Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Utforske m6A og m5C Epitranscriptomes ved virusinfeksjon: et eksempel med HIV

Published: March 5, 2022 doi: 10.3791/62426
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institute of Microbiology, Lausanne University Hospital and University of Lausanne, 2Bioinformatics Core Facility, SIB Swiss Institute of Bioinformatics

Summary

Rollen til RNA-modifikasjoner i virusinfeksjoner begynner å bli utforsket og kan markere nye viral-vert interaksjonsmekanismer. I dette arbeidet gir vi en rørledning for å undersøke m6A- og m5C RNA-modifikasjoner i sammenheng med virusinfeksjoner.

Abstract

Rollen til RNA-modifikasjoner i biologiske prosesser har vært fokus for et økende antall studier de siste årene og er i dag kjent som epitranscriptomics. Blant annet er N6-metyladenosin (m6A) og 5-metylcytosin (m5C) RNA-modifikasjoner beskrevet på mRNA-molekyler og kan ha en rolle i modulering av cellulære prosesser. Epitranscriptomics er dermed et nytt lag av regulering som må vurderes i tillegg til transkripsjonsanalyser, da det også kan endres eller moduleres ved eksponering for kjemiske eller biologiske midler, inkludert virusinfeksjoner.

Her presenterer vi en arbeidsflyt som tillater analyse av det felles cellulære og virale epitranskriptomiske landskapet på m6A- og m5C-merkene samtidig, i celler som er infisert eller ikke med det menneskelige immunsviktviruset (HIV). Ved mRNA-isolasjon og fragmentering fra HIV-infiserte og ikke-infiserte celler brukte vi to forskjellige prosedyrer: MeRIP-Seq, en RNA-immunoprecipitation-basert teknikk, for å berike for RNA-fragmenter som inneholder m6A-merket og BS-Seq, en bisulfittkonverteringsbasert teknikk, for å identifisere m5C-merket med en enkelt nukleotidoppløsning. Ved metyleringsspesifikk fangst er RNA-biblioteker forberedt for sekvensering med høy gjennomstrømning. Vi utviklet også en dedikert bioinformatikkpipeline for å identifisere differensialt metylerte (DM) transkripsjoner uavhengig av deres basale uttrykksprofil.

Totalt sett tillater metodikken utforskning av flere epitranskriptomiske merker samtidig og gir et atlas av DM-transkripsjoner ved virusinfeksjon eller annen celleperturbasjon. Denne tilnærmingen gir nye muligheter til å identifisere nye spillere og nye mekanismer for cellerespons, for eksempel cellulære faktorer som fremmer eller begrenser viral replikering.

Introduction

Det er lenge kjent at RNA-molekyler kan modifiseres, og mer enn 150 posttranskripsjonelle modifikasjoner har blitt beskrevet til dags dato1. De består i tillegg av kjemiske grupper, hovedsakelig metylgrupper, til praktisk talt enhver posisjon av pyrimidin- og purinringene til RNA-molekyler2. Slike posttranskripsjonelle modifikasjoner har allerede vist seg å være svært beriket i overføring RNA (tRNA) og ribosomal RNA (rRNA) og har nylig blitt beskrevet på mRNA molekyler også.

Fremveksten av nye teknologier, som Next Generation Sequencing (NGS), og produksjon av spesifikke antistoffer som gjenkjenner bestemte kjemiske modifikasjoner tillatt, for første gang, undersøkelsen av plasseringen og frekvensen av spesifikke kjemiske modifikasjoner på et transkripsjonsnivå. Disse fremskrittene har ført til en bedre forståelse av RNA modifikasjoner og til kartlegging av flere modifikasjoner på mRNA molekyler3,4.

Mens epigenetikk undersøker rollen som DNA- og histonemodifikasjoner i transkripsjonsregulering, fokuserer epitranskriptomikk på en lignende måte på RNA-modifikasjoner og deres rolle. Undersøkelsen av epitranskriptomiske modifikasjoner gir nye muligheter til å fremheve nye reguleringsmekanismer som kan stille inn en rekke cellulære prosesser (dvs. RNA-skjøting, eksport, stabilitet og oversettelse)5. Det var derfor ingen stor overraskelse at nyere studier avdekket mange epitranskriptomiske modifikasjoner ved virusinfeksjon i både cellulære og virale RNAer6. Virus undersøkt så langt inkluderer både DNA og RNA virus; blant dem kan HIV betraktes som et banebrytende eksempel. Til sammen kan oppdagelsen av RNA-metylering i sammenheng med virusinfeksjoner tillate undersøkelse av ennå ikke-innskrevne mekanismer for viralt uttrykk eller replikering, og dermed gi nye verktøy og mål for å kontrollere dem7.

Innen HIV-epitranskriptomikk har modifikasjoner av virale transkripsjoner blitt mye undersøkt og har vist at tilstedeværelsen av denne modifikasjonen var gunstig for viral replikasjon8,9,10,11,12,13. Til dags dato kan ulike teknikker brukes til å oppdage epitranscriptomiske merker på transkripsjonsnivå. De mest brukte teknikkene for m6A-identifisering er avhengige av immunutfellingsteknikker som MeRIP-Seq og miCLIP. Mens MeRIP-Seq er avhengig av RNA-fragmentering for å fange fragmenter som inneholder metylerte rester, er miCLIP basert på genereringen av α-m6A antistoffspesifikke signaturmutasjoner ved RNA-antistoff UV-krysskobling, og tillater dermed en mer presis kartlegging.

Påvisning av m5C-modifikasjon kan oppnås enten ved antistoffbaserte teknologier som ligner på m6A-deteksjon (m5C RIP), eller ved bisulfittkonvertering eller av AZA-IP eller miCLIP. Både Aza-IP og m5C miCLIP bruker en spesifikk metyltransferase som agn for å målrette RNA mens du går gjennom RNA-metylering. I Aza-IP blir målceller eksponert for 5-azacytidin, noe som resulterer i tilfeldig innføring av cytidin analoge 5-azacytidinsteder i nascent RNA. I miCLIP er NSun2 metyltransferase genetisk modifisert for å huse C271A-mutasjonen14,15.

I dette arbeidet fokuserer vi på dobbel karakterisering av m6A- og m5C-modifikasjoner i infiserte celler, ved hjelp av HIV som modell. Ved metologisk optimalisering har vi utviklet en arbeidsflyt som kombinerer metylert RNA-immunoprecipitation (MeRIP) og RNA bisulfittkonvertering (BS), slik at samtidig utforskning av m6A og m5C epitranscriptomiske merker på et transkripsjonsmessig bredt nivå, i både cellulære og virale sammenhenger. Denne arbeidsflyten kan implementeres på cellulære RNA-ekstrakter så vel som på RNA isolert fra viruspartikler.

Metylert RNA ImmunoPrecipitation (MeRIP)16 tilnærming som tillater undersøkelse av m6A på transkripsjonsnivå er godt etablert og en rekke m6A-spesifikke antistoffer er kommersielt tilgjengelige til dags dato17. Denne metoden består i selektiv fangst av m6A-inneholdende RNA-stykker ved hjelp av et m6A-spesifikt antistoff. De to store ulempene ved denne teknikken er (i) den begrensede oppløsningen, som er svært avhengig av størrelsen på RNA-fragmenter og dermed gir en omtrentlig plassering og region som inneholder metylerte rester, og (ii) den store mengden materiale som trengs for å utføre analysen. I den følgende optimaliserte protokollen standardiserte vi fragmentstørrelsen til ca. 150 nt og reduserte mengden startmateriale fra 10 μg poly-A-valgt RNA, som for tiden er anbefalt mengde startmateriale, til bare 1 μg poly-A-valgt RNA. Vi maksimerte også utvinningseffektiviteten til m6A RNA-fragmenter bundet til spesifikke antistoffer ved hjelp av en elution ved en konkurransetilnærming med et m6A-peptid i stedet for mer konvensjonelle og mindre spesifikke elutionmetoder ved hjelp av fenolbaserte teknikker eller proteinase K. Hovedbegrensningen i denne RIP-baserte analysen forblir imidlertid den suboptimale oppløsningen som ikke tillater identifisering av det presise modifiserte A-nukleotidet.

Analyse av m5C-merket kan for tiden utføres ved hjelp av to forskjellige tilnærminger: en RIP-basert metode med m5C-spesifikke antistoffer og RNA bisulfittkonvertering. Siden RIP bare tilbyr begrenset oppløsning på identifisering av metylerte rester, brukte vi bisulfittkonvertering som kan tilby enkel nukleotidoppløsning. RNA-eksponering for bisulfitt (BS) fører til cytosindeaminering, og konverterer dermed cytosinrester til uracil. Således, under RNA bisulfitt konvertering reaksjon, hver ikke-metylert cytosin er deaminert og konvertert til uracil, mens tilstedeværelsen av en metyl gruppe i posisjon 5 av cytosin har en beskyttende effekt, forhindrer BS-indusert deaminering og bevaring av cytosinrester rester. Den BS-baserte tilnærmingen gjør det mulig å oppdage et m5C modifisert nukleotid ved enkel basisoppløsning og for vurdering av metyleringsfrekvensen for hver transkripsjon, og gir innsikt i m5C modifikasjonsdynamikk18. Hovedbegrensningen av denne teknikken er imidlertid avhengig av den falske positive frekvensen av metylerte rester. Faktisk er BS-konvertering effektiv på enkeltstrengede RNA med tilgjengelige C-rester. Tilstedeværelsen av en stram RNA sekundærstruktur kan imidlertid maskere N5C-posisjonen og hemme BS-konvertering, noe som resulterer i ikke-metylerte C-rester som ikke konverteres til U-rester, og dermed falske positiver. For å omgå dette problemet og minimere den falske positive frekvensen, brukte vi 3 runder med denaturering og bisulfittkonverteringssykluser19. Vi introduserte også 2 kontroller i prøvene for å muliggjøre estimering av bisulfittkonverteringseffektivitet: vi spike-in ERCC-sekvenseringskontroller (ikke-metylerte standardiserte og kommersielt tilgjengelige sekvenser)20 samt poly-A-utarmede RNAer for å vurdere bisulfittkonverteringsfrekvens på den ene siden, og for å verifisere av RT-PCR tilstedeværelsen av et kjent og godt bevart metylert sted, C4447, på 28S ribosomal RNA derimot21.

Innen virologi muliggjør kobling av disse to epitranskriptomiske undersøkelsesmetodene med neste generasjons sekvensering og nøyaktige bioinformatiske analyser den grundige studien av m6A- og m5C-dynamikken (dvs. RNA-modifikasjon temporale endringer som kan oppstå ved virusinfeksjon og kan avdekke en rekke nye terapeutisk relevante mål for klinisk bruk).

Protocol

1. Celleforberedelse

MERK: Avhengig av celletypen og RNA-innholdet kan startnummeret for celler variere.

  1. Har nok celler til å oppnå mellom 200-500 μg totalt RNA eller 5-7 μg poly-A-valgt RNA. For eksempel bør 50 x 106 SupT1-celler gi rundt 500 μg total RNA ved ekstraksjon med fenolbaserte reagenser, og er dermed nødvendig for hver enkelt tilstand som testes.
  2. Forbered det nødvendige antall celler i henhold til eksperimentell design, og dermed i henhold til antall forhold testet (infeksjon, tidspunkter, behandling). Hvis eksperimentet tar sikte på å skaffe ikke-infiserte celler og HIV-infiserte celler ved 24 timers postinfeksjon, er det nødvendig med totalt 100 x 106 celler, halvparten for ikke-infisert tilstand og halvparten for infisert tilstand.

2. RNA-ekstraksjon

  1. Fra celler: RNA ekstraksjon med fenol-kloroform
    1. For hver tilstand samler du celler (f.eks. 50 x 106) ved sentrifugering og kaster supernatanten.
    2. Tilsett 5 ml fenolbasert reagens til hver 50 x 106 cellepellet og bland ved pipettering opp og ned flere ganger.
    3. Inkuber i 5 min ved romtemperatur for å tillate fullstendig lysis. Lysede celler kan lagres ved -80 °C eller behandles direkte.
      MERK: Om nødvendig kan celler også deles i aliquots på 10 x 106 celler per rør i 1,5 ml rør og lyses i 1 ml fenolbasert reagens for mer praktisk lagring.
    4. Tilsett 1 ml kloroform og bland ved inversjon.
    5. Inkuber i 3 min ved romtemperatur.
    6. Sentrifuge i 15 min ved 2000 x g og 4 °C.
    7. Pipette ut den vandige fasen (øvre fase) og overfør til et nytt rør. Fullfør overføringen av vandig fase ved å vinkle røret ved 45° og forsiktig pipetter løsningen ut.
      MERK: Mengden vandig fase kan variere mellom prøver, men bør være nær mengden kloroform som legges til prøven (dvs. 1 ml). Ikke overfør noe interfaset eller organisk lag! Bruken av faselås eller fase maker rør kan lette denne prosessen.
    8. Tilsett 0,5 ml 100% molekylær isopropanol i vandig fase.
    9. Inkuber i 1 time ved -80 °C for å tillate RNA-nedbør.
    10. Sentrifuge i 10 min ved 12.000 x g og 4 °C for å pellet den utfelte RNA.
    11. Kast den supernatante og resuspend RNA pellet i 1 ml av 75% molekylærbiologisk klasse etanol. Vortex kort.
    12. Sentrifuge i 5 min ved 7500 x g og 4 °C og kast supernatanten.
    13. Lufttørk pelletsen i 15 min.
    14. Resuspend pellet i 20 μL RNase-fritt vann og overfør til et nytt rør.
    15. Vask det tomme røret med ytterligere 20 μL vann for å maksimere RNA-utvinningen, og basseng med det første 20 μL-volumet.
    16. Kvantifisere den totale RNA med et spektrofotometer og vurdere RNA-kvaliteten med en fragmentanalysator.
  2. Fra virale partikler: RNA-ekstraksjon med kolonnebasert viral RNA-ekstraksjonssett
    MERK: RNA-ekstraksjon fra virale partikler med fenolbasert reagens resulterer i viral RNA av lav kvalitet og i biblioteker av lavere kvalitet. En kolonnebasert RNA-ekstraksjon bør derfor favoriseres. RNA ekstraksjonssett som bruker bærer RNA for RNA-elution og gjenoppretting, er ikke egnet for denne prosedyren og bør unngås. Siden HIV RNA er poly-adenylert, er direkte RNA-ekstraksjon uten ytterligere mRNA-isolasjon tilstrekkelig til å komme inn i MeRIP-Seq- og BS-Seq-rørledningene. Normalt bør 1-2 ml viral supernatant fra universelt infiserte celler gi nok RNA til å utføre hele arbeidsflyten.
    1. Forbered bufferen ved å tilsette 150 μL beta-mercaptoetanol til 30 ml lysisbuffer. Rekonstituer virusvaskbufferen ved å tilsette 96 ml 100 % etanol.
    2. Samle virusholdige supernatanter og sentrifuger til pelletscelleavfall for å minimere cellulær RNA-forurensning.
    3. Overfør 1 ml viral supernatant til et 15 ml rør.
    4. Tilsett 3 ml viral RNA-buffer til 1 ml viral prøve og bland ved virveling.
    5. Overfør 700 μL prøve i en kolonne, satt inn i et Collection Tube.
    6. Sentrifuge i 2 min ved 13.000 x g ved romtemperatur.
    7. Kast gjennomstrømningen.
    8. Gjenta de tre foregående trinnene til hele prøven er behandlet, og dermed er alle RNA fanget opp på den silikabaserte matrisekolonnen.
    9. Legg til 500 μL viral vaskebuffer i kolonnen.
    10. Sentrifuge i 1 min ved 10.000 x g ved romtemperatur. Kast gjennomstrømningen.
    11. Legg til 200 μL viral vaskebuffer i kolonnen.
    12. Sentrifuge i 1 min ved 10.000 x g ved romtemperatur. Kast gjennomstrømningen.
    13. Plasser kolonnen i et tomt oppsamlingsrør.
    14. Sentrifuge i 1 min ved 10.000 x g ved romtemperatur for ytterligere å kaste bort gjenværende vaskebufferforurensning.
    15. Overfør kolonnen forsiktig til et 1,5 ml rør.
    16. Tilsett 20 μL DNase/RNase-fritt vann direkte i midten av søylematrisen og sentrifugen ved 10.000 x g i 30 s ved romtemperatur.
    17. Legg til ytterligere 10 μL DNase / RNase-fritt vann direkte til midten av kolonnematrisen og sentrifugen igjen i 30 s.
    18. Kvantifisere den totale RNA med et spektrofotometer og vurdere RNA-kvaliteten med en fragmentanalysator.
      MERK: RNA-ekstraksjon kan utføres med hvilken som helst metode, hvis kvaliteten på den hentede RNA er høy, med et RNA-integritets-/kvalitetsnummer > 9. Total RNA kan oppbevares ved -80 °C inntil videre behandling.

3. mRNA-isolasjon ved valg av poly-A med Oligo(dT)25

MERK: På grunn av tilstedeværelsen av svært metylert ribosomal RNA i cellulære ekstrakter, anbefales det på det sterkeste å isolere poly-A RNA enten ved rRNA-uttømming eller fortrinnsvis ved poly-A positiv seleksjon. Dette trinnet er valgfritt og bør bare utføres for cellulære RNA-prøver for å oppnå sekvenseringsresultater med høyere oppløsning. Hvis du analyserer metylering av ikke-poly-adenylerte virale RNAer, favoriserer du rRNA-uttømming i stedet for poly-A-valg eller til slutt utfører analysen på total RNA.

  1. Bead Forberedelse for poly-A Capture
    1. Resuspend Oligo(dT)25 magnetiske perler lager hetteglass ved vortexing for >30 s.
    2. Overfør 200 μL magnetiske perler til et 1,5 ml rør. Forbered antall rør med magnetiske perler i henhold til den totale mengden RNA-prøver som skal behandles.
      MERK: Ett rør med 200 μL Dynabead lageroppløsning tilsvarer 1 mg perler og har plass til en prøve på 75 μg total RNA.
    3. Plasser rørene på en magnet i 1 min og kast supernatanten. Fjern rørene fra magneten.
    4. Tilsett 1 ml bindingsbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,0 M LiCl, 2 mM EDTA) og resuspend ved virveling. Plasser rørene på magneten i 1 min og kast supernatanten. Fjern rørene fra magneten. Gjenta.
    5. Resuspend de vaskede magnetiske perlene i 100 μL bindingsbuffer.
  2. Totalt RNA-forberedelse
    1. Fortynn den totale RNA ved en endelig konsentrasjon på 0,75 μg/μL med RNase-fritt vann, som tilsvarer 75 μg/100 μL.
      MERK: Hvis RNA har lavere konsentrasjon, fortsett som beskrevet nedenfor uten å endre volumene.
    2. Aliquot den totale RNA i flere rør ved å dispensere 100 μL RNA prøve per rør.
    3. Legg til 100 μL bindingsbuffer i hver RNA-prøve.
    4. Varm opp den totale RNA til 65 °C i 2 minutter for å forstyrre sekundære strukturer.
    5. Plasser umiddelbart på is til du er klar til å gå videre til neste trinn.
      MERK: Inkubasjonstiden kan variere i henhold til antall prøver som skal behandles, men bør ikke overstige 1 time for å unngå RNA-nedbrytning.
  3. Poly-A-merket område
    1. Til hvert RNA-rør (fra trinn 3.2), tilsett 100 μL vasket magnetiske perler (fra trinn 3.1).
    2. Bland grundig ved å pipettere opp og ned og la det bindes på et roterende hjul ved romtemperatur i 15 min.
    3. Åpne alle rør, plasser dem på magneten i 1 min, og fjern forsiktig alle supernatanten.
    4. Gjenopprett supernatanten i et nytt rør og hold til side for en andre runde med RNA-fangst (trinn 3.3.14), for å forbedre poly-A-endelige utvinningen.
    5. Fjern røret fra magneten og tilsett 200 μL vaskebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M LiCl, 1 mM EDTA). Bland ved pipettering forsiktig 4 til 5 ganger.
    6. Plasser røret på magneten i 1 min og kast supernatanten.
    7. Gjenta vasketrinnet én gang (gjenta trinn 3.3.5 og 3.3.6).
    8. Tilsett 20 μL iskald 10 mM Tris-HCl for å unngå poly-A RNA fra perlene.
    9. Inkuber ved 80 °C i 2 minutter.
    10. Plasser røret på magneten og overfør raskt supernatanten som inneholder poly-A RNA til et nytt RNase-fritt rør. Plasser røret på isen.
    11. Gjenta elution-trinnet (trinn 3.3.8 til 3.3.10) for å øke utbyttet.
    12. Vask de samme perlene en gang med 200 μL vaskebuffer. Bland ved pipettering forsiktig 4 til 5 ganger.
    13. Plasser på magneten i 1 min og kast vaskebufferen.
    14. Legg til gjennomstrømningen fra trinn 3.3.4 i perlene og gjenta prosedyren fra binding til elution (trinn 3.3.2 til 3.3.10). Hold RNA-eluates i separate rør for nå.
      MERK: Eventuelt, hold igjen den supernatante tilsvarende trinn 3.3.4 i et nytt rør, da det kan brukes som en kontroll. På slutten av prosedyren renser og konsentrerer du RNA ved etanolutfelling eller med en kolonnebasert valgmetode (dvs. RNA ren og konsentrator). Denne prøven tilsvarer en poly-A-utarmet RNA-prøve og kan brukes som en kontroll for bisulfittkonvertering (trinn 8.2.2).
    15. Kvantifisere den eluterte RNA med et spektrofotometer og hold en 2 μL aliquot for å vurdere RNA-kvaliteten ytterligere med en fragmentanalysator.
      MERK: Poly-A RNA kan oppbevares ved -80 °C til det er nødvendig.

4. RNA-arbeidsflyt

  1. Del de cellulære poly-A RNA (mRNA) og virale RNA-prøvene i 2 aliquots, dedikert til den respektive epitranscriptomiske analyserørledningen:
    (i) 5 μg cellulær mRNA eller 1 μg viral RNA for MeRIP-Seq og inngangskontroller (gå til trinn 5 til 7 og trinn 9).
    (ii) 1 μg cellulær mRNA eller 500 ng viral RNA for BS-Seq (gå til trinn 8 og 9).

5. RNA fragmentering

MERK: RNA fragmentering utføres med RNA fragmentering reagens og er beregnet for MeRIP-Seq og kontroll RNA prøver. Dette er et svært viktig skritt som krever nøye optimalisering for å oppnå fragmenter som varierer mellom 100-200 nt.

  1. Del det totale volumet av mRNA i 0,2 ml PCR-rør med 18 μL mRNA/rør.
    MERK: Arbeid raskt. Ikke arbeid med mer enn 8 prøver om gangen for å få reproduserbare resultater. Oppskalering av volumet garanterer ikke en reproduserbar og ensartet fragmentering.
  2. Varm opp en termosykler ved 70 °C.
  3. Tilsett 2 μL fragmenteringsreagens på kanten av hvert PCR-rør.
  4. Lukk røret og spinn ned (slik at reagenset kommer i kontakt med RNA samtidig for de 8 rørene).
  5. Inkuber prøvene 15 min ved 70 °C i den forvarmede termosykleren.
  6. Så snart inkubasjonen er over, legg raskt til 2 μL stoppløsning i hvert rør.
  7. Snurr ned og la sitte på is til du er klar til å gå videre til neste trinn.
    MERK: Inkubasjonstiden kan variere i henhold til antall prøver som skal behandles, men bør ikke overstige 1 time for å unngå RNA-nedbrytning.
  8. Gjenta prosedyren for alle prøvene (hvis det er mer enn 8 aliquots).
  9. Slå rørene sammen og fortsett til RNA-rensing med et RNA rent og konsentratorsett (trinn 6) eller et tilpasset kolonnebasert sett for å kvitte seg med bufferne og gjenopprette ren fragmentert RNA i vann.

6. RNA-rensing

MERK: Dette trinnet kan utføres ved etanolutfelling eller med noen form for kolonnebasert RNA-rensing og konsentrasjonsmetode (dvs. RNA Clean og Concentrator).

  1. Elute eller resuspend renset RNA i et totalt volum på 50-75 μL DNase / RNase-fritt vann.
    MERK: Hvis en kolonnebasert metode brukes, anbefales to runder med elution på det sterkeste for å sikre maksimal gjenoppretting.
  2. Kvantifisere den rensede fragmenterte mRNA med et spektrofotometer og vurdere RNA-kvaliteten med en fragmentanalysator.
  3. Hold 100 ng fragmentert mRNA som inngangskontroll for bibliotekforberedelse og sekvensering (gå til trinn 9). Den gjenværende fragmenterte mRNA (minimum 2,5 μg) kan brukes til MeRIP (gå til trinn 7.2).

7. MeRIP

MERK: Minimum 2,5 μg fragmentert mRNA er nødvendig for hver immunoprecipitation (IP), enten ved hjelp av et spesifikt anti-m6A antistoff (testtilstand) eller ved hjelp av et anti-IgG antistoff (negativ kontroll).

  1. Magnetisk perle forberedelse for immunoprecipitation
    1. For hver prøve, lag 4 ml 1x IP-buffer i et nytt konisk rør ved å fortynne 800 μL mRNA IP-buffer 5x (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 750 mM NaCl, 0,5% Igepal CA-630 og nuasefritt vann) med 3,2 ml vann uten vann.
      MERK: Minst 2 reaksjoner er nødvendig (en test og en IgG-kontroll).
    2. Plasser røret på isen.
    3. Merk riktig antall 1,5 ml mikrosenterrør for antall ønskede IP-reaksjoner:
      n rør (test) for anti-m6A antistoff.
      n rør (negativ kontroll) for normal muse-IgG.
    4. Resuspend de magnetiske perlene (f.eks. Magna ChIP Protein A/G) ved å invertere og virvelere. Ingen klumper av perler skal være synlige.
    5. For hver reaksjon planlagt, overfør 25 μL magnetiske perler til et mikrosenterrør.
    6. Tilsett ti ganger mer 1x IP-buffer (fra trinn 7.1.1) med hensyn til det opprinnelige volumet av perler som brukes (dvs. 250 μL 1x IP-buffer per 25 μL magnetiske perler).
    7. Bland perlene ved å pipette forsiktig opp og ned flere ganger for fullstendig resuspension.
    8. Plasser røret på magnetseparatoren i 1 min.
    9. Fjern og kast supernatanten, sørg for ikke å aspirere magnetiske perler. Fjern røret fra magneten.
    10. Gjenta vasketrinnet (trinn 7.1.6 til 7.1.9).
    11. Resuspend perlene i 100 μL av 1x IP Buffer per 25 μL av originalt volum magnetiske perler.
    12. Tilsett 5 μL antistoff (1 μg/μL) per 25 μL originalt volum magnetiske perler.
      n rør (test) med anti-m6A antistoff (klone 17-3-4-1) [1 μg/μL].
      n rør (negativ kontroll) med normal muse-IgG (1 μg/μL).
    13. Inkuber på det roterende hjulet i 30 min ved romtemperatur for å tillate konjugering av antistoffene med de magnetiske perlene.
    14. Plasser røret på magnetseparatoren i 1 min. Kast supernatanten. Fjern røret fra magneten og resuspend antistoff-perle blandingen i 100 μL av 1x IP Buffer.
  2. RNA Immunoprecipitation (RIP)
    1. Forbered 500 μL RIP-reaksjonsblanding for hver 2,5 μg mRNA-prøve som følger: 2,5 μg i 100 μL fragmentert RNA (fra trinn 6,12); 295 μL nukleasefritt vann; 5 μL 40 U/μL RNase-hemmer; og 100 μL 5x IP-buffer.
    2. Tilsett 500 μL RIP-reaksjonsblanding til hver antistoffperleblanding (~100 μL fra trinn 7.1.14). Bland forsiktig ved å pipettere flere ganger for å resuspendere perlene helt. Plasser på is.
    3. Inkuber alle RIP-rør på et roterende hjul i 2 timer ved 4 °C.
    4. Sentrifuger MeRIP-reaksjonene kort for å spinne ned væskedråper fra hetten og rørsidene. Plasser rørene på en magnetisk separator i 1 min.
    5. Overfør supernatanten i et nytt sentrifugerør, vær forsiktig så du ikke forstyrrer de magnetiske perlene .
      MERK: Gjennomstrømning kan holdes som kontroll for å bekrefte RIP-effektivitet (gå til trinn 7.3.9).
    6. Fjern rørene fra magneten. Vask perlene ved å tilsette 500 μL kald 1x IP-buffer. Bland perlene ved å pipettere forsiktig flere ganger for å resuspendere perlene helt.
    7. Plasser rørene på en magnetisk separator i 1 min og kast supernatant.
    8. Gjenta vaskeprosedyren (trinn 7.2.6-7.2.7) to ganger for totalt 3 vasker.
    9. Plasser rørene på isen og fortsett umiddelbart til elution.
  3. Elution
    1. Forbered 20 mM m6A oppløsning ved å oppløse 10 mg N6-Methyladenosin, 5′-monofosfat natriumsalt (m6A) i 1,3 ml nukleasefritt vann. Forbered 150 μL aliquots og oppbevar ved -20 °C.
    2. For hver prøve (test og kontroller): Forbered 225 μL elutionbuffer ved å blande følgende komponenter: 45 μL 5x IP-buffer, 75 μL 20 mM m6A, 3,5 μL 40U/μL RNase-hemmer og 101,5 μL nukleasefritt vann.
    3. Tilsett 100 μL elutionbuffer (fra trinn 7.3.2) i perlene (fra trinn 7.2.9). Bland ved forsiktig pipettering flere ganger for å fullstendig resuspend perler.
    4. Inkuber alle rør i 1 time med kontinuerlig risting på en rocker ved 4 °C.
    5. Sentrifuger RIP-reaksjonene kort for å spinne ned væskedråper fra hetten og rørsidene. Plasser rørene på en magnetisk separator i 1 min.
    6. Overfør supernatanten som inneholder eluterte RNA-fragmenter til et nytt 1,5 ml mikrosenterrør. Vær forsiktig så du ikke aspirerer perlene, da det vil øke bakgrunnsstøyen.
    7. Gjenta elution trinn (7.3.3 til 7.3.6) ved igjen å legge til 100 μL elution buffer, inkubere 1 h ved 4 °C, og samle eluate etter magnetisk separasjon.
    8. Kombiner alle eluates fra samme prøve (totalt elutionvolum skal være 200 μL).
    9. Rens den eluterte RNA og gjennomstrømningen (valgfritt, fra trinn 7.2.5) ved etanolutfelling eller ved en kolonnebasert valgfri metode (dvs. RNA Clean og Concentrator).
    10. Vurder RNA-mengden og kvaliteten på gjennomstrømning og eluterte prøver med en fragmentanalysator ved hjelp av et høysensitivt deteksjonssett. Hvis kvaliteten på RNA er tilfredsstillende, fortsett til bibliotekforberedelse og sekvensering med høy gjennomstrømning (trinn 9).
      MERK: Mengden RNA som hentes på MeRIP er svært lav, og krever imperativt høysensitive deteksjonssett for å sikre kvantifisering. Hvis ingen bioanalyse er tilgjengelig, er det mulig å fortsette blindt til bibliotekforberedelse.

8. RNA Bisulfite Konvertering

  1. Kontroll- og reagensforberedelse
    1. ERCC bland spike-in kontroll: Tilsett ERCC-blanding i henhold til produsentens instruksjoner, som anbefaler tilsetning av 0,5 μL ufortynnet ERCC-blanding til 500 ng mRNA. Denne kontrollen kan bidra til å vurdere effektiviteten av bisulfittkonvertering.
    2. Spike Poly-A-utarmet RNA (fra trinn 3.3.14) i forholdet 1/1000 (dvs. 500 pg poly-A-utarmet RNA for 500 ng mRNA). Denne prøven er beriket i ribosomal RNA og bør dermed inneholde 28S rRNA, en positiv kontroll for bisulfittkonvertering.
      MERK: Total RNA kan også brukes som positiv kontroll i stedet for poly-A-utarmet RNA.
    3. Utfør bisulfittkonvertering med et RNA-metyleringssett (f.eks. Zymo EZ).
    4. RNA Vaskebuffer: Tilsett 48 ml 100 % etanol (eller 52 ml 95 % etanol) til 12 ml RNA-vaskebufferkonsentrat før bruk.
  2. Bisulfitt konvertering
    MERK: Bisulfittkonvertering ble utført med et kommersielt tilgjengelig RNA bisulfittkonverteringssett etter produsentens prosedyre som angitt nedenfor.
    1. I 0,2 ml PCR-rør, tilsett 1000 ng mRNA (eller mellom 300 og 1000 ng). Legg til spike-in-kontroller: 1 μL ERCC-blanding (trinn 8.1.1) og 1000 pg poly-A-utarmet RNA (trinn 8.1.2). Komplett volum opptil 20 μL med DNase/RNase-fritt vann.
    2. Tilsett 130 μL RNA-reagens for konvertering i hver 20 μL RNA-prøve.
    3. Bland prøven ved å pipettere opp og ned.
    4. Spinn kort ned for å sikre at det ikke er dråper i hetten eller sidene av røret.
    5. Plasser PCR-rørene i en termisk syklist og utfør følgende trinn: denaturering ved 70 °C i 5 minutter; konvertering ved 54 °C i 45 minutter; gjenta denaturerings- og konverteringstrinn for totalt 3 sykluser; og hold deretter ved 4 °C på ubestemt tid.
      MERK: Tre sykluser med denaturering og bisulfittkonvertering sikrer fullstendig bisulfittkonvertering av prøven. Prøver kan lagres ved -80 °C eller behandles direkte.
    6. Fortsett med desulfonering i kolonne. Plasser en kolonne i et tomt oppsamlingsrør og tilsett 250 μL RNA bindingsbuffer i kolonnen.
    7. Legg prøven (~150 μL fra trinn 8.2.5) i kolonnen som inneholder RNA Binding Buffer og bland ved å pipettere opp og ned.
    8. Tilsett 400 μL 95-100% etanol i prøve-RNA Binding Buffer-blandingen i kolonnen. Lukk hetten og bland umiddelbart ved å invertere kolonnen flere ganger.
    9. Sentrifuge med full hastighet (≥ 10.000 x g) i 30 s. Kast gjennomstrømningen.
    10. Tilsett 200 μL RNA-vaskebuffer i kolonnen og sentrifuger med full hastighet i 30 s.
    11. Tilsett 200 μL RNA Desulphonation Buffer i kolonnen og inkuber ved romtemperatur i 30 min. Etter inkubasjonen, sentrifuge i full hastighet i 30 s. Kast gjennomstrømningen.
    12. Tilsett 400 μL RNA-vaskebuffer i kolonnen og sentrifuger med full hastighet i 30 s. Gjenta vasketrinnet med ytterligere 400 μL RNA-vaskebuffer. Kast gjennomstrømningen.
    13. Sentrifuger kolonnen i det tømte oppsamlingsrøret med full hastighet i 2 minutter. Overfør kolonnen til et RNase-fritt rør.
    14. Tilsett ≥ 10 μL DNase/RNase-fritt vann direkte til kolonnematrisen, og inkuber i 1 min ved romtemperatur. Sentrifuge i full fart i 30 s.
      MERK: Vi unngår vanligvis et volum på 20 μL. Den eluterte RNA kan brukes umiddelbart eller oppbevares ved -20 °C i opptil 3 måneder. Oppbevar ved -80 °C ved langvarig lagring.
    15. Ta ut 2,5 μL for fragmentanalysatorvurdering av RNA-kvalitet og kvantitet og fortsett til bibliotekforberedelse og sekvensering med høy gjennomstrømning (trinn 9).
    16. Ta 4 μL konvertert RNA for bisulfittkonverteringskontroll av effektivitet (trinn 8.3).
  3. Bisulfitt konverteringskontroll av RT-PCR
    MERK: Dette trinnet sikrer at bisulfittkonverteringen var vellykket før du går videre til sekvensering . 28S ribosomal RNA fra Homo sapiens vil bli brukt som positiv kontroll for RNA metyleringsanalyse, da C-rester i posisjon 4447 (GenBank tiltredelse # NR_003287) har blitt beskrevet som 100% metylert.
    Primer-sekvenser:
    H 28SF primer: 5'-GGGGTTTTAYGATTTTTTTGATTTTTGGG-3'
    H 28SR primer: 5'-CCAACTCACRTTCCCTATTAATAAATAAAC-3'
    1. Forbered omvendt transkripsjon (RT) reaksjonsblanding ved hjelp av et cDNA omvendt transkripsjonssett med høy kapasitet. Tine settkomponentene på is og klargjør RT-masterblandingen på is som følger:
      4 μL bisulfitt konvertert RNA (fra trinn 8.2.14):
      2 μL 10xRT-buffer
      0,8 μL 25x dNTP Mix [100 mM]
      2 μL 10x RT tilfeldige primere
      1 μL multiskriver omvendt transkripsjon
      1 μL RNase inhibitor
      9,2 μL nukleasefri H2O
      MERK: Hver RT-reaksjon skal inneholde et 20 μL sluttvolum i 0,2 ml PCR-rør.
    2. Sett rørene i den termiske syklisten med følgende RT-program: 25 °C i 10 minutter; 37 °C i 120 min; 85 °C i 5 min; ved 4 °C på ubestemt tid.
    3. Forbered PCR-reaksjonen for å forsterke spesielt 28S rRNA med et PCR-korrekturenzym. Tine settkomponentene på is, forsiktig virvel og kort sentrifugering. Forbered PCR-masterblandingen på is eller på en iskald metallplateholder som følger:
      0,6 μL 10 μM H 28SF primer
      0,6 μL 10 μM H 28SF primer
      6,5 μL mal cDNA
      22,5 μL DNA Polymerase master mix
      MERK: Hver PCR-reaksjon skal inneholde et 20 μL sluttvolum i 0,2 ml PCR-rør.
    4. Sett rørene i den termiske syklisten med følgende PCR-program: innledende denaturering ved 95 °C i 5 minutter; 45 sykluser med denaturering (95 °C i 15 s), gløding (57 °C i 30 s) og forlengelse (72 °C i 15 s), endelig forlengelse ved 72 °C i 10 minutter, og deretter ved 4 °C på ubestemt tid.
    5. Kjør 10 μL av reaksjonen på en 2% agarose gel. Forventet båndstørrelse er 130 - 200 bp.
  4. Sekvensering av PCR-produkter
    1. Rense PCR-produktene med en kolonnebasert metode for valg for å fjerne enzymer og dNTP-rester og unngå det forsterkede DNA-et i minst 20 μL DNase / RNase-fritt vann.
    2. Kvantifisere det rensede DNA-et med spektrofotometer.
    3. Sekvenseringsreaksjon
      1. Bruk 40 ng PCR produkt/sekvenseringsreaksjon.
      2. Sekvens i begge retninger med H 28SF og H 28SR primere.
      3. Juster sekvensene etter den kjente ikke-konverterte sekvensen (28S ribosomal N5 (RNA28SN5). Se etter tilstedeværelsen av C-rester i posisjon C4447, og for T-rester i stedet for C andre steder.

9. Bibliotekforberedelse og sekvensering med høy gjennomstrømning

  1. Klargjør biblioteker for sekvensering ved hjelp av mRNA-sett (f.eks. Illumina TruSeq Stranded), start protokollen på trinnet Elute-Prime-Fragment og følg produsentens instruksjoner.
    1. Men for inngangen RNA-Seq og MeRIP-Seq prøver, inkubere prøvene ved 80 °C i 2 min for å bare prime, men ikke ytterligere fragmentere dem.
  2. Utfør sekvensering ved hjelp av Illumina-plattformer. Sekvenseringsreaksjoner kan utføres i henhold til preferanser og eksperimentell design, enten enkle eller parrede ender, med minst 100 nt lengde.

10. Bioinformatikk Analyser

  1. m6A Databehandling
    1. Kjør FASTQC24 for å vurdere lesekvaliteten i m6A og legge inn FASTQ-filer fra sekvensering.
    2. Kjør Atropos25 for å trimme slutt- og kortsekvenser av lav kvalitet fra lesingene. Angi følgende parametere for kjøring av Atropos.
      1. Fjern følgende kortsekvenser: AGATCGGAAGAG, CTCTTCCGATCT, AACACTCTTTCCCT, AGATCGGAAGAGCG, AGGGAAAGAGTGTT, CGCTCTTCCGATCT.
      2. Bruk følgende phred kvalitet cutoff: 5, for trimming av lav kvalitet ender som spesifisert av produsenten (https://support.illumina.com/downloads/illumina-adapter-sequences-document-1000000002694.html).
      3. Bruk følgende minimum leselengde etter trimming: 25 basispar.
    3. Slå sammen GRh38 humant genom og HIV [Integrated linear pNL4-3Env-GFP] referanse i FASTA-format.
    4. Indekser den sammenslåtte referansen med HISAT226.
    5. Kjør HISAT2 på trimmede leseoperasjoner for å justere etter den indekserte referansen. Bruk standard HISAT-parametere.
    6. Sorter og indekser de justerte lesene med SAMtools27.
    7. Kjør SAMtools stat og Qualimap 228 for kvalitetskontroll etter justering av de sekvenserte bibliotekene.
    8. Du kan eventuelt samle inn og oppsummere kvalitetstiltak fra forrige trinn med multiQC29.
    9. HIV-genomet har homologe 634 bp-sekvenser i 5' LTR og 3' LTR: Omjuster multimapping leser fra 5' LTR til tilsvarende 3' LTR-region med SAMtools.
    10. For å identifisere m6A-toppene, kjør toppanropsprogramvaren MACS230 (v 2.1.2). Velg MACS2-løpende parametere nøye, for å sikre riktig funksjon på RNA-Seq-data, da toppanrop kan påvirkes av genuttrykksnivå, og korte eksoner kan bli feilkalert som topper. Derfor må inngangssignalet trekkes fra m6A-signalet, uten utjevning som macs2 rutinemessig bruker på DNA-baserte data. Bruk følgende parametere på underkommandoen callpeak fra MACS2:
      -keep-dup auto (kontrollerer MACS2-virkemåten mot dupliserte lesninger, 'auto' gjør det mulig for MACS å beregne maksimalt antall lesinger på nøyaktig samme sted basert på binomisk distribusjon ved hjelp av 1e-5 som p-verdi cutoff)
      -g 2,7e9 (størrelse på humant genom i bp)
      -q 0,01 (minimum FDR-avskjæring for å kalle betydelige topper)
      -nomodel (for å omgå byggingen av skiftende modell, som er skreddersydd for ChIP-Seq eksperimenter)
      -slocal 0
      -llocal 0 (hvis du setter denne og den forrige parameteren til 0, kan MACS2 trekkes direkte fra, uten utjevning, leser inngangen fra m6A-avlesningene)
      -extsize 100 (gjennomsnittlig lengde på fragmenter i bp)
      -B
    11. Kjør differensialtoppen som kaller underkommandoen for MACS2, 'bdgdiff' for å sammenligne infiserte kontra ikke-infiserte prøver. 'bdgdiff' tar som inngang bedGraph filer generert av 'callpeak' i forrige trinn. For hvert tidspunkt, kjør sammenligningen av infiserte versus ikke-infiserte prøver med 'bdgdiff', trekk det respektive inngangssignalet fra m6A-signalet og oppgi tilleggsparametrene: -g 60 -l 120.
  2. m5C Databehandling
    1. Kjør Cutadapt31 for å trimme kortsekvenser fra rålesningene, med følgende parametere:
      adapter "AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAAC"
      -minimumslengde=25.
    2. Omvendt komplementere de trimmede lesningene ved hjelp av seqkit32, da sekvenseringsprotokollen produserer avlesninger fra omvendt streng.
    3. Kjør FastQC for å undersøke lesekvaliteten.
    4. Slå sammen GRh38 humant genom og HIV [Integrert lineær pNL4-3Env-GFP]-referanse i FASTA-format.
    5. Indekser den sammenslåtte referansen med programmet meRanGh fra meRanTK-pakken33.
    6. Juster med meRanGh med følgende parametere:
      -UN gjør det mulig å skrive lesinger som ikke er tilordnet, til utdatafiler
      -MM gjør det mulig å skrive flertilordnede leseoperasjoner til utdatafilen
      -bg for utgang i bedGraph
      -mbgc 10 filter rapportert region etter dekning (minst 10 leseoperasjoner av dekning)
    7. HIV-genomet har homologe 634 bp-sekvenser i 5' LTR og 3' LTR: omjustere multimapping leser fra 5' LTR til tilsvarende 3' LTR-region med SAMtools.
    8. Kjør metyleringskall via meRanCall-verktøyet, levert av meRanTK, med følgende parametere:
      -rl = 126, lese lengde
      -ei = 0,1, feilintervall for beregningen av p-verdi for metyleringshastighet
      -cr = 0,99, forventet konvertering
    9. Kjør MeRanTKs verktøy estimateSizeFactors.pl for å estimere størrelsesfaktorer for hvert utvalg. Størrelsesfaktorene vil bli brukt som parametere i neste trinn.
    10. Kjør MeRanCompare for differensialmetyleringsanalyse av ikke-infiserte kontra infiserte på tvers av tidspunkt 12, 24 og 36 timer. Følgende parametere brukes: En signifikansverdi på 0,01 som minimal terskel for rapportering og størrelsesfaktorer fra forrige trinn.

Representative Results

Denne arbeidsflyten har vist seg nyttig for å undersøke rollen som m6A- og m5C-metylering i sammenheng med HIV-infeksjon. For dette brukte vi en CD4 + T cellelinjemodell (SupT1) som vi enten infiserer med HIV eller forlot ubehandlet. Vi startet arbeidsflyten med 50 millioner celler per tilstand og oppnådde i gjennomsnitt 500 μg totalt RNA med et RNA-kvalitetsnummer på 10 (figur 1A-B). Ved valg av poly-A hentet vi mellom 10 og 12 μg mRNA per tilstand (som representerer ca. 2 % av total RNA) (figur 1B). På dette tidspunktet brukte vi 5 μg poly-A-valgt RNA for MeRIP-Seq-rørledningen og 1 μg for BS-Seq-rørledningen. Siden HIV RNA er poly-adenylert, er det ikke nødvendig med ytterligere tiltak, og MeRIP-Seq- og BS-Seq-prosedyrer kan brukes direkte.

Figure 1
Figur 1: RNA-forberedelse for nedstrømsapplikasjoner. A) Arbeidsflyt som viser RNA-forberedelse og distribusjon for samtidige MeRIP-Seq- og BS-Seq-rørledninger. Hver fylte sekskantede figur representerer en RNA-endringstype, for eksempel m6A (grønn) eller m5C (rosa). Mengder RNA-materiale som trengs for å utføre eksperimentet er indikert. B) Representative resultater som viser forventede RNA-distribusjonsprofiler (størrelse og mengde) ved total RNA-ekstraksjon (øvre panel) og poly-A-valg (nedre panel). Prøver ble lastet på fragmentanalysatoren med standard følsomhetssett for å vurdere RNA-kvalitet før de gikk inn i spesifikke MeRIP-Seq- og BS-Seq-prosedyrer. RQN: RNA kvalitetsnummer; nt: nukleotider. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

MeRIP-Seq rørledning er en RNA immunoprecipitation-basert teknikk som tillater undersøkelse av m6A modifikasjon langs RNA molekyler. For dette blir RNA først fragmentert og deretter inkubert med m6A-spesifikke antistoffer koblet til magnetiske perler for immunoprecipitation og fangst. MeRIP-berikede RNA-fragmenter og den uberørte (inngangsfraksjonen) blir deretter sekvensert og sammenlignet med å identifisere m6A-modifiserte RNA-regioner og dermed m6A-metylerte transkripsjoner (figur 2A). Oppløsningen av teknikken er avhengig av effektiviteten til RNA-fragmentering. Faktisk gir kortere fragmenter en mer presis lokalisering av m6A-rester. Her ble cellulære poly-A-utvalgte RNAer og virale RNAer utsatt for ionbasert fragmentering med RNA-fragmenteringsbuffer i løpet av 15 minutter i et 20 μL sluttvolum for å oppnå RNA-fragmenter på 100-150 nt. Fra og med 5 μg mRNA gjenvunnet vi 4,5 μg fragmentert RNA, tilsvarende en utvinningsgrad på 90% (figur 2B). Vi brukte 100 ng fragmentert, renset RNA som inngangskontroll, utsatt direkte for bibliotekforberedelse og sekvensering. Den resterende RNA (~ 4,4 μg) ble behandlet i henhold til MeRIP-Seq-rørledningen, som starter med inkubasjon av fragmentert RNA med perler bundet enten til anti-m6A-spesifikke antistoffer eller anti-IgG-antistoffer som kontroll. m6A-spesifikk RIP (MeRIP) på 2,5 μg fragmentert RNA tillot henting rundt 15 ng m6A-beriket materiale som gjennomgikk bibliotekforberedelse og sekvensering (figur 2B). RIP med anti-IgG-kontroll ga som forventet ikke nok RNA til å tillate videre analyse (figur 2B).

Figure 2
Figur 2: MeRIP-Seq pipeline. A) Skjematisk representasjon av MeRIP-Seq arbeidsflyt og inndatakontroll. Ved valg av poly-A ble prøver fragmentert i 120-150 nt stykker og, enten direkte utsatt for sekvensering (100 ng, inngangskontroll), eller brukt til RNA-immunoprecipitation (2,5 μg, RIP) med anti-m6A spesifikt antistoff eller anti-IgG-antistoff som negativ kontroll før sekvensering. B) Representative resultater som viser forventede RNA-distribusjonsprofiler (størrelse og mengde) ved fragmentering (øvre panel) og RIP (nedre paneler, MeRIP: venstre, IgG-kontroll: høyre). Prøver ble lastet på fragmentanalysator for å evaluere RNA-kvalitet og konsentrasjon før videre behandling til bibliotekforberedelse og sekvensering. Fragmentert RNA-analyse ble utført ved hjelp av RNA standard følsomhetssett mens immunoprecipitated RNA brukte høysensitivitetssettet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

BS-Seq rørledning tillater utforskning av m5C RNA modifikasjon ved nukleotidoppløsning og fører til identifisering av m5C-metylerte transkripsjoner. Ved bisulfittkonvertering omdannes ikke-metylerte cytosiner til uracil, mens metylerte cytosiner forblir uendret (figur 3A). På grunn av de tøffe forholdene for bisulfittkonverteringsprosedyren (dvs. høy temperatur og lav pH), blir konverterte mRNAer sterkt degradert (figur 3B), men dette forstyrrer ikke bibliotekforberedelsene og sekvenseringen. Bisulfittkonvertering er bare effektiv på enkeltstrenget RNA og kan dermed potensielt hindres av sekundære dobbeltstrengede RNA-strukturer. For å evaluere effektiviteten av C-U-konvertering introduserte vi to kontroller. Som en positiv kontroll benyttet vi oss av den tidligere beskrevne tilstedeværelsen av en svært metylert cytosin i posisjon C4447 av 28S rRNA23. Ved RT-PCR-forsterkning og sekvensering av et fragment på 200 bp rundt det metylerte stedet kunne vi observere at alle cytosiner ble konvertert til uracils, og dermed vises som tymidiner i DNA-sekvensen, bortsett fra cytosinet i posisjon 4447 som forble uendret. Som en kontroll for bisulfittkonverteringsfrekvensen brukte vi kommersielt tilgjengelige syntetiske ERCC RNA-sekvenser. Denne blandingen består i et basseng med kjente, ikke-metylerte og poly-adenylerte RNA-sekvenser, med en rekke sekundære strukturer og lengder. Etter bibliotekforberedelse og sekvensering fokuserte vi på disse ERCC-sekvensene for å beregne konverteringsfrekvensen, som kan utføres ved å telle antall konverterte C blant de totale C-rester i alle ERCC-sekvensene og i hvert utvalg. Vi oppnådde en konverteringsfrekvens på 99,5%, noe som bekrefter effektiviteten og suksessen til bisulfittkonverteringsreaksjonen (figur 3D).

Figure 3
Figur 3: BS-Seq rørledning. A) Skjematisk representasjon av BS-Seq arbeidsflyt. Ved poly-A-utvalg blir prøver eksponert for bisulfitt, noe som resulterer i C til U-konvertering (på grunn av deaminering) for ikke-metylerte C-rester. Metylerte C-rester (m5C) påvirkes derimot ikke av bisulfittbehandling og forblir uendret. B) Representativt resultat av bisulfitt konvertert RNA-distribusjonsprofil (størrelse og mengde) ved analyse på fragmentanalysator med et standard følsomhetssett. C) Elektroferogram som viser representativ sekvenseringsresultat av RT-PCR-amplikon i regionen rundt den 100% metylerte C i posisjon 4447 i 28S rRNA (uthevet i blått). Til sammenligning ble C-rester av referansesekvensen identifisert som T-rester i amlikonsekvensen på grunn av bisulfittkonverteringssuksess. D) Evaluering av C-U konverteringsfrekvens ved analyse av ERCC-spike-in sekvenser i HIV-infiserte og ikke-infiserte celler. Den gjennomsnittlige konverteringsfrekvensen er på 99,5%. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

M6A-berikede prøver, bisulfittkonledede prøver og inngangskontroller behandles videre for biblioteksforberedelse, sekvensering og bioinformatisk analyse (figur 4). I henhold til eksperimentell design og biologiske spørsmål som er adressert, kan flere bioinformatiske analyser brukes. Som prinsippbevis her viser vi representative resultater fra en potensiell anvendelse (dvs. differensialmetyleringsanalyse), som fokuserer på identifisering av differensialt metylerte transkripsjoner indusert ved HIV-infeksjon. Kort fortalt undersøkte vi m6A- eller m5C-metyleringsnivået av transkripsjoner, uavhengig av genuttrykksnivå, i både ikke-infiserte og HIV-infiserte celler, for å forstå rollen til RNA-metyleringer i løpet av viral livssyklus. Ved normalisering av genuttrykk identifiserte vi at ZNF469-transkripsjonen var differensialt m6A-metylert i henhold til infeksjonsstatusen, faktisk ble denne transkripsjonen ikke metylert i ikke-infiserte celler mens den viste flere metylerte topper ved HIV-infeksjon (figur 5A). En lignende differensialmetyleringsanalyse på m5C viste at PHLPP1-transkripsjonen inneholdt flere metylerte rester, som har en tendens til å bli oftere metylert i HIV-tilstanden (figur 5B). I denne sammenhengen tyder begge analysene på at HIV-infeksjon påvirker cellulær epitranskriptom.

Figure 4
Figur 4: Skjematisk representasjon av den bioinformatiske arbeidsflyten for analyse av m6A- og m5C-data . Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Eksempel på differensialt metylerte transkripsjoner ved infeksjon. A) Representativt resultat som viser m6A-metylering av ZNF459-transkripsjon i HIV-infiserte (grønne) og ikke-infiserte (grå) celler. Toppintensitet (ved subtraksjon av inndatauttrykk) vises på y-aksen og posisjonen i kromosomet langs x-aksen. Differensial metyleringsanalyse viser at ZFN469-transkripsjon er hypermetylert ved HIV-infeksjon. B) Representativt resultat av m5C metylert gen i HIV-infiserte (øvre kjørefelt) og ikke-infiserte (nedre kjørefelt) celler. Høyden på hver stolpe representerer antall lesninger per nukleotid og tillater dekningsvurdering. Hver C rester i representert i rødt, og andelen metylert C er representert i blått. Den nøyaktige metyleringshastigheten (%) rapporteres over hver C-rest. Piler fremhever statistisk signifikant differensialt metylerte C. Prøver ble visualisert ved hjelp av IGV-visningsprogram. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Rollen til RNA-modifikasjoner i virusinfeksjon er fortsatt stort sett ukjent. En bedre forståelse av epitranskriptomiske modifikasjoners rolle i sammenheng med virusinfeksjon kan bidra til å søke nye antivirale behandlingsmål.

I dette arbeidet tilbyr vi en komplett arbeidsflyt som tillater undersøkelse av m6A og m5C epitranscriptomes av infiserte celler. Avhengig av det biologiske spørsmålet anbefaler vi å bruke poly-A-valgt RNA som startmateriale. Selv om det er valgfritt, da rørledningen kan brukes med total RNA, er det viktig å huske på at rRNAer så vel som små RNAer er høyt modifisert og inneholder et viktig antall metylerte rester. Dette kan føre til redusert kvalitet og mengde meningsfulle sekvenseringsdata.

Men hvis fokuset i studien er ikke-poly-adenylert RNA, bør RNA-ekstraksjonstrinnet tilpasses for å unngå å kaste bort små RNA (i tilfelle kolonnebasert RNA-ekstraksjon) og til privilegier ribosom-uttømmingsteknikker i stedet for poly-A-valg for å komme inn i rørledningen.

For å sikre høy kvalitet RNA, riktig fragmentering og egnet m6A-beriket og BS konvertert RNA kvalitet for bibliotek forberedelse anbefaler vi sterkt å bruke en fragmentanasator eller en bioanalyse. Dette utstyret er imidlertid ikke alltid tilgjengelig. Som et alternativ kan kvaliteten på RNA, mRNA og størrelsen på fragmentert RNA også vurderes ved visualisering på agarose gel. Alternativt kan bibliotekforberedelse utføres uten tidligere vurdering av RNA-mengde.

Vi brukte den antistoffbaserte MeRIP-Seq16-teknikken til å utforske det epitranskriptomiske landskapet m6A. Denne teknikken er basert på RNA immunoprecipitation og er vellykket; Noen trinn trenger imidlertid nøye optimalisering og kan være kritisk. Selv om m6A metylering har blitt beskrevet å forekomme hovedsakelig innenfor konsensussekvensen RRA * CH, er dette motivet svært hyppig langs mRNA-molekyler og tillater ikke presis identifisering av det metylerte stedet. Det er derfor viktig å oppnå en reproduserbar og konsistent RNA-fragmentering, som genererer små RNA-fragmenter, for å forbedre den RIP-baserte oppløsningen. I denne protokollen anbefaler vi en optimalisert prosedyre som gir reproduserbare og konsistente resultater i vår eksperimentelle setting; Dette fragmenteringstrinnet kan imidlertid trenge ytterligere optimalisering i henhold til bestemte eksempelfunksjoner.

Nylig ble en ny teknikk som tillater m6A direkte sekvensering beskrevet. Den er basert på bruk av spesifikke omvendte transkripsjonsvarianter som viser unike RT-signaturer som svar på å møte m6A RNA-modifikasjon24. Denne teknologien, ved nøye optimalisering, kan omgå den største begrensningen som MeRIP-Seq står overfor (redusere mengden innledende materiale og tillate en høyere oppløsning). For å utforske m5C modifikasjonen bestemte vi oss for å bruke bisulfittkonverteringsteknikken for å oppdage ved nukleotidoppløsning de modifiserte C-rester. For å redusere den falske positive frekvensen på grunn av tilstedeværelsen av RNA sekundære strukturer, utførte vi 3 sykluser med denaturering / bisulfittkonvertering og ytterligere kontroll bisulfitt konverteringsfrekvensytelse takket være bruk av ERCC-spike-in-kontroller. En av begrensningene knyttet til denne teknikken er at bisulfittkonvertering er veldig hard og tre sykluser med denaturering / bisulfittkonvertering kan forringe noe RNA og dermed redusere oppløsningen. I vår setting valgte vi imidlertid å nøye oss med en potensielt litt lavere oppløsning for å øke kvaliteten på datasettet.

Takket være disse optimaliseringene og kontrollene kunne vi tilby en pålitelig og god arbeidsflyt som kan utnyttes til å undersøke det epitranskriptomiske landskapet og dets endring i sammenheng med virusinfeksjoner, vertspatogeninteraksjoner eller eksponering for spesifikke behandlinger.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Swiss National Science Foundation (tilskudd 31003A_166412 og 314730_188877).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AccuPrime Pfx SuperMix Invitrogen 12344-040
anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1 Millipore MABE1006
Chloroform Merck 67-66-3
ERCC Invitrogen 4456740
EZ RNA Methylation Kit Zymo Research EZR5001
Fragment analyzer RNA Kit - HS RNA Kit Agilent DNF-472-0500
Fragment analyzer RNA Kit - RNA Kit Agilent DNF-471-0500
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystem 4368814
Illumina TruSeq Stranded mRNA Illumina 20020594
Magnetic Beads A/G Blend Merck 16-663
N6-Methyladenosine, 5′-monophosphate sodium salt (m6A) Sigma Aldrich M2780-10MG
Normal Mouse IgG Merk 12371
Oligo(dT)25 Life Technologies 61005,
PCRapace Stratec 1020220300
Quick RNA Viral Kit Zymo Research 1034
RNA Clean & Concentrator Zymo Research R1015
RNA Fragmentation Reagent Ambion AM8740
RNase Inhibitor Ambion AM2684
Trizol TRIzol Reagent 15596026

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Machnicka, M. A., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways--2013 update. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 262-267 (2013).
  2. Zaccara, S., Ries, R. J., Jaffrey, S. R. Reading, writing and erasing mRNA methylation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 608-624 (2019).
  3. Davalos, V., Blanco, S., Esteller, M. SnapShot: Messenger RNA Modifications. Cell. 174 (2), 498 (2018).
  4. Saletore, Y., et al. The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications. Genome Biology. 13 (10), 175 (2012).
  5. Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2017).
  6. Netzband, R., Pager, C. T. Epitranscriptomic marks: Emerging modulators of RNA virus gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (3), 1576 (2020).
  7. Pereira-Montecinos, C., Valiente-Echeverria, F., Soto-Rifo, R. Epitranscriptomic regulation of viral replication. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (4), 460-471 (2017).
  8. Lichinchi, G., et al. Dynamics of the human and viral m(6)A RNA methylomes during HIV-1 infection of T cells. Nature Microbiology. 1, 16011 (2016).
  9. Courtney, D. G., et al. Epitranscriptomic Addition of m(5)C to HIV-1 Transcripts Regulates Viral Gene Expression. Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).
  10. Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A Editing of HIV-1 mRNAs Enhances Viral Gene Expression. Cell Host & Microbe. 19 (5), 675-685 (2016).
  11. Tirumuru, N., Wu, L. HIV-1 envelope proteins up-regulate N (6)-methyladenosine levels of cellular RNA independently of viral replication. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 3249-3260 (2019).
  12. Tirumuru, N., et al. N(6)-methyladenosine of HIV-1 RNA regulates viral infection and HIV-1 Gag protein expression. Elife. 5, (2016).
  13. Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell. Frontiers in Virology. 1 (11), (2021).
  14. Khoddami, V., Cairns, B. R. Transcriptome-wide target profiling of RNA cytosine methyltransferases using the mechanism-based enrichment procedure Aza-IP. Nature Protocols. 9 (2), 337-361 (2014).
  15. Hussain, S., Aleksic, J., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome. Genome Biology. 14 (11), 215 (2013).
  16. Dominissini, D., Moshitch-Moshkovitz, S., Salmon-Divon, M., Amariglio, N., Rechavi, G. Transcriptome-wide mapping of N6-methyladenosine by m6A-seq based on immunocapturing and massively parallel sequencing. Nature Protocols. 8 (1), 176-189 (2013).
  17. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  18. Shobbir Hussain, J. A., Blanco, S., Dietmann, S., Frye, M. Characterizing 5-methylcytosine in the mammalian epitranscriptome. Genome Biology. 14 (215), (2013).
  19. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).
  20. Endrullat, C., Glökler, J., Franke, P., Frohme, M. Standardization and quality management in next-generation sequencing. Applied & Translational Genomics. 10, 2-9 (2016).
  21. Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing. Nucleic Acids Research. 37 (2), 12 (2009).
  22. Cristinelli, S., Angelino, P., Janowczyk, A., Delorenzi, M., Ciuffi, A. HIV Modifies the m6A and m5C Epitranscriptomic Landscape of the Host Cell. biorxiv. 1 (11), (2021).
  23. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and noncoding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  24. Aschenbrenner, J., et al. Engineering of a DNA Polymerase for Direct m(6) A Sequencing. Angewandte Chemie (International ed. in English). 57 (2), 417-421 (2018).
  25. Bioinformatics. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2021).
  26. Didion, J. P., Martin, M., Collins, F. S. Atropos: specific, sensitive, and speedy trimming of sequencing reads. PeerJ. 5, 3720 (2017).
  27. Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
  28. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  29. Okonechnikov, K., Conesa, A., García-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 32 (2), Oxford, England. 292-294 (2016).
  30. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), Oxford, England. 3047-3048 (2016).
  31. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), 137 (2008).
  32. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet Journal. 17 (1), (2011).
  33. Shen, W., Le, S., Li, Y., Hu, F. SeqKit: A Cross-Platform and Ultrafast Toolkit for FASTA/Q File Manipulation. PLOS ONE. 11 (10), 0163962 (2016).
  34. Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit. Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).

Tags

Biologi Utgave 181 Epitranscriptomics m6A m5C RNA modifikasjoner virus-vert interaksjoner virusinfeksjoner HIV
Utforske <sup>m6A</sup> og <sup>m5C</sup> Epitranscriptomes ved virusinfeksjon: et eksempel med HIV
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cristinelli, S., Angelino, P.,… More

Cristinelli, S., Angelino, P., Ciuffi, A. Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV. J. Vis. Exp. (181), e62426, doi:10.3791/62426 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter