Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Utforska m6A och m5C Epitranscriptomes vid virusinfektion: ett exempel med HIV

Published: March 5, 2022 doi: 10.3791/62426
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institute of Microbiology, Lausanne University Hospital and University of Lausanne, 2Bioinformatics Core Facility, SIB Swiss Institute of Bioinformatics

Summary

Rollen av RNA-modifieringar i virusinfektioner har precis börjat utforskas och kan lyfta fram nya interaktionsmekanismer för virus-värd. I detta arbete tillhandahåller vi en pipeline för att undersöka m6A och m5C RNA modifieringar i samband med virusinfektioner.

Abstract

RNA-modifieringarnas roll i biologiska processer har varit i fokus för ett ökande antal studier under de senaste åren och är idag känd som epitranscriptomics. Bland annat har N6-metyladenosin (m6A) och 5-metylcytosin (m5C) RNA-modifieringar beskrivits på mRNA-molekyler och kan ha en roll i modulering av cellulära processer. Epitranscriptomics är således ett nytt regleringslager som måste beaktas utöver transkriptomiska analyser, eftersom det också kan ändras eller moduleras genom exponering för något kemiskt eller biologiskt medel, inklusive virusinfektioner.

Här presenterar vi ett arbetsflöde som möjliggör analys av det gemensamma cellulära och virala epitranskriptomiska landskapet av m6A- och m5C-märkena samtidigt, i celler infekterade eller inte med humant immunbristvirus (HIV). Vid mRNA isolering och fragmentering från HIV- infekterade och icke-infekterade celler, använde vi två olika förfaranden: MeRIP-Seq, en RNA immunoprecipitation-baserad teknik, för att berika för RNA fragment som innehåller m6A märket och BS-Seq, en bisulfite konvertering-baserade teknik, för att identifiera m5C-märket vid en enda nukleotidupplösning. Vid metyleringsspecifik fångst förbereds RNA-bibliotek för sekvensering med hög genomströmning. Vi utvecklade också en dedikerad bioinformatik pipeline för att identifiera differentiellt metylerade (DM) transkriptioner oberoende av deras basala uttryck profil.

Sammantaget tillåter metoden utforskning av flera epitranscriptomic märken samtidigt och ger en atlas över DM transkript vid virusinfektion eller någon annan cell perturbation. Detta tillvägagångssätt erbjuder nya möjligheter att identifiera nya spelare och nya mekanismer för cellrespons, till exempel cellulära faktorer som främjar eller begränsar virusreplikering.

Introduction

Det är länge känt att RNA-molekyler kan modifieras, och mer än 150 post-transkriptionella modifieringar har beskrivits hittills1. De består i tillsats av kemiska grupper, främst metylgrupper, till praktiskt taget alla positioner av pyrimidin- och purinringar av RNA-molekyler2. Sådana post-transkriptionella modifieringar har redan visat sig vara mycket berikade i överföring RNA (tRNA) och ribosomal RNA (rRNA) och har nyligen beskrivits på mRNA-molekyler samt.

Uppkomsten av ny teknik, såsom nästa generations sekvensering (NGS), och produktionen av specifika antikroppar som erkänner bestämda kemiska modifieringar gjorde det för första gången möjligt att undersöka platsen och frekvensen av specifika kemiska modifieringar på transkriptomomfattande nivå. Dessa framsteg har lett till en bättre förståelse av RNA-modifieringar och till kartläggning av flera modifieringar på mRNA-molekyler3,4.

Medan epigenetik undersöker DNA: s roll och histonmodifieringar i transkriptomreglering, fokuserar epitranscriptomics på ett liknande sätt på RNA-modifieringar och deras roll. Undersökningen av epitranscriptomiska modifieringar ger nya möjligheter att lyfta fram nya regleringsmekanismer som kan finjustera en mängd olika cellulära processer (dvs. RNA-splitsning, export, stabilitet och översättning)5. Det var därför ingen stor överraskning att nyligen genomförda studier avslöjade många epitranscriptomiska modifieringar vid virusinfektion i både cellulära och virala RNAs6. Virus som hittills undersökts inkluderar både DNA- och RNA-virus; hiv kan betraktas som ett banbrytande exempel. Sammantaget kan upptäckten av RNA-metylering i samband med virusinfektioner tillåta undersökning av ännu obeskrivna mekanismer för virusuttryck eller replikering, vilket ger nya verktyg och mål för att kontrollera dem7.

Inom hiv-epitranscriptomics har modifieringar av virala transkriptioner undersökts i stor utsträckning och har visat att förekomsten av denna modifiering var fördelaktig för viral replikering8,9,10,11,12,13. Hittills kan olika tekniker användas för att upptäcka epitranscriptomiska märken på transkriptomnivå. De mest använda teknikerna för m6A-identifiering förlitar sig på immunutfällningstekniker som MeRIP-Seq och miCLIP. Medan MeRIP-Seq förlitar sig på RNA-fragmentering för att fånga fragment som innehåller metylerade rester, är miCLIP baserat på generering av α-m6A antikroppsspecifika signaturmutationer på RNA-antikropps UV-korslänkning, vilket möjliggör en mer exakt kartläggning.

Detektion av m5C-modifiering kan uppnås antingen genom antikroppsbaserad teknik som liknar m6A-detektion (m5C RIP) eller genom bisulfitkonvertering eller genom AZA-IP eller genom miCLIP. Både Aza-IP och m5C miCLIP använder en specifik metyltransferas som bete för att rikta in sig på RNA medan de genomgår RNA-metylering. I Aza-IP exponeras målceller för 5-azacytidin, vilket resulterar i slumpmässig introduktion av cytidinanaloga 5-azacytidin platser i gryende RNA. I miCLIP är NSun2 metyltransferas genetiskt modifierad för att hysa C271A mutationen14,15.

I detta arbete fokuserar vi på dubbel karakterisering av m6A- och m5C-modifieringar i infekterade celler, med HIV som modell. Vid metodoptimering har vi utvecklat ett arbetsflöde som kombinerar metylerad RNA immunoprecipitation (MeRIP) och RNA bisulfite conversion (BS), vilket möjliggör samtidig utforskning av m6A och m5C epitranscriptomic märken på en transkriptom-bred nivå, i både cellulära och virala sammanhang. Detta arbetsflöde kan implementeras på cellulära RNA-extrakt samt på RNA isolerat från viruspartiklar.

Metoden Methylated RNA ImmunoPrecipitation (MeRIP)16 som möjliggör undersökning av m6A på transkriptom-wide nivå är väl etablerad och en rad m6A-specifika antikroppar är kommersiellt tillgängliga hittills17. Denna metod består i selektiv avskiljning av m6A-innehållande RNA-bitar med hjälp av en m6A-specifik antikropp. De två största nackdelarna med denna teknik är i) den begränsade upplösningen, som är mycket beroende av storleken på RNA-fragment och därmed ger en ungefärlig plats och region som innehåller de metylerade resterna, och (ii) den stora mängd material som behövs för att utföra analysen. I följande optimerade protokoll standardiserade vi fragmentstorleken till ca 150 nt och minskade mängden startmaterial från 10 μg poly-A-valt RNA, som för närvarande är den rekommenderade mängden startmaterial, till endast 1 μg poly-A-valt RNA. Vi maximerade också återvinningseffektiviteten hos m6A RNA fragment bundna till specifika antikroppar med hjälp av en elution genom en konkurrensmetod med en m6A peptid i stället för mer konventionella och mindre specifika elution metoder med fenol-baserade tekniker eller proteinas K. Den huvudsakliga begränsningen av denna RIP-baserade analys är dock fortfarande den suboptimala upplösningen som inte tillåter identifiering av den exakta modifierade A-nukleotid.

Analys av m5C-märket kan för närvarande utföras med två olika metoder: en RIP-baserad metod med m5C-specifika antikroppar och RNA bisulfitkonvertering. Eftersom RIP endast erbjuder begränsad upplösning på identifiering av metylerade rester, använde vi bisulfitomvandling som kan erbjuda en enda nukleotidupplösning. RNA-exponering för bisulfit (BS) leder till cytosindeaminering och omvandlar därmed cytosinresterna till uracil. Således, under RNA bisulfite omvandlingsreaktionen, varje icke-metylerad cytosin deamineras och omvandlas till uracil, medan närvaron av en metylgrupp i position 5 av cytosin har en skyddande effekt, förhindra BS-inducerad deamination och bevara cytosin resterna. Den BS-baserade metoden möjliggör detektion av en m5C modifierad nukleotid vid en enda basupplösning och för bedömning av metyleringsfrekvensen för varje transkription, vilket ger insikter om m5C modifieringsdynamik18. Den huvudsakliga begränsningen av denna teknik förlitar sig dock på den falska positiva hastigheten av metylerade rester. BS-omvandlingen är faktiskt effektiv på enkelsträngat RNA med tillgängliga C-rester. Förekomsten av en snäv RNA sekundär struktur kan dock maskera N5C-positionen och hämma BS-omvandlingen, vilket resulterar i icke-metylerade C-rester som inte omvandlas till U-rester, och därmed falska positiva. För att kringgå det här problemet och minimera den falska positiva frekvensen tillämpade vi 3 omgångar av denaturering och bisulfitkonverteringscykler19. Vi införde också 2 kontroller i proverna för att möjliggöra uppskattning av bisulfitomvandlingseffektivitet: vi spikar in ERCC-sekvenseringskontroller (icke-metylerade standardiserade och kommersiellt tillgängliga sekvenser)20 samt poly-A-utarmade RNAs för att bedöma bisulfitomvandlingshastigheten å ena sidan och för att verifiera genom RT-PCR närvaron av ett känt och välkonserverat metylerat område, C4447, på 28S ribosomal RNA å ena sidan21.

Inom virologin möjliggör kopplingen av dessa två epitriskriptomiska undersökningsmetoder med nästa generations sekvensering och noggrann bioinformatisk analys en djupgående studie av m6A- och m5C-dynamiken (dvs. RNA-modifiering av tidsförändringar som kan uppstå vid virusinfektion och kan avslöja en rad nya terapeutiskt relevanta mål för klinisk användning).

Protocol

1. Cellberedning

OBS: Beroende på celltyp och dess RNA-innehåll kan startantalet celler variera.

  1. Ha tillräckligt med celler för att erhålla mellan 200-500 μg totalt RNA eller 5-7 μg poly-A-valt RNA. Till exempel bör 50 x 106 SupT1-celler ge cirka 500 μg totalt RNA vid extraktion med fenolbaserade reagenser, och krävs därför för varje enskilt tillstånd som testas.
  2. Förbered det önskade antalet celler enligt den experimentella designen, och därmed enligt antalet testade tillstånd (infektion, tidpunkter, behandling). Om experimentet syftar till att erhålla icke-infekterade celler och HIV-infekterade celler vid 24 timmar efter infektion behövs totalt 100 x 106 celler, hälften för icke-infekterat tillstånd och hälften för infekterat tillstånd.

2. RNA-extraktion

  1. Från celler: RNA-extraktion med fenol-kloroform
    1. För varje tillstånd, samla celler (t.ex. 50 x 106) genom centrifugering och kassera supernatanten.
    2. Tillsätt 5 ml fenolbaserat reagens till varje 50 x 106 cellpellet och blanda genom pipettering upp och ner flera gånger.
    3. Inkubera i 5 min vid rumstemperatur för att möjliggöra fullständig lys. Lyserade celler kan lagras vid -80 °C eller bearbetas direkt.
      OBS: Vid behov kan cellerna också delas in i alikvoter på 10 x 106 celler per rör i 1,5 ml-rör och lysas i 1 ml fenolbaserat reagens för bekvämare förvaring.
    4. Tillsätt 1 ml kloroform och blanda genom inversion.
    5. Inkubera i 3 min vid rumstemperatur.
    6. Centrifugera i 15 min vid 2 000 x g och 4 °C.
    7. Pipettera ut vattenfasen (övre fasen) och överför till ett nytt rör. Avsluta överföringen av vattenfasen genom att meta röret vid 45° och försiktigt pipettera lösningen.
      OBS: Mängden vattenfas kan variera mellan proverna men bör ligga nära den mängd kloroform som tillsätts provet (dvs. 1 ml). Överför inga interfasiga eller organiska skikt! Användningen av faslås eller fastillverkare rör kan underlätta denna process.
    8. Tillsätt 0,5 ml 100% isopropanol av molekylär kvalitet till vattenfasen.
    9. Inkubera i 1 h vid -80 °C för att tillåta RNA-nederbörd.
    10. Centrifugera i 10 min vid 12 000 x g och 4 °C för att pelletera det utfällda RNA.
    11. Kassera supernatanten och återanvänd RNA-pelleten i 1 ml 75% molekylärbiologisk etanol. Vortex kort.
    12. Centrifugera i 5 min vid 7 500 x g och 4 °C och kassera supernatanten.
    13. Lufttorka pelleten i 15 min.
    14. Återanvänd pelleten i 20 μL RNase-fritt vatten och överför till ett nytt rör.
    15. Tvätta det tomma röret med ytterligare 20 μL vatten för att maximera RNA-återhämtningen och poola med den första 20 μL-volymen.
    16. Kvantifiera det totala RNA med en spektrofotometer och utvärdera RNA-kvaliteten med en fragmentanalysator.
  2. Från virala partiklar: RNA-extraktion med kolumnbaserad viral RNA-extraktionssats
    OBS: RNA-extraktion från viruspartiklar med fenolbaserat reagens resulterar i viralt RNA av låg kvalitet och i bibliotek av lägre kvalitet. En kolumnbaserad RNA-extraktion bör därför gynnas. RNA-extraktionssatser som använder bärar-RNA för RNA-elution och återhämtning är inte lämpliga för detta förfarande och bör undvikas. Eftersom HIV RNA är poly-Adenylated, direkt RNA-extraktion utan ytterligare mRNA-isolering är tillräcklig för att komma in i MeRIP-Seq och BS-Seq rörledningar. Normalt bör 1-2 ml viral supernatant från universellt infekterade celler ge tillräckligt med RNA för att utföra hela arbetsflödet.
    1. Förbered bufferten genom att tillsätta 150 μL beta-mercaptoethanol till 30 ml lysbuffert. Rekonstituera virustvättbufferten genom att tillsätta 96 ml 100% etanol.
    2. Samla virusinnehållande supernatanter och centrifugera till pelletscellsskräp för att minimera cellulär RNA-förorening.
    3. Överför 1 ml viral supernatant till ett 15 ml-rör.
    4. Tillsätt 3 ml viral RNA-buffert till 1 ml virusprov och blanda genom virvel.
    5. Överför 700 μL prov i en kolumn, insatt i ett uppsamlingsrör.
    6. Centrifugera i 2 min vid 13 000 x g vid rumstemperatur.
    7. Ignorera genomströmningen.
    8. Upprepa de tre föregående stegen tills hela provet har bearbetats, och därmed har allt RNA fångats in på den kiselbaserade matriskolumnen.
    9. Tillsätt 500 μL virustvättbuffert i kolonnen.
    10. Centrifugera i 1 min vid 10 000 x g vid rumstemperatur. Ignorera genomströmningen.
    11. Tillsätt 200 μL virustvättbuffert i kolonnen.
    12. Centrifugera i 1 min vid 10 000 x g vid rumstemperatur. Ignorera genomströmningen.
    13. Placera kolonnen i ett tomt uppsamlingsrör.
    14. Centrifugera i 1 min vid 10 000 x g vid rumstemperatur för att ytterligare kassera eventuella återstående diskbuffertföroreningar.
    15. Överför försiktigt kolonnen till ett 1,5 ml-rör.
    16. Tillsätt 20 μL DNase/RNase-fritt vatten direkt i mitten av kolonnmatrisen och centrifugera vid 10 000 x g i 30 s vid rumstemperatur.
    17. Tillsätt ytterligare 10 μL DNase/RNase-fritt vatten direkt i mitten av kolonnmatrisen och centrifugera igen i 30 s.
    18. Kvantifiera det totala RNA med en spektrofotometer och utvärdera RNA-kvaliteten med en fragmentanalysator.
      OBS: RNA-extraktion kan utföras med vilken metod som helst, om kvaliteten på det hämtade RNA är hög, med ett RNA-integritet/ kvalitetsnummer > 9. Totalt RNA kan lagras vid -80 °C tills vidare bearbetning.

3. mRNA Isolering genom poly-A Urval med Oligo(dT)25

OBS: På grund av förekomsten av starkt metylerade ribosomala RNA i cellulära extrakt, Rekommenderas det starkt att isolera poly-A RNA antingen genom rRNA utarmning eller företrädesvis genom poly-A positivt urval. Detta steg är valfritt och bör endast utföras för cellulära RNA-prover, för att erhålla sekvenseringsresultat med högre upplösning. Om analysera metylering av icke-poly-adenylerade virala RNAs, gynna rRNA utarmning snarare än poly-A urval eller så småningom utföra analysen på totala RNA.

  1. Pärlberedning för poly-A Capture
    1. Resuspend Oligo(dT)25 magnetiska pärlor stockflaska genom att virvla i >30 s.
    2. Överför 200 μL magnetiska pärlor till ett 1,5 ml rör. Förbered antalet rör med magnetiska pärlor enligt den totala mängden RNA-prover som ska bearbetas.
      OBS: Ett rör med 200 μL Dynabead-stamlösning motsvarar 1 mg pärlor och rymmer ett prov på 75 μg totalt RNA.
    3. Placera rören på en magnet i 1 min och kassera supernatanten. Ta bort rören från magneten.
    4. Tillsätt 1 mL bindningsbuffert (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,0 M LiCl, 2 mM EDTA) och återanvänds genom virvel. Placera rören på magneten i 1 min och kassera supernatanten. Ta bort rören från magneten. Upprepa.
    5. Återanvänd de tvättade magnetiska pärlorna i 100 μL bindningsbuffert.
  2. Totalt RNA-preparat
    1. Späd ut det totala RNA vid en slutlig koncentration på 0,75 μg/μL med RNasefritt vatten, vilket motsvarar 75 μg/100 μL.
      OBS: Om RNA har en lägre koncentration, fortsätt enligt beskrivningen nedan utan att ändra volymerna.
    2. Aliquot det totala RNA i flera rör genom att dispensera 100 μL RNA-prov per rör.
    3. Tillsätt 100 μL bindningsbuffert till varje RNA-prov.
    4. Värm det totala RNA till 65 °C i 2 minuter för att störa sekundära strukturer.
    5. Placera omedelbart på is tills du är redo att gå vidare till nästa steg.
      OBS: Inkubationstiden kan variera beroende på antalet prover som ska bearbetas men bör inte överstiga 1 timme för att undvika RNA-nedbrytning.
  3. Poly-A-markering
    1. Till varje RNA-rör (från steg 3.2), tillsätt 100 μL tvättade magnetiska pärlor (från steg 3.1).
    2. Blanda noggrant genom pipettering upp och ner och låt bindning på ett roterande hjul vid rumstemperatur i 15 min.
    3. Öppna alla rör, placera dem på magneten i 1 min och ta försiktigt bort all supernatant.
    4. Återvinn supernatanten i ett nytt rör och håll åt sidan för en andra omgång RNA-fångst (steg 3.3.14), för att förbättra poly-A-den slutliga återhämtningen.
    5. Ta bort röret från magneten och tillsätt 200 μL tvättbuffert (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M LiCl, 1 mM EDTA). Blanda genom pipettering försiktigt 4 till 5 gånger.
    6. Placera röret på magneten i 1 min och kassera supernatanten.
    7. Upprepa tvättsteget en gång (upprepa steg 3.3.5 och 3.3.6).
    8. Tillsätt 20 μL iskall 10 mM Tris-HCl för att elute poly-A RNA från pärlorna.
    9. Inkubera vid 80 °C i 2 min.
    10. Placera röret på magneten och överför snabbt supernatanten som innehåller poly-A RNA till ett nytt RNase-fritt rör. Lägg röret på is.
    11. Upprepa elutionssteget (steg 3.3.8 till 3.3.10) för att öka avkastningen.
    12. Tvätta samma pärlor en gång med 200 μL tvättbuffert. Blanda genom pipettering försiktigt 4 till 5 gånger.
    13. Placera på magneten i 1 min och kassera tvättbufferten.
    14. Tillsätt genomströmningen från steg 3.3.4 till pärlorna och upprepa proceduren från bindning till elution (steg 3.3.2 till 3.3.10). Håll RNA-eluatesna i separata rör tills vidare.
      OBS: Behåll eventuellt supernatanten som motsvarar steg 3.3.4 i ett nytt rör eftersom den kan användas som en kontroll. I slutet av förfarandet rena och koncentrera RNA genom etanolutfällning eller med en kolumnbaserad valmetod (dvs. RNA-ren och koncentrator). Detta prov motsvarar ett poly-A-utarmat RNA-prov och kan användas som en kontroll för bisulfitomvandling (steg 8.2.2).
    15. Kvantifiera det eluterade RNA med en spektrofotometer och håll en 2 μL alikvot för att ytterligare bedöma RNA-kvaliteten med en fragmentanalysator.
      OBS: Poly-A RNA kan förvaras vid -80 °C tills det behövs.

4. RNA-arbetsflöde

  1. Dela upp cellulära poly-A RNA (mRNA) och virala RNA-prover i 2 alikvoter, dedikerade till respektive epitranscriptomisk analyspipeline:
    i) 5 μg cellulär mRNA eller 1 μg viralt RNA för MeRIP-Seq och inmatningskontroller (gå till steg 5-7 och steg 9).
    ii) 1 μg cellulär mRNA eller 500 ng viralt RNA för BS-Seq (gå till steg 8 och 9).

5. RNA-fragmentering

OBS: RNA-fragmentering utförs med RNA-fragmenteringsreagenset och är avsett för MeRIP-Seq och kontroll RNA-prover. Detta är ett mycket viktigt steg som kräver noggrann optimering för att få fragment som sträcker sig mellan 100-200 nt.

  1. Dela upp den totala volymen mRNA i 0,2 ml PCR-rör med 18 μL mRNA/rör.
    OBS: Arbeta snabbt. Arbeta inte med fler än 8 prover åt gången för att få reproducerbara resultat. Att skala upp volymen garanterar inte en reproducerbar och enhetlig fragmentering.
  2. Värm upp en termocykel vid 70 °C.
  3. Tillsätt 2 μL fragmenteringsreagens på kanten av varje PCR-rör.
  4. Stäng röret och snurra ner (så att reagenset kommer i kontakt med RNA samtidigt för de 8 rören).
  5. Inkubera proverna 15 min vid 70 °C i den förvärmda termocykeln.
  6. Så snart inkubationen är över, tillsätt snabbt 2 μL stopplösning i varje rör.
  7. Snurra ner och låt sitta på is tills du är redo att gå vidare till nästa steg.
    OBS: Inkubationstiden kan variera beroende på antalet prover som ska bearbetas men bör inte överstiga 1 timme för att undvika RNA-nedbrytning.
  8. Upprepa proceduren för alla prover (om det finns fler än 8 alikvoter).
  9. Poola rören tillsammans och fortsätt till RNA-rening med en RNA-ren och koncentratorsats (steg 6) eller något anpassat kolonnbaserat kit för att bli av med buffertarna och återställa rent fragmenterat RNA i vatten.

6. RNA-rening

OBS: Detta steg kan utföras genom etanolutfällning eller med någon form av kolonnbaserad RNA-rening och koncentrationsmetod (dvs. RNA Clean och Concentrateor).

  1. Elute eller resuspend det renade RNA i en total volym av 50-75 μL DNase/RNase-fritt vatten.
    OBS: Om en kolumnbaserad metod används rekommenderas två elutionsrundor starkt för att säkerställa maximal återhämtning.
  2. Kvantifiera det renade fragmenterade mRNA med en spektrofotometer och utvärdera RNA-kvaliteten med en fragmentanalysator.
  3. Håll 100 ng fragmenterat mRNA som inmatningskontroll för biblioteksförberedelse och sekvensering (gå till steg 9). Det återstående fragmenterade mRNA (minst 2,5 μg) kan användas för MeRIP (gå till steg 7.2).

7. MeRIP

OBS: Minst 2,5 μg fragmenterat mRNA krävs för varje immunprecipitation (IP), antingen med hjälp av en specifik anti-m6A-antikropp (testtillstånd) eller med hjälp av en anti-IgG-antikropp (negativ kontroll).

  1. Magnetisk pärla förberedelse för immunprecipitation
    1. För varje prov, förbered 4 ml 1x IP-buffert i ett nytt koniskt rör genom att späda ut 800 μL mRNA IP-buffert 5x (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 750 mM NaCl, 0,5% Igepal CA-630 och nukleasfritt vatten) med 3,2 ml nukleasfritt vatten.
      OBS: Minst 2 reaktioner behövs (ett test och en IgG-kontroll).
    2. Lägg röret på is.
    3. Märk lämpligt antal 1,5 ml mikrocentrifugerör för antalet önskade IP-reaktioner:
      n rör (test) för anti-m6A-antikropp.
      n rör (negativ kontroll) för Normal Mouse IgG.
    4. Återanvänd de magnetiska pärlorna (t.ex. Magna ChIP Protein A/G ) genom att invertera och virvla. Inga klumpar av pärlor bör vara synliga.
    5. För varje planerad reaktion, överför 25 μL magnetiska pärlor till ett mikrocentrifugerör.
    6. Tillsätt tio gånger mer 1x IP-buffert (från steg 7.1.1) med avseende på den ursprungliga volymen pärlor som används (dvs. 250 μL 1x IP-buffert per 25 μL magnetiska pärlor).
    7. Blanda pärlorna genom att försiktigt pipettera upp och ner flera gånger för fullständig resuspension.
    8. Placera röret på magnetavskiljaren i 1 min.
    9. Ta bort och kassera supernatanten, se till att inte aspirera några magnetiska pärlor. Ta bort röret från magneten.
    10. Upprepa tvättsteget (steg 7.1.6 till 7.1.9).
    11. Återsuspend pärlor i 100 μL 1x IP buffert per 25 μL originalvolym av magnetiska pärlor.
    12. Tillsätt 5 μL antikropp (1 μg/μL) per 25 μL originalvolym av magnetiska pärlor.
      n rör (test) med anti-m6A-antikropp (klon 17-3-4-1) [1 μg/μL].
      n rör (negativ kontroll) med Normal Mouse IgG (1 μg/μL).
    13. Inkubera på det roterande hjulet i 30 minuter vid rumstemperatur för att möjliggöra konjugation av antikropparna med de magnetiska pärlorna.
    14. Placera röret på magnetavskiljaren i 1 min. Kasta supernatanten. Ta bort röret från magneten och återanvänd antikropps-pärlablandningen i 100 μL 1x IP-buffert.
  2. RNA Immunoprecipitation (RIP)
    1. Förbered 500 μL RIP-reaktionsblandning för varje 2,5 μg mRNA-prov enligt följande: 2,5 μg i 100 μL fragmenterat RNA (från steg 6.12); 295 μL nukleasfritt vatten; 5 μL 40 U/μL RNase Inhibitor; och 100 μL 5x IP-buffert.
    2. Tillsätt 500 μL RIP-reaktionsblandning till varje antikropps-pärlblandning (~100 μL från steg 7.1.14). Blanda genom att försiktigt pipettera flera gånger för att helt återanvända pärlorna. Lägg på is.
    3. Inkubera alla RIP-rör på ett roterande hjul i 2 timmar vid 4 °C.
    4. Centrifugera MeRIP-reaktionerna kort för att spinna ner vätskedroppar från locket och rörsidorna. Placera rören på en magnetisk separator i 1 min.
    5. Överför supernatanten i ett nytt centrifugrör, var försiktig så att du inte stör de magnetiska pärlorna .
      OBS: Genomströmningen kan behållas som kontroll för att verifiera RIP-effektiviteten (gå till steg 7.3.9).
    6. Ta bort rören från magneten. Tvätta pärlorna genom att tillsätta 500 μL kall 1x IP-buffert. Blanda pärlorna genom att försiktigt pipettera flera gånger för att helt återanvända pärlorna.
    7. Placera rören på en magnetisk separator i 1 min och kassera supernatant.
    8. Upprepa tvättproceduren (steg 7.2.6-7.2.7) två gånger för totalt 3 tvättar.
    9. Placera rören på is och fortsätt omedelbart till elution.
  3. Elution
    1. Förbered 20 mM m6A lösning genom att lösa upp 10 mg N6-metyladenosin, 5′-monofosfat natriumsalt (m6A) i 1,3 ml nukleasfritt vatten. Förbered 150 μL alikvoter och förvara vid -20 °C.
    2. För varje prov (provning och kontroller): Förbered 225 μL elueringsbuffert genom blandning av följande komponenter: 45 μL 5x IP-buffert, 75 μL 20 mM m6A, 3,5 μL 40U/μL RNase Inhibitor och 101,5 μL nukleasfritt vatten.
    3. Tillsätt 100 μL elutionbuffert (från steg 7.3.2) till pärlorna (från steg 7.2.9). Blanda genom att försiktigt pipettera flera gånger för att helt återanvända pärlor.
    4. Inkubera alla rör i 1 h med kontinuerlig skakning på en vipp vid 4 °C.
    5. Centrifugera RIP-reaktionerna kort för att spinna ner vätskedroppar från locket och rörsidorna. Placera rören på en magnetisk separator i 1 min.
    6. Överför supernatanten som innehåller eluterade RNA-fragment till ett nytt 1,5 mL microcentrifuge-rör. Var försiktig så att du inte aspirera pärlorna, eftersom det kommer att öka bakgrundsljudet.
    7. Upprepa elueringsstegen (7.3.3 till 7.3.6) genom att återigen tillsätta 100 μL elueringsbuffert, inkubera 1 h vid 4 °C och samla upp eluatet efter magnetisk separation.
    8. Kombinera alla eluater från samma prov (den totala elueringsvolymen ska vara 200 μL).
    9. Rena det eluterade RNA och genomströmningen (valfritt, från steg 7.2.5) genom etanolutfällning eller med en kolonnbaserad valfri metod (dvs. RNA Clean and Concentrateor).
    10. Utvärdera RNA-kvantiteten och kvaliteten på genomströmnings- och eluterade prover med en fragmentanalysator med hjälp av ett kit för identifiering av hög känslighet. Om kvaliteten på RNA är tillfredsställande, fortsätt till biblioteksförberedelser och sekvensering med hög genomströmning (steg 9).
      OBS: Mängden RNA som hämtas på MeRIP är mycket låg och kräver absolut hög känslighetsdetekteringssatser för att säkerställa kvantifiering. Om ingen bioanalyzer är tillgänglig är det möjligt att blint fortsätta med biblioteksförberedelser.

8. RNA Bisulfite Konvertering

  1. Kontroll- och reagensberedning
    1. ERCC mix spike-in kontroll: Tillsätt ERCC mix enligt tillverkarens instruktioner, som rekommenderar tillsats av 0,5 μL outspädd ERCC-blandning till 500 ng mRNA. Denna kontroll kan hjälpa till att bedöma effektiviteten av bisulfitomvandling.
    2. Spike Poly-A-utarmat RNA (från steg 3.3.14) vid ett förhållande 1/1000 (dvs . 500 pg poly-A-utarmat RNA för 500 ng mRNA). Detta prov är berikat i ribosomal RNA och bör därför innehålla 28S rRNA, en positiv kontroll för bisulfitkonvertering.
      OBS: Totalt RNA kan också användas som positiv kontroll istället för poly-A-utarmat RNA.
    3. Utför bisulfitkonvertering med ett RNA-metyleringskit (t.ex. Zymo EZ).
    4. RNA Wash Buffer: Tillsätt 48 ml 100% etanol (eller 52 ml 95% etanol) till 12 ml RNA Wash Buffer-koncentrat före användning.
  2. Bisulfitkonvertering
    OBS: Bisulfitomvandling utfördes med en kommersiellt tillgänglig RNA-bisulfitkonverteringssats enligt tillverkarens förfarande enligt nedan.
    1. Tillsätt 1000 m ng mRNA (eller mellan 300 och 1000 ng) i 0,2 mL PCR-rör. Lägg till spike-in-kontroller: 1 μL ERCC-blandning (steg 8.1.1) och 1000 pg poly-A-utarmat RNA (steg 8.1.2). Komplett volym upp till 20 μL med DNase/RNase-fritt vatten.
    2. Tillsätt 130 μL RNA Conversion Reagent till varje 20 μL RNA-prov.
    3. Blanda provet genom pipettering upp och ner.
    4. Snurra ner en kort stund för att säkerställa att det inte finns några droppar i locket eller sidorna av röret.
    5. Placera PCR-rören i en termisk cyklist och utför följande steg: denaturering vid 70 °C i 5 min; Omvandling vid 54 °C i 45 minuter. upprepa denaturerings- och konverteringssteg under totalt 3 cykler. och håll sedan vid 4 °C på obestämd tid.
      OBS: Tre cykler av denaturering och bisulfit omvandling säkerställer fullständig bisulfit omvandling av provet. Proverna kan lagras vid -80 °C eller bearbetas direkt.
    6. Fortsätt med desulfonation i kolumnen. Placera en kolumn i ett tomt uppsamlingsrör och tillsätt 250 μL RNA-bindningsbuffert i kolonnen.
    7. Ladda provet (~150 μL från steg 8.2.5) i kolonnen som innehåller RNA-bindningsbufferten och blanda genom pipettering upp och ner.
    8. Tillsätt 400 μL 95-100% etanol till prov-RNA-bindningsbuffertblandningen i kolonnen. Stäng locket och blanda omedelbart genom att invertera kolumnen flera gånger.
    9. Centrifugera med full hastighet (≥ 10 000 x g) i 30 s. Ignorera genomströmningen.
    10. Tillsätt 200 μL RNA Wash Buffer till kolonnen och centrifugera med full hastighet i 30 s.
    11. Tillsätt 200 μL RNA Desulphonation Buffer till kolonnen och inkubera vid rumstemperatur i 30 min. Efter inkubationen, centrifugera med full hastighet i 30 s. Ignorera genomströmningen.
    12. Tillsätt 400 μL RNA Wash Buffer till kolonnen och centrifugera med full hastighet i 30 s. Upprepa tvättsteget med ytterligare 400 μL RNA Wash Buffer. Ignorera genomströmningen.
    13. Centrifugera kolonnen i det tömda uppsamlingsröret med full hastighet i 2 min. Överför kolonnen till ett RNase-fritt rör.
    14. Tillsätt ≥ 10 μL DNase/RNase-fritt vatten direkt till kolonnmatrisen och inkubera i 1 min vid rumstemperatur. Centrifugera i full hastighet i 30 s.
      OBS: Vi brukar elute i en volym av 20 μL. Det eluterade RNA kan användas omedelbart eller förvaras vid -20 °C i upp till 3 månader. För långtidsförvaring, håll vid -80 °C.
    15. Ta ut 2,5 μL för fragmentanalysatorbedömning av RNA:s kvalitet och kvantitet och fortsätt till biblioteksberedning och sekvensering med hög genomströmning (steg 9).
    16. Ta 4 μL konverterat RNA för bisulfitomvandlingskontroll av effektiviteten (steg 8.3).
  3. Bisulfitkonverteringskontroll av RT-PCR
    OBS: Det här steget säkerställer att bisulfitkonvertering lyckades innan du fortsatte till sekvensering . 28S ribosomal RNA från Homo sapiens kommer att användas som positiv kontroll för RNA-metyleringsanalys, eftersom C-resterna vid position 4447 (GenBank accession # NR_003287) har beskrivits som 100% metylerade.
    Primer-sekvenser:
    H 28SF primer: 5'-GGGGTTTTAYGATTTTTTTTGATTTTTTTTGGG-3'
    H 28SR primer: 5'-CCAACTCACRTTCCCTATTAATAAATAAAC-3'
    1. Förbered RT-reaktionsmix (Reverse Transcription) med hjälp av en CDNA Reverse Transcription Kit med hög kapacitet. Tina satsens komponenter på is och förbered RT-huvudblandningen på is enligt följande:
      4 μL bisulfitomvanderat RNA (från steg 8.2.14):
      2 μL 10xRT buffert
      0,8 μL 25x dNTP Mix [100 mM]
      2 μL 10x RT slumpmässiga primers
      1 μL multiskrivskrivelse omvänd transkriptas
      1 μL RNase-hämmare
      9,2 μL nukleasfri H2O
      OBS: Varje RT-reaktion bör innehålla en slutlig volym på 20 μL i 0,2 mL PCR-rör.
    2. Sätt rören i den termiska cyklisten med följande RT-program: 25 °C i 10 min; 37 °C i 120 min; 85 °C i 5 min; sedan vid 4 °C på obestämd tid.
    3. Förbered PCR-reaktionen för att förstärka specifikt 28S rRNA med ett PCR-korrekturläsningsenzym. Tina satsens komponenter på is, virvla försiktigt och centrifugera kort. Förbered PCR-huvudblandningen på is eller på en iskall plåthållare enligt följande:
      0,6 μL 10 μM H 28SF primer
      0,6 μL 10 μM H 28SF primer
      6,5 μL mall-cDNA
      22,5 μL DNA Polymeras master mix
      OBS: Varje PCR-reaktion bör innehålla en slutlig volym på 20 μL i 0,2 mL PCR-rör.
    4. Placera rören i termiska cyklisten med följande PCR-program: initial denaturering vid 95 °C i 5 min; 45 cykler av denaturering (95 °C för 15 s), glödgning (57 °C för 30 s) och förlängning (72 °C för 15 s), slutlig förlängning vid 72 °C i 10 minuter och sedan hålla vid 4 °C på obestämd tid.
    5. Kör 10 μL av reaktionen på en 2% agarosegel. Den förväntade bandstorleken är 130 - 200 bp.
  4. Sekvensering av PCR-produkter
    1. Rena PCR-produkterna med en kolonnbaserad metod för att avlägsna enzymer och dNTP-rester och elta det förstärkta DNA:t i minst 20 μL DNase/RNase-fritt vatten.
    2. Kvantifiera det renade DNA:t med spektrofotometer.
    3. Sekvenseringsreaktion
      1. Använd 40 ng PCR produkt/sekvensering reaktion.
      2. Sekvens i båda riktningarna med H 28SF- och H 28SR-primers.
      3. Justera sekvenserna med den kända icke-konverterade sekvensen (28S ribosomal N5 (RNA28SN5). Kontrollera om det finns C-rester i läge C4447 och T-rester i stället för C någon annanstans.

9. Biblioteksförberedelse och sekvensering med hög genomströmning

  1. Förbered bibliotek för sekvensering med mRNA-kit (t.ex. Illumina TruSeq Stranded), starta protokollet vid Elute-Prime-Fragment-steget och följ tillverkarens instruktioner.
    1. För indataproverna RNA-Seq och MeRIP-Seq, inkubera dock proverna vid 80 °C i 2 minuter för att endast prime men inte ytterligare fragmentera dem.
  2. Utför sekvensering med Illumina-plattformar. Sekvenseringsreaktioner kan utföras enligt preferenser och experimentell design, antingen enkla eller parade ändar, med minst 100 nt längd.

10. Bioinformatik Analyser

  1. m6A Databehandling
    1. Kör FASTQC24 för att bedöma läskvaliteten i m6A och mata in FASTQ-filer från sekvensering.
    2. Kör Atropos25 för att trimma end- och adaptersekvenser av låg kvalitet från läsningarna. Ange följande parametrar när du kör Atropos.
      1. Ta bort följande adaptersekvenser: AGATCGGAAGAG, CTCTTCCGATCT, AACACTCTTTCCCT, AGATCGGAAGAGCG, AGGGAAAGAGTGTT, CGCTCTTCCGATCT.
      2. Använd följande Phred kvalitetsavstängning: 5, för trimning av lågkvalitativa ändar enligt tillverkarens anvisningar (https://support.illumina.com/downloads/illumina-adapter-sequences-document-1000000002694.html).
      3. Använd följande minsta läslängd efter trimning: 25 baspar.
    3. Slå samman GRh38 humangenom och HIV [Integrerad linjär pNL4-3Env-GFP] referens i FASTA-format.
    4. Indexera den sammanslagna referensen med HISAT226.
    5. Kör HISAT2 på trimmade läsningar för att justera till den indexerade referensen. Använd standard hisat-parametrar.
    6. Sortera och indexera de justerade läsningarna med SAMtools27.
    7. Kör SAMtools stat och Qualimap 228, för kvalitetskontroll efter justering av de sekvenserade biblioteken.
    8. Alternativt samlar du in och sammanfattar kvalitetsmått från föregående steg med multiQC29.
    9. HIV genom har homologa 634 bp sekvenser i 5 ' LTR och 3 ' LTR: Realign multimapping läser från 5 ' LTR till motsvarande 3 ' LTR-regionen med SAMtools.
    10. För att identifiera m6A-topparna kör du den högsta samtalsprogramvaran MACS230 (v 2.1.2). Välj noggrant MACS2-körparametrar, för att säkerställa korrekt funktion på RNA-Seq-data eftersom toppsamtal kan påverkas av genuttrycksnivå, och korta exoner kan kallas fel som toppar. Därför måste ingångssignalen subtraheras från m6A-signalen, utan att MACS2 rutinmässigt applicerar på DNA-baserade data. Använd följande parametrar på underkommandot "callpeak" från MACS2:
      -keep-dup auto (styr MACS2-beteendet mot duplicerade läsningar, "auto" gör det möjligt för MACS att beräkna det maximala antalet avläsningar på exakt samma plats baserat på binomial distribution med 1e-5 som p-värde cutoff)
      -g 2,7e9 (storleken på det mänskliga genomet i bp)
      -q 0.01 (minsta FDR-cutoff för att ringa betydande toppar)
      -nomodel (för att kringgå byggandet av växlingsmodellen, som är skräddarsydd för ChIP-Seq-experiment)
      -slocal 0
      -llocal 0 (om du ställer in den här och föregående parametern till 0 kan MACS2 direkt subtrahera, utan utjämning, indatan läser från m6A-läsningarna)
      -extsize 100 (genomsnittlig längd av fragment i bp)
      -B
    11. Kör delkommandot för differentialtoppssamtal för MACS2, "bdgdiff" för att jämföra infekterade vs icke-infekterade exempel. "bdgdiff" tar som inmatningar sängenGraffiler som genereras av "callpeak" i föregående steg. För varje tidpunkt kör du jämförelsen av infekterade kontra icke-infekterade prover med "bdgdiff", subtraherar respektive ingångssignal från m6A-signalen och tillhandahåller ytterligare parametrar: -g 60 -l 120.
  2. m5C databehandling
    1. Kör Cutadapt31 för att trimma adaptersekvenser från de råa läsningarna, med följande parametrar:
      adapter "AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAAC"
      -minsta längd=25.
    2. Komplettera de trimmade läsningarna med seqkit32, eftersom sekvenseringsprotokollet producerar läsningar från den omvända strängen.
    3. Kör FastQC för att undersöka läskvaliteten.
    4. Sammanfoga GRh38 humant genom och HIV [Integrerad linjär pNL4-3Env-GFP] referens i FASTA-format.
    5. Indexera den sammanslagna referensen med programmet meRanGh från meRanTK-paketet33.
    6. Anpassa dig till meRanGh med följande parametrar:
      -FN som gör det möjligt att skriva omappade läsningar till utdatafiler
      -MM som gör det möjligt att skriva flera mappade läsningar till utdatafilen
      -bg för utmatning i bedGraph
      -mbgc 10 filter rapporterad region efter täckning (minst 10 läsningar av täckning)
    7. HIV genom har homologa 634 bp sekvenser i 5 ' LTR och 3 ' LTR: realign multimapping läser från 5 ' LTR till motsvarande 3 ' LTR-regionen med SAMtools.
    8. Kör metyleringssamtal via meRanCall-verktyget, som tillhandahålls av meRanTK, med följande parametrar:
      -rl = 126, läslängd
      -ei = 0,1, felintervall för beräkningen av metyleringshastigheten p-värde
      -cr = 0,99, förväntad konvertering
    9. Kör MeRanTK:s verktygs estimateSizeFactors.pl för att uppskatta storleksfaktorer för varje prov. Storleksfaktorerna kommer att användas som parametrar i nästa steg.
    10. Kör MeRanCompare för differentialmetyleringsanalys av icke-infekterad vs infekterad över tidspunkterna 12, 24 och 36h. Följande parametrar tillämpas: ett signifikansvärde på .01 som det minimala tröskelvärdet för rapportering och storleksfaktorer från föregående steg.

Representative Results

Detta arbetsflöde har visat sig användbart för att undersöka rollen av m6A och m5C metylering i samband med HIV-infektion. För detta använde vi en CD4 + T-cellinjemodell (SupT1) som vi antingen infekterar med HIV eller lämnas obehandlad. Vi startade arbetsflödet med 50 miljoner celler per tillstånd och erhöll i genomsnitt 500 μg totalt RNA med ett RNA-kvalitetsnummer på 10 (figur 1A-B). Vid poly-A urval hämtade vi mellan 10 och 12 μg mRNA per villkor (som representerar ca 2% av det totala RNA) (figur 1B). Vid denna tidpunkt använde vi 5 μg poly-A-valt RNA för MeRIP-Seq-rörledningen och 1 μg för BS-Seq-rörledningen. Eftersom HIV RNA är poly-adenylated, behövs inga ytterligare åtgärder och MeRIP-Seq och BS-Seq förfaranden kan tillämpas direkt.

Figure 1
Figur 1: RNA-förberedelse för nedströmstillämpningar. A) Arbetsflöde som visar RNA-förberedelse och distribution för samtidiga MeRIP-Seq- och BS-Seq-rörledningar. Varje fylld sexkantig form representerar en RNA-modifieringstyp, till exempel m6A (grön) eller m5C (rosa). Mängder RNA-material som behövs för att utföra experimentet anges. B) Representativa resultat som visar förväntade RNA-distributionsprofiler (storlek och mängd) vid total RNA-extraktion (övre panel) och poly-A-urval (nedre panelen). Prover laddades på fragmentanalysatorn med standardkänslighetssats för att bedöma RNA-kvalitet innan de gick in i specifika MeRIP-Seq- och BS-Seq-procedurer. RQN: RNA-kvalitetsnummer; nt: nukleotider. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

MeRIP-Seq pipeline är en RNA immunoprecipitation-baserad teknik som möjliggör undersökning av m6A modifiering längs RNA-molekyler. För detta fragmenteras RNA först och inkuberas sedan med m6A-specifika antikroppar kopplade till magnetiska pärlor för immunoprecipitation och fångst. MeRIP-berikade RNA-fragment och den orörda (indatafraktionen) sekvenseras sedan och jämförs för att identifiera m6A-modifierade RNA-regioner och därmed m6A-metylerade transkriptioner (figur 2A). Upplösningen av tekniken förlitar sig på effektiviteten av RNA-fragmentering. I själva verket möjliggör kortare fragment en mer exakt lokalisering av m6A-resterna. Här utsattes cellulära poly-A-utvalda RNAs och virala RNAs för jonbaserad fragmentering med RNA fragmentering buffert under 15 min i en 20 μL slutlig volym för att erhålla RNA fragment av 100-150 nt. Från och med 5 μg mRNA, vi återhämtade 4,5 μg fragmenterat RNA, motsvarande en återvinningsgrad på 90% (figur 2B). Vi använde 100 ng fragmenterat, renat RNA som inmatningskontroll, utsatt direkt för biblioteksförberedelse och sekvensering. Det återstående RNA (~4,4 μg) bearbetades enligt MeRIP-Seq-rörledningen, som börjar med inkubation av fragmenterat RNA med pärlor bundna antingen till anti-m6A-specifika antikroppar eller till anti-IgG-antikroppar som kontroll. m6A-specifik RIP (MeRIP) på 2,5 μg fragmenterat RNA tillät hämtning av cirka 15 ng m6A-berikat material som genomgick biblioteksberedning och sekvensering (figur 2B). RIP med anti-IgG kontroll, som förväntat, gav inte tillräckligt med RNA för att möjliggöra ytterligare analys (figur 2B).

Figure 2
Bild 2: MeRIP-Seq-pipeline. A) Schematisk representation av MeRIP-Seq-arbetsflöde och inmatningskontroll. Vid poly-A-urval fragmenterades proverna i 120-150 nt bitar och, antingen direkt utsatt för sekvensering (100 ng, inmatningskontroll) eller användes för RNA immunoprecipitation (2,5 μg, RIP) med anti-m6A-specifika antikroppar eller anti-IgG-antikroppar som negativ kontroll före sekvensering. B) Representativa resultat som visar förväntade RNA-distributionsprofiler (storlek och mängd) vid fragmentering (övre panel) och RIP (nedre paneler, MeRIP: vänster, IgG-kontroll: höger). Prover laddades på fragmentanalysator för att utvärdera RNA kvalitet och koncentration före vidare bearbetning till biblioteksberedning och sekvensering. Fragmenterad RNA-analys utfördes med hjälp av RNA standard känslighet kit medan immunoprecipitated RNA använde hög känslighet kit. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

BS-Seq pipeline tillåter prospektering av m5C RNA modifiering vid nukleotid upplösning och leder till identifiering av m5C-metylerade transkriptioner. Vid omvandling av bisulfit omvandlas icke-metylerade cytosiner till uracil, medan metylerade cytosiner förblir oförändrade (figur 3A). På grund av de hårda förhållandena i bisulfitkonverteringsförfarandet (dvs. hög temperatur och lågt pH) försämras konverterade mRNAs mycket (figur 3B), men detta stör inte biblioteksförberedelser och sekvensering. Bisulfitkonvertering är effektiv endast på enkelsträngat RNA och kan därmed potentiellt hindras av sekundära dubbelsträngade RNA-strukturer. För att utvärdera effektiviteten i C-U-konverteringen införde vi två kontroller. Som en positiv kontroll, vi utnyttjade den tidigare beskrivna förekomsten av en högt metylerad cytosin i position C4447 av 28S rRNA23. Vid RT-PCR förstärkning och sekvensering av en 200 bp fragment som omger den metylerade platsen kunde vi observera att alla cytosiner framgångsrikt omvandlades till uraciler, och därmed visas som tymidiner i DNA-sekvensen, förutom cytosin i läge 4447 som förblev oförändrade. Som en kontroll för bisulfitomvandlingshastighet använde vi kommersiellt tillgängliga syntetiska ERCC RNA-sekvenser. Denna blandning består i en pool av kända, icke-metylerade och polydenylerade RNA-sekvenser, med en mängd sekundära strukturer och längder. Vid biblioteksförberedelser och sekvensering fokuserade vi på dessa ERCC-sekvenser för att beräkna konverteringsfrekvensen, som kan utföras genom att räkna antalet konverterade C bland de totala C-resterna i alla ERCC-sekvenser och i varje prov. Vi erhöll en konverteringsfrekvens på 99,5%, vilket bekräftar effektiviteten och framgången för bisulfitkonverteringsreaktionen (figur 3D).

Figure 3
Figur 3: BS-Seq-rörledning. A) Schematisk representation av BS-Seq-arbetsflöde. Vid poly-A-urval exponeras prover för bisulfit, vilket resulterar i C-U-omvandling (på grund av avmetaminering) för icke-metylerade C-rester. Metylerade C-rester (m5C) påverkas däremot inte av bisulfitbehandling och förblir oförändrade. B) Representativt resultat av bisulfitomvanderad RNA-fördelningsprofil (storlek och mängd) vid analys på fragmentanalysator med ett standardkänslighetskit. C) Elektrosfärogram som visar representativt sekvenseringsresultat av RT-PCR amplicon i regionen som omger 100% metylerad C vid position 4447 i 28S rRNA (markerad i blått). Däremot identifierades C rester av referenssekvensen som T rester i amplicon sekvensen på grund av att bisulfit omvandling framgång. D) Utvärdering av C-U-konverteringsfrekvensen genom analys av ERCC spike-in sekvenser i HIV-infekterade och icke-infekterade celler. Den genomsnittliga konverteringskursen är 99,5%. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

M6A-berikade prover, bisulfitomvanderade prover och inmatningskontroller bearbetas vidare för biblioteksberedning, sekvensering och bioinformatisk analys (figur 4). Enligt den experimentella design och biologiska frågor som behandlas kan flera bioinformatiska analyser tillämpas. Som principbevis här visar vi representativa resultat från en potentiell applikation (dvs. differentialmetyleringsanalys), som fokuserar på identifiering av differentiellt metylerade transkript som induceras vid HIV-infektion. Kortfattat undersökte vi m6A eller m5C metylering nivå av transkriptioner, oberoende av deras genuttryck nivå, i både icke-infekterade och HIV-infekterade celler, för att ytterligare förstå rollen av RNA metylering under viral livscykel. Vid genuttryck normalisering identifierade vi att ZNF469 transkript var differentiell m6A-metylerad enligt infektion status, verkligen denna transkript var inte metylerad i icke-infekterade celler medan det visade flera metylerade toppar på HIV infektion (figur 5A). En liknande differentialmetyleringsanalys på m5C visade att PHLPP1-avskriften innehöll flera metylerade rester, som tenderar att vara oftare metylerade i HIV-tillståndet (figur 5B). I detta sammanhang tyder båda analyserna på att HIV-infektion påverkar cellulära epitranscriptome.

Figure 4
Bild 4: Schematisk representation av det bioinformatiska arbetsflödet för analys av m6A- och m5C-data. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Exempel på differentiellt metylerade transkript vid infektion. A) Representativt resultat som visar m6A-metylering av ZNF459-transkript i HIV-infekterade (gröna) och icke-infekterade (grå) celler. Toppintensitet (vid subtraktion av ingångsuttryck) visas på y-axeln och positionen i kromosomen längs x-axeln. Differentiell metylering analys visar att ZFN469 transkript är hypermethylated på HIV infektion. B) Representativt resultat av m5C metylerad gen i HIV-infekterade (övre körfält) och icke-infekterade (nedre körfält) celler. Höjden på varje stapel representerar antalet avläsningar per nukleotid och möjliggör täckningsbedömning. Varje C-rester representeras i rött och andelen metylerat C representeras i blått. Den exakta metyleringshastigheten (%) rapporteras över varje C-rest. Pilar markera statistiskt signifikant differentiellt metylerade C. Prover visualiserades med hjälp av IGV tittare. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Discussion

Rollen av RNA ändringar i viral infektion är fortfarande i stort sett okänd. En bättre förståelse för rollen av epitranscriptomic modifieringar i samband med virusinfektion kan bidra till sökandet efter nya antivirala behandlingsmål.

I detta arbete tillhandahåller vi ett komplett arbetsflöde som möjliggör undersökning av m6A och m5C epitranscriptomes av infekterade celler. Beroende på den biologiska frågan rekommenderar vi att du använder poly-A-valt RNA som startmaterial. Även om det är valfritt, eftersom rörledningen kan användas med totalt RNA, är det viktigt att komma ihåg att rRNAs samt små RNAs är mycket modifierade och innehåller ett viktigt antal metylerade rester. Detta kan resultera i en minskad kvalitet och kvantitet av meningsfulla sekvenseringsdata.

Emellertid, om fokusera av studien är non-poly-adenylated RNA, bör RNA extraktion kliver anpassas för att undvika att kassera lilla RNA (i fall av kolonn-baserade RNA extraktion) och att privilegiera ribosom-utarmningtekniker i stället för poly-A val för att skriva in pipelinen.

För att säkerställa högkvalitativt RNA, korrekt fragmentering och lämplig m6A-berikad och BS-konverterad RNA-kvalitet för biblioteksberedning rekommenderar vi starkt att du använder en fragmentanalysator eller en bioanalyzer. Denna utrustning är dock inte alltid tillgänglig. Som ett alternativ kan kvaliteten på RNA, mRNA och storleken på fragmenterat RNA också bedömas genom visualisering på agarosgel. Alternativt kan biblioteksförberedelser utföras utan tidigare bedömning av RNA-kvantitet.

Vi använde den antikroppsbaserade MeRIP-Seq16-tekniken för att utforska det epitranskriptomiska landskapet m6A. Denna teknik är baserad på RNA immunoprecipitation och är framgångsrik. Vissa steg behöver dock noggrann optimering och kan vara kritiska. Även om m6A metylering har beskrivits främst inom konsensussekvensen RRA * CH, är detta motiv mycket frekvent längs mRNA-molekyler och tillåter inte exakt identifiering av det metylerade området. Det är därför viktigt att uppnå en reproducerbar och konsekvent RNA-fragmentering, som genererar små RNA-fragment, för att förbättra den RIP-baserade upplösningen. I det här protokollet rekommenderar vi en optimerad procedur som ger reproducerbara och konsekventa resultat i vår experimentella inställning; Detta fragmenteringssteg kan dock behöva ytterligare optimering enligt specifika exempelfunktioner.

Nyligen beskrevs en ny teknik som tillåter m6A direkt sekvensering. Det är baserat på användningen av specifika omvända transkriptasvarianter som uppvisar unika RT-signaturer som ett svar på att stöta på m6A RNA-modifiering24. Denna teknik, vid noggrann optimering, kan kringgå den stora begränsningen som merip-seq står inför (minska mängden initialt material och tillåta en högre upplösning). För att utforska m5C-modifieringen bestämde vi oss för att använda bisulfitkonverteringstekniken för att vid nukleotidupplösning upptäcka de modifierade C-resterna. För att minska den falska positiva hastigheten på grund av förekomsten av RNA sekundära strukturer, utförde vi 3 cykler av denaturation/bisulfite konvertering och ytterligare kontroll bisulfite konverteringsfrekvens prestanda tack vare användningen av ERCC spike-in kontroller. En av begränsningarna kopplade till denna teknik är att bisulfit omvandling är mycket hård och tre cykler av denaturation/bisulfite omvandling kan försämra vissa RNA och därmed minska upplösningen. I vår miljö valde vi dock att nöja oss med en potentiellt något lägre upplösning för att öka datauppsättningens kvalitet.

Tack vare dessa optimeringar och kontroller kunde vi tillhandahålla ett tillförlitligt och sunt arbetsflöde som kan utnyttjas för att undersöka det epitranskriptomiska landskapet och dess förändring i samband med virusinfektioner, värdpatogeninteraktioner eller exponering för specifika behandlingar.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Swiss National Science Foundation (bidrag 31003A_166412 och 314730_188877).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AccuPrime Pfx SuperMix Invitrogen 12344-040
anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1 Millipore MABE1006
Chloroform Merck 67-66-3
ERCC Invitrogen 4456740
EZ RNA Methylation Kit Zymo Research EZR5001
Fragment analyzer RNA Kit - HS RNA Kit Agilent DNF-472-0500
Fragment analyzer RNA Kit - RNA Kit Agilent DNF-471-0500
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystem 4368814
Illumina TruSeq Stranded mRNA Illumina 20020594
Magnetic Beads A/G Blend Merck 16-663
N6-Methyladenosine, 5′-monophosphate sodium salt (m6A) Sigma Aldrich M2780-10MG
Normal Mouse IgG Merk 12371
Oligo(dT)25 Life Technologies 61005,
PCRapace Stratec 1020220300
Quick RNA Viral Kit Zymo Research 1034
RNA Clean & Concentrator Zymo Research R1015
RNA Fragmentation Reagent Ambion AM8740
RNase Inhibitor Ambion AM2684
Trizol TRIzol Reagent 15596026

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Machnicka, M. A., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways--2013 update. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 262-267 (2013).
  2. Zaccara, S., Ries, R. J., Jaffrey, S. R. Reading, writing and erasing mRNA methylation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 608-624 (2019).
  3. Davalos, V., Blanco, S., Esteller, M. SnapShot: Messenger RNA Modifications. Cell. 174 (2), 498 (2018).
  4. Saletore, Y., et al. The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications. Genome Biology. 13 (10), 175 (2012).
  5. Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2017).
  6. Netzband, R., Pager, C. T. Epitranscriptomic marks: Emerging modulators of RNA virus gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (3), 1576 (2020).
  7. Pereira-Montecinos, C., Valiente-Echeverria, F., Soto-Rifo, R. Epitranscriptomic regulation of viral replication. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (4), 460-471 (2017).
  8. Lichinchi, G., et al. Dynamics of the human and viral m(6)A RNA methylomes during HIV-1 infection of T cells. Nature Microbiology. 1, 16011 (2016).
  9. Courtney, D. G., et al. Epitranscriptomic Addition of m(5)C to HIV-1 Transcripts Regulates Viral Gene Expression. Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).
  10. Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A Editing of HIV-1 mRNAs Enhances Viral Gene Expression. Cell Host & Microbe. 19 (5), 675-685 (2016).
  11. Tirumuru, N., Wu, L. HIV-1 envelope proteins up-regulate N (6)-methyladenosine levels of cellular RNA independently of viral replication. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3249-3260 (2019).
  12. Tirumuru, N., et al. N(6)-methyladenosine of HIV-1 RNA regulates viral infection and HIV-1 Gag protein expression. Elife. 5, (2016).
  13. Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell. Frontiers in Virology. 1 (11), (2021).
  14. Khoddami, V., Cairns, B. R. Transcriptome-wide target profiling of RNA cytosine methyltransferases using the mechanism-based enrichment procedure Aza-IP. Nature Protocols. 9 (2), 337-361 (2014).
  15. Hussain, S., Aleksic, J., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome. Genome Biology. 14 (11), 215 (2013).
  16. Dominissini, D., Moshitch-Moshkovitz, S., Salmon-Divon, M., Amariglio, N., Rechavi, G. Transcriptome-wide mapping of N6-methyladenosine by m6A-seq based on immunocapturing and massively parallel sequencing. Nature Protocols. 8 (1), 176-189 (2013).
  17. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  18. Shobbir Hussain, J. A., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome. Genome Biology. 14 (215), (2013).
  19. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).
  20. Endrullat, C., Glökler, J., Franke, P., Frohme, M. Standardization and quality management in next-generation sequencing. Applied & Translational Genomics. 10, 2-9 (2016).
  21. Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing. Nucleic Acids Research. 37 (2), 12 (2009).
  22. Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell. biorxiv. 1 (11), (2021).
  23. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and noncoding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  24. Aschenbrenner, J., et al. Engineering of a DNA Polymerase for Direct m(6) A Sequencing. Angewandte Chemie (International ed. in English). 57 (2), 417-421 (2018).
  25. Bioinformatics. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2021).
  26. Didion, J. P., Martin, M., Collins, F. S. Atropos: specific, sensitive, and speedy trimming of sequencing reads. PeerJ. 5, 3720 (2017).
  27. Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
  28. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  29. Okonechnikov, K., Conesa, A., García-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 32 (2), Oxford, England. 292-294 (2016).
  30. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), Oxford, England. 3047-3048 (2016).
  31. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), 137 (2008).
  32. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet Journal. 17 (1), (2011).
  33. Shen, W., Le, S., Li, Y., Hu, F. SeqKit: A Cross-Platform and Ultrafast Toolkit for FASTA/Q File Manipulation. PLOS ONE. 11 (10), 0163962 (2016).
  34. Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit. Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).

Tags

Biologi nummer 181 Epitranscriptomics m6A m5C RNA-modifieringar virus-värdinteraktioner virusinfektioner HIV
Utforska <sup>m6A</sup> och <sup>m5C</sup> Epitranscriptomes vid virusinfektion: ett exempel med HIV
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cristinelli, S., Angelino, P.,… More

Cristinelli, S., Angelino, P., Ciuffi, A. Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV. J. Vis. Exp. (181), e62426, doi:10.3791/62426 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter