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Bioengineering

कैस 9 जीनोम संपादन के लिए मकई प्लांटहॉपर, पेरेग्रीनस मैडिस, भ्रूण का माइक्रोइंजेक्शन

Published: March 26, 2021 doi: 10.3791/62417
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Entomology and Plant Pathology, North Carolina State University
* These authors contributed equally

Summary

इसमें सीआरआईएसपीआर /सीएएस 9-आधारित जीनोम संपादन के माध्यम से अपने जीनोम को संशोधित करने या जर्मलाइन परिवर्तन के माध्यम से चिह्नित ट्रांसपोसेबल तत्वों को जोड़ने के उद्देश्य से प्रीसेलुलर मकई प्लांटहॉपर भ्रूण को एकत्र करने और माइक्रोइंजेक्ट करने के लिए प्रोटोकॉल हैं।

Abstract

मकई प्लांटहॉपर, पेरेग्रीनस मैडिस, मक्का का एक कीट है और कई मक्का वायरस का वेक्टर है। पहले प्रकाशित विधियों में अप्सराओं और वयस्कों में डबल-फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) के माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से पी. मैडिस में आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) के ट्रिगर का वर्णन किया गया है। आरएनएआई की शक्ति के बावजूद, इस तकनीक के माध्यम से उत्पन्न फेनोटाइप क्षणिक होते हैं और दीर्घकालिक मेंडेलियन वंशानुक्रम की कमी होती है। इसलिए, पी. मेडिस टूलबॉक्स को कार्यात्मक जीनोमिक उपकरणों को शामिल करने के लिए विस्तारित करने की आवश्यकता है जो स्थिर उत्परिवर्ती उपभेदों के उत्पादन को सक्षम करेगा, जिससे शोधकर्ताओं के लिए इस आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण कीट पर सहन करने के लिए नए नियंत्रण विधियों को लाने के लिए दरवाजा खुल जाएगा। हालांकि, आरएनएआई के लिए उपयोग किए जाने वाले डीएसआरएनए के विपरीत, सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9-आधारित जीनोम संपादन और जर्मलाइन परिवर्तन में उपयोग किए जाने वाले घटक आसानी से कोशिका झिल्ली को पार नहीं करते हैं। नतीजतन, प्लास्मिड डीएनए, आरएनए, और / या प्रोटीन को भ्रूण सेलुलर होने से पहले भ्रूण में सूक्ष्म इंजेक्शन दिया जाना चाहिए, जिससे इंजेक्शन का समय सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण कारक बन जाता है। उस अंत तक, अपेक्षाकृत कम अंतराल पर पी. मैडिस मादाओं से भ्रूण की कटाई की अनुमति देने के लिए एक अगारोस-आधारित अंडा-ले विधि विकसित की गई थी। इसमें सीआरआईएसपीआर घटकों (सीएएस 9 न्यूक्लियस जिसे गाइड आरएनए के साथ जटिल किया गया है) के साथ पूर्वकोशिकीय पी. मैडिस भ्रूण को एकत्र करने और माइक्रोइंजेक्ट करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किए गए हैं, और पी. मेडिस आंख-रंग जीन, सफेद के सीएएस 9-आधारित जीन नॉकआउट के परिणाम प्रस्तुत किए गए हैं। यद्यपि ये प्रोटोकॉल पी. मैडिस में सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9-जीनोम संपादन का वर्णन करते हैं, लेकिन उनका उपयोग इंजेक्शन समाधान की संरचना को बदलकर जर्मलाइन परिवर्तन के माध्यम से ट्रांसजेनिक पी मैडिस के उत्पादन के लिए भी किया जा सकता है।

Introduction

मकई प्लांटहॉपर, पेरेग्रीनस मैडिस, मक्का 1,2,3 का एक आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण कीट है। वे पौधे को प्रत्यक्ष शारीरिक नुकसान पहुंचाते हैं, दोनों अपने छेदने-चूसने वाले मुंह के हिस्सों के साथ भोजन करते समय, और प्रजनन के दौरान जब वे अपने भ्रूण को सीधे पौधे के ऊतकों में डालते हैं 2,4। फसलों को प्रत्यक्ष नुकसान के कई मार्गों के बावजूद, मक्का मोज़ेक वायरस (एमएमवी) और मक्का पट्टी वायरस 5,6 के वेक्टर के रूप में कार्य करके, फसल स्वास्थ्य पर इन कीड़ों का सबसे बड़ा प्रभाव अप्रत्यक्ष है। एमएमवी अपने पी. मेडिस वेक्टर के शरीर में प्रतिकृति बनाने में सक्षम है, जिससे वायरस अपने जीवन की संपूर्णता के माध्यम से व्यक्तिगत कीड़ों में बना रह सकता है, ताकि वे वायरस को नए मेजबान पौधों 7,8 में फैलाना जारी रख सकें। पी. मैडिस को नियंत्रित करने के लिए सबसे आम तरीके, और इस प्रकार वायरस वैक्टर, कीटनाशक हैं।

दुर्भाग्यवश, इन उत्पादों के कुप्रबंधन के कारण लक्षित कीट में प्रतिरोध का विकास हुआ है और साथ ही पर्यावरण का प्रदूषण भीहुआ है। इसलिए, इस कीट/वायरस-कीट संयोजन से फसल के नुकसान को कम करने के लिए नई रणनीतियों की आवश्यकता है। पिछले काम से पता चला है कि आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) पी. मैडिस के लिए एक प्रभावी नियंत्रण विधि हो सकती है क्योंकि वे डबल-स्ट्रैंडेड आरएनए (डीएसआरएनए) 10 को निगलने पर भी जीन अभिव्यक्ति में डाउनरेग्यूलेशन के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। हालांकि, क्षेत्र में डीएसआरएनए को प्रशासित करने का सबसे प्रभावी तरीका उन पौधों के माध्यम से होगा जिन पर कीड़े फ़ीड करते हैं; इसलिए, फसलें अभी भी किसी भी वायरस के लिए अतिसंवेदनशील हो सकती हैं जो कीड़े पहले से ही ले जा रहे हैं। CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन के आगमन के साथ, नई कीट नियंत्रण रणनीतियां संभव हैं, जिनमें Cas9-आधारित जीन ड्राइव11,12 शामिल हैं, जिसका उपयोग कीट आबादी के आकार को कम करने के लिए किया जा सकता है, या उक्त आबादी को वायरस प्रतिरोधी व्यक्तियों के साथ बदलने के लिए किया जा सकता है।

हालांकि, किसी भी प्रकार की जीन-ड्राइव प्रणाली के विकास और तैनाती के लिए ट्रांसजेनिक तकनीकों के विकास की आवश्यकता होगी। पी. मैडिस में आरएनएआई प्रयोगों को पूरा करने के लिए इस तरह के तरीके आवश्यक नहीं थे क्योंकि डीएसआरएनए और / या एसआईआरएनए को पी. मेडिस10,13 में आरएनएआई की दक्षता के कारण कोशिका झिल्ली को पार करने में सक्षम माना जाता है। यह पारंपरिक ट्रांसजेनेसिस या कैस 9-आधारित जीन संपादन में नियोजित डीएनए और / या प्रोटीन के लिए सच नहीं है, जिनमें से कोई भी जीन ड्राइव ले जाने वाले कीड़े बनाने का अग्रदूत होगा। जीन संपादन या जर्मलाइन परिवर्तन के अन्य रूपों को पूरा करने के लिए, इन डीएनए और प्रोटीन को आदर्श रूप से सिंसाइटियल ब्लास्टोडर्म चरण के दौरान भ्रूण में सूक्ष्म इंजेक्शन दिया जाता है, इससे पहले कि कीट भ्रूण सेलुलर हो जाए। समय महत्वपूर्ण है, क्योंकि समकालिक चरण विकास का सबसे पहला हिस्साहै 14,15. चूंकि पी. मेडिस मादाएं अधिमानतः पौधे के ऊतकों में अपने अंडे देती हैं, सूक्ष्म इंजेक्शन के लिए पर्याप्त मात्रा में पूर्वकोशिकीय भ्रूण निकालना श्रम-गहन और समय लेने वाला हो सकता है। इसलिए, सेलुलराइजेशन से पहले पी. मैडिस भ्रूण को जल्दी से इकट्ठा करने और माइक्रोइंजेक्ट करने के लिए नई तकनीकें विकसित की गईं।

Protocol

1. पी. नौकरानियों का कॉलोनी-स्तरीय पालन

  1. प्रति पालन पिंजरे में प्रति सप्ताह मकई के कम से कम चार बर्तन लगाएं, जिसमें प्रति बर्तन 3-4 बीज हों। कीट मुक्त वातावरण में उगाएं।
  2. जब पौधे ~ 5 सप्ताह पुराने होते हैं, तो 30 सेमी x 30 सेमी x 60 सेमी पिंजरे के अंदर रखें।
  3. एक शोध प्रयोगशाला या जंगली से पी. मैडिस वयस्कों (~ 500) की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करें, और 9-12 मकई के पौधों (3-4 बर्तन) के साथ एक कीट-प्रूफ पिंजरे में रखें।
  4. कॉलोनी को 25 डिग्री सेल्सियस (± 1 डिग्री सेल्सियस) पर कीट-पालन इनक्यूबेटर में बनाए रखें, जिसमें कम से कम 70% आर्द्रता और 14:10 प्रकाश चक्र हो।
  5. एक आयु-कैलिब्रेटेड कॉलोनी उत्पन्न करने के लिए, अंडे देने के चार दिनों के बाद सभी प्रारंभिक वयस्कों को हटा दें, और पिंजरे में रखे गए भ्रूण को स्वाभाविक रूप से बाहर निकलने और उम्र बढ़ने की अनुमति दें।
  6. 5 सप्ताह के पी. मैडिस कीड़ों (वयस्कों) को एक श्वासयंत्र के साथ इकट्ठा करके साप्ताहिक उपसंस्कृति के लिए ताजा मकई के पौधों में ले जाएं (चित्र 1)। फिर, वयस्कों को ताजा मकई के पौधों के साथ एक साफ पिंजरे में छोड़ दें। प्रयोगात्मक उद्देश्यों के लिए युवा वयस्कों की स्थिर आपूर्ति बनाए रखने के लिए, हर हफ्ते नए आयु-कैलिब्रेटेड पिंजरे तैयार करें।
  7. पिंजरों में रखे बर्तनों को दिन में दो बार पानी दें। समय-समय पर डंठल को क्लिप करें, सड़ने वाली पौधे सामग्री को हटा दें, और आवश्यकतानुसार ताजे मकई के बर्तनों के साथ बदलें।
    नोट: उचित रखरखाव के साथ, एक कॉलोनी ~ 5 सप्ताह तक रह सकती है (यानी, पिंजरे में रखे गए भ्रूण को वयस्क बनने के लिए पर्याप्त लंबा)।

2. अगारोस-आधारित अंडा देने वाला कक्ष

  1. स्वच्छ 100 मिमी x 15 मिमी पेट्री व्यंजनों में पानी में 1% डब्ल्यू / वी एगारोस डालकर अंडे संग्रह व्यंजन (अंडाकार माध्यम) बनाएं। जमने के बाद अंडाकार माध्यम को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. वयस्कों को खिलाने के लिए 10% डब्ल्यू / वी सुक्रोज समाधान तैयार करें। सुक्रोज समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस पर एक महीने तक स्टोर करें।
  3. 1 औंस कप के तल में एक छेद काटकर वयस्कों को पकड़ने के लिए एक कक्ष बनाएं ( सामग्री की तालिका देखें) और हवा के आदान-प्रदान के लिए छेद पर एक स्क्रीन चिपकाएं (चित्रा 2)।
  4. प्लास्टिक पैराफिन मोम फिल्म को 5 सेमी x 5 सेमी वर्गों में काटें; प्रत्येक कप के लिए 2 वर्ग अलग रखें।
  5. एक उम्र-कैलिब्रेटेड पी. मैडिस कॉलोनी से ~ 15 1 सप्ताह की वयस्क महिलाओं को इकट्ठा करें। महिलाओं का चयन करने के लिए, पेट के उदर पक्ष की जांच करें, और अंडाकार की तलाश करें, जो आमतौर पर पेट के बाकी हिस्सों की तुलना में गहरा होता है (चित्रा 3)। कई अंडे देने वाले कक्षस्थापित करते समय 15 एमएल शंक्वाकार शीशी में वयस्कों को एक घंटे तक पकड़ो। सेक्स करने से पहले बर्फ पर कीड़ों को थोड़ी देर के लिए ठंडा करें और वयस्क कंटेनर में स्थानांतरित करें।
    नोट: यह परीक्षा माइक्रोस्कोप के बिना की जा सकती है। वयस्क महिलाएं जिनके पास खिलाने और संभोग करने का समय होता है, उनमें आमतौर पर वयस्क पुरुषों की तुलना में बड़े पेट होते हैं और वे अधिक विनम्र होते हैं; इसलिए, उन्हें पिंजरे की आबादी से अधिक आसानी से चुना जा सकता है।
  6. मादाओं को एक वयस्क कंटेनर में स्थानांतरित करें, और प्लास्टिक पैराफिन मोम फिल्म की 1 परत के साथ कप को अपने मूल आकार से 3-4 गुना खींचकर सील करें (चित्रा 4 ए, बी)।
  7. प्लास्टिक पैराफिन मोम फिल्म सील के शीर्ष पर 10% डब्ल्यू / वी सुक्रोज समाधान का 400 μL लागू करें, और प्लास्टिक पैराफिन मोम फिल्म की एक दूसरी परत जोड़ें, प्लास्टिक पैराफिन मोम फिल्म को ठीक ऊपर की तरह खींचें (चित्रा 4 सी, डी)।
    नोट: फैला हुआ प्लास्टिक पैराफिन मोम फिल्म का सैंडविच सुक्रोज समाधान पर दबाव डालता है, जो वयस्क भोजन के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, लेकिन महिलाओं को अंडाकार माध्यम में अपने ओविपोजिटर को छेदने से नहीं रोकेगा।
  8. वयस्क कक्ष को प्लास्टिक पैराफिन मोम फिल्म साइड के साथ एक अंडा संग्रह पकवान पर सीधे अंडाकार माध्यम पर रखें, और हवा के छेद को कवर किए बिना प्लास्टिक रैप के साथ पूरे अंडे देने वाले कक्ष को लपेटें, क्योंकि ये वायु विनिमय के लिए आवश्यक हैं (चित्रा 5)।
  9. प्रत्येक अंडे देने वाले कक्ष को 70% आर्द्रता और 14:10 प्रकाश चक्र के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  10. प्लास्टिक पैराफिन मोम फिल्म और 10% डब्ल्यू / वी सुक्रोज समाधान के सैंडविच को रोजाना बदलें, और कप के अंदर जमा होने वाले किसी भी पानी को हटा दें।

3. उच्च आर्द्रता वातावरण में भ्रूण संग्रह और संरेखण

  1. एक ह्यूमिडिफाइड स्पेस या हुड (ह्यूमिडिफाइड हुड) में एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप-आधारित माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम स्थापित करें; चित्र 6) यह सुनिश्चित करने के लिए कि काम का माहौल माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान कम से कम 70% आर्द्रता प्राप्त करता है।
  2. वांछित अंडे देने की अवधि के बाद अंडे के लिए अंडाकार माध्यम की जांच करें। इसे ह्यूमिडिफाइड हुड या किसी अन्य आर्द्र वातावरण में करें।
    नोट: आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली अंडे देने की अवधि रात भर, शाम 6 बजे से सुबह 10 बजे तक, ~ 16 घंटे तक चलती थी।
  3. यदि कोई अंडे अगारोस में रखे जाते हैं, तो उन्हें सावधानीपूर्वक खोदने के लिए बारीक बल का उपयोग करें, और उन्हें नम रखने के लिए अगारोस की सतह पर रखें (चित्रा 7 ए)।
  4. 22 मिमी x 30 मिमी कवरस्लिप (चित्रा 7 बी) पर 1 मिमी x 15 मिमी डबल-साइडेड टेप की एक पट्टी लागू करें। कवरस्लिप टेप-साइड को ओवीपोजिशन माध्यम (चित्रा 7 सी) पर रखें।
  5. आगर की सतह से प्रत्येक अलग-अलग अंडे को उठाएं, और एक ठीक ब्रश का उपयोग करके दो तरफा टेप पर जाएं। किसी भी अंडे को हटा दें जो पूरी तरह से सफेद हैं या उन पर काला रंग है। स्वस्थ अंडे अर्ध-पारदर्शी होंगे।
  6. केले के आकार के अंडे को उनके किनारे पर रखें, जिसमें बड़ा सिरा दो तरफा टेप (चित्रा 7 डी) पर अटका हुआ है।
    नोट: अंडे को हमेशा उच्च आर्द्रता वाले वातावरण में रखें, जैसे कि पेट्री डिश को नीचे 1% आगर की परत के साथ डाला जाता है।

4. सीआरआईएसपीआर अभिकर्मकों और इंजेक्शन सुइयों की तैयारी

  1. ब्राउन प्रकार के माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करके क्वार्ट्ज सुइयों को खींचें।
  2. माइक्रोपिपेट बेवेलर का उपयोग करके क्वार्ट्ज सुइयों का उपयोग करें।
  3. उपयोग के लिए तैयार होने तक पेट्री डिश जैसे स्पष्ट कंटेनर में खींची गई सुइयों को सुरक्षित करने के लिए डबल-साइडेड चिपचिपा टेप का उपयोग करें।
  4. कैस 9 प्रोटीन के 0.5 μL (5 μg/μL स्टॉक समाधान) और SgRNA के 0.5 μL (4 μg/μL स्टॉक समाधान; सामग्री की तालिका देखें) को 5 μL फिनोल लाल बफर के साथ 5 μL की अंतिम मात्रा में मिलाकर इंजेक्शन समाधान तैयार करें। सुई को अवरुद्ध करने वाले कणों को अवक्षेपित करने के लिए, घोल को संक्षेप में भंवर करें, और अधिकतम गति पर 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. इंजेक्शन सुई को बैकफिल करें, सुई के पतले छोर के पास इंजेक्शन मिश्रण को छोड़ने का ध्यान रखें। सुई की नोक से बुलबुले, यदि कोई हो, को हटा दें।
  6. सुई धारक में बैकफिल्ड सुई को सावधानीपूर्वक रखें, और माइक्रोइंजेक्शन के दौरान सुई को सुरक्षित रूप से पकड़ने के लिए स्टेनलेस स्टील कॉलर को कसें।
  7. इंजेक्शन प्रणाली के साथ सुई को हवा के दबाव के विस्फोट को वितरित करते हुए, एक महीन, कम पेंटब्रश के साथ धीरे-धीरे घुमावदार नोक को सहलाकर सुई से इंजेक्शन समाधान का एक विश्वसनीय प्रवाह उत्पन्न करें।
    नोट: सुई इंजेक्शन के लिए तैयार है जब इंजेक्शन मिश्रण छोटी मात्रा में टिप छोड़ सकता है।

5. माइक्रोइंजेक्शन और पोस्ट-इंजेक्शन देखभाल

  1. डिश के शीर्ष के साथ फ्लश होने वाली आगर की एक स्तर परत बनाने के लिए 1% आगर के साथ एक साफ 100 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश को भरकर एक माइक्रोइंजेक्शन प्लेटफॉर्म तैयार करें।
  2. आगर प्लेटफॉर्म (चित्रा 8 ए) पर ~ 25 भ्रूण के साथ पहले से तैयार कवरस्लिप रखें।
    नोट: सभी इंजेक्शन चरणों को एक ह्यूमिडिफायर हुड (~ 70% आर्द्रता) के अंदर किया जाना चाहिए।
  3. सुई की नोक को पानी की एक बूंद में रखकर और इंजेक्शन चक्र शुरू करके इंजेक्शन के दबाव की जांच करें।
    नोट: यदि दबाव सेटिंग सही है तो इंजेक्शन समाधान की एक छोटी मात्रा पानी में फैलनी चाहिए (चित्रा 8 बी)।
  4. सुई को भ्रूण के बड़े छोर में डालें, कवरस्लिप के बाईं ओर से आ रहा है (चित्रा 8 सी)। अंडे में इंजेक्शन का घोल वितरित करें, और सुई को जल्दी से बाहर निकालें।
  5. सभी अंडों को इंजेक्ट करने के बाद, कवरस्लिप को एक नए 1% आगर डिश की सतह पर रखें, और पकवान को आर्द्रता कक्ष में स्थानांतरित करें (चित्रा 9)।

6. भ्रूण का प्रजनन और सेने का कार्य

  1. हैचिंग चैंबर को 6 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  2. साफ पानी और एक महीन ब्रश का उपयोग करके किसी भी जीवित भ्रूण को डिश के तल को कवर करने वाले पानी-नम फिल्टर पेपर के साथ 35 मिमी x 10 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। पेट्री डिश को प्लास्टिक पैराफिन मोम फिल्म के साथ सील करें, और भ्रूण को हैच करने की अनुमति देने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें। जीवित रहने के लिए इंजेक्शन के 6 दिन बाद भ्रूण की जांच शुरू करें।
    नोट: पहली इनस्टार अप्सराएं 8 वें दिन के आसपास निकलना शुरू कर देंगी।
  3. एक महीन ब्रश का उपयोग करके अप्सराओं को पत्ती की कतरन वाले पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। पकवान को कवर करें, और प्लास्टिक पैराफिन मोम फिल्म के साथ सील करें।
  4. पत्ती की कटाई पर हैचलिंग के सीलबंद पकवान को 25 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. सभी 2-दिवसीय अप्सराओं को इंजेक्शन के एक दौर से एक महीन ब्रश का उपयोग करके मकई के पौधों के साथ पालन पिंजरे में स्थानांतरित करें। यदि दृश्यमान फेनोटाइप वाले इंजेक्शन पर्याप्त संख्या में पुनर्प्राप्त किए जाते हैं, तो अगली पीढ़ी में लक्ष्य विशेषता की वसूली को अधिकतम करने के लिए उन्हें अलग से पालें। अन्यथा, सभी इंजेक्शनों का बड़े पैमाने पर संभोग करें।
    नोट: शरण प्रदान करने और उनके तत्काल वातावरण की उचित आर्द्रता सुनिश्चित करने के लिए मकई के पौधे के छिद्र में धीरे से हैचलिंग रखें।
  6. ऊपर वर्णित स्थितियों में कीड़ों को पालें, उचित तापमान, आर्द्रता और ताजा मकई के पौधों में नियमित हस्तांतरण सुनिश्चित करें।
  7. अपेक्षित फेनोटाइप के लिए स्क्रीन संतान। होमोजीगस लाइनों को स्थापित करने के लिए वांछित फेनोटाइप का प्रदर्शन करने वाले व्यक्तियों को अपने पिंजरे में रखें।

Representative Results

अंडे देने वाले कक्ष को विशेष रूप से पी. मैडिस मादाओं को एक सुरक्षात्मक माध्यम में ओवीपोस करते समय खिलाने में सक्षम बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जिससे उनके अंडे आसानी से बरामद किए जा सकते थे। इस विधि का उपयोग करके, डीएनए, आरएनए और / या प्रोटीन के साथ माइक्रोइंजेक्शन के लिए पर्याप्त मात्रा में पूर्वकोशिकीय भ्रूण बरामद किए गए थे। वयस्क पी मेडिस मादाएं आमतौर पर मकई के पौधों के पत्ती ऊतक के अंदर अंडे देती हैं, जो कम समय में पर्याप्त अंडे प्राप्त करना एक चुनौती बनाती हैं क्योंकि इसके लिए बहुत अधिक पत्ती विच्छेदन की आवश्यकता होती है। कृत्रिम अंडा देने वाला वातावरण इन समस्याओं को दूर करने का समाधान प्रदान करता है। जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है, 4 सप्ताह में कुल 645 महिलाओं से 6,483 अंडे एकत्र किए गए थे। मादाएं आमतौर पर दिन 2 के बाद अंडे देना शुरू करती हैं और दिन 4 से दिन 6 तक अधिकांश अंडे प्रदान करती हैं। ओविपोजीशन गतिविधि 9 वें दिन तक धीमी हो गई। प्रत्येक अंडाकार कक्ष शुक्रवार को स्थापित किया गया था और रविवार से अगले रविवार तक अंडों की जांच की गई थी। इस अनुसूची के बाद अधिकांश अंडों को कार्य सप्ताह के दौरान सूक्ष्म इंजेक्शन के लिए एकत्र करने की अनुमति दी गई।

इस अंडे देने वाली प्रणाली का पहला व्यावहारिक अनुप्रयोग कैस 9-मध्यस्थता जीन नॉकआउट की प्रभावकारिता का परीक्षण करना था, जिसमें लक्ष्य के रूप में आंख-रंग जीन, सफेद (पीएमडब्ल्यू) के पी मेडिस ऑर्थोलॉग का उपयोग किया गया था। सफेद में उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप अन्य कीट प्रजातियों में आंख रंजकता का पर्याप्त नुकसान होता है, और व्हाइट सेल-स्वायत्त है, जिससेइंजेक्शन वाले व्यक्तियों में उत्परिवर्तन का पता लगाया जा सकता है। इस संभावना को बढ़ाने के लिए कि एक छोटे से उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप फ़ंक्शन का नुकसान हो सकता है, गाइड आरएनए को एटीपी-बाइंडिंग कैसेट के क्षेत्र के भीतर कटौती करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जो व्हाइट फ़ंक्शन16 के लिए आवश्यक है। पी. मैडिस भ्रूण को या तो 20% फिनोल लाल (इंजेक्शन बफर), कैस 9 के साथ इंजेक्शन बफर को 800 एनजी /एएल (सीएएस 9 नियंत्रण) की अंतिम सांद्रता पर इंजेक्शन बफर के साथ इंजेक्ट किया गया था, या इंजेक्शन बफर में सीएएस 9 के साथ-साथ 400 एनजी / एक इंजेक्शन मिश्रण के भीतर तीन गाइडों के संयोजन का उद्देश्य म्यूटेंट उत्पन्न करने की संभावनाओं को और अधिक से अधिक करना था, दोनों एक बड़ा विलोपन बनाकर, और इस संभावना की भरपाई करके कि कोई भी गाइड काटने के लिए अप्रभावी हो सकता है। प्रत्येक उपचार के लिए विकास दर तुलनीय थी (तालिका 2), जिसमें 50-60% इंजेक्शन वाले व्यक्ति विकास के लक्षण दिखाते थे। बफर और कैस 9 नियंत्रणों के लिए हैच दरें भी तुलनीय थीं; हालांकि, तीन-गाइड मिश्रण प्राप्त करने वाले व्यक्तियों की हैच दर अपेक्षाकृत कम थी। इस समय, यह स्पष्ट नहीं है कि कम अस्तित्व सफेद फ़ंक्शन के नुकसान का परिणाम है या तीन-गाइड मिश्रण के अनपेक्षित परिणामों का परिणाम है, जैसे कि ऑफ-टारगेट प्रभाव (चर्चा अनुभाग देखें)। हालांकि, आंखों के रंजकता (यानी, पूर्ण नॉकआउट) के पूर्ण नुकसान वाले व्यक्तियों में से कोई भी नहीं था, और इंजेक्शन वाले व्यक्तियों की संतानों में से किसी की भी आंखें सफेद नहीं थीं। कैस 9-आधारित म्यूटेनेसिस की ऑन-टारगेट प्रभावकारिता को दो तरीकों से सत्यापित किया गया था। सबसे पहले, आंखों के रंजकता के नुकसान के लिए इंजेक्शन की जांच की गई थी।

विकसित होने वाले 71 गाइड-इंजेक्शन वाले व्यक्तियों में से, 23 ने कुछ हद तक वर्णक हानि दिखाई (चित्रा 10), और उन व्यक्तियों में से 9 ने हैच किया, जिसके परिणामस्वरूप ≥32% की नॉकआउट दर हुई। नियंत्रण उपचार में कोई आंख वर्णक हानि नहीं देखी गई थी। दूसरा, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) 18 और अनुक्रमण19 के माध्यम से क्रोमोसोमल म्यूटेशन की पुष्टि की गई। चूंकि एक उत्परिवर्ती रेखा को पुनर्प्राप्त नहीं किया जा सकता था, इसलिए जीनोमिक डीएनए का विश्लेषण तीन-गाइड मिश्रण या बफर के साथ इंजेक्ट किए गए भ्रूण के पूल से किया गया था। तीन-गाइड मिश्रण से सफेद टिड्डी से ~ 180 बेस जोड़े को हटाने की उम्मीद है। यह पीसीआर उत्पादों में देखा जा सकता है जो इंजेक्शन वाले व्यक्तियों से अलग जीनोमिक डीएनए के साथ-साथ उन उत्पादों से उत्पन्न संबंधित अनुक्रम डेटा से प्रवर्धित होते हैं (चित्रा 11)। यह संयुक्त सबूत इंगित करता है कि सेलुलराइजेशन होने से पहले भ्रूण को इंजेक्ट किया गया था।

Figure 1
चित्र 1: एस्पिरेटर। प्लास्टिक ट्यूबिंग के माध्यम से, सेवन पर वैक्यूम पंप को संलग्न करने से एक प्रभावी एस्पिरेटर को 15 एमएल प्लास्टिक शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा किया जा सकता है। शंक्वाकार ट्यूब के तल से लगभग 0.5 सेमी सावधानीपूर्वक हटा दिया जाना चाहिए। प्लास्टिक ट्यूबिंग के उद्घाटन के ऊपर शंक्वाकार ट्यूब में एक कपास की गेंद रखी जानी चाहिए, ताकि पी. मैडिस वयस्कों को पकड़ा जा सके क्योंकि वे एकत्र किए जाते हैं और उन्हें वैक्यूम पंप से बाहर रखते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: वयस्क कंटेनरों का निर्माण। (ए) आवश्यक आपूर्ति (ऊपर बाएं से घड़ी के अनुसार): स्क्रीन, गर्म गोंद बंदूक, रेजर ब्लेड, 1 औंस कंटेनर। (बी) 1 औंस कंटेनर के तल में एक बड़ा छेद काटा जाना चाहिए, और स्क्रीन का एक वर्ग इस छेद को कवर करने के लिए पर्याप्त बड़ा काटा जाता है। (सी) स्क्रीन को फिर गर्म गोंद का उपयोग करके छेद पर चिपकाया जाता है। (डी) एक बार गोंद सेट हो जाने के बाद, किसी भी अतिरिक्त जाल को हटा दिया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: सेक्सिंग पी. मेडिस वयस्क। पुरुष (बाएं) और महिला (दाएं) पी. मैडिस वयस्कों के उदर पक्ष दिखाए गए हैं। महिला पेट पर दिखाई देने वाला अंडाकार, किसी व्यक्ति के लिंग का सबसे स्पष्ट संकेतक है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: वयस्कों को कंटेनरों में सील करना। (A) प्लास्टिक पैराफिन मोम फिल्म का 5 सेमी x 5 सेमी वर्ग। (बी) फिल्म को अपने मूल आकार से 3-4 गुना तक समान रूप से बढ़ाया जाना चाहिए। (सी) एक बार वयस्कों को वयस्क कंटेनर में डाल दिया जाता है, तो वयस्कों को सुरक्षित करने के लिए विस्तारित फिल्म को उद्घाटन के ऊपर रखा जाना चाहिए। 10% डब्ल्यू / वी सुक्रोज समाधान की 400 μL की बूंद को फिर फिल्म के शीर्ष पर रखा जाना चाहिए। (डी) वयस्कों के लिए पर्याप्त भोजन दबाव प्रदान करने के लिए, प्लास्टिक पैराफिन फिल्म के दूसरे 5 सेमी x 5 सेमी वर्ग को इसी तरह फैलाया जाना चाहिए और सुक्रोज की बूंद पर रखा जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: एक अंडाकार कक्ष स्थापित करना। (A) आवश्यक आपूर्ति (ऊपर बाईं ओर से घड़ी के अनुसार): प्लास्टिक रैप, एक पूर्ण वयस्क कंटेनर (वयस्कों के साथ), और 1% अगारोस (अंडाकार माध्यम) के साथ एक पेट्री डिश। (बी) वयस्क कंटेनर को प्लास्टिक पैराफिन फिल्म / 10% सुक्रोज 'सैंडविच' के साथ अगारोस पर रखा जाना चाहिए, जिसे सीधे अंडाकार माध्यम पर रखा जाना चाहिए। (सी) प्लास्टिक रैप का उपयोग वयस्क कंटेनर को अंडाकार माध्यम में सुरक्षित करने के लिए किया जाता है। यह माध्यम को बहुत जल्दी सूखने से बचाता है। (डी) वयस्क कंटेनर की स्क्रीन को कवर करने से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, ताकि एयर एक्सचेंज अभी भी जारी रह सके। (ई) अंडाकार कक्ष का आरेख। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: ह्यूमिडिफाइड हुड। इंजेक्शन के दायरे के चारों ओर ह्यूमिडिफायर के साथ एक हुड स्थापित किया गया है ताकि भ्रूण को संभालने के दौरान हवा के ड्राफ्ट को कम करने और आर्द्रता बनाए रखी जा सके। उचित आर्द्रता के स्तर को बनाए रखने में सहायता के लिए, कार्यकर्ता के होने के बाद प्रवेश द्वार पर फ्लैप को मोड़ा जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्र 7: इंजेक्शन की तैयारी में भ्रूण एकत्र करना। (A) भ्रूण जो अंडाकार माध्यम में जमा किए गए हैं। माध्यम से भ्रूण निकालने और उन्हें इसकी सतह पर रखने के लिए महीन बल की एक जोड़ी का उपयोग किया जाता है। (बी) 22 मिमी x 30 मिमी कवरस्लिप पर 1 मिमी x 15 मिमी डबल-साइडेड टेप की एक संकीर्ण पट्टी। (सी) कवरस्लिप को माध्यम की सतह से कवरस्लिप पर टेप तक भ्रूण को स्थानांतरित करने में आसानी के लिए अंडाकार माध्यम पर रखा जा सकता है। (घ) पी. मैडिस भ्रूण केले के आकार के होते हैं, जिनका एक सिर दूसरे की तुलना में संकरा होता है (लाल तीर सिर के साथ संकेतित संकीर्ण छोर; उदाहरण भ्रूण में पीले तीर सिर के साथ इंगित व्यापक छोर)। भ्रूण के चौड़े सिरे को टेप पर रखा जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्र 8: इंजेक्शन( A) इंजेक्शन प्लेटफॉर्म एक पेट्री डिश है जो 1% एगर के साथ भरी हुई है। टेप होल्डिंग भ्रूण की एक पट्टी के साथ कवरस्लिप को सीधे इंजेक्शन प्लेटफॉर्म की सतह पर रखा जाना चाहिए। (बी) इंजेक्शन के दबाव का परीक्षण भ्रूण को पानी की एक बूंद में इंजेक्शन समाधान की एक छोटी मात्रा को 'इंजेक्ट' करके इंजेक्ट करने से पहले किया जाना चाहिए। इस विधि का उपयोग इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान किसी भी समय क्लोग के लिए सुई की जांच करने के लिए भी किया जा सकता है। (सी) भ्रूण के बड़े छोर में सुई डालकर भ्रूण को इंजेक्ट किया जाना चाहिए। इंजेक्शन सफल होने पर इंजेक्शन समाधान दिखाई देना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्र 9: इंजेक्शन के बाद की देखभाल। (A) एक बार कवरस्लिप पर सभी भ्रूणों को इंजेक्ट कर दिया गया है, तो कवरस्लिप को 1% अगारोस युक्त एक ताजा पेट्री डिश में रखा जाना चाहिए। (बी) कवरस्लिप के साथ पेट्री डिश को तब तक आर्द्रता कक्ष (जैसा कि दिखाया गया है) में बनाए रखा जा सकता है जब तक कि भ्रूण नहीं निकलता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 10
चित्रा 10: पीएमडब्ल्यू नॉकआउट फेनोटाइप। (ए) आयु-मिलान नियंत्रण और (बी) पीएमडब्ल्यू नॉकआउट भ्रूण, जिसमें विकासशील आंखें काले तीर के निशान द्वारा इंगित की जाती हैं। बी में भ्रूण मोज़ेक है, क्योंकि रंजकता की एक छोटी पट्टी देखी जा सकती है। (सी) आयु-मिलान नियंत्रण और (डी) पीएमडब्ल्यू नॉकआउट हैचलिंग, जिसमें इनसेट आंखों पर एक अलग कोण दिखाते हैं। डी में हैचलिंग भी मोज़ेक है। एक सफेद तीर मुख्य चित्र में एक क्षेत्र को इंगित करता है जो रंजकता के नुकसान को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 11
चित्र 11: पीएमडब्ल्यू नॉकआउट अनुक्रम। (ए) पीएमडब्ल्यू एमआरएनए का टू-स्केल मॉडल, जिसे 500-बीपी वृद्धि में चिह्नित किया गया है, जिसमें जीआरएनए बाइंडिंग साइटों के स्थानों को इंगित किया गया है: जी 1, नीला; जी 2, पीला; जी 3, गुलाबी। इस बिंदु पर उत्पन्न कोई भी फ्रेम-शिफ्ट म्यूटेशन अनुवाद उत्पाद के बहुमत को बाधित करेगा। (बी) जीआरएनए साइटों का जीनोमिक संदर्भ, सभी एक एक्सॉन (बोल्ड कैपिटलाइज्ड टेक्स्ट) में। गाइड बाइंडिंग साइटों को ए के समान रंगों में हाइलाइट किया जाता है, और पीएएम को रेखांकित किया जाता है। स्पैन ~ 300 बीपी है। एक्सॉन का इन-फ्रेम अनुवाद ऊपर दिखाया गया है, पूंजी पाठ में एकल-अक्षर संक्षिप्तीकरण के रूप में। आंखों के वर्णक ट्रांसपोर्टरों के लिए विशिष्ट दो रूपांकनों को चिह्नित किया गया है। वॉकर बी कार्यात्मक डोमेन के सीडीपीटी मोटिफ को बैंगनी रंग में बॉक्स किया गया है, और एच-लूप डोमेन के आईएचक्यूपी मोटिफ को हरे रंग में बॉक्स किया गया है। दोनों डोमेन एटीपी-ट्रांसपोर्टर फ़ंक्शन के लिए महत्वपूर्ण हैं। (ग) पीसीआर के दो दौरों का उपयोग करके पीएमडब्ल्यू लक्ष्य क्षेत्र को बढ़ाया गया था। गाइड के बीच के क्षेत्र को सफलतापूर्वक हटाने के कारण आकार-बदलाव के सबूत के लिए दूसरे दौर के उत्पाद की जांच एक जेल पर की गई थी। लेन: एल = 100 बीपी सीढ़ी; 1 = पीसीआर जल नियंत्रण; 2 = बफर इंजेक्शन अंडे; 3-4 = तीन-गाइड मिश्रण के साथ इंजेक्ट किए गए अंडे के दो अलग-अलग सेट। केवल तीन-गाइड मिश्रण प्राप्त करने वाले भ्रूण ने डब्ल्यूटी बैंड (लाल तीर) और एक पूर्ण छांटने (सफेद तीर) के परिणामस्वरूप बैंड दोनों का उत्पादन किया। (डी) निचले (सफेद तीर) बैंड की पहचान की पुष्टि करने के लिए, इस डीएनए को शुद्ध, क्लोन और अनुक्रमित किया गया था। शीर्ष पंक्ति जंगली प्रकार का अनुक्रम है। अन्य दो लाइनें दो क्लोनों के अनुक्रम हैं। तीन अतिरिक्त क्लोन नीचे के अनुक्रम से मेल खाते हैं। नीला हाइलाइट गाइड 1 की बाइंडिंग साइट को इंगित करता है, जबकि गुलाबी हाइलाइट गाइड 3 की बाइंडिंग साइट को इंगित करता है। दोनों एलील्स में, इन दो गाइड साइटों के बीच के पूरे क्षेत्र को हटा दिया गया है। संक्षिप्तरूप: पीएमडब्ल्यू = पेरेग्रीनस मेडिस सफेद जीन; जीआरएनए = गाइड आरएनए; पीएएम = प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति; एटीपी = एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट; पीसीआर = पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन; डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; केओ = नॉकआउट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अस्त हो # कप # प्रत्येक कप में महिलाओं की संख्या # अंडे का अंडे का कुल #
दिन 2 तीसरा दिन चौथा दिन पांचवां दिन दिन 6 दिन 7 दिन 8 दिन 9
1 10 15 0 26 166 355 530 193 91 37 1398
2 15 15 22 238 489 699 520 379 203 58 2608
3 8 15 0 57 230 190 116 80 34 1 708
4 10 15 0 226 446 519 301 179 24 15 1710
कुल 43 15 23 547 1331 1763 1467 831 352 111 6483

तालिका 1: कृत्रिम अंडाकार वातावरण से प्रतिनिधि अंडा संग्रह। अंडे-संग्रह कप के चार सेटों से डेटा दिखाया गया है, जिसमें सेटअप के बाद दूसरे दिन अंडे की परतें शुरू होती हैं और नौवें दिन तक चलती हैं।

इंजेक्शन उपचार कुल इंजेक्शन कुल विकसित कुल हैच्ड विकास दर (%) हैच दर (%)
बफ़र 39 20 12 51 31
Cas9 39 24 14 61 36
Cas9 + Pmw gRNA 121 71 28 59 28

तालिका 2: 3 अलग-अलग इंजेक्शन मिक्स के इंजेक्शन से उत्तरजीविता और नॉकआउट दरें।

Discussion

अंडे देने की गुणवत्ता और पोषण
हाल ही में, एक संबंधित प्रजाति, नीलापर्वता लुगेंस के साथ काम करने वाले शोधकर्ताओं ने सीधे पत्ती से सूक्ष्म इंजेक्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले अंडे प्राप्त किए, इंजेक्शन वाले अंडे को पत्ती केऊतकों में तब तक रखा जब तक कि वे 17 नहीं निकल गए। जबकि इस पत्ती-आधारित विधि ने भ्रूण के विकास के लिए अधिक प्राकृतिक वातावरण प्रदान किया, इसने हटाने की प्रक्रिया के दौरान संक्रमण और अंडे की क्षति की संभावना भी बढ़ा दी। यहां प्रस्तुत कृत्रिम अंडाकार प्रणाली एक अधिक समान वातावरण प्रदान करती है और हैंडलिंग से अंडों को नुकसान की संभावना को कम करती है। शुक्रवार को ओविपोजीशन कप स्थापित करके, अधिकांश अंडाणु एक विशिष्ट कार्य सप्ताह के दौरान एकत्र किए गए थे, ताकि माइक्रोइंजेक्शन कार्य करने वालों के लाभ के लिए। हालांकि, इस विधि के लिए एक चेतावनी यह है कि 10% सुक्रोज समाधान आहार में पोषक तत्वों की कमी अंततः कीड़ों के स्वास्थ्य को प्रभावित करेगी, और कप में मादाएं आमतौर पर केवल 10 दिनों के बाद मरना शुरू कर देती हैं। अंडे की गुणवत्ता भी 6 दिनों के बाद गिरने लगती है, जैसा कि मृत या अस्वास्थ्यकर दिखने वाले अंडों में वृद्धि से स्पष्ट है। नतीजतन, माइक्रोइंजेक्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले अंडों का चयनात्मक होना और 6 वें दिन के बाद मादाओं को नहीं रखना महत्वपूर्ण है।

उत्तरजीविता दर और आर्द्रता
माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया के माध्यम से भ्रूण के अस्तित्व के लिए दो कारक महत्वपूर्ण प्रतीत होते हैं। मैडिस भ्रूण को संभालने का सबसे चुनौतीपूर्ण पहलू उन्हें अंडाकार माध्यम से हटाने के बाद और पूरे माइक्रोइंजेक्शन में डिसिकेटिंग से रोक रहा है। चूंकि अंडे आमतौर पर पौधे के ऊतकों के अंदर रखे जाते हैं, इसलिए उनमें निर्जलीकरण को रोकने के लिए पर्याप्त खोल की कमी होती है। यहां तक कि ह्यूमिडिफाइड हुड में भी निर्जलीकरण के कारण अंडों के पूरे सेट खो गए थे। हालांकि, अत्यधिक उच्च आर्द्रता माइक्रोइंजेक्शन को भी प्रभावित कर सकती है यदि पानी दो तरफा टेप पर या दायरे पर जमा होता है। दुर्भाग्य से, अंडे के निर्जलीकरण को आमतौर पर माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान नोटिस करना आसान नहीं था, और वे अक्सर 2 या 3 दिनों बाद तक सामान्य दिखाई देते थे, जब वे पूरी तरह से पारदर्शी हो जाते थे, विकास के कोई संकेत नहीं दिखाते थे।

सुई की गुणवत्ता भी जीवित रहने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। अंडे को अनावश्यक नुकसान को कम करने के लिए सुई को लगाया जाना चाहिए। जब सुई अवरुद्ध हो जाती है, तो इंजेक्टर पर समाशोधन फ़ंक्शन का उपयोग करते हुए, धीरे से सुई की नोक को एक कम पेंटब्रश के साथ सहलाते हुए (चरण 4.7 देखें) आमतौर पर सुई को कार्यात्मक स्थिति में लौटा दिया जाता है। भले ही, प्रत्येक सुई में केवल थोड़ी मात्रा में इंजेक्शन समाधान (~ 0.25 μL) डालना और हर कुछ स्लाइड (~ 50-60 अंडे) में एक नई सुई पर स्विच करना यह सुनिश्चित करने के लिए अनुशंसित है कि इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान सुई की गुणवत्ता बनाए रखी जाए।

नॉकआउट फेनोटाइप की सफल पीढ़ी
रोगाणु कोशिकाओं को सफलतापूर्वक बदलने के लिए, भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन आमतौर पर सेलुलराइजेशन से पहले जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए। कीट प्रजातियों के आधार पर, सूक्ष्म इंजेक्शन को पूरा करने के लिए समय की खिड़की केवल कुछ घंटों से लेकर पूरे दिन 14,15,20 तक होती है। यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि पी मेडिस भ्रूण सेलुलराइजेशन से कब गुजरते हैं। कैस 9-मध्यस्थता नॉकआउट का परीक्षण 4 घंटे के बाद अंडे के बाद (पेल) से 16 घंटे पेल तक के भ्रूण पर किया गया था, और सभी प्रयोगों में अपेक्षित फेनोटाइप देखे गए थे, यह सुझाव देते हुए कि सभी सूक्ष्म इंजेक्शन प्रीसेल्यूराइजेशन विंडो के भीतर किए गए थे।

आंख-रंग जीन, सफेद के पी. मेडिस ऑर्थोलॉग का चयन किया गया था क्योंकि नॉकआउट फेनोटाइप को इसकी सेल-स्वायत्त प्रकृति के कारण इंजेक्शन में स्क्रीन करना आसान होने की उम्मीद थी। दरअसल, जैसा कि अपेक्षित था, कैस 9 और गाइड आरएनए युक्त इंजेक्शन मिश्रण प्राप्त करने वाले भ्रूणों के बीच मोज़ेक और कुल नॉकआउट दोनों स्पष्ट रूप से पहचाने जाने योग्य थे। दुर्भाग्य से, पूर्ण नॉकआउट के साथ कोई इंजेक्शन नहीं लगाया गया था, और जीवित इंजेक्शनों का बड़े पैमाने पर संभोग सफेद आंखों वाली संतान उत्पन्न करने में विफल रहा। हालांकि, बाद में एक अलग जीन (क्लोबासा एट अल, प्रगति पर) को लक्षित करके एक उत्परिवर्ती रेखा सफलतापूर्वक उत्पन्न हुई। इससे पता चलता है कि सफेद उत्परिवर्ती रेखा स्थापित करने में विफलता या तो ऑफ-टारगेट प्रभावों (यानी, जीनोम में कहीं और महत्वपूर्ण क्षेत्रों को काटने) के कारण सबसे अधिक संभावना है, जो एक निकटता से जुड़े घातक उत्परिवर्तन उत्पन्न करती है, या पी मैडिस में सफेद के लिए एक अप्रत्याशित महत्वपूर्ण भूमिका है।

फेनोटाइपिक और आणविक डेटा (चित्रा 8 और चित्रा 9) पुष्टि करते हैं कि इंजेक्शन भ्रूण के नमूने में सफेद लोकस में एक महत्वपूर्ण नॉकआउट बनाया गया था, जिसके परिणामस्वरूप जीन फ़ंक्शन का कुल नुकसान होगा। इसके अलावा, जबकि सफेद में उत्परिवर्तन कुछ प्रजातियों में व्यवहार्य हैं, कम सफेद गतिविधि के हानिकारक होने की मिसाल है21,22। उस ने कहा, ऑफ-टारगेट प्रभावों को पूरी तरह से खारिज नहीं किया जा सकता है। संभावित ऑफ-टारगेट की भविष्यवाणी करने के लिए सटीक जीनोम अनुक्रम डेटा23 की आवश्यकता होती है, जो पी मैडिस में जीनोमिक संसाधनों की वर्तमान स्थिति इस समय करना असंभव बनाती है। भले ही, इन नए तरीकों के साथ, अन्य लक्ष्य जीनों का परीक्षण आत्मविश्वास से किया जा सकता है, यहां तक कि इस घातक कीट में नए आनुवंशिक उपकरण लाने के प्रयास में अधिक पारंपरिक ट्रांसजेनेसिस की ओर बढ़ना।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

नॉर्थ कैरोलिना स्टेट यूनिवर्सिटी, कीटविज्ञान और प्लांट पैथोलॉजी विभाग, डीएआरपीए के कीट सहयोगी कार्यक्रम का समर्थन करने वाली एक टीम का हिस्सा है। व्यक्त किए गए विचार, राय और / या निष्कर्ष लेखकों के हैं और उन्हें रक्षा विभाग या अमेरिकी सरकार के आधिकारिक विचारों या नीतियों का प्रतिनिधित्व करने के रूप में व्याख्या नहीं की जानी चाहिए। लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया है। एमडीएल, डीआर और एईडब्ल्यू ने परियोजना की कल्पना की और वित्त पोषण अधिग्रहण, परियोजना प्रशासन और संसाधन प्रदान किए। एफसी, डब्ल्यूके, एनजी और एमडीएल ने माइक्रोइंजेक्शन प्रयोगों की कल्पना और डिजाइन किया; ओएच ने अंडे देने की विधि की कल्पना और डिजाइन किया। एफसी और डब्ल्यूके ने प्रयोगों का प्रदर्शन किया; एफसी और डब्ल्यूके ने परिणामों का विश्लेषण किया; और एफसी, डब्ल्यूके, एनजी और एमडीएल ने पांडुलिपि लिखी। लेखक पी. मैडिस कॉलोनियों को बनाए रखने में उनकी मदद के लिए काइल सोज़ांस्की और विक्टोरिया बार्नेट को विशेष धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 oz Containers Dart P100N Adult container for egg-laying setup
15 mL Conical Tubes Olympus Genesee 28-103 Serves as collection tube on vacuum aspirator setup
15 mL Conical Tubes Olympus Genesee 28-106 For making 10% sucorose solution and for holding adults when chilling before screening
Aspirator Bioquip 1135A For handling planthoppers
Vacuum Aspirator Fischer Technical LAV-3 Vacuum for aspirating larger numbers of insects
Blue Spectrum LED Lights Home Depot GLP24FS/19W/LED Grow lights for potted corn plants hoppers are feeding on
Cas9 TrueCut Cas9 Protein v2 A36498 Endonuclease for cutting planthopper genes
Clear Vinyl Tubing Home Depot 3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft. Connects collection tube to pump on vacuum aspirator setup
Corn planthoppers North Carolina State University N/A Request from Dr. Anna Whitfield's lab
Cotton balls Genessee 51-101 Serves as a filter/insect catcher in collection tube on vacuum aspirator setup
Double sided tape Scotch Double Sided Tape NA Holding eggs for microinjection
Early Sunglow corn Park Seed Company 05093-PK-N Corn for rearing planthoppers
epTIPS Microloader Tips Eppendorf C2554691 Backfilling needle loading tips
Femtojet Microinjection System Eppendorf 5247 Controls injection pressure (12-20 psi, depending on needle bore size)
Nutri-Fly Drosophila Agar Genessee 66-103 Substrate for everything except egg-laying dish
Fine forceps Bioquip 4731 Egg handling
General Purpose LE Agarose Apex 20-102 Substrate inn egg-laying dish (oviposition medium)
Guide RNA 1 - GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG Synthego CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) RNA guides for targeting planthopper white gene
Guide RNA 2 - UCUGAAAUCACUGGCCAAUA Synthego CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) RNA guides for targeting planthopper white gene
Guide RNA 3 - GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU Synthego CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) RNA guides for targeting planthopper white gene
Humidifyer Homedics UHE-CM45 For providing humidity in humidified hood
Humidity chamber Billups-Rothenberg MIC-101 For holding injected embryos until hatching
Insect rearing cages Bioquip (special order) Close to 1450 L (has plastic front and mesh fabric sides) Cage for planthoppers on corn
Laser-based Micropipiette Puller Sutter Instruments P-2000/G For making injection needles / Heat = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160
Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope Leica M165 FC Planthopper screening
Microinjection Scope Leica MZ12-5 Microinjection scope outfited with an XY stage
Micromanipulator Narishige MN-151 For positioning microinjection needle
Micropipette beveler Sutter Instruments FG-BV10-D For beveling injection needles / Used 'fine' graded plate at 20° angle
Microscope Stage AmScope GT100 X-Y Gliding Table For positioning and moving embryos under microscope
Miniature Paint Brush Testor #2 8733 Sold in 3 pack 281206 Fine paintbrushes for embryo handling
Needle Holder Narishige HI-7 For holding the microinjection needle
Percival Incubator Percival I41VLH3C8 Rearing injectees until hatch
Petri Dishes (100 x 15 mm) VWR 89038-968 Making agar dish for egg-lay
pGEM-T Easy Vector System I cloning kit Promega A1360 Cloning Pm white target site
Phenol Red Sigma 143-78-8 Microinjection buffer
Plain Microscope Slides or coverslip Fisher Scientific 12-549-3 Hold eggs for microinjection
Plasmid DNA Midi Kit Zymo D4200 Purification of injection-ready plasmid DNAs
Plastic paraffin film Pechiney Plastic Packaging PM-996 Roll size 4 in. x 125 ft
Plastic wrap Glad ClingWrap Plastic Wrap NA Wrap the entire egg-laying chamber
Primer - PmW CRISPR check F1 - AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA IDT 25 nmole DNA Oligo First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene
Primer - PmW CRISPR check R1 - GATTCCTCGCTGTTGGGT IDT 25 nmole DNA Oligo First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene
Primer - PmW CRISPR check F3 - TCACAGACCCTGGTGCTAATC IDT 25 nmole DNA Oligo Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene
Primer - PmW CRISPR check R3 - GTCCACAATCCACACTTCTGA IDT 25 nmole DNA Oligo Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene
Quartz capillaries Sutter Instruments QF100-50-10 For making microinjection needles / O.D. 1 mm, I.D. 0.7 mm, 10 cm length
Screen (White Organza Fabric) Joann Fabrics 16023889 For covering the adult container
Sparkleen Fisher Scientific 04-320-4 Wash dishes
Sucrose Fisher Scientific BP220-1 To make 10% sucorose solution

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 169 भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन कार्यात्मक जीनोमिक्स जर्मलाइन परिवर्तन सीआरआईएसपीआर /
कैस 9 जीनोम संपादन के लिए मकई प्लांटहॉपर, <em>पेरेग्रीनस मैडिस</em>, भ्रूण का माइक्रोइंजेक्शन
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Klobasa, W., Chu, F. C., Huot, O.,… More

Klobasa, W., Chu, F. C., Huot, O., Grubbs, N., Rotenberg, D., Whitfield, A. E., Lorenzen, M. D. Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing. J. Vis. Exp. (169), e62417, doi:10.3791/62417 (2021).

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