Summary
الأحماض الفينولية هي مواد كيميائية نباتية مهمة موجودة في الحبوب الكاملة. أنها تمتلك خصائص نشطة بيولوجيا مثل وظائف الحماية المضادة للأكسدة. يهدف هذا العمل إلى الإبلاغ عن طريقة معممة لتحديد HPLC ، وتقدير إجمالي محتوى الفينول ، وتحديد القدرة المضادة للأكسدة للأحماض الفينولية في الحبوب والبقوليات.
Abstract
الأحماض الفينولية هي فئة من المركبات العضوية التي تحمل كلا من مجموعة الفينول ومجموعة كربوكسيلية. توجد في الحبوب وتتركز في نخالة الحبوب أو معطف بذور البقوليات. لديهم خصائص مضادة للأكسدة التي ولدت الكثير من الاهتمام البحثي في السنوات الأخيرة ، حول وظائفهم الصحية الوقائية المضادة للأكسدة المحتملة. يقدم هذا العمل طريقة معممة لاستخراج الأحماض الفينولية القابلة للذوبان الحرة من الحبوب الكاملة وتحليل قدرتها المضادة للأكسدة. تم استخدام خمس عينات من الحبوب الكاملة تتكون من حبوبين (القمح والذرة الصفراء) وثلاث بقوليات (حبوب اللوبيا والفاصوليا الكلوية وفول الصويا). تم طحن الحبوب إلى دقيق واستخراج الأحماض الفينولية القابلة للذوبان الحرة باستخدام الميثانول المائي. ثم تم تحديد المركبات باستخدام كروماتوغراف سائل عالي الضغط (HPLC). تم استخدام طريقة Folin-Ciocalteu لتحديد محتواها الفينولي الكلي بينما تم تحديد قدراتها المضادة للأكسدة باستخدام قدرة الكسح الجذري DPPH ، وقدرة مضادات الأكسدة المكافئة ل Trolox (TEAC) وقدرة امتصاص الأكسجين الجذري (ORAC). وشملت الأحماض الفينولية التي تم تحديدها أحماض الفانيليك والكافيين والكوماريك والفيروليك. تم تحديد حمض الفانيليك فقط في اللوبيا بينما تم تحديد حمض الكافيين فقط في حبوب الكلى. تم تحديد حمض p-Coumaric في الذرة الصفراء واللوبيا وفول الصويا ، في حين تم تحديد حمض الفيروليك في جميع العينات. كان حمض الفيروليك هو حمض الفينوليك السائد الذي تم تحديده. انخفض التركيز الكلي للأحماض الفينولية في العينات بالترتيب التالي: فول الصويا > اللوبيا > الذرة الصفراء = الفاصوليا الكلوية > القمح. انخفضت القدرة الكلية المضادة للأكسدة (مجموع قيم اختبارات DPPH و TEAC و ORAC) على النحو التالي: فول الصويا > والفاصوليا > الذرة الصفراء = حبة اللوبيا > القمح. خلصت هذه الدراسة إلى أن تحليل HPLC بالإضافة إلى اختبارات DPPH و TEAC و ORAC توفر معلومات مفيدة حول تكوين حمض الفينول والخصائص المضادة للأكسدة للحبوب الكاملة.
Introduction
الأحماض الفينولية هي من بين أهم المواد الكيميائية النباتية التي تمت دراستها في النباتات بسبب الدور الحيوي الذي تلعبه في الدفاع عن النبات ضد العدوى العاشبة والفطرية ، وكذلك الحفاظ على الدعم الهيكلي والسلامة في الأنسجة النباتية 1,2. فهي وفيرة في نخالة الحبوب ومعطف البذور من البقوليات3. من الناحية الهيكلية ، يتم تقسيمها إلى مجموعتين: أحماض هيدروكسي بنزويك (الشكل 1) وأحماض الهيدروكسي سيناميك (الشكل 2). تشمل أحماض الهيدروكسي بنزويك الشائعة في الحبوب والبقوليات أحماض الجاليك و p-hydroxybenzoic و 2,4-dihydroxybenzoic و protocatechuic و vanillic و syringic ، في حين أن أحماض الهيدروكسي سيناميك الشائعة تشمل أحماض الكافيك و p-coumaric و ferulic و sinapic3. تمتلك الأحماض الفينولية أيضا خصائص مضادة للأكسدة لأنها قادرة على مسح الجذور الحرة ، والتي تسبب التزنخ التأكسدي في الدهون ، وبدء ونشر الإجهاد التأكسدي الناجم عن الجذور في الأنظمة الفسيولوجية 4,5. بسبب هذا الدور الفسيولوجي الحيوي كمضادات للأكسدة ، فهي موضوع بحث حديث. هذا لأنه عند استهلاكها كمكونات للأطعمة النباتية ، يمكنها ممارسة حماية مضادة للأكسدة.
الحبوب ومنتجات الحبوب هي مصادر غذائية رئيسية للكربوهيدرات للبشر والحيوانات في جميع أنحاء العالم6. وتشمل الحبوب القمح والأرز والذرة (الذرة) والشعير والتريتيكال والدخن والذرة الرفيعة. ومن بين هذه الذرة، الذرة هي الأكثر استخداما، حيث يقدر الاستخدام العالمي بنحو 1,135.7 مليون طن في 2019/2020، يليها القمح مع استخدام عالمي يقدر بنحو 757.5 مليون طن خلال نفس الفترة7. تعد أطعمة الحبوب مصادر رائعة للطاقة للمستهلكين لأنها مصادر غنية بالكربوهيدرات. كما أنها توفر بعض البروتين والدهون والألياف والفيتامينات والمعادن6. بالإضافة إلى قيمتها الغذائية ، تعد الحبوب مصادر جيدة لمضادات الأكسدة الكيميائية النباتية ، وخاصة الأحماض الفينولية ، والتي لديها القدرة على حماية النظام الفسيولوجي من الأضرار التأكسدية الناجمة عن الجذور3. البقوليات هي أيضا مصادر جيدة للمغذيات وهي عموما أعلى في البروتين من الحبوب. كما أنها تحتوي على الفيتامينات والمعادن وتستخدم في إعداد الأطعمة المختلفة8. بالإضافة إلى ذلك ، البقوليات هي مصادر جيدة لمجموعة متنوعة من مضادات الأكسدة الكيميائية النباتية ، بما في ذلك الأحماض الفينولية ، والفلافونويد ، والأنثوسيانين ، والبروانثوسيانيدينات9،10. قد يكون لأنواع مختلفة من الحبوب والبقوليات تركيبة حمض فينولية مختلفة. لذلك هناك حاجة لدراسة تكوين حمض الفينوليك للحبوب والبقوليات وأصنافها ، من أجل معرفة فوائدها الصحية المحتملة فيما يتعلق بمضادات الأكسدة الفينولية.
تم الإبلاغ عن عدد من الفحوصات لقياس كمية الأحماض الفينولية في الحبوب والبقوليات ، وتحديد أنشطتها المضادة للأكسدة. الطرق الأكثر شيوعا لتحليل الأحماض الفينولية للحبوب الكاملة هي قياس الطيف الضوئي والكروماتوغرافيا السائلة11. كان الهدف من هذا العمل هو إظهار طريقة كروماتوغرافية سائلة معممة عالية الضغط لتحديد تكوين حمض الفينول القابل للذوبان الحر ، وطرق الطيف الضوئي لتحديد المحتوى الفينولي الكلي والقدرة المضادة للأكسدة لبعض الحبوب الكاملة والبقوليات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. نوع العينات
- استخدم خمس عينات من الحبوب الكاملة ، تتكون من حبوبين (على سبيل المثال ، القمح القاسي والذرة الصفراء) وثلاث بقوليات (على سبيل المثال ، حبوب اللوبيا Blackeye وفول الصويا والفاصوليا الحمراء الكلوية) لهذه الدراسة.
- طحن 50 غرام من كل حبة في ثلاثة أضعاف في الدقيق ، وذلك باستخدام مطحنة القهوة ، وتمريرها من خلال غربال 500 ميكرومتر.
- تخزينها في -20 درجة مئوية.
2. إعداد العينات
-
تحديد محتوى المادة الجافة والتعبير عن أساس الوزن الجاف
ملاحظة: حدد محتوى المادة الجافة لكل عينة مسحوقة وفقا لطريقة AOAC (2000)12.- قم بتشغيل فرن حراري قسري واضبط درجة الحرارة على 130 درجة مئوية.
- مجفف جاف (هلام السيليكا) في الفرن لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة ونقل هلام السيليكا المجفف إلى مجفف.
- وزن 2 غرام من كل عينة بدقة في علبة ألومنيوم نظيفة ومجففة مسبقا وموزونة.
- جفف العينات الموزونة عند 130 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في فرن حراري قسري.
- انقل العينة المجففة إلى المجفف واتركها تبرد إلى درجة الحرارة المحيطة.
- وزن العينة المجففة والمبردة وتسجيل وزنها.
- احسب محتوى المادة الجافة لكل عينة على النحو التالي:
- عبر عن كل معلمة تم قياسها على أساس الوزن الجاف باستخدام الصيغة التالية:
-
استخراج حمض الفينوليك
ملاحظة: استخراج المركبات الفينولية الحرة القابلة للذوبان في عينات الحبوب باستخدام تعديل طريقة Y. Qiu et al.5 التي تمكن من استخراج الفينول من كميات ملليغرام من الحبوب الكاملة.- يزن بدقة 100 ملغ من عينة دقيق الحبوب الكاملة مباشرة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق بسعة 2 مل بلون العنبر. يساعد اللون الداكن للأنبوب على منع تعرض الخليط للضوء.
- أضف 1 مل من الميثانول المائي من الدرجة HPLC بنسبة 80٪ إلى كل من الأنابيب التي تحتوي على العينات.
- دوامة لفترة وجيزة لخلط محلول الميثانول والعينات.
- سونيك العينات لمدة 60 دقيقة لاستخراج المركبات الفينولية القابلة للذوبان الحرة. ضع غطاء فوق العينات طوال مدة الصوتنة لمزيد من الحماية من الضوء.
- بعد الصوتنة ، قم بالطرد المركزي للخليط عند 20000 × جم لمدة 5 دقائق لترسيب المخلفات الصلبة تاركا السوبرناتانت في الأعلى. ستكون المركبات الفينولية الحرة موجودة في supernatant بعد الطرد المركزي.
- انقل السوبرناتانت إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف.
ملاحظة: يجب تصفية المادة الفائقة قبل حقنها في جهاز HPLC. لتصفية supernatant ، قم بإزالة مكبس حقنة 3 مل وإرفاق مرشح حقنة. يجب ألا يزيد حجم المسام عن 0.22 ميكرومتر. - ماصة حوالي 0.4 مل من supernatant في الجزء العلوي من حقنة. أعد إدخال المكبس وادفع السائل عبر الفلتر إلى قارورة HPLC تحتوي على إدخال قارورة.
- بمجرد إعداد الأداة لتشغيل الطريقة الموضحة في المخطوطة لتحليل HPLC ، قم بتحميل القوارير في الدوار لتتوافق مع قائمة العينات.
- احصل على كروماتوغرام HPLC عند 320 نانومتر و 280 نانومتر تظهر قمم متميزة تمثل مركبات فينولية مختلفة.
- باستخدام منحنيات قياسية مناسبة ، قم بقياس أحماض الهيدروكسي سيناميك عند 320 نانومتر نظرا لأن لديها أقصى امتصاص عند هذا الطول الموجي. وفقا لنفس المبدأ ، حدد كمية أحماض الهيدروكسي بنزويك عند 280 نانومتر.
- تخزين المستخلصات المتبقية في -20 درجة مئوية للتحليلات الأخرى.
3. تكوين الفينول
- استخدم كروماتوغراف سائل عالي الضغط (جدول المواد) لتحديد المركبات الفينولية المستخرجة في العينات وقياسها كميا ، استنادا إلى طريقة J. Xiang و F.B. Apea-Bah و V. U. Ndolo و M.C. Katundu و T. Beta 4.
- إعداد معايير حمض الفينوليك (حمض الفانيليك ، حمض الكافيين ، حمض p-coumaric ، حمض الفيروليك ، وحمض sinapic) لتحديد وقياس المركبات الفينولية المكونة في المستخلصات.
- للقيام بذلك ، يزن 1 ملغ من كل معيار ويذوب في 1 مل من الميثانول المائي بنسبة 50٪ لإنتاج 1000 ميكروغرام / مل من كل معيار.
- امزج كميات متساوية من جميع المعايير الخمسة في أنبوب طرد مركزي كهرماني سعة 2 مل لإنتاج مزيج من المعايير ، كل منها بتركيز 200 ميكروغرام / مل.
- قم بإعداد تخفيفات تسلسلية للكوكتيل القياسي عن طريق أخذ حجم في أنبوب جديد وتخفيفه بحجم متساو من مذيب الميثانول المائي.
- كرر التخفيفات التسلسلية وصولا إلى تركيز 3.125 ميكروغرام / مل.
- أيضا ، قم بتخفيف كل معيار بشكل منفصل 40 مرة باستخدام المذيب للحصول على تركيز 25 ميكروغرام / مل لكل معيار.
- اضبط درجة حرارة العمود على 35 درجة مئوية ودرجة حرارة فرن العينة على 15 درجة مئوية.
- لإعداد المرحلة المتنقلة A (0.1٪ من حمض الفورميك المائي) ، انقل 1 مل من حمض الفورميك إلى قارورة حجمية بسعة 1 لتر وأضف ماء من فئة HPLC إلى علامة 1 لتر. يرج جيدا حتى يمتزج.
- لإعداد المرحلة المتنقلة B (0.1٪ من حمض الفورميك في الميثانول) ، انقل 1 مل من حمض الفورميك إلى قارورة حجمية بسعة 1 لتر وأضف الميثانول من فئة HPLC إلى علامة 1 لتر. يرج جيدا حتى يمتزج.
- اضبط وحدات التخزين على علامة 1 لتر إذا لزم الأمر.
- قم بتصفية كلتا المرحلتين المتنقلتين من خلال ورق ترشيح محب للماء بسعة 0.45 ميكرومتر.
- للتحليل ، قم بحقن 10 ميكرولتر من كل مستخلص أو معيار (معايير 25 ميكروغرام / مل والكوكتيلات القياسية) في عمود الطور العكسي.
- Elute مع المراحل المتنقلة وفقا لبرنامج التدرج الخطي لمدة 25 دقيقة على النحو التالي: 0-3.81 دقيقة ، 9٪ -14٪ B ؛ 3.81-4.85 دقيقة ، 14٪ -15٪ ب ؛ 4.85-5.89 دقيقة ، 15٪ -15٪ B ، 5.89-8.32 دقيقة ، 15٪ -17٪ B ؛ 8.32-9.71 دقيقة ، 17٪ -19٪ ب ؛ 9.71-10.40 دقيقة ، 19٪ -19٪ ب ؛ 10.40-12.48 دقيقة ، 19٪ -26٪ ب ؛ 12.48-13.17 دقيقة ، 16٪ -28٪ ب ؛ 13.17-14.21 دقيقة ، 28٪ -35٪ ب ؛ 14.21-15.95 دقيقة ، 35٪ -40٪ ب ؛ 15.95-16.64 دقيقة ، 40٪ -48٪ ب ؛ 16.64-18.37 دقيقة ، 48٪ -53٪ ب ؛ 18.37-22.53 دقيقة ، 53٪ -70٪ ب ؛ 22.53-22.88 دقيقة ، 70٪ -90٪ ب ؛ 22.88-25.00 دقيقة، 90٪ ب.
- قارن أوقات الاحتفاظ بالقمم الكروماتوغرافية التي تم الحصول عليها للمعايير الأصيلة للتركيزات 25 ميكروغرام / مل ، عند 280 نانومتر و 320 نانومتر ، مع أوقات المستخلصات ، من أجل تحديد المركبات الفينولية المكونة في العينات.
- منحنيات معايرة المؤامرة للكوكتيلات القياسية للحمض الفينولي ، مع تركيز المعايير على المحور الأفقي ، ومنطقة الذروة على المحور الرأسي
- استخدم منحنيات المعايرة لتقدير تركيزات المركبات الفينولية المحددة ، من خلال مقارنة مناطق الذروة على قطعة الأرض مع مناطق المركبات المحددة عند 280 نانومتر و 320 نانومتر كما هو مذكور في القسم السابق.
4. إجمالي المحتوى الفينولي
ملاحظة: حدد إجمالي المحتوى الفينولي للمستخلصات باستخدام طريقة فولين-سيوكالتيو التي وصفها F.B. Apea-Bah et al.13.
- إعداد معايير حمض الفيروليك وحمض الغال ضمن نطاق تركيز من 0.025 إلى 0.150 ملغم / مل لرسم منحنيات المعايرة بالمقارنة ، لتقدير إجمالي المحتوى الفينولي.
- للقيام بذلك ، يزن بدقة 1 ملغ لكل من معايير حمض الفيروليك وحمض الغال في أنابيب طرد مركزي بسعة 2 مل.
- أضف 1 مل من الميثانول المائي بنسبة 50٪ إلى كل معيار ودوامة تذوب ، مما ينتج عنه مخزون 1 مجم / مل من كل معيار.
- إعداد سلسلة من التخفيفات من كل محلول مخزون في ما مجموعه 500 ميكرولتر.
- ماصة 18.2 ميكرولتر من كل مستخلص أو قياسي في بئر منفصل على صفيحة صغيرة من 96 بئرا.
- أضف 36.4 ميكرولتر من كاشف Folin-Ciocalteu المائي بنسبة 10٪ (v / v) إلى كل مستخلص أو معيار.
- ثم أضف 145.4 ميكرولتر من كربونات الصوديوم 700 مللي متر إلى كل خليط تفاعل.
- احتضن مخاليط التفاعل في الظلام في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) لمدة 2 ساعة.
- اقرأ الامتصاص على قارئ microplate عند 750 نانومتر.
- رسم منحنيات معايرة التغير في الامتصاص مقابل تركيز معايير حمض الفينوليك واستخدامها لتقدير إجمالي محتويات الفينول.
- عبر عن النتائج على أنها مكافئات حمض الفيروليك الملليغرام لكل غرام من العينة المطحونة (mg FAE / g) ومعادلات حمض الغاليك الملليغرام لكل غرام من العينة المطحونة (mg GAE / g) على أساس الوزن الجاف.
5. مقايسات مضادات الأكسدة
ملاحظة: تحديد القدرة المضادة للأكسدة لمستخلصات الحبوب باستخدام الفحوصات الثلاثة التالية: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) قدرة الكسح الجذرية. 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) قدرة الكسح الجذري ، والتي تسمى أيضا قدرة مضادات الأكسدة المكافئة Trolox (TEAC) ؛ وقدرة امتصاص الأكسجين الجذري (ORAC).
- إعداد معايير ترولوكس للمنحنيات القياسية
- استخدم Trolox ، وهو تناظرية قابلة للذوبان في الماء من فيتامين E ، كمعيار لتقدير قدرة مضادات الأكسدة في المختبر لمستخلصات الحبوب الكاملة.
- يزن بدقة 1 ملغ من Trolox في أنبوب 15 مل. يذوب في 4 مل من الميثانول المائي 50٪. دوامة تذوب لإعداد محلول مخزون من 1 mM (1000 μM).
- قم بإعداد ستة تركيزات من Trolox ، أي 50 و 100 و 200 و 400 و 600 و 800 ميكرومتر لرسم منحنيات قياسية لتقدير قدرة الكسح الجذري DPPH وقدرة مضادات الأكسدة المكافئة ل Trolox (TEAC). وبالمثل ، قم بإعداد تركيزات 6.25 و 12.5 و 25 و 50 ميكرومتر من Trolox لتقدير قدرة امتصاص الأكسجين الجذري (ORAC). تشكل الحجم الإجمالي لكل تركيز إلى 500 ميكرولتر كما هو موضح في الجدول 1.
- تخفيف مستخلصات العينات
- تمييع مقتطفات العينة مع الميثانول قبل التحليل. هنا ، تم تخفيف مستخلصات الذرة الصفراء واللوبيا مرتين ، وتم تخفيف القمح والفاصوليا الكلوية خمس مرات بينما تم تخفيف مستخلص فول الصويا 10 مرات بالميثانول.
- ترولوكس ما يعادل قدرة مضادات الأكسدة (TEAC) فحص
- قم بقياس قدرة مضادات الأكسدة المكافئة ل Trolox (TEAC) للعينات باستخدام الطريقة الموضحة سابقا بواسطة F.B. Apea-Bah et al.14.
- يزن 8.23 ملغ من ABTS في أنبوب طرد مركزي كهرماني نظيف بسعة 2 مل.
- بعد ذلك ، يزن 1.62 ملغ من كبريتات البوتاسيوم في أنبوب طرد مركزي كهرمان آخر بسعة 2 مل.
- أضف 1 مل من الماء المقطر إلى كل منها ودوامة لإذابتها.
ملاحظة: ينتج عن ذلك محلول مخزون ABTS 16 mM مع محلول بيرسلفات البوتاسيوم المائي 6 mM. - تحضير محلول مخزون ABTS عن طريق خلط محاليل ABTS وبيرسلفات البوتاسيوم بكميات متساوية. سوف يتغير الحل على الفور إلى لون داكن.
- احتضن خليط الكاشف في الظلام لمدة 12-16 ساعة.
- قم بتخفيف محلول مخزون ABTS 30 مرة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) سعة 200 ملليمتر ، لتشكيل حل عمل ABTS. للقيام بذلك ، أضف 58 مل من 200 mM PBS إلى 2 مل من حل مخزون ABTS. سيحتوي حل العمل على 0.27 mM ABTS و 0.1 mM بيرسلفات البوتاسيوم.
- للتحليل ، ضع 10 ميكرولتر من كل مستخلص مخفف أو Trolox في صفيحة صغيرة من 96 بئرا.
- أضف 190 ميكرولتر من محلول عمل ABTS إلى كل بئر واحتضن مخاليط التفاعل لمدة 60 دقيقة.
- قياس امتصاص مخاليط التفاعل عند 750 نانومتر في قارئ الصفائح الدقيقة.
- استخدم معايير Trolox بتركيز يتراوح من 100 إلى 800 ميكرومول / لتر لرسم منحنى المعايرة.
- تقدير قدرة الكسح الجذري ABTS من منحنى المعايرة.
- عبر عن النتائج على أنها مكافئات ميكرومول ترولوكس لكل عينة غرام (ميكرومول TE / g) على أساس الوزن الجاف.
- فحص DPPH
ملاحظة: تحديد قدرة الكسح الجذري DPPH للعينات باستخدام الطريقة الموصوفة سابقا من قبل F.B. Apea-Bah et al.13. يتطلب فحص DPPH المضاد للأكسدة مركبا مولدا للجذور ، DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl).- يزن بدقة 1.2 ملغ من DPPH في أنبوب طرد مركزي فارغ بسعة 50 مل. قم بإذابة DPPH في 30 مل من الميثانول لإعداد محلول ميثانول 60 ميكرومول / لتر.
ملاحظة: يختبر فحص DPPH قدرة مستخلصات العينة على مسح الجذور الحرة التي تنتجها DPPH. - للتحليل ، أضف 5 ميكرولتر من مستخلصات العينة أو محلول Trolox في آبار الصفائح الدقيقة.
- بعد ذلك ، أضف 195 ميكرولتر من محلول الميثانول DPPH 60 ميكرومول / لتر واحتضنه لمدة 60 دقيقة.
- قياس امتصاص خليط التفاعل عند 515 نانومتر.
- استخدم معايير Trolox (50-800 ميكرومول / لتر) لرسم منحنى المعايرة ، مع التغير في الامتصاص على المحور الرأسي وتركيزات Trolox على المحور الأفقي.
- تقدير قدرة الكسح DPPH من منحنى المعايرة.
- عبر عن النتائج على أنها مكافئات ميكرومول ترولوكس لكل عينة غرام (ميكرومول TE / g) على أساس الوزن الجاف.
- يزن بدقة 1.2 ملغ من DPPH في أنبوب طرد مركزي فارغ بسعة 50 مل. قم بإذابة DPPH في 30 مل من الميثانول لإعداد محلول ميثانول 60 ميكرومول / لتر.
- قدرة امتصاص الأكسجين الجذرية
- تحديد قدرة امتصاص الأكسجين الجذري (ORAC) للعينات استنادا إلى طريقة F.B. Apea-Bah et al.13.
- للبدء ، قم بإعداد معايير Trolox للتركيزات 6.25 و 12.5 و 25 و 50 ميكرومتر من محلول مخزون قياسي 1000 ميكرومتر Trolox في المخزن المؤقت 75 mM فوسفات البوتاسيوم (K 2 HPO4 / KH2PO4).
- للقيام بذلك ، يزن 1 ملغ من مسحوق Trolox ويذوب في 4 مل من محلول المخزن المؤقت تحت الصوتنة لإعداد محلول مخزون 1000 ميكرومتر.
- بعد ذلك ، خذ 50 ميكرولتر من محلول المخزون في أنبوب طرد مركزي بسعة 2 مل وقم بتخفيفه باستخدام 950 ميكرولتر من محلول المخزن المؤقت للحصول على 1000 ميكرولتر من محلول Trolox 50 ميكرومتر.
- ماصة 500 ميكرولتر من محلول 50 ميكرومتر في أنبوب جديد وتمييع مع حجم متساو من المخزن المؤقت للحصول على محلول Trolox 25 ميكرومتر.
- كرر التخفيف التسلسلي ل 25 ميكرومتر للحصول على 12.5 ميكرومتر ، ثم كرر بالمثل تخفيف 12.5 ميكرومتر للحصول على 6.25 ميكرومتر.
- إعداد التخفيفات المناسبة لمقتطفات العينة.
- قم بتخفيف مستخلصات الذرة الصفراء واللوبيا 20 مرة ، ومستخلصات القمح والفاصوليا 50 مرة ، ومستخلص فول الصويا 100 مرة باستخدام المحلول العازل.
- انقل 200 ميكرولتر من كل عينة أو معيار Trolox إلى آبار صفيحة سوداء ذات 96 بئرا للسحب التلقائي.
- ثم املأ خزانات الكاشف الثلاثة المزودة بمعدات ORAC ، بما يلي: (1) الحل العازل. (2) 0.816 نانومتر فلوريسين في المخزن المؤقت ؛ و (3) 153 mM من 2,2′-azobis (2-amidinopropane) ثنائي هيدروكلوريد (AAPH) في المخزن المؤقت.
- ضعها في أوعية السحب التلقائي.
- قم بإعداد آلة ORAC ونظام السحب التلقائي للتحليل ، استنادا إلى إجراء التشغيل القياسي.
- للتحليل ، قم بإعداد نظام السحب الآلي لنقل 25 ميكرولتر من كل مستخلص مخفف أو قياسي إلى آبار صفيحة سوداء شفافة ذات 96 بئرا.
- ثم ، أضف تلقائيا 150 ميكرولتر من 0.816 نانومتر فلوريسين في المخزن المؤقت.
- احتضن خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في آلة ORAC.
- بعد ذلك ، أضف تلقائيا 25 ميكرولتر من AAPH إلى كل خليط تفاعل.
- احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة في جهاز ORAC.
- قم بإعداد آلة ORAC لقياس اضمحلال التألق ، خلال فترة الحضانة ، عند الإثارة والأطوال الموجية للانبعاثات من 485 نانومتر و 520 نانومتر ، على التوالي.
- بعد القياسات ، ارسم منحنى Trolox القياسي ، مع Trolox (6.25-50 μM) على المحور الأفقي واضمحلال التألق على المحور الرأسي.
- تقدير قدرة امتصاص الأكسجين الجذري للمستخلصات من منحنى Trolox القياسي.
- عبر عن النتائج كعينة ميكرومول TE / g على أساس الوزن الجاف.
- التحليل الإحصائي
- تقديم جميع النتائج كوسيلة ± الانحراف المعياري لثلاثة أضعاف على الأقل.
- إجراء تحليل التباين (ANOVA) لتحديد تأثير نوع الحبوب على متغيرات الاستجابة.
- في حالة وجود فروق ذات دلالة إحصائية عند p < 0.05 ، استخدم أقل فرق ذي دلالة (LSD) لمقارنة الوسائل.
- قم بإجراء تحليل ارتباط بيرسون لتقدير العلاقة بين المحتوى الفينولي والقدرات المضادة للأكسدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الجدول 2 الأحماض الفينولية التي تم تحديدها في الحبوب والبقوليات. استنادا إلى المعايير الأصيلة المتاحة ، تم تحديد أربعة أحماض فينولية في العينات وهي: الفانيليا ، والكافيين ، والأحماض الكومارية ، والفيروليك. حمض الفانيليك هو حمض هيدروكسي بنزويك في حين أن الثلاثة الأخرى هي أحماض هيدروكسي سيناميك. تم تحديد حمض الفانيليك فقط في حبوب اللوبيا Blackeye بينما تم تحديد حمض الكافيين فقط في حبوب الكلى. تم تحديد حمض p-Coumaric في الذرة الصفراء وحبوب اللوبيا وفول الصويا. تراوح تركيزه بين 7.57 و 12.48 ميكروغرام / غرام من الدقيق على أساس الوزن الجاف ، مع الذرة الصفراء التي لها أدنى قيمة في حين أن فول الصويا له أعلى قيمة. كان حمض الفيروليك هو حمض الفينوليك الوحيد الذي تم تحديده في جميع العينات. وتراوح تركيزه بين 5.69 و 41.76 ميكروغرام/غرام دقيق على أساس الوزن الجاف. ومن بين العينات، كان تركيز حمض الفيروليك أعلى في فول الصويا يليه حبة اللوبيا بينما كان للقمح والذرة الصفراء والفاصوليا الكلوية قيم مماثلة (الجدول 2). عندما تم تلخيص جميع تركيزات حمض الفينوليك لكل عينة ، انخفضت قيمها بالترتيب التالي: فول الصويا > اللوبيا > الذرة الصفراء = الفاصوليا الكلوية > القمح.
ويبين الجدول 3 إجمالي المحتوى الفينولي (TPC) والقدرة المضادة للأكسدة للحبوب والبقوليات. وشملت القدرة المضادة للأكسدة DPPH قدرة الكسح الجذري ، TEAC ، و ORAC. وبالتالي فإن جمع هذه القيم الثلاث أعطى القدرة الكلية المضادة للأكسدة للعينات. تم قياس TPC في كل من مكافئ حمض الفيروليك ومكافئ حمض الغاليك لغرض المقارنة. تراوحت TPC بين 1.16 و 2.78 ملغ من دقيق FAE / g و 0.63 إلى 1.48 mg GAE / g من الدقيق ، على أساس الوزن الجاف. بغض النظر عن الوحدة المكافئة ، انخفض TPC من العينات بالترتيب التالي: فول الصويا > القمح = الذرة الصفراء = الفاصوليا > اللوبيا الكلوية.
وتراوحت قدرة العينات على الكسح الجذري DPPH بين 4.48 و 14.87 ميكرومول من دقيق TE/g على أساس الوزن الجاف. كان لفول الصويا أعلى قدرة على جمع DPPH ، يليه الفول الكلوي ، في حين أن الذرة الصفراء وحبوب اللوبيا لهما قيم مماثلة. كان القمح أقل قدرة على البحث عن جذر DPPH. تراوحت قدرة مضادات الأكسدة المكافئة ل Trolox (TEAC) للعينات بين 12.82 و 57.24 ميكرومول TE / g من الدقيق على أساس الوزن الجاف. مرة أخرى ، كان لفول الصويا أعلى قيمة TEAC ، تليها الفاصوليا الكلوية ، ثم القمح ، في حين أن الذرة الصفراء وحبوب اللوبيا لديها قيم TEAC منخفضة نسبيا. وتراوحت قدرة العينات على امتصاص الأكسجين الجذري بين 0.35 و1.67 ميكرومول من دقيق TE/g على أساس الوزن الجاف، حيث كانت حبوب الحبوب أقل قيمة بينما كان لفول الصويا أعلى قيمة. عندما تم تلخيص جميع القدرات المضادة للأكسدة ، انخفضت قيمها في العينات بالترتيب التالي: فول الصويا > والفاصوليا > والذرة الصفراء = حبة اللوبيا > القمح.
وكانت هناك علاقة إيجابية قوية بين قيمتي TPC، وقيم TEAC وORAC وإجمالي القدرة المضادة للأكسدة (TAC) (الجدول 4). ومع ذلك ، كان هناك ارتباط ضعيف بين قيم TPC و DPPH.
الشكل 1: أحماض هيدروكسي بنزويك المحددة في الحبوب والبقوليات.
الشكل 2: أحماض الهيدروكسي سيناميك المحددة في الحبوب والبقوليات.
الجدول 1: تحضير تركيزات ترولوكس للمنحنيات القياسية DPPH و ABTS. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: محتوى حمض الفينوليك في بعض الحبوب الكاملة والبقوليات. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 3: المحتوى الفينولي الكلي (TPC) والقدرة المضادة للأكسدة لبعض الحبوب الكاملة والبقوليات. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 4: مصفوفة ارتباط بيرسون لإجمالي المحتوى الفينولي والقدرات المضادة للأكسدة لبعض الحبوب والبقوليات. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم اختيار الحبوب الكاملة كحبوب وبقوليات تمثيلية للحبوب التي تجد تطبيقات غذائية واسعة في جميع أنحاء العالم. في حين قد توجد اختلافات بين أصناف كل حبة ، كان تركيز هذه الدراسة هو إظهار طريقة معممة لاستخراج وتحليل حمض الفينول الحر للحبوب الكاملة. تم تعديل طريقة الاستخراج عن طريق تقليل كميات العينات والمذيبات بشكل كبير ، من أجل تقليل كمية المواد الكيميائية التي سيتم إطلاقها في البيئة عند إجراء مثل هذه التجارب. كما يتيح التعديل استخراج الفينول من كميات ملليغرام من الحبوب الكاملة.
ينتج تحليل HPLC كروماتوجرام للأحماض الفينولية المكونة في العينة. يمكن تحديد كل قمة كروماتوغرافية تمثل حمض الفينوليك ، من خلال مقارنة وقت الاحتفاظ بها ، بطول موجي محدد مسبقا ، مع معايير حمض الفينول الأصلية. تستخدم أجهزة الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية (UV) عادة لتحديد الأحماض الفينولية ضمن نطاق الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية. عادة ما يتم تحديد أحماض هيدروكسي بنزويك بين 254-280 نانومتر بينما يتم تحديد أحماض الهيدروكسي سيناميك عادة بين 300-330 نانومتر15. يمكن استخدام كاشفات صفيف الصمام الثنائي الضوئي لمسح نطاق الطول الموجي المرئي للأشعة فوق البنفسجية بالكامل ، وهي مفيدة بشكل خاص في تحديد الأطياف المرئية للأشعة فوق البنفسجية للمركبات الموجودة في العينات التي لم تتم دراستها أبدا. روبنز و س. ر. ب15 عن الأطوال الموجية التالية لتحقيق أقصى قدر من الامتصاص، لحمض الفانيليك، وحمض الكافيين، وحمض الكوماريك p-coumaric، وحمض الفيروليك، على التوالي: 260 نانومتر؛ 325 نانومتر ؛ 310 نانومتر ؛ 325 نانومتر. عادة ما تكون طريقة تحديد HPLC مقبولة لعينات تكوين حمض الفينول المعروف ، والتي تم تحديد أوقات الاحتفاظ بها والبيانات الطيفية للأشعة فوق البنفسجية سابقا. هذا مهم لأن بعض المركبات يمكن أن تتلاشى عندما لا يتم تحقيق فصل جيد على العمود. بالنسبة لعينات تكوين حمض الفينول غير المعروف ، يتم استخدام مطياف الكتلة بالإضافة إلى المعايير الأصيلة لتحديد الهوية. توفر الأدبيات المنشورة معلومات مفيدة حول المركبات الفينولية التي تم تحديدها مسبقا في العينة قيد الدراسة أو في عينات مماثلة 3,9,14. تجدر الإشارة إلى أنه أثناء تحليل HPLC ، لا يمكن التعرف على قمم حمض الفينول في الكروماتوجرام إلا عندما تتوفر معايير أصلية للمقارنة. لذلك ، قد تكون هناك قمم أخرى لن يكون من الممكن تحديدها بدون معاييرها المقابلة. هذا هو القيد مع تحليل HPLC الذي يمكن التغلب عليه عندما يقترن HPLC إلى مطياف الكتلة. لذلك ، فإن التركيز الكلي للأحماض الفينولية المحددة كميا يعتمد على عدد الأحماض الفينولية المحددة.
طريقة فولين-سيوكالتيو ، التي نشرت لأول مرة من قبل V. L. Singleton و J. A. Rossi (1965)16 هي مقايسة قائمة على نقل الإلكترون تستخدم لتقدير TPC لتحليل17. يعتمد على قدرة التحليل على تقليل الفوسفوموليبدات - الفوسفوتونغستات في وسط قلوي ، وبالتالي تحويله من الأصفر إلى محلول أزرق داكن18. يمكن بعد ذلك قياس امتصاص المحلول الناتج عند 765 نانومتر19. الكاشف ليس محددا للمركبات الفينولية وحدها ولكن يمكن أن يتفاعل مع العديد من المركبات الأخرى مع تقليل الخصائص مثل الثيولات ، والحد من السكريات وبعض الأحماض الأمينية (على سبيل المثال ، التيروزين). ولذلك، يقترح أن يستخدم TPC لتقدير الخاصية المختزلة لعينة أو تحليل17. أثناء استخراج الفينول ، يتم استبعاد معظم المركبات المتداخلة وبما أن المركبات الفينولية هي أكثر المواد الكيميائية النباتية انتشارا في كل مكان ، فإن فحص Folin-Ciocalteu يظل طريقة مفيدة لتقدير TPC للعينة. في معظم العينات التي لا يعرف تركيبها الفينولي ، يستخدم حمض الغال كمعيار لرسم منحنى معايرة لتقدير TPC. ومع ذلك ، لن تحتوي جميع العينات على حمض الغاليك. في الدراسة الحالية ، استخدمنا حمض الفيروليك لمقارنة نتائجه بنتائج حمض الغال. أظهر اختبار T المكون من عينتين أن TPC الذي تم تحديده على أنه مكافئ حمض الفيروليك له قيم أعلى بكثير من TPC المعبر عنها كمكافئ لحمض الغاليك. نظرا لأننا أكدنا وجود حمض الفيروليك في جميع العينات بناء على تحليل HPLC الخاص بنا والنتائج الأخرى المبلغ عنها ، فإننا نميل أكثر نحو التعبير عن نتائج TPC كمكافئ لحمض الفيروليك. من المفيد التعبير عن TPC بالنسبة إلى مركب فينولي مكون سائد في العينة.
باستخدام ثلاثة اختبارات مختلفة مضادة للأكسدة ، لوحظ أن الحبوب المختلفة استجابت بشكل مختلف في قدراتها على مسح الجذور الحرة. تعتمد قدرة الكسح الجذري DPPH وفحص TEAC على آلية نقل الإلكترون (ET) بينما يعتمد فحص ORAC على آلية نقل ذرة الهيدروجين (HAT)20. لذلك ، فإن الجمع بين الفحوصات الثلاثة يعطي مؤشرا أفضل على قدرة العينة المضادة للأكسدة. تجدر الإشارة إلى أن فحص ORAC يقيس قدرة العينة على مسح جذر البيروكسيل ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية ، والذي ، في النظام الفسيولوجي ، يمكن أن يسبب بيروكسيد الدهون المرتبط بتكوين الخلايا الرغوية وتكوين الشرايين21,22. من ناحية أخرى ، تستخدم اختبارات DPPH و TEAC جذورا ليست ذات أهمية فسيولوجية. ومع ذلك ، فإن سهولة استخدامها تجعلها مفيدة كطرق سريعة لتقدير قدرة الكسح الجذري للعينة. كما تقارن اختبارات ORAC بشكل جيد مع اختبارات مضادات الأكسدة الأخرى في المختبر أو خارج الجسم الحي التي تستخدم الخلايا والحمض النووي كمؤشرات حيوية23.
جميع الطرق الموضحة أعلاه لاستخراج وتحديد الأحماض الفينولية الحرة ، وتقدير المحتوى الفينولي الكلي ، وتحديد خصائص مضادات الأكسدة ، ليست موحدة. توصي الشركات المصنعة المختلفة للأعمدة الكروماتوغرافية السائلة بأنظمة مختلفة للتخلص من المذيبات لفصل الأحماض الفينولية لتحديد هويتها. على الرغم من أن طريقة Folin-Ciocalteu هي الأكثر شيوعا لتقدير إجمالي المحتوى الفينولي للعينات ، إلا أن المختبرات المختلفة تجري هذا الفحص بشكل مختلف. ويمكن قول الشيء نفسه عن طرق مضادات الأكسدة. ولذلك، هناك حاجة إلى مواءمة هذه الأساليب لتعزيز المقارنة بين المختبرات للنتائج. هناك أيضا حاجة لتطوير نماذج تنبؤية قوية يمكنها ربط تكوين حمض الفينول بخصائص مضادات الأكسدة التي تقاس بهذه الطرق المهمة للتحليل.
ويستنتج من هذه الدراسة أن طريقة استخراج المذيبات المستخدمة فعالة في استخراج الأحماض الفينولية الحرة القابلة للذوبان من دقيق الحبوب الكاملة والبقوليات، مما يسهل تحديدها وتحديدها كميا. تمكن طريقة HPLC من تحديد وقياس الأحماض الفينولية القابلة للذوبان الحرة في مستخلصات الحبوب الكاملة ، شريطة وجود معايير أصلية للمقارنة. باستخدام ثلاث طرق مختلفة مضادة للأكسدة: DPPH و TEAC و ORAC ، يمكن تحديد القدرات المضادة للأكسدة لمستخلصات الفينول القابلة للذوبان الحر من الحبوب الكاملة بشكل فعال بناء على آليات نقل ذرة الهيدروجين ونقل الإلكترون. تؤكد هذه الدراسة كذلك أن الحبوب الكاملة تختلف في تكوين حمض الفينوليك وقدراتها المضادة للأكسدة. يوضح تحليل الارتباط أن القدرات المضادة للأكسدة المقاسة مرتبطة بالأحماض الفينولية المكونة في المستخلصات القابلة للذوبان الخالية من الحبوب الكاملة. على الرغم من أن كلا من TEAC و DPPH ينقبان الجذور الحرة بواسطة آلية نقل الإلكترون ، إلا أنهما يرتبطان بشكل مختلف مع TPC. يتطلب الاختلاف في سلوكيات المقايسات المضادة للأكسدة المختلفة الحاجة إلى تحديد القدرة المضادة للأكسدة للعينات باستخدام مجموعة متنوعة من المقاييس. من بين الحبوب الكاملة الخمس التي تمت دراستها ، يحتوي فول الصويا على أعلى تركيز حمض الفينوليك وأعلى قدرة مضادة للأكسدة في المقابل. وتوضح الدراسة أيضا أنه يمكن استخراج الأحماض الفينولية القابلة للذوبان الخالية من الحبوب الكاملة ودراسة قدراتها المضادة للأكسدة في أقل من 1 مل من محلول الميثانول المائي ، وبالتالي تقليل كمية المواد الكيميائية المختبرية التي يتم إطلاقها في البيئة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويعرب صاحبا البلاغ عن امتنانهما للدعم التقني الذي قدمته السيدة أليسون سير والسيدة هانا أودورو - أوبينغ، فضلا عن الدعم الذي قدمته السيدة جانيس فاجاردو والسيد ميغيل ديل روزاريو لتحرير الفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Falcon conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 2 mL Amber glass ID Surestop vial | Thermo Scientific | C5000-2W | |
| 2 mL Amber microcentrifuge tubes | VWR | 20170-084 | |
| 2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) | Sigma-Aldrich | 440914-100G | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, | Sigma Aldrich | A1888-2G | |
| 2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) | Sigma Aldrich | D913-2 | |
| 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% | Fluka Chemika | 56510 | |
| 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | Thermo Scientific | 60180-670 | |
| 96 well flat bottom plates | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Agilent BioTek ELx800 microplate reader | Fisher Scientific | BT-ELX800NB | |
| Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System | Fisher Scientific | N/A | |
| Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader | Fisher Scientific | N/A | |
| Analytical balance SI-114 | Denver Instrument | SI-114.1 | |
| Autosampler, Waters 717 Plus | Waters | WAT078900 | |
| BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip | BD | 309657 | |
| Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 | Millipore Sigma | Z245143 | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) | Merck Millipore Ltd | HVLP04700 | |
| Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) | Merck Millipore Ltd | HVHP04700 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL | Eppendorf | 3123000071 | |
| Eppendorf Research plus, 100-1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus, 10-100 µL | Eppendorf | 3123000047 | |
| Ethyl acetate, HPLC grade | Fisher Chemical | E195-4 | |
| Ferulic acid standard | Sigma Aldrich | 128708-5G | |
| Fluorescein | Fisher Scientific | AC119245000 | |
| Folin & Ciocalteu phenol reagent | Sigma Aldrich | F9252 | |
| Formic acid, 99% | Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a | 27048-0010 | |
| Gallic acid standard | Sigma | G7384 | |
| High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 | Waters | 960402 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Chemical | A452-4 | |
| Micro pipet tips, 0.5-10 µL | Fisherbrand | 21-197-2F | |
| Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge | Thermo Scientific | 75002435 | |
| Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL | Sartorius | 728240 | |
| Photodiode array detector, Waters 2996 | Waters | 720000350EN | |
| Pipet tips, 1000 µL | VWR | 83007-382 | |
| Pipet tips, 1-5 mL | VWR | 82018-840 | |
| Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% | Sigma Aldrich | 216224-100G | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom | Corning | 4321-250 | |
| Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ | Thermo Scientific | 17326-103030 | |
| Roto evaporator, IKA RV 10 | IKA | 0010005185 | |
| Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous | Fisher Chemical | S263-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Mallinckrodt AR® | 7581 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) | Fisher bioreagents | BP329-500 | |
| Standardization pipet tips 0-200µL | Fisherbrand | 02-681-134 | |
| Syringe Driven Filter unit (0.22 µm) | Millex®-GV | SLGVR04NL | |
| Target micro-serts vial insert (400 µL) | Thermo Scientific | C4011-631 | |
| Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) | Millipore | ZRQSVP030 |
References
- Huitu, O., et al. Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores. Frontiers in Plant Science. 5, 478 (2014).
- Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I. Plant phenolic acids affect the virulence of Pectobacterium aroidearum and P. carotovorum ssp. brasiliense via quorum sensing regulation. Molecular Plant Pathology. 17 (4), 487-500 (2016).
- Dykes, L., Rooney, L. W. Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits. Cereal Foods World. 52 (3), 105-111 (2007).
- Xiang, J., Apea-Bah, F. B., Ndolo, V. U., Katundu, M. C., Beta, T. Profile of phenolic compounds and antioxidant activity of finger millet varieties. Food Chemistry. 275, 361-368 (2019).
- Qiu, Y., Liu, Q., Beta, T. Antioxidant properties of commercial wild rice and analysis of soluble and insoluble phenolic acids. Food Chemistry. 121 (1), 140-147 (2010).
- Beverly, R. L. Encyclopedia of Food Safety. Motarjemi, Y. 3, Academic Press. 309-314 (2014).
- FAO. Food Outlook - Biannual report on global food markets. Food and Agriculture Organization. , Rome, Italy. (2020).
- Erbersdobler, H. F., Barth, C. A., Jahreis, G. Legumes in human nutrition. Nutrient content and protein quality of pulses. Ernahrungs Umschau. 64 (9), 134-139 (2017).
- Dueñas, M., Hernández, T., Estrella, I. Assessment of in vitro antioxidant capacity of the seed coat and the cotyledon of legumes in relation to their phenolic contents. Food Chemistry. 98 (1), 95-103 (2006).
- Khang, D. T., Dung, T. N., Elzaawely, A. A., Xuan, T. D. Phenolic profiles and antioxidant activity of germinated legumes. Foods. 5 (2), 27 (2016).
- Hefni, M. E., Amann, L. S., Witthöft, C. M. A HPLC-UV method for the quantification of phenolic acids in cereals. Food Analytical Methods. 12 (12), 2802-2812 (2019).
- AOAC. Official Methods of Analysis. 17th edn. , Association of Official Analytical Chemists. Gaithersburg, MD, USA. (2000).
- Apea-Bah, F. B., Head, D., Scales, R., Bazylo, R., Beta, T. Hydrothermal extraction, a promising method for concentrating phenolic antioxidants from red osier dogwood (Cornus stolonifer) leaves and stems. Heliyon. 6 (10), 05158 (2020).
- Apea-Bah, F. B., Minnaar, A., Bester, M. J., Duodu, K. G. Sorghum-cowpea composite porridge as a functional food, Part II: Antioxidant properties as affected by simulated in vitro gastrointestinal digestion. Food Chemistry. 197, Pt A 307-315 (2016).
- Robbins, R. J., Bean, S. R. Development of a quantitative high-performance liquid chromatography-photodiode array detection measurement system for phenolic acids. Journal of Chromatography A. 1038 (1-2), 97-105 (2004).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Prior, R. L., Wu, X., Schaich, K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (10), 4290-4302 (2005).
- Ainsworth, E. A., Gillespie, K. M. Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent. Nature Protocols. 2 (4), 875-877 (2007).
- Waterhouse, A. L.
- Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (6), 1841-1856 (2005).
- Esterbauer, H., Wäg, G., Puhl, H. Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis. British Medical Bulletin. 49 (3), 566-576 (1993).
- Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H., Jürgens, G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radical Biology and Medicine. 13 (4), 341-390 (1992).
- Apea-Bah, F. B., Serem, J. C., Bester, M. J., Duodu, K. G. Phenolic composition and antioxidant properties of Koose, a deep-fat fried cowpea cake. Food Chemistry. 237, 247-256 (2017).
