Summary
Her er protokoller for innsamling og mikroinjeksjon av precellulære maisplantehopperembryoer med det formål å modifisere genomet deres via CRISPR / Cas9-basert genomredigering eller for tilsetning av markerte transponerbare elementer gjennom kimlinjetransformasjon.
Abstract
Maisplanthopperen, Peregrinus maidis, er et på mais og en vektor av flere maisvirus. Tidligere publiserte metoder beskriver utløsing av RNA-interferens (RNAi) i P. maidis gjennom mikroinjeksjon av dobbeltstrengede RNA (dsRNA) i nymfer og voksne. Til tross for kraften til RNAi, er fenotyper generert via denne teknikken forbigående og mangler langsiktig mendelsk arv. Derfor må P. maidis-verktøykassen utvides til å omfatte funksjonelle genomiske verktøy som vil muliggjøre produksjon av stabile mutantstammer, og åpne døren for forskere å bringe nye kontrollmetoder til å bære på dette økonomisk viktige. Imidlertid, i motsetning til dsRNAene som brukes til RNAi, krysser komponentene som brukes i CRISPR / Cas9-basert genomredigering og kimlinjetransformasjon ikke lett cellemembraner. Som et resultat må plasmid-DNA, RNA og / eller proteiner mikroinjiseres i embryoer før embryocellulariseringen, noe som gjør tidspunktet for injeksjon en kritisk faktor for suksess. For dette formål ble en agarosebasert eggleggingsmetode utviklet for å tillate embryoer å bli høstet fra P. maidis-hunner med relativt korte intervaller. Her er gitt detaljerte protokoller for innsamling og mikroinjeksjon av precellulære P. maidis-embryoer med CRISPR-komponenter (Cas9-nuklease som har blitt kompleksert med guide-RNA), og resultater av Cas9-basert genknockout av et P. maidis øyenfargegen, hvitt, presenteres. Selv om disse protokollene beskriver CRISPR/Cas9-genomredigering i P. maidis, kan de også brukes til å produsere transgen P. maidis via kimlinjetransformasjon ved ganske enkelt å endre sammensetningen av injeksjonsoppløsningen.
Introduction
Maisplantehopperen, Peregrinus maidis, er et økonomisk viktig på mais 1,2,3. De forårsaker direkte fysisk skade på planten, både mens de spiser med sine piercing-sugende munndeler, og under reproduksjon når de legger embryoene sine direkte inn i plantevev 2,4. Til tross for de mange rutene for direkte skade på avlinger, er den største effekten disse insektene har på avlingshelsen indirekte, ved å fungere som vektor av maismosaikkvirus (MMV) og maisstripevirus 5,6. MMV er i stand til å replikere i kroppen av sin P. maidis-vektor, slik at viruset kan vedvare i individuelle insekter gjennom hele livet, slik at de kan fortsette å spre viruset til nye vertsplanter 7,8. De vanligste metodene for å kontrollere P. maidis, og dermed virusene det vektorer, er insektmidler.
Dessverre har dårlig forvaltning av disse produktene forårsaket utvikling av resistens i målskadedyret samt forurensning av miljøet9. Derfor er det behov for nye strategier for å redusere avlingstap fra denne insekt / virus-skadedyrskombinasjonen. Tidligere arbeid viste at RNA-interferens (RNAi) kan være en effektiv kontrollmetode for P. maidis fordi de er utsatt for nedregulering i genuttrykk selv ved inntak av dobbeltstrenget RNA (dsRNA)10. Imidlertid vil den mest effektive måten å administrere dsRNA i feltet være gjennom plantene insektene spiser på; Derfor kan avlinger fortsatt være utsatt for virus insektene allerede bærer. Med fremkomsten av CRISPR / Cas9-genomredigering, er nye skadedyrbekjempelsesstrategier mulige, inkludert Cas9-basert gendrift11,12, som kan brukes til å redusere størrelsen på en skadedyrpopulasjon, eller for å erstatte befolkningen med individer som er resistente mot virusene de vektor.
Imidlertid vil utvikling og distribusjon av enhver type gen-drive system kreve utvikling av transgene teknikker. Slike metoder var ikke nødvendige for å utføre RNAi-eksperimenter i P. maidis fordi dsRNA og/eller siRNA antas å kunne krysse cellemembraner på grunn av effektiviteten av RNAi i P. maidis10,13. Dette er ikke sant for DNAer og / eller proteiner som brukes i tradisjonell transgenese eller i Cas9-basert genredigering, som begge ville være en forløper for å skape insekter som bærer en gendrift. For å oppnå genredigering eller andre former for kimlinjetransformasjon, blir disse DNAene og proteinene ideelt mikroinjisert i embryoer under syncytial blastodermstadiet, før når insektembryoet cellulariseres. Timing er kritisk, fordi syncytialstadiet er den tidligste delen av utviklingen14,15. Siden P. maidis-hunner fortrinnsvis legger eggene sine i plantevev, kan det være arbeidskrevende og tidkrevende å trekke ut tilstrekkelige mengder precellulære embryoer til mikroinjeksjoner. Derfor ble nye teknikker utviklet for raskt å samle og mikroinjisere P. maidis-embryoer før cellularisering.
Protocol
1. Oppdrett på koloninivå av P. maidis voksne
- Plant minimum fire potter mais per uke per oppdrettsbur, med 3-4 frø per potte. Vokse i et insektfritt miljø.
- Når plantene er ~ 5 uker gamle, plasser inne i et 30 cm x 30 cm x 60 cm bur.
- Få en tilstrekkelig mengde P. maidis voksne (~ 500) fra et forskningslaboratorium eller naturen, og legg inn i et insektsikkert bur med 9-12 maisplanter (3-4 potter).
- Hold kolonien i en insektoppdrettsinkubator ved 25 °C (± 1 °C), med minst 70 % fuktighet og en lyssyklus på 14:10.
- For å generere en alderskalibrert koloni, fjern alle første voksne etter fire dager med egglegging, og la embryoene som ligger i buret klekkes og eldes naturlig.
- Flytt 5 uker gamle P. maidis-insekter (voksne) til ferske maisplanter for ukentlig subkultur ved å samle med en aspirator (figur 1). Deretter slipper du de voksne inn i et rent bur med friske maisplanter. For å opprettholde en jevn tilførsel av unge voksne til eksperimentelle formål, tilbered ferske alderskalibrerte bur hver uke.
- Vann pottene i burene to ganger daglig. Klipp stilker regelmessig, fjern råtnende plantemateriale og erstatt med friske maispotter etter behov.
MERK: Med riktig vedlikehold kan en koloni vare ~ 5 uker (dvs. lenge nok til at embryoer som legges i buret blir voksne).
2. Agarosebasert eggleggingskammer
- Lag eggesamlingsfat (oviposisjonsmedium) ved å helle 1% w/v agarose i vann i rene 100 mm x 15 mm petriskåler. Oppbevar oviposisjonsmediet ved 4 °C etter at det har størknet.
- Tilbered 10 % w/v sukroseoppløsning til fôring av voksne. Oppbevar sukroseoppløsningen ved -20 °C i opptil en måned.
- Lag et kammer for å holde de voksne ved å kutte et hull i bunnen av en 1 oz kopp (se materialfortegnelsen) og lime en skjerm over hullet for luftutveksling (figur 2).
- Skjær parafinvoksfilm av plast i 5 cm x 5 cm firkanter; Sett av 2 ruter til hver kopp.
- Samle ~ 15 1 uke gamle voksne kvinner fra en alderskalibrert P. maidis-koloni. For å velge kvinner, undersøk den ventrale siden av magen, og se etter ovipositoren, som vanligvis er mørkere enn resten av magen (figur 3). Hold voksne i opptil én time i et 15 ml konisk hetteglass hvis du setter opp flere kamre for egglegging. Avkjøl insektene kort på is før kjønn og overfør til voksenbeholderen.
MERK: Denne undersøkelsen kan gjøres uten mikroskop. Voksne hunner som har hatt tid til å mate og pare seg har også vanligvis større underliv enn voksne hanner og er mer føyelige; Dermed kan de lettere selekteres fra en merdpopulasjon. - Overfør hunnene til en voksenbeholder, og forsegl koppen med 1 lag parafinvoksfilm av plast ved å strekke den jevnt 3-4 ganger sin opprinnelige størrelse (figur 4A,B).
- Påfør 400 μL 10% w / v sukroseoppløsning på toppen av parafinvoksfilmforseglingen av plast, og tilsett et andre lag med parafinvoksfilm av plast, og strekk parafinvoksfilmen nøyaktig som ovenfor (figur 4C, D).
MERK: Sandwichen av strukket plast parafinvoksfilm presser sukroseoppløsningen, noe som er svært viktig for voksenfôring, men vil ikke hindre kvinner i å piercing sine ovipositorer helt inn i oviposisjonsmediet. - Legg voksenkammeret på et eggoppsamlingsfat med parafinvoksfilmsiden av plast direkte på oviposisjonsmediet, og pakk hele eggleggingskammeret med plastfolie uten å dekke lufthullene, da disse er nødvendige for luftutveksling (figur 5).
- Inkuber hvert eggleggingskammer ved 25 °C med 70 % fuktighet og en lyssyklus på 14:10.
- Bytt sandwich av plast parafin voks film og 10% w / v sukrose løsning daglig, og fjern alt vann som samler seg inne i koppen.
3. Embryoinnsamling og justering i et miljø med høy luftfuktighet
- Sett opp et stereomikroskopbasert mikroinjeksjonssystem i et fuktet rom eller hette (fuktet hette; Figur 6) for å sikre at arbeidsmiljøet oppnår minst 70 % fuktighet gjennom hele mikroinjeksjonsprosessen.
- Kontroller oviposisjonsmediet for egg etter ønsket eggleggingsperiode. Gjør dette i en fuktet hette eller et annet fuktig miljø.
MERK: Eggleggingsperioden som vanligvis ble brukt var over natten, fra kl. 18.00 til 10.00, og varte ~ 16 timer. - Hvis det legges egg i agarose, bruk tynn tang til å grave dem forsiktig ut, og legg dem på overflaten av agarose for å holde dem fuktige (figur 7A).
- Påfør en stripe med 1 mm x 15 mm dobbeltsidig tape på et 22 mm x 30 mm deksel (figur 7B). Plasser dekkbåndet med forsiden opp på oviposisjonsmediet (figur 7C).
- Plukk opp hvert enkelt egg fra agaroverflaten, og flytt til dobbeltsidig tape ved hjelp av en fin børste. Fjern egg som er helt hvite eller har svart farge på dem. Sunn egg vil være semi-gjennomsiktig.
- Legg de bananformede eggene på siden, med den større enden fast på dobbeltsidig tape (figur 7D).
NOTAT: Oppbevar alltid eggene i et miljø med høy luftfuktighet, for eksempel en petriskål med et lag på 1% agar på bunnen.
4. Tilberedning av CRISPR-reagenser og injeksjonsnåler
- Trekk kvartsnåler med en mikropipettetrekker av flammende/brun type.
- Skråstill kvartsnålene ved hjelp av en mikropipettebeveler.
- Bruk dobbeltsidig klebrig tape for å feste trukne nåler i en klar beholder, for eksempel en petriskål, til den er klar til bruk.
- Klargjør injeksjonsoppløsningen ved å kombinere 0,5 μL Cas9-protein (5 μg/μL stamoppløsning) og 0,5 μL sgRNA (4 μg/μL stamløsning; se materialfortegnelsen) med 1 μL fenolrød buffer i et endelig volum på 5 μL. For å felle ut partikler som kan tette nålen, virvle oppløsningen kort og sentrifuger i 3 minutter ved maksimal hastighet.
- Fyll på kanylen igjen, og pass på at injeksjonsblandingen forlater den koniske enden av kanylen. Fjern eventuelle bobler fra kanylespissen.
- Plasser den tilbakefylte kanylen forsiktig i kanyleholderen, og stram kragen i rustfritt stål for å holde kanylen godt på plass under mikroinjeksjonen.
- Generer en pålitelig strøm av injeksjonsoppløsning fra nålen ved å stryke forsiktig på den skråstilte spissen med en fin, fuktet pensel, samtidig som det tilfører utbrudd av lufttrykk til nålen med injeksjonssystemet.
MERK: Nålen er klar til injeksjon når injeksjonsblandingen kan etterlate spissen i små mengder.
5. Mikroinjeksjon og pleie etter injeksjon
- Forbered en mikroinjeksjonsplattform ved å fylle en ren 100 mm x 15 mm petriskål med 1 % agar for å danne et jevnt lag agar som er i flukt med toppen av fatet.
- Plasser en tidligere forberedt dekkseddel med ~25 embryoer på agarplattformen (figur 8A).
MERK: Alle injeksjonstrinn må utføres inne i en fuktet hette (~70 % luftfuktighet). - Kontroller injeksjonstrykket ved å plassere nålespissen i en dråpe vann og starte injeksjonssyklusen.
MERK: En liten mengde injeksjonsvæske skal løses opp i vannet hvis trykkinnstillingen er riktig (figur 8B). - Stikk nålen inn i den større enden av embryoet, nærmer seg fra venstre side av dekselet (figur 8C). Lever injeksjonsoppløsningen inn i egget, og trekk nålen raskt ut.
- Etter at alle eggene er injisert, legg dekselet på overflaten av en ny 1% agarfat, og overfør parabolen til et fuktighetskammer (figur 9).
6. Inkubering og klekking av embryoer
- Sett klekkekammeret i en 25 °C kuvøse i 6 dager.
- Overfør eventuelle overlevende embryoer, med rent vann og en fin børste, til en 35 mm x 10 mm petriskål med vannfuktet filterpapir som dekker bunnen av fatet. Forsegl petriskålen med parafinvoksfilm av plast, og hold den ved 25 °C slik at embryoene klekkes. Begynn å sjekke embryoene 6 dager etter injeksjon for overlevelse.
MERK: De første stjernenymfene begynner å klekke rundt dag 8. - Overfør nymfer, med en fin børste, til en petriskål som inneholder bladklipp. Dekk fatet, og forsegl med parafinvoksfilm av plast.
- Inkuber den forseglede tallerkenen med klekkinger på bladstiklinger i 48 timer ved 25 °C.
- Overfør alle 2 dager gamle nymfer fra en injeksjonsrunde til et oppdrettsbur med maisplanter ved hjelp av en fin børste. Hvis injektører med synlig fenotype gjenvinnes i tilstrekkelig antall, bak dem separat for å maksimere utvinningen av målegenskapen i neste generasjon. Ellers utfør masseparring av alle injektørene.
MERK: Plasser hatchlings forsiktig i hvirvelen av maisplanten for å gi tilflukt og sikre riktig fuktighet i deres umiddelbare miljø. - Bak insektene under forholdene beskrevet ovenfor, sørg for riktig temperatur, fuktighet og regelmessig overføring til friske maisplanter.
- Skjermavkom for forventede fenotyper. Plasser individer som viser ønsket fenotype i sitt eget bur for å etablere homozygote linjer.
Representative Results
Eggleggingskammeret ble spesielt designet for å gjøre det mulig for P. maidis-hunner å mate mens de oviposerte i et beskyttende medium hvorfra eggene deres lett kunne gjenvinnes. Ved hjelp av denne metoden ble tilstrekkelige mengder precellulære embryoer gjenfunnet for mikroinjeksjon med DNA, RNA og/eller proteiner. Voksne P. maidis-hunner legger vanligvis egg inne i bladvevet til maisplantene, noe som gjør det utfordrende å få nok egg på kort tid fordi det krever mye bladdisseksjon. Det kunstige eggleggingsmiljøet gir en løsning for å overvinne disse problemene. Som vist i tabell 1 ble det samlet inn 6 483 egg fra totalt 645 hunner på 4 uker. Hunnene begynner vanligvis å legge egg etter dag 2 og gir de fleste egg fra dag 4 til dag 6. Oviposisjonsaktiviteten avtok etter dag 9. Hvert oviposisjonskammer ble satt opp på fredag og sjekket for egg fra søndag til neste søndag. Etter denne planen tillot de fleste egg å bli samlet for mikroinjeksjoner i løpet av arbeidsuken.
Den første praktiske anvendelsen av dette eggleggingssystemet var å teste effekten av Cas9-mediert genknockout, ved å bruke P. maidis ortholog av øyenfargegenet, hvitt (Pmw), som et mål. Mutasjoner i hvitt er kjent for å resultere i betydelig tap av øyepigmentering hos andre insektarter, og hvit er celleautonom, slik at mutasjoner kan oppdages hos injiserte individer16,17. For å øke sjansen for at selv en liten mutasjon kan føre til tap av funksjon, ble guide-RNA designet for å kutte i regionen av ATP-bindende kassett, noe som er nødvendig for hvit funksjon16. P. maidis-embryoer ble injisert med enten 20 % fenolrødt (injeksjonsbuffer), injeksjonsbuffer med Cas9 i en endelig konsentrasjon på 800 ng/μL (Cas9-kontroll), eller Cas9 i injeksjonsbuffer sammen med tre RNA tilsatt i en konsentrasjon på 400 ng/μL hver. Kombinasjonen av tre guider i en injeksjonsblanding var ment å ytterligere maksimere sjansene for å generere mutanter, både ved å skape en stor delesjon, og ved å kompensere for muligheten for at en guide kan være ineffektiv for kutting. Utviklingsratene for hver behandling var sammenlignbare (tabell 2), med 50-60 % av de injiserte individene som viste tegn til utvikling. Lukeratene for buffer- og Cas9-kontrollene var også sammenlignbare; Imidlertid var lukefrekvensen til individer som mottok treveisblandingen relativt lavere. På dette tidspunktet er det uklart om den reduserte overlevelsen er et resultat av tap av hvit funksjon eller et resultat av utilsiktede konsekvenser av treveisblandingen, for eksempel off-target-effekter (se diskusjonsdelen). Imidlertid klekket ingen av individene med fullstendig tap av øyepigmentering (dvs. fullstendig knockout), og ingen av avkomene til injiserte individer hadde hvite øyne. Den målrettede effekten av Cas9-basert mutagenese ble verifisert på to måter. Først ble injektører screenet for tap av øyepigmentering.
Av de 71 guide-injiserte individene som utviklet, viste 23 en viss grad av pigmenttap (figur 10), og 9 av disse individene klekket, noe som resulterte i en knockout-rate på ≥32%. Ingen tap av pigmenter i øyet ble observert i noen av kontrollbehandlingene. For det andre ble kromosomale mutasjoner bekreftet via polymerasekjedereaksjon (PCR)18 og sekvensering19. Fordi en mutant linje ikke kunne gjenopprettes, ble genomisk DNA analysert fra bassenger av embryoer injisert med enten tre-guide-blandingen eller bufferen. Tre-ledeblandingen forventes å fjerne ~ 180 basepar fra det hvite lokuset. Dette kan sees i PCR-produktene forsterket av genomisk DNA isolert fra injiserte individer, samt tilhørende sekvensdata generert fra disse produktene (figur 11). Dette kombinerte beviset indikerer at embryoer ble injisert før cellularisering skjedde.
Figur 1: Aspirator. En effektiv aspirator kan monteres fra å feste en vakuumpumpe ved inntaket, via plastrør, til et 15 ml plastkonisk rør. Omtrent 0,5 cm skal fjernes forsiktig fra bunnen av det koniske røret. En bomullsdott bør plasseres i det koniske røret, over åpningen av plastslangen, for å fange P. maidis voksne når de samles inn og holde dem ute av vakuumpumpen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bygging av voksencontainere. (A) Nødvendige forsyninger (med klokken fra øverst til venstre): skjerm, varm limpistol, barberblad, 1 oz beholder. (B) Et stort hull skal kuttes i bunnen av 1 oz beholderen, og en firkant av skjermen er kuttet akkurat stor nok til å dekke dette hullet. (C) Skjermen limes deretter over hullet ved hjelp av varmt lim. (D) Når limet er satt, bør overflødig nett fjernes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kjønning av voksne P. maidis. De ventrale sidene av mannlige (venstre) og kvinnelige (høyre) P. maidis voksne er vist. Ovipositoren, synlig over den kvinnelige magen, er den klareste indikatoren på individets kjønn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Forsegling av voksne i beholdere . (A) En 5 cm x 5 cm firkant av plast parafinvoksfilm. (B) Filmen skal strekkes jevnt til 3-4 ganger sin opprinnelige størrelse. (C) Når voksne har blitt lagt i den voksne beholderen, skal den strukkede filmen plasseres over åpningen for å sikre de voksne. En 400 μL dråpe på 10% w/v sukroseoppløsning skal deretter plasseres på toppen av filmen. (D) For å gi tilstrekkelig fôringstrykk for de voksne, bør en annen 5 cm x 5 cm firkant av plastparafinfilm strekkes på samme måte og plasseres over dråpen sukrose. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Sette opp et oviposisjonskammer. (A) Nødvendige forsyninger (med klokken fra øverst til venstre): plastfolie, en ferdig voksenbeholder (med voksne) og en petriskål med 1% agarose (oviposisjonsmedium). (B) Den voksne beholderen skal plasseres på agarose med parafinfilmen av plast/10 % sukrose 'sandwich' plassert direkte på oviposisjonsmediet. (C) Plastfolie brukes til å feste den voksne beholderen til oviposisjonsmediet. Dette hindrer mediet i å tørke ut for raskt. Det må utvises forsiktighet for å unngå tildekking av skjermen på beholderen for voksne personer, slik at luftutvekslingen fortsatt kan fortsette. (E) Diagram over oviposisjonskammeret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Ventilert hette. En hette utstyrt med en luftfukter er satt opp rundt injeksjonsområdet for å minimere lufttrekk og opprettholde fuktighet mens embryoene håndteres. Klaffer kan brettes over inngangen etter at arbeideren er på plass, for å hjelpe til med å opprettholde riktig fuktighetsnivå. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Innsamling av embryoer som forberedelse til injeksjoner . (A) Embryoer som har blitt avsatt i oviposisjonsmediet. Et par fine tang brukes til å trekke ut embryoer fra mediet og plassere dem på overflaten. (B) En smal stripe på 1 mm x 15 mm dobbeltsidig tape på en 22 mm x 30 mm coverslip. (C) Dekselet kan plasseres på oviposisjonsmediet for enkel overføring av embryoer fra overflaten av mediet til båndet på dekselet. (D) P. maidis-embryoer er bananformede, med den ene enden smalere enn den andre (smal ende indikert med rødt pilhode; bredere ende indikert med gult pilhode i eksempelembryo). Den brede enden av embryoet skal plasseres på båndet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Injeksjon . (A) Injeksjonsplattformen er en petriskål fylt til randen med 1 % agar. Dekselet med en stripe tape som holder embryoer, skal plasseres direkte på overflaten av injeksjonsplattformen. (B) Injeksjonstrykket bør testes før embryoer injiseres ved å "injisere" en liten mengde injeksjonsoppløsning i en dråpe vann. Denne metoden kan også brukes når som helst under injeksjonsprosessen for å kontrollere nålen for tilstopping. (C) Embryoer skal injiseres ved å stikke nålen inn i den større enden av embryoet. Injeksjonsoppløsningen skal være synlig hvis injeksjonen var vellykket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Pleie etter injeksjon . (A) Når alle embryoene på en dekkseddel er injisert, skal dekkseddelen legges i en fersk petriskål som inneholder 1 % agarose. (B) Petriskålen med dekselet kan deretter opprettholdes i et fuktighetskammer (som det som er vist) til embryoer klekkes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Pmw knockout fenotype. (A) Alderstilpasset kontroll og (B) Pmw knockoutembryoer, med utviklende øyne indikert med svarte pilspisser. Embryoet i B er mosaikk, da en liten stripe av pigmentering kan ses. (C) Alderstilpasset kontroll og (D) Pmw knockout hatchlings, med innsatser som viser en annen vinkel på øynene. Klekkingen i D er også mosaikk. En hvit pil peker på et område i hovedbildet som viser tap av pigmentering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: Pmw knockout-sekvens. (A) To-skala modell av Pmw mRNA, merket i trinn på 500 bp, med plasseringer av gRNA-bindingssteder indikert: G1, blå; G2, gul; G3, rosa. Eventuelle rammeskiftmutasjoner som genereres på dette tidspunktet, vil forstyrre størstedelen av oversettelsesproduktet. (B) Genomisk kontekst av gRNA-steder, alt i ett ekson (fet tekst med stor forbokstav). Bindingssteder for TV-guiden utheves i de samme fargene som A, og PAM-er er understreket. Span er ~ 300 bp. In-frame-oversettelsen av eksonen er vist ovenfor, som enkeltbokstavsforkortelser i stor tekst. To motiver som er spesifikke for øyepigmenttransportører er merket. CDEPT-motivet til det funksjonelle domenet Walker B er innpakket i lilla, og IHQP-motivet til H-loop-domenet er innpakket i grønt. Begge domenene er kritiske for ATP-transportørfunksjonen. (C) PMW-målregionen ble forsterket ved hjelp av to runder med PCR. Det andre rundeproduktet ble undersøkt på en gel for bevis på størrelsesforskyvning på grunn av vellykket fjerning av regionen mellom styrene. Baner: L = 100 bp stige; 1 = PCR vannkontroll; 2 = Buffer injiserte egg; 3-4 = to separate sett med egg injisert med tre-veisblanding. Bare embryoer som mottok tre-guideblandingen produserte både WT-båndet (rød pil) og båndet som følge av en fullstendig eksisjon (hvit pil). (D) For å bekrefte identiteten til det nedre (hvite pil) båndet, ble dette DNA renset, klonet og sekvensert. Den øverste linjen er villtypesekvensen. De to andre linjene er sekvenser fra to kloner. Ytterligere tre kloner matchet bunnsekvensen. Blå utheving indikerer bindingsstedet for guide 1, mens rosa utheving indikerer bindingsstedet for guide 3. I begge allelene er hele regionen mellom disse to guideområdene slettet. Forkortelser: Pmw = Peregrinus maidis hvitt gen; gRNA = guide RNA; PAM = protospacer tilstøtende motiv; ATP = adenosintrifosfat; PCR = polymerasekjedereaksjon; WT = villtype; KO = knockout. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Sett | # av kopper | # av kvinner i hver kopp | # av egg | Totalt # egg | |||||||
| Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 5 | Dag 6 | Dag 7 | Dag 8 | Dag 9 | ||||
| 1 | 10 | 15 | 0 | 26 | 166 | 355 | 530 | 193 | 91 | 37 | 1398 |
| 2 | 15 | 15 | 22 | 238 | 489 | 699 | 520 | 379 | 203 | 58 | 2608 |
| 3 | 8 | 15 | 0 | 57 | 230 | 190 | 116 | 80 | 34 | 1 | 708 |
| 4 | 10 | 15 | 0 | 226 | 446 | 519 | 301 | 179 | 24 | 15 | 1710 |
| Total | 43 | 15 | 23 | 547 | 1331 | 1763 | 1467 | 831 | 352 | 111 | 6483 |
Tabell 1: Representative eggsamlinger fra kunstig oviposisjonsmiljø. Data fra fire sett med egginnsamlingskopper vises, med eggtall som starter den andre dagen etter oppsett og løper gjennom den niende dagen.
| Injeksjon Behandling | Totalt injisert | Totalt utviklet | Totalt klekket | Utviklingsgrad (%) | Lukefrekvens (%) |
| Buffer | 39 | 20 | 12 | 51 | 31 |
| Cas9 | 39 | 24 | 14 | 61 | 36 |
| Cas9 + Pmw gRNA | 121 | 71 | 28 | 59 | 28 |
Tabell 2: Overlevelse og knockoutrate fra injeksjoner med 3 forskjellige injeksjonsblandinger.
Discussion
Egg-legg kvalitet og ernæring
Nylig fikk forskere som arbeider med en beslektet art, Nilaparvata lugens, eggene de brukte til mikroinjeksjoner direkte fra bladet, og holdt de injiserte eggene i bladvevet til de klekket17. Mens denne bladbaserte metoden ga et mer naturlig miljø for embryonal utvikling, økte den også sjansene for infeksjoner og for eggskader under fjerningsprosessen. Det kunstige oviposisjonssystemet som presenteres her, gir et mer ensartet miljø og reduserer sjansene for skade på eggene fra håndtering. Ved å sette opp oviposisjonskoppene på fredag, ble flertallet av eggene samlet inn i løpet av en typisk arbeidsuke, til fordel for de som gjorde mikroinjeksjonsarbeidet. En advarsel til denne metoden er imidlertid at mangelen på næringsstoffer i 10% sukroseløsningsdiet til slutt vil påvirke insektens helse, og kvinner i koppene begynner vanligvis å dø av etter bare 10 dager. Eggkvaliteten begynner også å falle av etter 6 dager, som det fremgår av en økning i døde eller usunne egg. Som et resultat er det viktig å være selektiv med eggene som brukes til mikroinjeksjoner og ikke beholde hunnene etter dag 6.
Overlevelse og fuktighet
To faktorer synes å være kritiske for embryonal overlevelse gjennom mikroinjeksjonsprosessen. Det mest utfordrende aspektet ved håndtering av P. maidis-embryoer er å hindre dem i å tørke ut etter fjerning fra oviposisjonsmediet og gjennom mikroinjeksjon. Siden eggene vanligvis legges inne i plantevev, mangler de et tilstrekkelig skall for å forhindre dehydrering. Selv i den fuktede hetten gikk hele sett med egg tapt på grunn av uttørking. For høy luftfuktighet kan imidlertid også påvirke mikroinjeksjonene hvis det samler seg vann på dobbeltsidig tape eller på skopet. Dessverre var eggdehydrering vanligvis ikke lett å legge merke til under mikroinjeksjonsprosessen, og de virket ofte normale til 2 eller 3 dager senere, da de ble helt gjennomsiktige, og viste ingen tegn på utvikling.
Nålekvalitet ser også ut til å spille en viktig rolle for overlevelse. Nålen skal skråstilles for å minimere unødvendig skade på egget. Når nålen er tett, vil nålen brukes til en funksjonell tilstand ved hjelp av clearingfunksjonen på injektoren mens du forsiktig stryker på kanylespissen med en fuktet pensel (se trinn 4.7). Uansett anbefales det å sette bare små mengder injeksjonsoppløsning (~0,25 μL) i hver nål og bytte til en ny nål med noen få lysbilder (~50-60 egg) for å sikre at nålekvaliteten opprettholdes gjennom hele injeksjonsprosessen.
Vellykket generasjon av en knockout-fenotype
For å lykkes med å transformere bakteriecellene, må embryomikroinjeksjoner vanligvis gjøres så tidlig som mulig før cellularisering. Avhengig av insektarten, varierer tidsvinduet for å fullføre mikroinjeksjonene fra bare et par timer til så lenge som en hel dag14,15,20. Det er fortsatt uklart når P. maidis-embryoer gjennomgår cellularisering. Cas9-mediert knockout ble testet på embryoer så unge som 4 timer etter egglegging (pel) til så mange som 16 timers pel, og de forventede fenotypene ble observert i alle eksperimenter, noe som tyder på at alle mikroinjeksjoner ble utført innenfor precelluriseringsvinduet.
P. maidis ortholog av øyenfargegenet, hvit, ble valgt fordi knockout-fenotypen ble forventet å være lett å screene hos injektører på grunn av sin celleautonome natur. Faktisk, som forventet, var både mosaikk og totale knockouts tydelig identifiserbare blant embryoer som mottok injeksjonsblandingen som inneholdt Cas9 og guide-RNA. Dessverre klekket ingen injektorer med fullstendig knockout, og en masseparring av overlevende injektorer klarte ikke å generere hvitøyet avkom. Imidlertid ble en mutant linje senere vellykket generert ved å målrette et annet gen (Klobasa et al., pågår). Dette antyder at manglende etablering av en hvit mutantlinje mest sannsynlig skyldes enten off-target effekter (dvs. Cas9 kutte viktige regioner andre steder i genomet) som genererer en nært knyttet dødelig mutasjon, eller til en uforutsigbar kritisk rolle for hvit i P. maidis.
Fenotypiske og molekylære data (figur 8 og figur 9) bekrefter at en signifikant knockout i det hvite lokuset ble opprettet i en prøve av injiserte embryoer, noe som ville resultere i totalt tap av genfunksjon. Dessuten, mens mutasjoner i hvitt er levedyktige hos noen arter, er det presedens for at redusert hvit aktivitet er skadelig21,22. Når det er sagt, kan ikke off-target effekter utelukkes helt. Å forutsi sannsynlige off-targets krever nøyaktige genomsekvensdata23, som den nåværende tilstanden til genomiske ressurser i P. maidis gjør umulig å gjøre på dette tidspunktet. Uansett, med disse nye metodene, kan testing av andre målgener gjøres trygt, til og med bevege seg mot mer tradisjonell transgenese i et forsøk på å bringe nye genetiske verktøy til dette skadelige.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
North Carolina State University, Institutt for entomologi og plantepatologi, er en del av et team som støtter DARPAs Insect Alllies Program. Synspunktene, meningene og / eller funnene som er uttrykt er forfatternes og bør ikke tolkes som å representere de offisielle synspunktene eller retningslinjene til forsvarsdepartementet eller den amerikanske regjeringen. Forfatterne oppgir ingen konkurrerende interesser. MDL, DR og AEW unnfanget prosjektet og ga finansieringsoppkjøp, prosjektadministrasjon og ressurser. FC, WK, NG og MDL unnfanget og designet mikroinjeksjonseksperimentene; OH unnfanget og designet eggleggingsmetoden. FC og WK utførte eksperimentene; FC og WK analyserte resultatene; og FC, WK, NG og MDL skrev manuskriptet. Forfatterne ønsker å gi spesiell takk til Kyle Sozanski og Victoria Barnett for deres hjelp med å opprettholde P. maidis-kolonier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 oz Containers | Dart | P100N | Adult container for egg-laying setup |
| 15 mL Conical Tubes | Olympus | Genesee 28-103 | Serves as collection tube on vacuum aspirator setup |
| 15 mL Conical Tubes | Olympus | Genesee 28-106 | For making 10% sucorose solution and for holding adults when chilling before screening |
| Aspirator | Bioquip | 1135A | For handling planthoppers |
| Vacuum Aspirator | Fischer Technical | LAV-3 | Vacuum for aspirating larger numbers of insects |
| Blue Spectrum LED Lights | Home Depot | GLP24FS/19W/LED | Grow lights for potted corn plants hoppers are feeding on |
| Cas9 | TrueCut Cas9 Protein v2 | A36498 | Endonuclease for cutting planthopper genes |
| Clear Vinyl Tubing | Home Depot | 3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft. | Connects collection tube to pump on vacuum aspirator setup |
| Corn planthoppers | North Carolina State University | N/A | Request from Dr. Anna Whitfield's lab |
| Cotton balls | Genessee | 51-101 | Serves as a filter/insect catcher in collection tube on vacuum aspirator setup |
| Double sided tape | Scotch Double Sided Tape | NA | Holding eggs for microinjection |
| Early Sunglow corn | Park Seed Company | 05093-PK-N | Corn for rearing planthoppers |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Femtojet Microinjection System | Eppendorf | 5247 | Controls injection pressure (12-20 psi, depending on needle bore size) |
| Nutri-Fly Drosophila Agar | Genessee | 66-103 | Substrate for everything except egg-laying dish |
| Fine forceps | Bioquip | 4731 | Egg handling |
| General Purpose LE Agarose | Apex | 20-102 | Substrate inn egg-laying dish (oviposition medium) |
| Guide RNA 1 - GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
| Guide RNA 2 - UCUGAAAUCACUGGCCAAUA | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
| Guide RNA 3 - GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
| Humidifyer | Homedics | UHE-CM45 | For providing humidity in humidified hood |
| Humidity chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | For holding injected embryos until hatching |
| Insect rearing cages | Bioquip (special order) | Close to 1450 L (has plastic front and mesh fabric sides) | Cage for planthoppers on corn |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | For making injection needles / Heat = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160 |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | Planthopper screening |
| Microinjection Scope | Leica | MZ12-5 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Micromanipulator | Narishige | MN-151 | For positioning microinjection needle |
| Micropipette beveler | Sutter Instruments | FG-BV10-D | For beveling injection needles / Used 'fine' graded plate at 20° angle |
| Microscope Stage | AmScope | GT100 X-Y Gliding Table | For positioning and moving embryos under microscope |
| Miniature Paint Brush | Testor #2 8733 | Sold in 3 pack 281206 | Fine paintbrushes for embryo handling |
| Needle Holder | Narishige | HI-7 | For holding the microinjection needle |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | Rearing injectees until hatch |
| Petri Dishes (100 x 15 mm) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay |
| pGEM-T Easy Vector System I cloning kit | Promega | A1360 | Cloning Pm white target site |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Plain Microscope Slides or coverslip | Fisher Scientific | 12-549-3 | Hold eggs for microinjection |
| Plasmid DNA Midi Kit | Zymo | D4200 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Roll size 4 in. x 125 ft |
| Plastic wrap | Glad ClingWrap Plastic Wrap | NA | Wrap the entire egg-laying chamber |
| Primer - PmW CRISPR check F1 - AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
| Primer - PmW CRISPR check R1 - GATTCCTCGCTGTTGGGT | IDT | 25 nmole DNA Oligo | First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
| Primer - PmW CRISPR check F3 - TCACAGACCCTGGTGCTAATC | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
| Primer - PmW CRISPR check R3 - GTCCACAATCCACACTTCTGA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
| Quartz capillaries | Sutter Instruments | QF100-50-10 | For making microinjection needles / O.D. 1 mm, I.D. 0.7 mm, 10 cm length |
| Screen (White Organza Fabric) | Joann Fabrics | 16023889 | For covering the adult container |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | To make 10% sucorose solution |
References
- Namba, R., Higa, S. Y. Host plant studies of the corn planthopper, Peregrinus maidis (Ashmead) in Hawaii. Proceedings of the Hawaiian Entomological Society. 21, 105-108 (1971).
- Singh, B. U., Seetharama, N. Host plant interactions of the corn planthopper, Peregrinus maidis Ashm.(Homoptera: Delphacidae) in maize and sorghum agroecosystems. Arthropod-Plant Interactions. 2 (3), 163-196 (2008).
- Tsai, J. Occurrence of a corn disease in Florida transmitted by Peregrinus maidis. Plant Disease Reporter. 59 (10), 830-833 (1975).
- Chelliah, S., Basheer, M. Biological studies of Peregrinus maidis (Ashmead) (Araeopidae: Homoptera) on sorghum. Indian Journal of Entomology. 27, 466-471 (1965).
- Lastra, J., Esparza, J. Multiplication of vesicular stomatitis virus in the leafhopper Peregrinus maidis (Ashm.), a vector of a plant rhabdovirus. Journal of General Virology. 32 (1), 139-142 (1976).
- Nault, L. R., Ammar, E. -D. Leafhopper and planthopper transmission of plant viruses. Annual Review of Entomology. 34 (1), 503-529 (1989).
- Ammar, E. -D., Tsai, C. -W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts. Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).
- Barandoc-Alviar, K., Ramirez, G. M., Rotenberg, D., Whitfield, A. E. Analysis of acquisition and titer of Maize mosaic rhabdovirus in its vector, Peregrinus maidis (Hemiptera: Delphacidae). Journal of Insect Science. 16 (1), 14 (2016).
- Tsai, J. H., Steinberg, B., Falk, B. W. Effectiveness and residual effects of seven insecticides on Dalbulus maidis (Homoptera: Cicadellidae) and Peregrinus maidis (Homoptera: Delphacidae). Journal of Entomological Science. 25 (1), 106-111 (1990).
- Yao, J., Rotenberg, D., Afsharifar, A., Barandoc-Alviar, K., Whitfield, A. E. Development of RNAi methods for Peregrinus maidis, the corn planthopper. PloS One. 8 (8), 70243 (2013).
- Esvelt, K. M., Smidler, A. L., Catteruccia, F., Church, G. M. Emerging technology: concerning RNA-guided gene drives for the alteration of wild populations. Elife. 3, 03401 (2014).
- Gantz, V. M., Bier, E. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 348 (6233), 442-444 (2015).
- Yao, J., Rotenberg, D., Whitfield, A. E. Delivery of maize mosaic virus to planthopper vectors by microinjection increases infection efficiency and facilitates functional genomics experiments in the vector. Journal of Virological Methods. 270, 153-162 (2019).
- Kimelman, D., Martin, B. L. Anterior-posterior patterning in early development: three strategies. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (2), 253-266 (2012).
- Mito, T., Nakamura, T., Noji, S. Evolution of insect development: to the hemimetabolous paradigm. Current Opinion in Genetics & Development. 20 (4), 355-361 (2010).
- Grubbs, N., Haas, S., Beeman, R. W., Lorenzen, M. D. The ABCs of eye color in Tribolium castaneum: orthologs of the Drosophila white, scarlet, and brown Genes. Genetics. 199 (3), 749-759 (2015).
- Xue, W. H., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of two eye pigmentation genes in the brown planthopper, Nilaparvata lugens (Hemiptera: Delphacidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 93, 19-26 (2018).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3998 (2012).
- Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94 (3), 441-448 (1975).
- Chu, F. C., Wu, P. S., Pinzi, S., Grubbs, N., Lorenzen, M. D. Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or CRISPR/Cas9 genome editing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57497 (2018).
- Brent, C. S., Hull, J. J. RNA interference-mediated knockdown of eye coloration genes in the western tarnished plant bug (Lygus hesperus Knight). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 100 (2), 21527 (2019).
- Khan, S. A., Reichelt, M., Heckel, D. G. Functional analysis of the ABCs of eye color in Helicoverpa armigera with CRISPR/Cas9-induced mutations. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Manghwar, H., et al. CRISPR/Cas systems in genome editing: methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects. Advanced Science. 7 (6), 1902312 (2020).
