Summary
이 프로토콜은 생체 외에서췌장 계보로 인간 치과 펄프 줄기 세포 (hDPSC)를 분화하기위한 두 가지 다른 유도 프로토콜 사이의 비교를 제시합니다 : 통합 프로토콜 및 비 통합 프로토콜. 통합 프로토콜은 더 많은 인슐린 생산 세포(IPC)를 생성합니다.
Abstract
2000년 현재, 에드먼튼 프로토콜을 사용하여 췌장 이식의 성공은 여전히 몇 가지 장애물에 직면했습니다. 이들은 cadaveric 췌장 기증자의 제한된 수 및 면역 억제제의 장기 사용을 포함합니다. 중간 엽 줄기 세포 (MSC) islet 같은 세포 생성의 대체 소스로 잠재적인 후보로 간주 되었습니다. 우리의 이전 보고서는 성공적으로 인슐린 생산 세포 (CFC)에 인간 치과 펄프 줄기 세포 (hDPSC)를 분화하기위한 유도 프로토콜의 설립을 설명했다. 그러나 유도 효율은 크게 다양했습니다. 이 논문에서는 hDPSC 유래 IpC(hDPSC-IpC)를 전달하기 위한 통합(마이크로 환경 및 유전 조작) 및 비통합(microenvironmental 조작) 유도 프로토콜을 통한 hDPSCs 췌장 유도 효율의 비교를 시연합니다. 결과는 다중 복용량 포도당 도전에 3 차원 식민지 구조, 수율, 췌장 mRNA 마커 및 기능성 속성의 관점에서 유도 접근 둘 다에 대한 뚜렷한 유도 효율을 건의합니다. 이러한 사실 인정은 임상적으로 적용 가능한 IpC 및 췌장 계보 생산 플랫폼의 미래 설립을 지원할 것입니다.
Introduction
당뇨병은 지속적인 글로벌 관심사입니다. 국제 당뇨병 연맹(IDF) 보고서에 따르면 당뇨병의 전 세계 보급률은 2000년 1억 5,100만 명에서 2015년 4억 1,500만 명으로 증가할 것으로추정했다. 최신 역학 기지를 둔 연구 결과는 추정된 세계적인 당뇨병 보급이 2017년에 4억 5천1백만에서 2045년1년에693,000,000로 증가할 것이라는 점을 예측했습니다. 에드먼튼 프로토콜을 이용한 췌장적 이식의 성공은 2000년에 처음 입증되었으며, 내인성 인슐린 생산을 유지하고 I형 당뇨병 환자3에서노모글리세믹 상태를 안정화시키는 것으로 나타났다. 그러나 Edmonton 프로토콜의 적용은 여전히 병목 현상에 직면해 있습니다. 타입-I 당뇨병을 가진 각 환자는 적어도 2-4 islet 기증자를 필요로 하기 때문에 cadaveric 췌장 기증자의 제한된 수는 주요 문제점입니다. 더욱이, 면역억제제의 장기간 사용은 생명을 위협하는부작용4,5를유발할 수 있다. 이를 해결하기 위해 지난 10년간 당뇨병에 대한 잠재적 치료법의 개발은 주로 다양한 줄기 세포6에서효과적인 인슐린 생산 세포(IpC)의 생성에 초점을 맞추고 있다.
줄기 세포는 베타 세포의 손실에 기인하는 당뇨병 타입 I를 포함하여 많은 질병에서 대체 처리가 되었습니다. IpC의 이식은 이들 환자에서 혈당을 조절하는 새로운 유망한 방법입니다7. 통합 및 비통합 유도 프로토콜인 IpC 생성을 위한 두 가지 방법이 이 문서에서 제시됩니다. 유도 프로토콜은 성숙하고 기능적인 IPC8,9를얻기 위해 자연 췌장 발달 과정을 모방했다.
이 연구를 위해, hDPSC는 MSC 표면 마커 검출, 다중리 분화 전위 및 RT-qPCR을 위한 유동 세포측정을 특징으로 하여 줄기 성질 및 증식 유전자 마커(data)의 발현을 결정하기 위해8,9,10. hDPSC는 최종 내막, 췌장 내분비, 췌장 내분비 및 췌장 베타 세포 또는 IpC(도 1)를향해 각각7을유도하였다. 세포를 유도하기 위해, 3단계 유도 접근법은 백본 프로토콜로 사용되었다. 이 프로토콜을 통합되지 않는 프로토콜이라고 합니다. 통합 프로토콜의 경우, 필수 췌장 전사 인자 인 PDX1은hDPSC에서 과발현된 PDX1을 3단계 분화 프로토콜을 사용하여 hDPSC에서 과도하게 발현되었다. 통합되지 않는 프로토콜과 통합 프로토콜의 차이점은 통합 프로토콜이 아닌 통합 프로토콜에서 PDX1의 과발현입니다. 췌장 분화는 이 연구에서 통합 및 비 통합 프로토콜 사이에서 비교되었습니다.
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Protocol
이 작품은 헬싱키 선언에 따라 수행되었으며, 출라롱콘 대학 치과 학부인 인간 연구 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 인간 DPSC (hDPSC)는 사랑니 문제로 인해 노모와 어금니 모두에서 추출 된 인간의 치과 펄프 조직에서 분리되었다. 승인된 프로토콜(HREC-DCU 2018/054)에 따라 환자로부터 통보된 동의를 얻었다.
1. 통합 유도 프로토콜
- PDX1을 운반하는 렌티바이러스 벡터의 준비
- 바이러스 성 포장을 위해 인간 배아 신장 (HEK) 293FT 세포를 사용하십시오. 배양 및 DMEM의 변형 된 독수리 매체 (DMEM)에서 이러한 세포를 유지 하여 10% 태아 소 혈청 (FBS), 1 % L-글루타민, 1 % 항생제 - 항진성으로 보충.
- PDX1-렌즈바이러스벡터를 각각 10μg의 공동 배분하여 각각 포장 및 봉투 플라스미드와 표적 유전자 플라스미드의 20 μg을 헤K293FT 세포로 결합하여 칼슘 인산염 트랜스퍼션 시스템(예를 들어, psPAX2, pMD2)을 생성한다. G, 및 인간 pWPT-PDX111. 감염 시 세포가 80%-90% 컨실수 있는지 확인합니다.
- 렌티바이러스 입자를 함유하는 배지를 48 및 72h에서 배설 후 수집한다.
- 0.45 μm 필터를 통해 수집된 매체를 필터링하는 행위; 100 kDa 명목 분자량 컷오프(NMWCO)에서 원심 필터로 바이러스를 농축한다.
- PDX1 과발현
- 70-80% 컨할수 있는 통로 3-5 hDPSC를 사용합니다. 시도및 셀 카운터를 사용하여 세포를 계산합니다. 씨앗 1 x 106 hDPSC는 60mm 조직 배양 처리 접시에 하룻밤 동안 배양한다.
- 24시간 후, 폴리브레인 전처리 셀(4 μg/mL 폴리브레네, 37°C 미만 30분, CO2 5%CO2)을원하는 복합감염성(MOI)에서 트랜스듀하기 위해 1.1.4단계에서 얻은 신선한 바이러스 입자를 첨가한다. 예를 들어, 이 경우 사용되는 MOI는 20입니다. 세포 배양인인큐베이터에서 세포를 37°C에서 5%CO2로유지한다.
- 24h 감염 기간 후, 바이러스 성 입자를 포함하는 매체를 폐기하십시오. 신선한 배양 매체를 추가하고 48 h에 대한 세포를 계속 성장. 모든 배양은 37°C 및 5% CO2로유지됩니다.
- 유도 단계로 진행하기 전에 감염된 세포의 집계 된 형태여부를 확인하십시오. PDX1 전염은 유전자 발현분석(보충도 1)에의해 확인된다.
참고: 다음 단계로 진행하기 전에 현미경으로 세포 형태학을 확인하십시오. - 수확및 미세환경 유도 접근법으로서 3단계 유도 프로토콜(단계 1.3)으로 진행한다.
- 3단계 유도 프로토콜
참고: 3단계 유도 프로토콜은 혈청 이없는 매체(SFM)-A, SFM-B 및 SFM-C를 사용하여 hDPSC의 일련의 췌장 분화를 최종 엔데드럼, 췌장 내분비 및 췌장 베타 세포/IpC로 각각 발생시켰습니다.- 배양 배지를 폐기한 다음 1x 인산염 버퍼링 용액(PBS)으로 변환된 hDPSC를 세척합니다.
- 세포에 0.25% 트립신-EDTA 용액을 추가하고 37°C, 5% CO2에서1분 동안 배양한다.
- 배양 배지를 추가하여 트립신 활성을 중지하고 세포를 부드럽게 플러시하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 각 수집 튜브에 세포와 알리쿼트 1 x 106 세포를 계산합니다.
- 468 x g(상대 원심력: RCF), 4°C에서 셀 서스펜션을 원심분리하여 5분 동안 분리합니다. 상체를 버리고 셀 펠릿을 저장합니다.
- 제1췌장 유도 배지, 즉 혈청이 없는 배지(SFM)-A. 낮은 부착 배양판(60mm)에 세포를 시드하는 제1췌도 유도 배지의 3mL에서 펠릿을 재연한다. 3일 동안 세포를 37°C 및 5% CO2로 유지한다.
참고: 다음 단계로 진행하기 전에 반전된 현미경으로 세포 형태학을 관찰합니다. - SFM-A를 제거하고 두 번째 유도 매체, 즉 SFM-B의 3mL을 추가합니다. 37°C, 5% CO2에서다음 2일 동안 세포를 유지한다.
참고: 다음 단계로 진행하기 전에 반전된 현미경으로 세포 형태학을 관찰합니다. - SFM-B를 제거하고 세 번째 유도 매체, 즉 SFM-C의 3mL을 추가합니다. 세포 배양에서 다음 5일 동안 세포를 유지하여 37°C에서 5%CO2로유지한다. 매 48 시간마다 매체를 변경합니다. 5 일 후에 그들의 형태를 관찰하십시오.
참고: 각 유도 매체는 설명된 바와 같이 상이한 시약으로 보충됩니다. SFM-A: 1% 소 혈청 알부민 (BSA), 1 x 인슐린 -transferrin-selenium (ITS), 4 nM 의 활성, 1 nM의 나트륨 부티레이트, 및 베타 메카포에탄올의 50 μM; SFM-B: 1% BSA, 1배 ITS, 0.3 mM 타우린; 및 SFM C: 1.5% BSA, 1x ITS, 3 mM 타우린, 글루카곤 같은 펩티드 (GLP)-1, 1 mM 니코티나미드, 1x 비필수 아미노산 (NEAA). - 각 단계 후에 반전된 현미경의 밑에 세포 형태학을 확인하십시오. 세포는 더 집계되고 식민지로 떠있을 것입니다.
- 추가 분석을 위해 세포 식민지를 수집합니다. 식민지 형태와 크기를 확인합니다. 췌장 유전자 마커 발현 분석 및 기능 분석을 수행합니다(포도당 자극 C-펩티드 분비 분석).
2. 비통합 유도 프로토콜
참고: 비통합 프로토콜은 미세환경 유도 접근법8,9로3단계 유도 프로세스를 가진 IC를 전달하기 위한 백본 프로토콜이다.
- 70%-80%의 인플루엔자에 3-5 hDPSC를 사용합니다.
- 배양 매체를 폐기하고 1x PBS로 hDPSC를 세척합니다.
- 세포에 0.25% 트립신-EDTA 용액을 넣고 37°C, 5% CO2에서1분 동안 배양한다.
- 배양 배지를 추가하여 트립신 활성을 중지하고 세포를 부드럽게 피펫하여 단일 셀 현탁액을 얻습니다. 각 수집 튜브에 세포 와 알리쿼트 1 x 106 세포를 계산합니다.
- 468 x g (RCF), 4 °C, 5 분에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 상부체를 폐기합니다.
- SFM-A에서 펠릿을 다시 중단하고 낮은 부착 배양 플레이트(60mm)에 시드합니다. 3 일 동안 37 °C 및 5 % CO2에서 세포를 배양합니다. 반전된 현미경의 밑에 세포 형태학을 확인하십시오.
- SFM-A를 제거하고, SFM-B(3일차)를 추가한 다음, 37°C, 5% CO2하에서 다음 2일 동안 세포를 유지한다.
- SFM-B를 제거하고, SFM-C(5일)를 추가한 다음, 37°C, 5% CO2하에서 다음 5일 동안 세포를 유지한다. SFM-C는 48h마다 변경됩니다.
참고: 각 유도 매체는 설명된 바와 같이 상이한 시약으로 보충됩니다. SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 nM 의 활성A, 1 nM의 나트륨 부티레이트, 및 베타-메르카포에탄올의 50 μM; SFM-B: 1% BSA, 1배 ITS, 0.3 mM 타우린; 및 SFM C: 1.5% BSA, 1x ITS, 3 mM 타우린, GLP-1의 100 nM, 1 mM 니코티나미드, 1x NEAA. - 각 단계 후 와 10 일 반전 현미경에서 세포 형태학을 확인해야합니다.
참고: 세포가 더 집계되고 식민지로 떠들것입니다. - 추가 분석을 위해 세포 식민지를 수집합니다. 식민지 형태와 크기를 확인합니다. 췌장 유전자 마커 발현 분석 및 기능 분석을 수행합니다(포도당 자극 C-펩티드 분비 분석).
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Representative Results
이 문서에서는 유도 프로토콜의 결과를 비교했습니다. 두 유도 프로토콜의 다이어그램은 그림 2A,C에 설명되어있습니다. 두 프로토콜 모두에서, 평가는 가벼운 현미경으로 수행되었고, 이미지는 ImageJ로 분석되었다. hDPSC는 유도 프로토콜 모두에서 유도 첫날부터 식민지와 같은 구조를 형성할 수 있었습니다. 식민지의 형태는 둥글고 조밀했으며, 모든 식민지는 유도 기간 동안 배양 용기에 떠있었다(그림 2B,D). 두 프로토콜의 총 식민지 수도 결정되었다; 그 결과 통합 유도 프로토콜의 경우 전체 콜로니 수가 비통합 유도프로토콜(도 2E)에비해 약간 높았다는 것을 보여주었다. 그러나, 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. 더욱이, 두 유도 프로토콜 모두에서 콜로니 크기 분포도 평가하였다(도2F). 우리의 결과에 따르면, 중소형 식민지는 식민지 내부의 괴사 코어를 줄이는 데 중요한 통합 유도에 형성되었다.
췌장 유전자 마커 분석은 우리의 최근 간행물에 따라 RT-qPCR를 사용하여 수행되었다10. 이 연구에서 사용되는 프라이머 목록에 대한 정보는 표 1에포함되어 있습니다. mRNA 값은 18S 리보소말 RNA로 정규화하여 상대mRNA 발현로 제시되었고2(-ΔΔCt)의공식을 이용하여 대조군하였다. 이 연구의 결과는 통합 유도 프로토콜이 ISL-1, MAF-A, GLUT-2, 인슐린및 GLP-1R(그림 3)을 포함하여 후기 췌장 마커의 높은 발현으로 식민지를 산출한 것으로 나타났습니다(그림 3),HDPSC의 분화를 IpC로 의하여 건의하였다. hDPSC-IpC의 기능성 평가도설명하였다(도 4)이 연구에서. 포도당 자극 C-펩티드 분비8,9 분석은 ELISA 키트를 사용하여 사용되었다. 결과는 통합 및 비 통합 유도 프로토콜이 C-펩티드를 분비할 수 있던 식민지를 산출했다는 것을 보여주었습니다.
그림 1: MSC 차별화 를 IpC에 대한 다이어그램.
그림 2: 두 개의 서로 다른 프로토콜을 사용하여 IpC의 형태학, 총 식민지 수 및 콜로니 크기 분포. 필수 전사 계수, PDX1의 과발현에 의한 통합 프로토콜의 다이어그램, 그리고 3-가파른 유도프로토콜(A)이뒤따릅니다. 유도의 각 단계에서 형질 감염된 hDPSC의 형태(B). 백본프로토콜(C)으로통합되지 않는 다이어그램. 비통합프로토콜(D)을사용하는 hDPSC-IpC의 형태. 두 개의 서로 다른 프로토콜의 토탈콜로니(E)및 콜로니 크기분포(F) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 두 개의 상이한 프로토콜로부터 얻은 hDPSC-IpC의 췌장 유전자 발현 분석. 췌장내막(PDX1 및 NGN-3)(A),췌장축성 배분 마커(ISL-1, MAF-A, GLUT-2,및 인슐린)(B),및 췌장 관련마커(GLP-1R)(C)의mRNA 발현을 분석하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 두 개의 서로 다른 프로토콜에서 얻은 hDPSC-IpC의 기능 분석. C-펩티드 분비물은 각 유도 프로토콜,통합(A)및 비통합(B)프로토콜에서, 포도당 자극 C-펩티드 분비(GSCS) 분석에 의해 결정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 도 1: PDX1 변환 후 PDX1 mRNA 분석. PDX1 mRNA 발현 분석은 HDPSC에서 MOI 20에서 PDX1 의 48 h 의 PDX1 변환 후 나타내고 있다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 유전자 | 가입 번호 | 포워드 프라이머 | 길이 | Tm | |
| 역프라이머 | (bp) | (°C) | |||
| PDX-1 | NM_000209.4 | 5' – AAGCTCACGCGTGAGAg – 3' | 145 | 57.89 | |
| 5' – GGCCGTGAGATGTACTTG – 3' | 52.38 | ||||
| NGN-3 | NM_020999.3 | 5' – CGGTAGAAAGGATGACGT – 3' | 138 | 59.54 | |
| 5' – GGTCACTTCGTCTTCCGAGG – 3' | 60.11 | ||||
| ISL-1 | NM_002202.2 | 5' – TCCCTATGTGTTGGTTGCGG - 3' | 200 | 60.32 | |
| 5' – TTGGCGCATTTGATCCCGTA – 3' | 60.39 | ||||
| MAF-A | NM_201589.3 | 5' – GCACATTCTGGAGAGCGAGA – 3' | 102 | 59.83 | |
| 5' – TTCTCCTTGTACAGGTCCCG – 3' | 58.74 | ||||
| 글루트-2 | NM_000340.1 | 5' – GGTTGTAACTTATGCCTAAG – 3' | 211 | 52.25 | |
| 5' – GCCTAGTTATGCATTGCAG – 3' | 54.24 | ||||
| 인슐린 | NM_000207.2 | 5' – CCGCAGCCTTTGTGAACCAACA – 3' | 215 | 64.34 | |
| 5' – TTCCACAATGCGCTTCTGC – 3' | 64.45 | ||||
| GLP-1R | NM_002062.4 | 5' – TCGCTGTGAAAATGAGGAGGA – 3' | 189 | 59.38 | |
| 5' – TCACTCCCGCTGTGTGTGTGTG – 3' | 60.25 | ||||
| 18S | NR_003286.2 | 5' – GTGATGCCCTTAGGTCC – 3' | 233 | 55.04 | |
| 5' – CCATCCAATCGGTAGTAGC – 3' | 54.86 | ||||
표 1: 프라이머 정보.
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Discussion
MsC에서 더 높은 IpC 생산을 달성하는 것은 당뇨병 치료에 필수적인 역할을합니다. 통합 프로토콜의 중요한 단계는 변환 및 변환된 세포의 품질에 사용되는 세포의 품질에 의존합니다. 성공적인 트랜스퍼션을 위해 확인해야 하는 몇몇 세포 요구 사항은 세포 건강, 세포 은행 관리 및 세포가 미상 활성 상태에 있다는 것을 보장하고 있습니다. 또한, 트랜스듀스 된 세포의 생존가능성을 모니터링하는 것도 중요한 역할을 한다. 덜 성공적인 트랜스듀션은 자극된 세포의 열악한생존력(12)에기인한다. 비통합 프로토콜의 경우, 형태학적 외관과 부동 식민지는 췌장 분화9의성숙과 관련이 있기 때문에 달성되어야 한다.
통합 유도 프로토콜에 대한 기술의 수정 및 문제 해결 측면에서, 건강하고 양질의 세포는 3-5 및 70%-80% 인플루엔자에 있는 세포를 사용하여 얻을 수 있으며, 유도된 세포의 품질은 다음 단계로 이동하기 전에 자극된 세포의 품질을 정기적으로 확인하여 모니터링되어야 한다. 이 발견은 감산의 효율성에 영향을 미치는 여러 가지 요인이 세포 건강, 세포 합류 및구절(13)의수에 의존한다는 것을 언급한 이전 연구와 상관관계가 있다. 이 연구에서는, 3단계 유도 과정을 가진 비통합 프로토콜은 여전히 한계에 직면하고 있으며, 주로 식민지 크기 및 식민지 수 형성에 관한 것이다. 이 결과는 우리의 이전 연구8,9와일치합니다 . 이 문제를 극복하기 위해, 우리는 낮은 부착 배양 용기의 품질뿐만 아니라 세포의 품질뿐만 아니라 확인하는 것이 좋습니다.
이 기술의 한계는 두 개의 서로 다른 연속 플랫폼의 사용으로 인한 통합 유도 프로토콜의 복잡성입니다. 또한 MOI가 높을수록 더 높은 변환 효율을 의미하지는 않습니다. lentivirus 트랜스듀션을 사용하는 유사한 연구에서 더 높은 MOI는 더 나은 트랜스듀션 효율성을 달성할 수 없었습니다. 저자는 프로타민 황산염14와같은 보조를 사용하여 제안합니다. 비통합 프로토콜을 사용하는 한계는 식민지의 생산 및 수확을 위한 취급 기술과 생산된 IpC의 다양한 크기 및 형태학적 구조와 같은 기술적 문제와 관련이 있습니다.
필수 전사 인자, PDX1은,따라서 성숙한 IpC에 대한 MSC 유도의 헌신에 잠재적 인 역할을 갖는 중요한15,16,17,18. PDX1-과발현hDPSC를 이용하여 백본 프로토콜의 수정은 주로 성숙하고 기능적인 IpC19,20,21의성공적인 고수익 생산을 목표로 했다. 이 프로토콜의 결과는 성숙한 IpC를 향한 MSC 유도가 PDX19의사전 내분비식을 필요로 한다는 것을 반영했습니다. 형태학적 평가는 낮은 부착 용기를 사용하여 두 프로토콜모두에서 콜로니의 비부착된 3D 구조를 얻을 수 있음을 보여주었다. 이 구조는 췌장 분화7,9,22,23의성숙을 달성하는 데 중요했다. 또한, 식민지 크기 평가에 따르면, 통합 프로토콜은 식민지의 괴사 코어를 방지할 수 있는 전체 식민지 수와 중소형 식민지 생산의 긍정적인 추세를 초래하였다. 따라서,7,19,21,24,25를추가이식하는데 도움이 될 것이다. 후기 단계 췌장 유전자마커(ISL-1, MAF-A, GLUT-2, 인슐린및 GLP-1R)의강화 조절이 이 프로토콜에서 관찰되었다. 통합 유도 프로토콜의 후기 단계 췌장 유전자 마커는 백본 프로토콜에 비해 더 높았다. PDX1의 과발현은 췌장 선조의 수를 증가시켰으며, 즉 중후반기 췌장 개발의 진행 측면에서 더 나은 결과를 얻을 수 있는 것이19,26,27,28을달성할 수 있는 것으로 나타났다. 또한, IpC의 기능을 명확히하기 위해, GSCS 분석이 수행되었다. 두 프로토콜에서 생산된 hDPSC-IpC는 기능적으로 활성 식민지를 제안하여 C-펩티드를 분비했다.
이 연구에서 사용되는 기술의 향후 응용 프로그램을 요약하기 위해 두 췌장 유도 프로토콜은 시험관 내에서IpC를 생성할 수 있었습니다. 전체 식민지 수, 중소형 식민지 생산 및 췌장 마커 발현의 관점에서, 통합 프로토콜은 IPC 형성에 유익한 추세를 보였으며, 인간 및 수의학적 행위에 대한 줄기세포 기반 당뇨병 치료제에서 추가 MSC적용을지원하는7,29,30,31,32.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
SK, WR, QDL은 수의학 줄기세포 및 생명공학 연구단위인 라타다피섹톰포트 엔다우먼트 펀드, 출라롱콘대학교의 지원을 받았습니다. TO와 PP는2세기 프로젝트로 출라롱콘 학술 발전에 의해 지원되었다. CS는 수의학 학부의 보조금을 지원하는 연구에 의해 지원되었다, 출라롱콘 학술 발전 2세기 프로젝트, 수의학 줄기 세포 및 생명 공학 연구 단위, Ratchadaphiseksomphot 엔다우먼트 기금, 출라롱콘 대학, 정부 연구 기금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific Corporation, USA | 15240062 | |
| Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish | Corning® | 430166 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 12800017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 10270106 | |
| GlutaMAX™ | Thermo Fisher Scientific Corporation | 35050061 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 25200072 | |
| Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation | |||
| Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter | Merck Millipore, USA | UFC910024 | |
| Human pWPT-PDX1 plasmid | Addgene | 12256 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256 |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260 |
| Three-step Induction Protocol | |||
| Activin A Recombinant Human Protein | Merck Millipore | GF300 | |
| Beta-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific Corporation | 21985-023 | |
| Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Glucagon-like peptide (GLP)-1 | Sigma-Aldrich | G3265 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAAs) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 11140-050 | |
| Non-treated cell culture dish, 60mm | Eppendorf | 30701011 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
References
- Cho, N. H., et al. IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Danaei, G., et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants. Lancet. 378 (9785), 31-40 (2011).
- Diabetes Care.
- Health Quality Ontario. Islet transplantation: an evidence-based analysis. Ontario Health Technology Assessment Series. 3 (4), 1-45 (2003).
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