Summary
Här finns protokoll för insamling och mikroinjicering av precellulära majsplanthopparembryon i syfte att modifiera deras genom via CRISPR / Cas9-baserad genomredigering eller för tillägg av markerade transposerbara element genom germline transformation.
Abstract
Majshopparen, Peregrinus maidis, är ett skadedjur av majs och en vektor av flera majsvirus. Tidigare publicerade metoder beskriver utlösandet av RNA-interferens (RNAi) i P. maidis genom mikroinjektion av dubbelsträngade RNA (dsRNA) till nymfer och vuxna. Trots kraften hos RNAi är fenotyper som genereras via denna teknik övergående och saknar långsiktigt mendelskt arv. Därför måste P. maidis verktygslåda utvidgas till att omfatta funktionella genomiska verktyg som skulle möjliggöra produktion av stabila mutanta stammar, vilket öppnar dörren för forskare att använda nya bekämpningsmetoder för denna ekonomiskt viktiga skadegörare. Men till skillnad från dsRNA som används för RNAi, korsar komponenterna som används i CRISPR / Cas9-baserad genomredigering och germlinetransformation inte lätt cellmembran. Som ett resultat måste plasmid-DNA, RNA och / eller proteiner mikroinjiceras i embryon innan embryot celluleras, vilket gör tidpunkten för injektion till en kritisk faktor för framgång. För detta ändamål utvecklades en agarosbaserad äggläggningsmetod för att göra det möjligt att skörda embryon från P. maidis honor med relativt korta intervall. Här tillhandahålls detaljerade protokoll för insamling och mikroinjicering av precellulära P. maidis embryon med CRISPR-komponenter (Cas9-nukleas som har komplexiserats med guide-RNA), och resultat av Cas9-baserad genknockout av en P. maidis ögonfärgsgen, vit, presenteras. Även om dessa protokoll beskriver CRISPR/Cas9-genomredigering i P. maidis, kan de också användas för att producera transgen P. maidis via germline transformation genom att helt enkelt ändra sammansättningen av injektionslösningen.
Introduction
Majshopparen, Peregrinus maidis, är en ekonomiskt viktig skadegörare på majs 1,2,3. De orsakar direkt fysisk skada på växten, både när de matar med sina piercing-sugande mundelar och under reproduktion när de lägger sina embryon direkt i växtvävnad 2,4. Trots de många vägarna för direkt skada på grödor är den största inverkan dessa insekter har på grödans hälsa indirekt genom att fungera som vektor för majsmosaikvirus (MMV) och majsrandvirus 5,6. MMV kan replikera i kroppen av sin P. maidis vektor, vilket gör att viruset kan kvarstå i enskilda insekter under hela deras liv, så att de kan fortsätta att sprida viruset till nya värdväxter 7,8. De vanligaste metoderna för att kontrollera P. maidis, och därmed de virus som den vektorer, är insekticider.
Tyvärr har misskötsel av dessa produkter orsakat resistensutveckling hos målskadegöraren samt förorening av miljön9. Därför behövs nya strategier för att minska skördeförlusterna från denna kombination av insekter och virus-skadedjur. Tidigare arbete visade att RNA-interferens (RNAi) kan vara en effektiv kontrollmetod för P. maidis eftersom de är mottagliga för nedreglering i genuttryck även vid intag av dubbelsträngat RNA (dsRNA)10. Det mest effektiva sättet att administrera dsRNA i fältet skulle dock vara genom växterna som insekterna matar på; Därför kan grödor fortfarande vara mottagliga för eventuella virus som insekterna redan bär. Med tillkomsten av CRISPR / Cas9-genomredigering är nya skadedjursbekämpningsstrategier möjliga, inklusive Cas9-baserad gendrivare11,12, som kan användas för att minska storleken på en skadedjurspopulation eller för att ersätta nämnda population med individer som är resistenta mot de virus de vektor.
Utveckling och användning av alla typer av gendrivsystem kommer dock att kräva utveckling av transgena tekniker. Sådana metoder var inte nödvändiga för att utföra RNAi-experiment i P. maidis eftersom dsRNA och / eller siRNA antas kunna korsa cellmembran på grund av effektiviteten av RNAi i P. maidis10,13. Detta är inte sant för DNA och / eller proteiner som används i traditionell transgenes eller i Cas9-baserad genredigering, som båda skulle vara en föregångare till att skapa insekter som bär en gendrift. För att åstadkomma genredigering eller andra former av könscellsomvandling mikroinjiceras dessa DNA och proteiner idealiskt i embryon under syncytial blastoderm-stadiet, innan insektsembryot cellulariserar. Timing är kritisk, eftersom syncytialstadiet är den tidigaste delen av utvecklingen14,15. Eftersom P. maidis honor företrädesvis lägger sina ägg i växtvävnad kan det vara arbetskrävande och tidskrävande att extrahera tillräckliga mängder precellulära embryon för mikroinjektioner. Därför utvecklades nya tekniker för att snabbt samla in och mikroinjicera P. maidis embryon före cellularisering.
Protocol
1. Uppfödning på koloninivå av vuxna P. maidis
- Plantera minst fyra krukor majs per vecka per uppfödningsbur, med 3-4 frön per kruka. Odla i en insektsfri miljö.
- När växter är ~ 5 veckor gamla, placera inuti en 30 cm x 30 cm x 60 cm bur.
- Skaffa en tillräcklig mängd P. maidis vuxna (~ 500) från ett forskningslaboratorium eller naturen och placera i en insektssäker bur med 9-12 majsplantor (3-4 krukor).
- Håll kolonin i en insektsuppfödningsinkubator vid 25 °C (± 1 °C), med minst 70 % luftfuktighet och en ljuscykel på 14:10.
- För att generera en ålderskalibrerad koloni, ta bort alla initiala vuxna efter fyra dagars äggläggning och låt embryon som läggs i buren kläckas och åldras naturligt.
- Flytta 5 veckor gamla P. maidis insekter (vuxna) till färska majsplantor för veckovis subkultur genom att samla med en aspirator (figur 1). Släpp sedan de vuxna i en ren bur med färska majsplantor. För att upprätthålla en stadig tillgång på unga vuxna för experimentella ändamål, förbered färska ålderskalibrerade burar varje vecka.
- Vattna krukorna i burarna två gånger dagligen. Klipp regelbundet stjälkar, ta bort förfallna växtmaterial och ersätt med färska majskrukor efter behov.
OBS: Med rätt underhåll kan en koloni vara ~ 5 veckor (dvs tillräckligt länge för att embryon som läggs i buren ska bli vuxna).
2. Agarosbaserad äggläggningskammare
- Gör ägguppsamlingsfat (oviposition medium) genom att hälla 1% w/v agaros i vatten i rena 100 mm x 15 mm petriskålar. Förvara ovipositionsmediet vid 4 °C efter att det stelnat.
- Bered 10% w/v sackaroslösning för utfodring av vuxna. Förvara sackaroslösningen vid -20 °C i upp till en månad.
- Gör en kammare för att hålla de vuxna genom att klippa ett hål i botten av en 1 oz kopp (se materialtabellen) och limma en skärm över hålet för luftutbyte (figur 2).
- Skär plastparaffinvaxfilm i rutor på 5 cm x 5 cm; Lägg åt 2 rutor för varje kopp.
- Samla ~ 15 1 veckor gamla vuxna honor från en ålderskalibrerad P. maidis koloni. För att välja kvinnor, undersök den ventrala sidan av buken och leta efter ovipositorn, som vanligtvis är mörkare än resten av buken (figur 3). Håll vuxna i upp till en timme i en 15 ml konisk injektionsflaska om du ställer in flera äggläggningskammare. Kyl insekterna kort på is före könsbestämning och överför till den vuxna behållaren.
OBS: Denna undersökning kan göras utan mikroskop. Vuxna kvinnor som har haft tid att mata och para sig har också vanligtvis större bukar än vuxna män och är mer fogliga; Därför kan de lättare väljas från en burpopulation. - Överför honorna till en vuxen behållare och försegla koppen med 1 lager plastparaffinvaxfilm genom att jämnt sträcka den 3-4 gånger sin ursprungliga storlek (figur 4A, B).
- Applicera 400 μl 10 % w/v sackaroslösning på toppen av plastparaffinvaxfilmens försegling och tillsätt ett andra lager paraffinvaxfilm av plast och sträck ut paraffinvaxfilmen av plast exakt enligt ovan (figur 4C,D).
OBS: Smörgåsen av sträckt plastparaffinvaxfilm trycksätter sackaroslösningen, vilket är mycket viktigt för vuxenfoder, men kommer inte att hindra kvinnor från att genomborra sina ovipositorer hela vägen in i ovipositionsmediet. - Placera vuxenkammaren på en ägguppsamlingsskål med plastparaffinvaxfilmsidan direkt på ovipositionsmediet och linda in hela äggläggningskammaren med plastfolie utan att täcka lufthålen, eftersom dessa krävs för luftutbyte (figur 5).
- Inkubera varje äggläggningskammare vid 25 °C med 70 % luftfuktighet och en ljuscykel på 14:10.
- Byt smörgås av plastparaffinvaxfilm och 10% w / v sackaroslösning dagligen och ta bort allt vatten som ackumuleras inuti koppen.
3. Embryoinsamling och anpassning i en miljö med hög luftfuktighet
- Ställ in ett stereomikroskopbaserat mikroinjektionssystem i ett fuktat utrymme eller huva (fuktad huv; Figur 6) för att säkerställa att arbetsmiljön uppnår minst 70% luftfuktighet under hela mikroinjektionsprocessen.
- Kontrollera ovipositionsmediet för ägg efter önskad äggläggningsperiod. Gör detta i en fuktad huva eller annan fuktig miljö.
OBS: Äggläggningsperioden som vanligtvis användes var över natten, från 6 PM till 10 AM, varade ~ 16 timmar. - Om några ägg läggs i agarosen, använd fina pincett för att noggrant gräva ut dem och placera dem på agarosens yta för att hålla dem fuktiga (figur 7A).
- Applicera en remsa med 1 mm x 15 mm dubbelhäftande tejp på ett täckglas på 22 mm x 30 mm (bild 7B). Placera täckglasets sida uppåt på ovipositionsmediet (bild 7C).
- Plocka upp varje enskilt ägg från agarytan och flytta till den dubbelsidiga tejpen med en fin borste. Ta bort alla ägg som är helt vita eller har svart färg på dem. Friska ägg kommer att vara halvtransparenta.
- Placera de bananformade äggen på sidan, med den större änden fast på den dubbelhäftande tejpen (figur 7D).
OBS: Förvara alltid äggen i en miljö med hög luftfuktighet, till exempel en petriskål gjuten med ett lager av 1% agar på botten.
4. Beredning av CRISPR-reagens och injektionsnålar
- Dra kvartsnålar med en Flaming / Brown typ mikropipettavdragare.
- Avfasning av kvartsnålarna med en mikropipettfasning.
- Använd dubbelhäftande tejp för att säkra dragna nålar i en klar behållare, till exempel en petriskål, tills den är klar att användas.
- Bered injektionslösningen genom att kombinera 0,5 μl Cas9-protein (5 μg/μl stamlösning) och 0,5 μl sgRNA (4 μg/μl stamlösning; se materialtabellen) med 1 μl fenolröd buffert i en slutlig volym på 5 μl. För att fälla ut partiklar som kan täppa till nålen, virvla lösningen kort och centrifugera i 3 minuter med maximal hastighet.
- Återfyll injektionsnålen, var noga med att lämna injektionsblandningen nära nålens avsmalnande ände. Ta bort eventuella bubblor från nålspetsen.
- Placera försiktigt den återfyllda nålen i nålhållaren och dra åt kragen i rostfritt stål för att hålla nålen ordentligt på plats under mikroinjektionen.
- Generera ett tillförlitligt flöde av injektionslösning från nålen genom att försiktigt stryka den fasade spetsen med en fin, fuktad pensel, samtidigt som du levererar lufttryck till nålen med injektionssystemet.
OBS: Nålen är klar för injektion när injektionsblandningen kan lämna spetsen i små mängder.
5. Mikroinjektion och vård efter injektion
- Förbered en mikroinjektionsplattform genom att fylla en ren 100 mm x 15 mm petriskål med 1% agar för att bilda ett jämnt lager agar som spolas med toppen av skålen.
- Placera ett tidigare berett täckglas med ~ 25 embryon på agarplattformen (figur 8A).
OBS: Alla injektionssteg måste utföras inuti en fuktad huva (~ 70% luftfuktighet). - Kontrollera injektionstrycket genom att placera nålspetsen i en droppe vatten och starta injektionscykeln.
Anmärkning: En liten mängd injektionslösning ska lösas upp i vattnet om tryckinställningen är korrekt (figur 8B). - För in nålen i den större änden av embryot och närmar sig från vänster sida av täckglaset (figur 8C). Leverera injektionslösningen i ägget och dra snabbt ut nålen.
- När alla ägg har injicerats, placera täckglaset på ytan av en ny 1% agarfat och överför skålen till en fuktighetskammare (figur 9).
6. Ruvning och kläckning av embryon
- Sätt kläckningskammaren i en 25 °C inkubator i 6 dagar.
- Överför alla överlevande embryon, med rent vatten och en fin borste, till en 35 mm x 10 mm petriskål med vattenfuktat filterpapper som täcker botten av skålen. Förslut petriskålen med paraffinvaxfilm av plast och håll den vid 25 °C så att embryona kläcks. Börja kontrollera embryon 6 dagar efter injektionen för överlevnad.
OBS: De första instarnymferna börjar kläckas runt dag 8. - Överför nymfer med en fin borste till en petriskål som innehåller bladklipp. Täck skålen och försegla med paraffinvaxfilm av plast.
- Inkubera den förseglade skålen med ungar på sticklingar i 48 timmar vid 25 °C.
- Överför alla 2 dagar gamla nymfer från en injektionsrunda till en uppfödningsbur med majsplantor med en fin borste. Om injektioner med synlig fenotyp återvinns i tillräckligt antal, baka dem separat för att maximera återhämtningen av målegenskapen i nästa generation. Annars utför massparning av alla injektionspersoner.
OBS: Placera ungarna försiktigt i majsplantans virvel för att ge tillflykt och säkerställa korrekt fuktighet i deras omedelbara miljö. - Bakre insekterna under de ovan beskrivna förhållandena, vilket säkerställer korrekt temperatur, fuktighet och regelbundna överföringar till färska majsplantor.
- Skärmavkomma för förväntade fenotyper. Placera individer som uppvisar önskad fenotyp i sin egen bur för att etablera homozygota linjer.
Representative Results
Äggläggningskammaren var speciellt utformad för att göra det möjligt för P. maidis honor att mata medan de ägglossning i ett skyddande medium från vilket deras ägg lätt kunde återvinnas. Med hjälp av denna metod återfanns tillräckliga mängder precellulära embryon för mikroinjektion med DNA, RNA och / eller proteiner. Vuxna P. maidis honor lägger vanligtvis ägg inuti bladvävnaden hos majsplantorna, vilket gör att få tillräckligt med ägg på kort tid en utmaning eftersom det kräver mycket bladdissektion. Den konstgjorda äggläggningsmiljön ger en lösning för att övervinna dessa problem. Som framgår av tabell 1 samlades 6 483 ägg in från totalt 645 honor på 4 veckor. Kvinnor börjar vanligtvis lägga ägg efter dag 2 och ger de flesta ägg från dag 4 till dag 6. Ovipositionsaktiviteten avtog vid dag 9. Varje ovipositionskammare inrättades på fredagen och kontrollerades för ägg från söndag till nästa söndag. Efter detta schema kunde de flesta ägg samlas in för mikroinjektioner under arbetsveckan.
Den första praktiska tillämpningen av detta äggläggningssystem var att testa effekten av Cas9-medierad genknockout, med P. maidis ortolog av ögonfärggenen, vit (Pmw), som mål. Mutationer i vitt är kända för att resultera i betydande förlust av ögonpigmentering hos andra insektsarter, och vitt är cellautonomt, vilket gör att mutationer kan detekteras hos injicerade individer16,17. För att öka chansen att även en liten mutation kan leda till förlust av funktion, utformades guide-RNA för att skära inom området för den ATP-bindande kassetten, vilket är nödvändigt för vit funktion16. P. maidis embryon injicerades med antingen 20% fenolrött (injektionsbuffert), injektionsbuffert med Cas9 vid en slutlig koncentration av 800 ng / μL (Cas9-kontroll) eller Cas9 i injektionsbuffert tillsammans med tre guide-RNA tillsatta i en koncentration av 400 ng / μL vardera. Kombinationen av tre guider inom en injektionsmix var avsedd att ytterligare maximera chanserna att generera mutanter, både genom att skapa en stor radering och genom att kompensera för möjligheten att någon guide kan vara ineffektiv för skärning. Utvecklingstakten för varje behandling var jämförbar (tabell 2), där 50-60% av de injicerade individerna visade tecken på utveckling. Kläckningshastigheterna för buffert- och Cas9-kontrollerna var också jämförbara. Kläckningsgraden för individer som fick treguideblandningen var dock relativt lägre. För närvarande är det oklart om den reducerade överlevnaden är resultatet av förlusten av vit funktion eller resultatet av oavsiktliga konsekvenser av treguideblandningen, såsom off-target-effekter (se diskussionsavsnittet). Ingen av individerna med fullständig förlust av ögonpigmentering (dvs. fullständig knockout) kläcktes dock, och ingen av avkomman till injicerade individer hade vita ögon. Effekten på målet av Cas9-baserad mutagenes verifierades på två sätt. Först screenades injektioner för förlust av ögonpigmentering.
Av de 71 guideinjicerade individerna som utvecklades visade 23 en viss grad av pigmentförlust (figur 10) och 9 av dessa individer kläcktes, vilket resulterade i en knockoutfrekvens på ≥32%. Ingen ögonpigmentförlust observerades i någon av kontrollbehandlingarna. För det andra bekräftades kromosomala mutationer via polymeraskedjereaktion (PCR)18 och sekvensering19. Eftersom en mutantlinje inte kunde återvinnas analyserades genomiskt DNA från pooler av embryon injicerade med antingen treledarblandningen eller bufferten. Treguideblandningen förväntas ta bort ~ 180 baspar från den vita locusen. Detta kan ses i PCR-produkter som amplifierats av genomiskt DNA isolerat från injicerade individer, liksom tillhörande sekvensdata som genereras från dessa produkter (figur 11). Detta kombinerade bevis tyder på att embryon injicerades innan cellularisering inträffade.
Figur 1: Aspirerare. En effektiv sug kan monteras från att fästa en vakuumpump vid intaget, via plaströr, till ett 15 ml koniskt plaströr. Cirka 0,5 cm ska försiktigt avlägsnas från botten av det koniska röret. En bomullstuss ska placeras i det koniska röret, över plaströrets öppning, för att fånga P. maidis vuxna när de samlas in och hålla dem borta från vakuumpumpen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Konstruktion av vuxna containrar. (A) De förnödenheter som behövs (medurs uppifrån vänster): skärm, varm limpistol, rakblad, 1 oz behållare. (B) Ett stort hål ska skäras i botten av 1 oz-behållaren, och en kvadrat av skärm skärs precis tillräckligt stor för att täcka detta hål. (C) Skärmen limmas sedan över hålet med varmt lim. (D) När limet har stelnat ska eventuellt överflödigt nät tas bort. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Könning av P. maidis vuxna. De ventrala sidorna av manliga (vänster) och kvinnliga (höger) P. maidis vuxna visas. Ovipositorn, synlig över kvinnobuken, är den tydligaste indikatorn på en individs kön. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Försegling av vuxna i behållare . A) En kvadrat av paraffinvaxfilm av plast på 5 x 5 cm. (B) Filmen ska sträckas jämnt till 3-4 gånger sin ursprungliga storlek. (C) När vuxna har lagts i vuxenbehållaren ska den sträckta filmen placeras över öppningen för att säkra de vuxna. En 400 μl droppe 10 % w/v sackaroslösning placeras sedan ovanpå filmen. (D) För att ge de vuxna tillräckligt matningstryck bör en andra 5 cm x 5 cm kvadrat av plastparaffinfilm sträckas ut på samma sätt och placeras över sackarosdroppen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Upprättande av en ägglossningskammare. (A) De förnödenheter som behövs (medurs uppifrån vänster): plastfolie, en färdig vuxenbehållare (med vuxna) och en petriskål med 1% agaros (ovipositionsmedium). (B) Behållaren för vuxna ska placeras på agarosen med plastparaffinfilm/10 % sackarossmörgås placerad direkt på ovipositionsmediet. (C) Plastfolie används för att fästa vuxenbehållaren vid ovipositionsmediet. Detta förhindrar att mediet torkar ut för snabbt. (D) Försiktighet bör iakttas för att undvika att täcka skärmen på vuxenbehållaren, så att luftutbytet fortfarande kan fortsätta. (E) Diagram över ovipositionskammaren. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Befuktad huva. En huva utrustad med en luftfuktare har satts upp runt injektionsomfånget för att minimera luftdrag och bibehålla fuktigheten medan embryona hanteras. Klaffar kan vikas över ingången efter att arbetaren är på plats, för att hjälpa till att upprätthålla lämpliga fuktighetsnivåer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Insamling av embryon som förberedelse för injektioner . a) Embryon som har deponerats i ovipositionsmediet. Ett par fina pincett används för att extrahera embryon från mediet och placera dem på ytan. (B) En smal remsa med 1 mm x 15 mm dubbelhäftande tejp på ett täckglas på 22 mm x 30 mm. (C) Täckglaset kan placeras på ägglägesmediet för att underlätta överföring av embryon från mediets yta till tejpen på täckglaset. D) P. maidis embryon är bananformade, med ena änden smalare än den andra (smal ände markerad med rött pilhuvud; bredare ände markerad med gult pilhuvud i exempelembryot). Den breda änden av embryot ska placeras på bandet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Injektion. (A) Injektionsplattformen är en petriskål fylld till brädden med 1% agar. Täckglaset med en remsa tejp som håller embryon ska placeras direkt på injektionsplattformens yta. (B) Injektionstrycket bör testas innan embryon injiceras genom att "injicera" en liten mängd injektionslösning i en droppe vatten. Denna metod kan också användas när som helst under injektionsprocessen för att kontrollera nålen för träskor. (C) Embryon ska injiceras genom att nålen förs in i den större änden av embryot. Injektionslösningen ska vara synlig om injektionen lyckades. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Vård efter injektion . a) När alla embryon på ett täckglas har injicerats ska täckglaset placeras i en färsk petriskål som innehåller 1 % agaros. (B) Petriskålen med täckglaset kan sedan förvaras i en fuktkammare (som den som visas) tills embryon kläcks. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10: Pmw knockout fenotyp. (A) Åldersmatchad kontroll och (B) Pmw knockout-embryon, med utvecklande ögon markerade med svarta pilspetsar. Embryot i B är mosaik, eftersom en liten rand av pigmentering kan ses. (C) Åldersmatchad kontroll och (D) Pmw knockout hatchlings, med insatser som visar en annan vinkel på ögonen. Kläckningen i D är också mosaik. En vit pil pekar på ett område i huvudbilden som visar förlust av pigmentering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 11: Pmw knockout-sekvens. (A) Skalenlig modell av Pmw mRNA, märkt i steg om 500 bp, med platser för gRNA-bindningsställen indikerade: G1, blå; G2, gul; G3, rosa. Alla ramförskjutningsmutationer som genereras vid denna tidpunkt kommer att störa majoriteten av översättningsprodukten. (B) Genomisk kontext för gRNA-platser, allt i en exon (fet text). Bindningsställen markeras i samma färger som A och PAMs är understrukna. Spännvidden är ~300 bp. Översättningen av exon i ramen visas ovan, som förkortningar med en bokstav i versaler. Två motiv som är specifika för ögonpigmenttransportörer är markerade. CDEPT-motivet för den funktionella domänen Walker B är förpackat i lila och IHQP-motivet för H-loop-domänen är förpackat i grönt. Båda domänerna är kritiska för ATP-transportörfunktionen. (C) Pmw-målregionen förstärktes med hjälp av två omgångar PCR. Den andra omgångens produkt undersöktes på en gel för bevis på storleksförskjutning på grund av framgångsrikt avlägsnande av regionen mellan guiderna. Körfält: L = 100 bp stege; 1 = PCR-vattenkontroll; 2 = Bufferinjicerade ägg; 3-4 = två separata uppsättningar ägg injicerade med treledarblandning. Endast embryon som fick treguideblandningen producerade både WT-bandet (röd pil) och bandet som härrör från en fullständig excision (vit pil). (D) För att bekräfta identiteten på det nedre (vita pilen) bandet renades, klonades och sekvenserades detta DNA. Den översta raden är vildtypsekvensen. De andra två raderna är sekvenser från två kloner. Ytterligare tre kloner matchade den nedre sekvensen. Blå markering anger bindningsstället för guide 1, medan rosa markering indikerar bindningsstället för guide 3. I båda allelerna har hela regionen mellan dessa två guidesidor tagits bort. Förkortningar: Pmw = Peregrinus maidis vit gen; gRNA = guide RNA; PAM = protospacer intilliggande motiv; ATP = adenosintrifosfat; PCR = polymeraskedjereaktion; WT = vildtyp; KO = knockout. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Ställa | # av koppar | # av honor i varje kopp | # av ägg | Totalt # ägg | |||||||
| Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 5 | Dag 6 | Dag 7 | Dag 8 | Dag 9 | ||||
| 1 | 10 | 15 | 0 | 26 | 166 | 355 | 530 | 193 | 91 | 37 | 1398 |
| 2 | 15 | 15 | 22 | 238 | 489 | 699 | 520 | 379 | 203 | 58 | 2608 |
| 3 | 8 | 15 | 0 | 57 | 230 | 190 | 116 | 80 | 34 | 1 | 708 |
| 4 | 10 | 15 | 0 | 226 | 446 | 519 | 301 | 179 | 24 | 15 | 1710 |
| Total | 43 | 15 | 23 | 547 | 1331 | 1763 | 1467 | 831 | 352 | 111 | 6483 |
Tabell 1: Representativa äggsamlingar från artificiell ovipositionsmiljö. Data från fyra uppsättningar ägguppsamlingskoppar visas, med äggtal som börjar den andra dagen efter installationen och löper till den nionde dagen.
| Injektionsbehandling | Totalt injicerat | Totalt utvecklad | Totalt kläckta | Utvecklingstakt (%) | Kläckningshastighet (%) |
| Buffert | 39 | 20 | 12 | 51 | 31 |
| Cas9 | 39 | 24 | 14 | 61 | 36 |
| Cas9 + Pmw gRNA | 121 | 71 | 28 | 59 | 28 |
Tabell 2: Överlevnad och knockoutfrekvens från injektioner av 3 olika injektionsblandningar.
Discussion
Äggläggningskvalitet och näring
Nyligen fick forskare som arbetar med en besläktad art, Nilaparvata lugens, äggen som de använde för mikroinjektioner direkt från bladet och behöll de injicerade äggen i bladvävnaden tills de kläcktes17. Medan denna bladbaserade metod gav en mer naturlig miljö för embryonal utveckling, ökade den också risken för infektioner och äggskador under borttagningsprocessen. Det artificiella ovipositionssystemet som presenteras här ger en mer enhetlig miljö och minskar risken för skador på äggen från hantering. Genom att ställa in ovipositionskopparna på fredagen samlades majoriteten av de ovipositerade äggen under en typisk arbetsvecka, till förmån för dem som gjorde mikroinjektionsarbetet. En varning för denna metod är dock att bristen på näringsämnen i 10% sackaroslösningsdieten så småningom kommer att påverka insekternas hälsa, och honor i kopparna börjar vanligtvis dö av efter bara 10 dagar. Äggkvaliteten börjar också sjunka efter 6 dagar, vilket framgår av en ökning av döda eller ohälsosamma ägg. Som ett resultat är det viktigt att vara selektiv av äggen som används för mikroinjektioner och att inte behålla honorna efter dag 6.
Överlevnad och fuktighet
Två faktorer verkar vara avgörande för embryonal överlevnad genom mikroinjektionsprocessen. Den mest utmanande aspekten av att hantera P. maidis embryon är att hålla dem från uttorkning efter avlägsnande från ovipositionsmediet och under hela mikroinjektionen. Eftersom äggen vanligtvis läggs inuti växtvävnad saknar de ett tillräckligt skal för att förhindra uttorkning. Även i den fuktade huven förlorades hela uppsättningar ägg på grund av uttorkning. För hög luftfuktighet kan dock också påverka mikroinjektionerna om vatten ackumuleras på den dubbelhäftande tejpen eller på kikarsiktet. Tyvärr var ägguttorkning vanligtvis inte lätt att märka under mikroinjektionsprocessen, och de verkade ofta normala tills 2 eller 3 dagar senare, när de blev helt transparenta och inte visade några tecken på utveckling.
Nålkvalitet verkar också spela en viktig roll för överlevnad. Nålen ska avfasas för att minimera onödig skada på ägget. När nålen är blockerad återställde nålen vanligtvis till ett funktionellt tillstånd med hjälp av rensningsfunktionen på injektorn medan du försiktigt strök nålspetsen med en fuktad pensel (se steg 4.7). Oavsett rekommenderas att endast små mängder injektionslösning (~ 0,25 μL) sätts i varje nål och byter till en ny nål med några få bilder (~ 50-60 ägg) för att säkerställa att nålkvaliteten bibehålls under hela injektionsprocessen.
Framgångsrik generering av en knockoutfenotyp
För att framgångsrikt omvandla könscellerna måste embryomikroinjektioner vanligtvis göras så tidigt som möjligt före cellularisering. Beroende på insektsart varierar tidsfönstret för att slutföra mikroinjektionerna från bara ett par timmar till så länge som en hel dag14,15,20. Det är fortfarande oklart när P. maidis embryon genomgår cellularisering. Cas9-medierad knockout testades på embryon så unga som 4 timmar efter äggläggning (pel) till så många som 16 h pel, och de förväntade fenotyperna observerades i alla experiment, vilket tyder på att alla mikroinjektioner utfördes inom precelluriseringsfönstret.
P. maidis ortolog av ögonfärgsgenen, vit, valdes eftersom knockoutfenotypen förväntades vara lätt att screena i injektioner på grund av dess cellautonoma natur. Som förväntat var både mosaik och totala knockouts tydligt identifierbara bland embryon som fick injektionsblandningen innehållande Cas9 och guide-RNA. Tyvärr kläcktes inga injektioner med fullständig knockout, och en massparning av överlevande injektionssprutor misslyckades med att generera vitögd avkomma. En mutantlinje genererades dock senare framgångsrikt genom att rikta in sig på en annan gen (Klobasa et al., pågår). Detta tyder på att misslyckandet med att etablera en vit mutantlinje troligen beror på antingen off-target-effekter (dvs. Cas9 skär viktiga regioner någon annanstans i genomet) som genererar en nära kopplad dödlig mutation eller till en oförutsägbar kritisk roll för vit i P. maidis.
Fenotypiska och molekylära data (figur 8 och figur 9) bekräftar att en signifikant knockout i den vita locus skapades i ett prov av injicerade embryon, vilket skulle resultera i total förlust av genfunktion. Dessutom, medan mutationer i vitt är livskraftiga hos vissa arter, finns det prejudikat för minskad vit aktivitet som är skadlig21,22. Som sagt, off-target effekter kan inte helt uteslutas. Att förutsäga sannolika off-targets kräver noggrann genomsekvensdata23, vilket det nuvarande tillståndet för genomiska resurser i P. maidis gör omöjligt att göra just nu. Oavsett, med dessa nya metoder kan testning av andra målgener göras med tillförsikt, till och med gå mot mer traditionell transgenes i ett försök att få nya genetiska verktyg till denna skadliga skadedjur.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
North Carolina State University, Institutionen för entomologi och växtpatologi, är en del av ett team som stöder DARPA: s insektsallierade program. De åsikter, åsikter och / eller resultat som uttrycks är författarnas och bör inte tolkas som att de representerar försvarsdepartementets eller den amerikanska regeringens officiella åsikter eller politik. Författarna förklarar inte några konkurrerande intressen. MDL, DR och AEW utformade projektet och tillhandahöll finansieringsförvärv, projektadministration och resurser. FC, WK, NG och MDL utformade mikroinjektionsexperimenten; OH utformade och utformade äggläggningsmetoden. FC och WK utförde experimenten; FC och WK analyserade resultaten; och FC, WK, NG och MDL skrev manuskriptet. Författarna vill särskilt tacka Kyle Sozanski och Victoria Barnett för deras hjälp med att upprätthålla P. maidis kolonier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 oz Containers | Dart | P100N | Adult container for egg-laying setup |
| 15 mL Conical Tubes | Olympus | Genesee 28-103 | Serves as collection tube on vacuum aspirator setup |
| 15 mL Conical Tubes | Olympus | Genesee 28-106 | For making 10% sucorose solution and for holding adults when chilling before screening |
| Aspirator | Bioquip | 1135A | For handling planthoppers |
| Vacuum Aspirator | Fischer Technical | LAV-3 | Vacuum for aspirating larger numbers of insects |
| Blue Spectrum LED Lights | Home Depot | GLP24FS/19W/LED | Grow lights for potted corn plants hoppers are feeding on |
| Cas9 | TrueCut Cas9 Protein v2 | A36498 | Endonuclease for cutting planthopper genes |
| Clear Vinyl Tubing | Home Depot | 3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft. | Connects collection tube to pump on vacuum aspirator setup |
| Corn planthoppers | North Carolina State University | N/A | Request from Dr. Anna Whitfield's lab |
| Cotton balls | Genessee | 51-101 | Serves as a filter/insect catcher in collection tube on vacuum aspirator setup |
| Double sided tape | Scotch Double Sided Tape | NA | Holding eggs for microinjection |
| Early Sunglow corn | Park Seed Company | 05093-PK-N | Corn for rearing planthoppers |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Femtojet Microinjection System | Eppendorf | 5247 | Controls injection pressure (12-20 psi, depending on needle bore size) |
| Nutri-Fly Drosophila Agar | Genessee | 66-103 | Substrate for everything except egg-laying dish |
| Fine forceps | Bioquip | 4731 | Egg handling |
| General Purpose LE Agarose | Apex | 20-102 | Substrate inn egg-laying dish (oviposition medium) |
| Guide RNA 1 - GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
| Guide RNA 2 - UCUGAAAUCACUGGCCAAUA | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
| Guide RNA 3 - GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
| Humidifyer | Homedics | UHE-CM45 | For providing humidity in humidified hood |
| Humidity chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | For holding injected embryos until hatching |
| Insect rearing cages | Bioquip (special order) | Close to 1450 L (has plastic front and mesh fabric sides) | Cage for planthoppers on corn |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | For making injection needles / Heat = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160 |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | Planthopper screening |
| Microinjection Scope | Leica | MZ12-5 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Micromanipulator | Narishige | MN-151 | For positioning microinjection needle |
| Micropipette beveler | Sutter Instruments | FG-BV10-D | For beveling injection needles / Used 'fine' graded plate at 20° angle |
| Microscope Stage | AmScope | GT100 X-Y Gliding Table | For positioning and moving embryos under microscope |
| Miniature Paint Brush | Testor #2 8733 | Sold in 3 pack 281206 | Fine paintbrushes for embryo handling |
| Needle Holder | Narishige | HI-7 | For holding the microinjection needle |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | Rearing injectees until hatch |
| Petri Dishes (100 x 15 mm) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay |
| pGEM-T Easy Vector System I cloning kit | Promega | A1360 | Cloning Pm white target site |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Plain Microscope Slides or coverslip | Fisher Scientific | 12-549-3 | Hold eggs for microinjection |
| Plasmid DNA Midi Kit | Zymo | D4200 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Roll size 4 in. x 125 ft |
| Plastic wrap | Glad ClingWrap Plastic Wrap | NA | Wrap the entire egg-laying chamber |
| Primer - PmW CRISPR check F1 - AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
| Primer - PmW CRISPR check R1 - GATTCCTCGCTGTTGGGT | IDT | 25 nmole DNA Oligo | First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
| Primer - PmW CRISPR check F3 - TCACAGACCCTGGTGCTAATC | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
| Primer - PmW CRISPR check R3 - GTCCACAATCCACACTTCTGA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
| Quartz capillaries | Sutter Instruments | QF100-50-10 | For making microinjection needles / O.D. 1 mm, I.D. 0.7 mm, 10 cm length |
| Screen (White Organza Fabric) | Joann Fabrics | 16023889 | For covering the adult container |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | To make 10% sucorose solution |
References
- Namba, R., Higa, S. Y. Host plant studies of the corn planthopper, Peregrinus maidis (Ashmead) in Hawaii. Proceedings of the Hawaiian Entomological Society. 21, 105-108 (1971).
- Singh, B. U., Seetharama, N. Host plant interactions of the corn planthopper, Peregrinus maidis Ashm.(Homoptera: Delphacidae) in maize and sorghum agroecosystems. Arthropod-Plant Interactions. 2 (3), 163-196 (2008).
- Tsai, J. Occurrence of a corn disease in Florida transmitted by Peregrinus maidis. Plant Disease Reporter. 59 (10), 830-833 (1975).
- Chelliah, S., Basheer, M. Biological studies of Peregrinus maidis (Ashmead) (Araeopidae: Homoptera) on sorghum. Indian Journal of Entomology. 27, 466-471 (1965).
- Lastra, J., Esparza, J. Multiplication of vesicular stomatitis virus in the leafhopper Peregrinus maidis (Ashm.), a vector of a plant rhabdovirus. Journal of General Virology. 32 (1), 139-142 (1976).
- Nault, L. R., Ammar, E. -D. Leafhopper and planthopper transmission of plant viruses. Annual Review of Entomology. 34 (1), 503-529 (1989).
- Ammar, E. -D., Tsai, C. -W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts. Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).
- Barandoc-Alviar, K., Ramirez, G. M., Rotenberg, D., Whitfield, A. E. Analysis of acquisition and titer of Maize mosaic rhabdovirus in its vector, Peregrinus maidis (Hemiptera: Delphacidae). Journal of Insect Science. 16 (1), 14 (2016).
- Tsai, J. H., Steinberg, B., Falk, B. W. Effectiveness and residual effects of seven insecticides on Dalbulus maidis (Homoptera: Cicadellidae) and Peregrinus maidis (Homoptera: Delphacidae). Journal of Entomological Science. 25 (1), 106-111 (1990).
- Yao, J., Rotenberg, D., Afsharifar, A., Barandoc-Alviar, K., Whitfield, A. E. Development of RNAi methods for Peregrinus maidis, the corn planthopper. PloS One. 8 (8), 70243 (2013).
- Esvelt, K. M., Smidler, A. L., Catteruccia, F., Church, G. M. Emerging technology: concerning RNA-guided gene drives for the alteration of wild populations. Elife. 3, 03401 (2014).
- Gantz, V. M., Bier, E. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 348 (6233), 442-444 (2015).
- Yao, J., Rotenberg, D., Whitfield, A. E. Delivery of maize mosaic virus to planthopper vectors by microinjection increases infection efficiency and facilitates functional genomics experiments in the vector. Journal of Virological Methods. 270, 153-162 (2019).
- Kimelman, D., Martin, B. L. Anterior-posterior patterning in early development: three strategies. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (2), 253-266 (2012).
- Mito, T., Nakamura, T., Noji, S. Evolution of insect development: to the hemimetabolous paradigm. Current Opinion in Genetics & Development. 20 (4), 355-361 (2010).
- Grubbs, N., Haas, S., Beeman, R. W., Lorenzen, M. D. The ABCs of eye color in Tribolium castaneum: orthologs of the Drosophila white, scarlet, and brown Genes. Genetics. 199 (3), 749-759 (2015).
- Xue, W. H., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of two eye pigmentation genes in the brown planthopper, Nilaparvata lugens (Hemiptera: Delphacidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 93, 19-26 (2018).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3998 (2012).
- Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94 (3), 441-448 (1975).
- Chu, F. C., Wu, P. S., Pinzi, S., Grubbs, N., Lorenzen, M. D. Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or CRISPR/Cas9 genome editing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57497 (2018).
- Brent, C. S., Hull, J. J. RNA interference-mediated knockdown of eye coloration genes in the western tarnished plant bug (Lygus hesperus Knight). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 100 (2), 21527 (2019).
- Khan, S. A., Reichelt, M., Heckel, D. G. Functional analysis of the ABCs of eye color in Helicoverpa armigera with CRISPR/Cas9-induced mutations. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Manghwar, H., et al. CRISPR/Cas systems in genome editing: methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects. Advanced Science. 7 (6), 1902312 (2020).
