K. E., et al. A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation. Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).
- Wu, Z., et al. A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).
- Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
- Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).
