Summary
이 프로토콜은 배양 배지에서 혈소판을 방출할 수 있는 배혈구를 방출할 수 있는 배혈구를 생성할 수 있는 배혈구-발광식 CD34+ 조혈선 및 체외 분화 및 성숙을 얻는 데 관련된 모든 단계를 자세히 설명합니다. 이 절차는 거대 karyopoiesis를 통제하는 세포 및 분자 기계장치의 심층 분석에 유용합니다.
Abstract
자궁 내 의 팽창 및 발판을 연장하고 혈소판을 방출 할 수있는 거대 karyocytes로 인간의 조혈 선조의 분화는 혈소판 생물 발생의 메커니즘의 심층 연구를 할 수 있습니다. 사용 가능한 배양 프로토콜은 주로 골수 또는 코드 혈액에서 파생 된 조혈 선조에 기초하여 윤리적, 기술적, 경제적 우려를 제기합니다. 말초 혈액에서 CD34 세포를 얻기 위한 이미 유효한 프로토콜이 있는 경우에, 이 원고는 혈액 센터에서 쉽게 유효한 백혈구 필터에서 CD34+ 세포를 얻기 위한 간단하고 최적화된 프로토콜을 제안합니다. 이 세포는 8개의 혈액 기증에 대응하는 수혈 제품의 준비에 사용된 백혈구 필터에서 격리됩니다. 이러한 필터는 폐기해야 합니다. 이러한 필터에서 CD34+ 세포로 확인된 조혈 선조를 수집하는 상세한 절차가 설명되어 있습니다. 그들의 현상 진화를 토론하는 동안 proplatelet을 확장하는 성숙한 megakaryocytes를 얻는 방법 또한 상세합니다. 마지막으로, 프로토콜은 형태학적으로 그리고 기능적으로 네이티브 와 유사한 혈소판을 효율적으로 방출하기 위해 보정된 파이펫팅 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 기본 메커니즘을 해부하고 생체 내 혈소판 수율에 접근하는 과정의 다양한 단계에서 작용하는 약리학적 화합물을 평가하기위한 기초가 될 수 있습니다.
Introduction
혈액 혈소판은 메가카요포이시스(MKP)로 알려진 상수 및 미세 조정 된 생산 공정에서 유래한 특수 대형 폴리플로이드 세포, 메가 카요사이클 (MK)에서 비롯됩니다. 이 과정의 정점에는 골수 환경(사이토카인, 전사 인자, 조혈 성 틈새)과 접촉하여 거대 핵증식 경로로 커밋할 수 있는 조혈선(HP)으로 증식하고 분화할 수 있는 조혈 줄기세포가있습니다. MKP의 주요 사이토카인인 다양한 사이토카인 및 특히 혈전포이에틴(TPO)의 영향하에서; MK는 다음 성숙의 두 가지 주요 단계를 겪습니다: 내막과 경계 막의 개발 (DMS). 이 완전히 성숙한 MK는 세포질 확장을 방출할 수 있는 부비동성 혈관에 가깝게 나타나며, 혈류하에서 방출되고 이후에 기능혈소판2로리모델링될 프로플라소판이 된다. 1994년3월 TPO의 복제는 HP 분화 및 MK 성숙을 허용하는 체외 배양 기술의 개발을 가속화함으로써 MKP 연구에 활력을 불어넣습니다.
혈소판 수(증가 또는 감소) 및 기능4,5의 관점에서 혈액 혈소판에 영향을 미치는 많은 병리들이있다. 인간 HP에서 시험관에서 MKP를 다시 수면할 수 있다는 것은 이 과정의 근간을 근로하고 궁극적으로 환자의 치료 관리를 위한 분자 및 세포 기계장치의 이해를 향상시킬 수 있었습니다.
인간의 HP의 다양한 소스는 적합하다 : 코드 혈액, 골수, 말초 혈액6,7,8. 말초 혈액에서 HP를 수확하는 것은 코드 혈액 또는 골수에서 회복하는 것보다 덜 물류 및 윤리적 문제를 제기합니다. HP는 백혈구 또는 버피 코트에서 복구 할 수 있지만, 이러한 소스는 비싸고 혈액 센터에서 항상 사용할 수 없습니다. 다른 프로토콜은, 더 저렴하고 수행하기 쉬운, 이전 CD34 구동절연4에대한 필요없이 인간의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 직접 복구를 허용4,8. 그러나, 메가카요세포의 순도는 이 방법으로 만족스럽지 못하며 PBMC로부터 CD34+ 셀을 선택하여 MK로의 최적의 분화를 권장한다. 이것은 백혈구를 제거하고 따라서 불리한 면역 반응을 피하기 위하여 혈액 은행에서 일상적으로 이용되는 백혈구 감소 필터 (LRF)에서 HP 정화를 구현하기 위하여 저희를지도했습니다. 실제로, 1998 년 이후, 혈소판 농축액은 자동으로 프랑스에서 백류오데트되었습니다. 이 과정이 끝나면 LRF가 폐기되고 LRF에 유지되는 모든 셀이 파괴됩니다. 따라서 LRF의 세포는 추가 비용 없이 쉽게 사용할 수 있습니다. LRF는 백혈구 또는 버피 코트에 의해 얻은 것과 가까운 셀룰러 함량을 가지고 있으며, 특히 CD34 + HP의 구성에서 놀랍도록 매력적인 소스10을만듭니다. 인간 HP 소스로서의 LRF는 이미 세포에 온전한 기능성 용량을 제공하는 것으로입증되었다(11). 이 소스는 실험실 연구에 대 한 풍부 하 고 저렴 한 되 고의 장점이 있다. 이 맥락에서 이 문서에서는 연속적으로 설명합니다: i) LRFs의 CD34+ HP의 추출 및 선택; ii) 2단계 최적화 된 문화, 이는 발판을 방출 할 수있는 MK의 메가 카요 사이클 경로 및 성숙에 HP의 헌신을 재구성; iii) 이러한 MK로부터 혈소판을 효율적으로 방출하는 방법; 및 iv) Phenotyping MK 및 배양 혈소판에 대한 절차.
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Protocol
제어 인간 샘플은 연구가 수행 된 수혈 센터에 의해 모집 서면 통보 동의를 준 volonteer 혈액 기증자로부터 얻어졌다 (Etablissement 프랑수아 뒤 상 - 그랜드 에스트). 모든 절차는 프랑스 고등 교육 연구부에 의해 등록및 승인되었으며 AC_2015_2371 번호에 따라 등록되었습니다.기부자는 연구 목적으로 샘플을 사용하기 위해 CODHECO 번호 AC- 2008 - 562 동의 서에 승인을 받았습니다. 헬싱키 선언에 따라 인간 연구가 수행되었다.
1. LRF에서 CD34+ 셀(HP)의 추출 및 선택
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시약준비(LRF 1개)
- 여과 된 용출 버퍼 25 mL 준비 : 21.25 mL 의 인산 완충식 살린 (PBS), 산 성산 - 점막 - 덱스트로스 (ACD) 및 1.25 mL의 변형 된 태아 보빈 혈청 (FBS). 0.22 μm을 걸기하고 37 °C에서 놓습니다.
- 에틸렌디아민테트라아세산(EDTA)의 2mM로 PBS 500mL를 준비한다.
- 2개의 50mL 튜브에 25mL의 밀도 그라데이션 배지(DGM) (1.077 g/mL)를 폐기하십시오.
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LRF 백 플러싱 양식(그림 1)
참고: 이 단계에서는 멸균 튜브 용접 기가 필요하며 열가소성 튜브의 멸균 연결을 허용합니다.- 먼저 LRF를 빈 600mL 이송 백과 LRF를 튜브세트(도 1A)에연결합니다. 생물 안전 캐비닛하에서, 빈 가방에 처리된 LRF(xLRF x 25 mL)의 수에 해당하는 필터링 및 준비된 용출 버퍼의 총 부피를 주입한다. 이어서, 30mL 주사기를 사용하여 LRF를 통해 가방의 전체 내용을 부드럽게 흡인시키고, 세포를 새로운 50mL튜브(도 1B)로이송한다.
- 적혈구 퇴적물, Dextran 2%로 세포 현탁액을 반으로 희석하고 적혈구를 집계하기 위해 잘 섞는다. 실온(RT)에서 30분 동안 기다립니다.
도 1: LRF 백 플러싱 양식. (a)LRF및 (ii) LRF에 대한 이송 가방의 멸균 연결 및(ii)튜브 세트의 대표적인 방식. (B)셀 수집을 위한 주사기의 연결의 대표적인 방식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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PBMC 컬렉션
- 적혈구 퇴적에 따라 상체를 50mL 튜브로 제거하고 전송하여 PBS-EDTA 2 mM으로 채웁니다. 상체를 위에서 준비한 DGM에 부드럽게 오버레이합니다. 밀도 그라데이션의 표면 평면을 손상시키지 않고 상체가 부드럽게 흐르게 하십시오. RT에서 400 x g의 원심 분리기는 브레이크 오프 모드에서 30 분 동안.
- 일회용 이송 파이펫으로 PBMC 레이어를 수집합니다. 각 DGM 튜브에서 새로운 멸균 50 mL 튜브로 세포를 전송합니다. 각 튜브를 PBS-EDTA 2m로 채우고 200 x g에서 PBS-EDTA 2 mM50mL로 두 번 세척하여 RT에서 10 분 동안 브레이크 모드로 세척하십시오.
- 파이펫 을 끄고 50 mL PBS-EDTA 2 mM로 셀 펠릿을 풀.
참고: 야간 동안 4°C에서 교반하에서 수집된 세포를 유지하여 절차를 중지할 가능성이 있다. 이어서, 40 μm 셀 스트레이너로 서스펜션을 걸게 하여 형성된 응집체를 제거한다.
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CD34+ 셀 선택
- 실온에서 400 x g의 셀 수와 원심분리기를 10분 동안 결정합니다.
- CD34 선택 키트의 제조업체에 의해 상세한 PBS-EDTA 2 mM의 적절한 부피에서 슈퍼네티를 완전히 흡인하고 재연한다(108셀에 대한 PBS-EDTA의 300 μL). 적절한 농도에 FcR 차단 시약 및 CD34 마이크로비드를 추가합니다(108셀의 경우 50 μL).
- 4°C에서 30분 후, CD34 셀(108셀당 500 μL)의 제조사에 의해 상세한 PBS-EDTA 2 mM의 적절한 부피로 셀 서스펜션을 세척하고 재연한다.
참고: 열당 최대 2 x 109 셀의 통과를 위해 열을 정렬할 때 선택 항목이 만들어집니다. - 자석의 젖은 열 위에 샘플을 전달합니다. PBS-EDTA 2 mM3mL로 두 번 세척하고 PBS-EDTA 2 mM의 5mL로 세포를 엘루트하십시오. 샘플의 순도를 향상시키기 위해 동일한 절차에 따라 새 컬럼에서 두 번째 실행이 필요합니다.
참고: 예상 수 6.1 x 105 셀/LRF(그림2A). LRF 수치가 높을수록 시약 및 메서드를 확장합니다.
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CD34+ 셀 순도 평가
- CD34+ 선택 후 얻어진 100 μL의 알리쿼트에 추가, 인간 CD34-PE 항체의 2 μL 또는 IgG -PE (대조군)의 2 μL. 잘 섞고 4 °C에서 15 분 동안 인큐베이션하십시오.
- PBS와 원심분리기2mL을 400 x g에서 5분 동안 첨가하여 셀을 세척합니다. PBS의 200 μL에서 완전히 흡인 및 재중단.
- 그림 2A 및 토론에서와 같이 흐름 세포측정에 의해 순도를 분석한다.
참고: 90% 이상의 CD34+ 셀의 순도가 예상됩니다(그림2Bii). - CD34+ 셀을 직접 사용하거나 추가 사용을 위해 동결하십시오.
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CD34+ 셀 동결
참고: CD34+ 세포 동결은 mL당 106세포의 밀도로 수행된다.- CD34+ 세포 수 결정에 따라 다음과 같은 냉동 보존 매체를 준비합니다: (1) 60% 줄기간 + 40% FBS, (2) 40% 줄기간 + 40% FBS + 20% 디메틸 설프리산화물(DMSO) 및 4°C에서 냉각을 허용한다.
- CD34+ 셀을 실온에서 400 x g에서 5분 동안 원심분리하고 차가운 용액 1에서 펠릿을 다시 한 다음 즉시 차가운 용액 2 (v/v)에 추가합니다.
- 냉동튜브를 즉시 -80°C 냉동고에 넣고 24시간 동안 냉동튜브를 액체 질소 탱크로 옮춥시다.
2. 성숙한 프로플라틀 베어링 메가 카요세포를 생산하는 CD34+ 세포의 배양 및 분화
참고: 세포 배양프로토콜(도 3A),세포 배양 절차의 대표적인 방식은 이 섹션에 상세하다.
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CD34+ 셀 해동(필요한 경우)
- 해동 용액 준비: PBS-20% FBS의 13mL및 15분 동안 37°C에 배치합니다. 냉동튜브를 작은 얼음 결정이 하나만 갈 때까지 37°C 의 수조로 빠르게 옮기습니다. 생물학적 배양 캐비닛하에서 전체 함량을 피펫하고, 예동 해동 용액의 13mL로 천천히 전송한다.
- 셀 수와 셀 생존 가능성을 결정합니다.
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문화 프로토콜, 1단계: 0일부터 7일까지
참고: 일반적으로 배양은 20,000개의 실행 가능한 세포/cm2에대응하는 40,000개의 실행 가능한 세포/mL의 밀도에서 잘 당 1 mL의 매체를 가진 24웰 플레이트에서 만들어집니다. 확장이 계획되어 있으면 이 밀도를 존중하는 것이 중요합니다.- 성장 매체 준비 : 혈청이없는 혈토포이틱 세포 팽창 매체 (이전에 37 °C로 가열)에서 페니실린 - 연쇄상 구균 - 글루타민 (PSG) 1x, 인간 저밀도 지단백 (hLDL)을 20 μg /mL, 메가 카르요시테 팽창 1x 및 줄기 줄기 11의 사이토카인 칵테일을 추가합니다.
- 세포 파종 : 5 분 동안 실온에서 400 x g에서 해동 된 CD34 + 세포를 원심 분리합니다. 상체를 철저히 제거하고 배양 배지의 1mL에서 세포 펠릿을 재일시 중단하고 세포를 시드하는 적절한 부피를 결정하는 세포 수치 및 생존성을 수행한다.
- 원심분리기 세포는 실온에서 400 x g를 5분 동안 원심분리하고 따뜻한 성장 배지의 적절한 부피로 펠릿을 재연한다. 7 일 동안 5 % CO2로 37 °C에서 세포를 배양합니다.
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문화 프로토콜, 2단계: 7일부터 13일까지(그림 3B,13일째 대표 이미지)
참고: 일반적으로 배양은 25,000개의 실행 가능한 세포/cm²에 해당하는 50,000개의 실행 가능한 세포/mL의 밀도에서 잘 당 1 mL의 매체를 가진 24웰 플레이트에서 만들어집니다. 확장이 계획되어 있으면 이 밀도를 존중하는 것이 중요합니다.- 성숙 배지 준비: 혈청이 없는 조혈 세포 팽창 매체(이전에 는 37°C로 가열)에서 PSG 1x, hLDL 20 μg/mL, TPO at 50 ng/mL, SR1을 1 μM에 첨가한다.
- 현미경의 밑에 세포를 검사합니다. 7일째에, 세포는 너무 냉수하지 않고 우물이나 플라스크를 채우면 둥글고 균일한 외관을 표시합니다.
- 생물 안전 캐비닛 에서 15 mL 튜브에서 세포를 부드럽게 전달합니다. PBS로 우물을 씻으시면 됩니다. 그런 다음 셀 수를 결정하고 세포를 시드하는 적절한 부피를 계산할 수 있는 생존력을 결정합니다.
- 실온에서 400 x g의 세포를 5 분 동안 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 이전 단계에서 계산된 웜 미디어의 적절한 부피에서 셀을 다시 일시 중단합니다. 세포를 37°C, 6일 동안 5%CO2로 배양한다.
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13일째에 배양혈소판 방출
- 프로스타글란딘 I2(PGI 2)의 0.5 μM과 0.02 U/mL의 어피라제를 배양에 추가하고 1mL 파이펫으로 5회 연속 파이펫을 연주합니다.
참고 : 혈소판은 이제 매체로 방출됩니다.
- 프로스타글란딘 I2(PGI 2)의 0.5 μM과 0.02 U/mL의 어피라제를 배양에 추가하고 1mL 파이펫으로 5회 연속 파이펫을 연주합니다.
3. 유동 세포측정 분석(MK 페노티핑 및 배양 혈소판 수)
참고: 이 프로토콜은 선택한 배양 일에 셀의 페노티핑에 적용할 수 있습니다. 또한 배양 된 혈소판 방출의 수(도 4A,B)의측정을 허용합니다.
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MK 분석 준비
- 다음과 같이 마이크로 센심 분리기 튜브의 네 세트를 라벨 : 제어로 표시되지 않은 세포, 세포 + 5 μL CD41 - 알렉사 플루어 488, 셀 + 5 μL CD34 - PECy7, 세포 + 5 μL CD41 - 알렉사 플루어 488 + 5 μL CD34 - 5 μL CD34 - PECy7. 튜브 당 최소 1.105 세포를 사용 하 여 튜브 당 1.106 세포를 초과 하지 마십시오. 세포측정관 및 상이한 항체당 세포 현탁액의 100 μL에 추가하십시오. 4 °C에서 30 분 동안 어둠 속에서 배양하십시오.
- 그런 다음 튜브당 PBS-EDTA 2mM의 2mL을 넣고 상온에서 5분 동안 400 x g의 원심분리기를 추가합니다. 원심 분리 하는 동안, PBS-EDTA 2 mM + 7-아미노 락티노마이신-D (7AAD) (1/100)의 솔루션을 준비 하 고, 튜브 당 300 μL 용액을 허용.
- 상체를 제거하고 7AAD와 PBS-EDTA 2 mM의 300 μL에서 펠릿을 차지합니다. 30분 이내에 유동 사이토미터를 통해 샘플을 실행합니다.
참고: 흐름 세포측정에 대한 분석 전략은 그림 3C 및 토론에표시됩니다.
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배양 혈소판 분석을 위한 튜브 준비
- 다음과 같이 마이크로 센심 분리기 튜브의 네 세트를 라벨 : 제어로 표시되지 않은 세포, 세포 + 5 μL CD41 - 알렉사 플루어 488, 셀 + 20 μL CD42a - PE, 세포 + 5 μL CD41 - 알렉사 플루어 488 + 20 μL CD42a - PE. 배양에서 5회 연속 배관에 이어, 형광구의 보정수를 포함하는 세포형을 위해 튜브에서 서스펜션의 300 μL을 이송한다.
- 30 분 동안 RT에서 어둠 속에서 항체를 추가하고 배양하십시오.
- 30분 이내에 유동 사이토미터를 통해 샘플을 실행하고 5,000개의 구슬 을 통과하는 데 대한 인수를 설정합니다.
참고: 흐름 세포측정에 대한 분석 전략은 그림 4B 및 토론에서표시됩니다.
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Representative Results
LRF에서 CD34+ 셀 추출 및 선택
여기서, Peytour외. 9로부터유래된 방법은 백혈구 제거 후 혈액 은행에서 사용할 수 있는 버려진 LRFs로부터 CD34+ 세포의 추출 및 선택을 설명한다. 백플러시 절차에 따라, 보통 1.03 x 109 ± 2.45 x 108 세포/LRF(Mean±SEM; n =155)는 94.88 ± 0.10%의 생존율로 회복된다(그림2A i). CD34 양성 선택 후, 평균 615.54 x 103 ± 12.28 세포/LRF가 얻어진다(n =155)(도 2A ii). 셀 수가 300,000 미만인 경우 절차가 올바르게 수행되지 않았으며 중지해야 한다는 결론을 내릴 수 있어야 합니다. CD34 선택의 성공을 평가하기 위해, CD34+ 세포의 순도는 유동 세포측정(도2B)에의해 평가된다. 90%(91.88± 0.79%)를 상회하는 순도가 예상됩니다(그림2B). 75% 미만의 순도는 프로토콜, 특히 열의 용출을 수행하는 데 문제가 있음을 의미할 수 있습니다. 75% 순도 미만의 세포는 배양 실험을 위해 보존되지 않습니다.
그림 2: CD34+ 셀 번호/LRF 및 CD34 순도 분석. (a)(i)세포 카운터에 의한 분석, PBMC 수집 및 CD34 선택을 모두 포함하는 절차에 따라 얻어진 세포 수와 생존가능성((1.03.109 ± 2.45.10 8셀/LRF(평균 ± SEM; n=155)의 생존가능성(평균 ± SEM; n=155)=15=0.10%의 생존율(1.03 ±.10 9)이 수행된다. (ii)셀 카운터에 의한 분석은 CD34 선택(615.54 x103 ± 12.28 세포/LRF(n=155)))를 수행한다. (B)CD34 순도는 혈류 세포측정에 의해 분석된다. (i)세포는 CD34-PE 항체로 염색되었고 그들의 FSC/SSC 파라미터상에서 확인되었다. (ii)산란 신호 및 CD34 발현 해석에 기초하여 순도가 결정된다. CD34 긍정성의 사전 게이트는 CD34 마커에 대한 음의 제어를 기반으로 사용되었다. (iii)바 그래프에서 볼 수 있듯이 CD34+ 세포의 순도가 90% 이상(91.88 ± 0.79%(n=17)이 예상된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
MK 베어링 프로소틀렛의 다이엔션 및 성숙
설명된 세포 배양 절차는 2단계로 나뉩니다. 첫 번째 일은 일(D) 0에서 D7까지, 사이토카인의 조합과 화학 화합물 SR1의 첨가에 대응하여 메가카요사이클 경로로 HP 증식 및 헌신에 전념하고 있습니다. 두 번째는 D7에서 D13까지, TPO 및 SR1(도 3A)의첨가에 따라 MK 성숙 및 proplatelet 확장에 초점을 맞추고 있다. 배양, 세포 계수, 세포 생존가능성 의 결정 및 세포의 페노티핑의 품질 관리로서 D7 및 D10에서 퍼포드된다. 이러한 단계는 HP 약정, D7 및 MK 성숙, D10(개인 데이터)에 매우 중요하기 때문에 선택되었습니다. D7 및 10에서, 증식은 일상적으로 x4.16 ± 0.25 (n = 34) 및 x2.30 ± 0.16 (n = 5), 각각 86.38 ± 0.73 % (n = 34) 사이로 구성된 세포 생존가능성; 및 84.80 ± 2.67%(n=5)(그림 3B). 도 3C에서, D0에서와 같이 세포 페노티핑과 관련, 세포의 90% 이상이 CD34에 대해 양성이다. 그런 다음, CD34+ 세포는 MKP의 특정 및 초기 마커인 CD41의 유령에 의해 목격된 바와 같이 메가카요시틱 계보를 향해 커밋됩니다. 실제로, D7에서, 50.20 ± 2.90%의 세포는 CD34와 CD41(그림3Bii)에대해 양성이다. 그런 다음 MK는 성숙도를 향상시킵니다. D10에서, MK의 대다수는 CD41에 대해 부정적인 세포의 15.60 ± 4.7 ±0 % 미만, CD34+CD41+ 및 36.40 ± 12.40 % CD34-CD41+ (그림 3Biii)로성숙합니다.
그림 3: MK 베어링 프로플라톤의 다이크와 성숙. (A)세포 배양 절차의 대표적인 계획. D0에서 D7(SR1 및 사이토카인의 칵테일)으로의 증식 단계와 D7에서 D13(SR1 및 TPO)까지의 성숙 단계의 2단계 방법이 사용됩니다. D13에서 배양 된 혈소판은 5 개의 연속 파이프팅에 따라 방출 될 수 있습니다. (b)(i)D7(x4.16 ± 0.25(n=34)과 세포 생존율(86.38 ± 0.73%(n=34)에서증식 (ii)D10(x2.30 ± 0.16(n=5)과 세포 생존율(84.80 ± 2.67%(n=5)에서의 증식율.) (C)문화에서 MK의 현상진화의 유동 세포측정 분석 상태. D0에서, 95.80 ± 세포의 0.80%는 CD34 양성(n=3)이다. D7에서, 50.20 ± 세포의 2.90%는 CD34 및 CD41에 대해 양성이다. D10에서는 세포의 4.70%가 CD41에 대해 15.60 ± 미만이 부정적이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
배양 혈소판 방출, 13일차
D13에서 우물의 검사는 라운드 MK 및 proplatelet 베어링 MK(그림 4A)를보여줍니다. 배양 MK의 평균 35%가 프로플라틀렛12를확장한다. 참고, D13은 프로플라틀 연장 및 혈소판 방출을 위한 최적의 날을 나타낸다. 프로플라실을 방출할 수 있는 MK의 필수 수준에 도달하지 못하면 문화 과정을 거치면서 뭔가 잘못됐어야 하며 그 결과를 고려하지 말아야 합니다.
성숙한 MK에서 혈소판 방출을 촉진하는 정확한 메커니즘은 여전히 제대로 이해되지 않지만, 혈역학력은 필수 불가결하다는 것은 잘 알려져 있습니다. 시험관 내이러한힘을 모방하기 위해, 프로플라츠핀 베어링 MK를 함유한 현탁액은 P1000 콘으로 5회 흡입및 격퇴한 다음 유동 세포측정에 의해 분석된다. 이를 위해 보정된 형광구슬 수를 포함하는 튜브가 사용됩니다. 먼저, 튜브에 존재하는 구슬은 CD41-알렉사 플루오 488/PErcP-Cy5창(그림 4Bi,빨간색)에 문이 있습니다. 이어서, 배양된 혈소판은 종리 혈소판(도4Bii)의전방 분산(FSC) 및 측면 산란(SSC) 파라미터상에 결정된 프리게이트(혈소판 과 같은 원소)에서 시각화된다. 혈소판의 수는 CD41/CD42a양성(도 4Biii)에서결정된다. 셀 카운트는 5,000 구슬에서 이 프로토콜에서 중지되지만 공급자의 권고에 따라 다른 고정 번호가 사용될 수 있습니다. 획득한 데이터에서 5,000개의 구슬당 계산된 혈소판 수는 평균 24.01 ± 92(n=15)(도 4C)로정기적으로 집계된다. 유동 세포계에 의해 흡인된 부피를 알면 5,000개의 구슬(각 세포계에 대해 계산됨)과 총 배양량의 양을 알면, 방출된 배양 된 혈소판의 총 수의 근사치를 얻을 수 있다.
도 4: 배양 혈소판은 13일째에 방출된다. (A)D13에서 MK 발하 프로플라츠의 대표적인 광 현미경 이미지. (B)배양 된 혈소판 방출을 정량화하는 전략. (i)구슬은 CD41-알렉사 플루오 488/PErcP-Cy5 창(빨간색)에 문이 있습니다. (ii)혈소판과 같은 요소는 네이티브 혈소판(회색 점)의 FSC/SSC 파라미터에 결정된 게이트에서 시각화된다. (iii)배양 된 혈소판은 CD41/CD42 양성(보라색)에 결정된다. (C)5,000개의 구슬당 계산된 혈소판 의 수는 일상적으로 평균 24,011± 919(n=15)를 얻을 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
절차를 한눈에 볼 수 있습니다.
메서드를 더 잘 요약하고 각 단계를 이해하려면 프로토콜 단계를 단계별로 요약한 포스터가 그림 5에표시됩니다. 이 요약 시트는 문화실에 표시하고 메모 역할을 할 수 있습니다. 참고로, 실험의 성공은 제공된 표에 표시된 제품 참조만 보장됩니다.
그림 5: CD34+격리 . 프로토콜 단계를 단계별로 요약한 포스터입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 혈액 유래 HP로부터 프로플라판을 방출하고 배양 배지에서 혈소판을 방출할 수 있는 MK를 생산하는 방법을 설명합니다. HP는 혈액 은행의 부산물인 LRF로부터 수득되며, 세포 혈액 제품에서 백혈구를 오염시키는 것을 제거하고 불리한 반응을 피하는 데 사용됩니다. 이 방법은 비교적 간단하지만 몇 가지 점은 특별한주의를 기울일 자격이 있습니다.
밀도 그라데이션 배지(Step 1.3.1)에 대한 세포 현탁액의 침착은 혼합물(적색 함량)을 피하기 위해 부드럽게 수행되어야 한다. 이 단계가 신중하게 수행되지 않으면 이 시점에서 프로토콜을 중지해야 합니다. 마찬가지로, 또한 1.3.1 단계에서 브레이크는 분수를 혼합하지 않도록 오프 모드에 있어야합니다. 그렇지 않은 경우 HP 선택을 중단해야 합니다. 프로토콜에 표시된 바와 같이 섹션 1.4에서는 PBMC 수집 후 프로시저를 중단할 수 있습니다. 이 경우, 세포는 4°C에서 하룻밤 사이에 교반하에 유지될 수 있다. 그런 다음 40 μm 셀 스트레이너를 사용하여 형성된 응집체를 제거하여 후속 CD34 선택에 영향을 미칠 수 있습니다. 참고로, 절차를 중단하는 것은 CD34+ 세포의 수율과 순도에 영향을 미치지 않습니다. CD34 선택의 끝에서, 순도는 이전 연구에서, MK의 분화 및 성숙이 이 순도12 (도 2)이하로 가난했기 때문에 세포를 종자하기 위해 75 % 이상이어야한다.
특별한주의는 세포의 생존에 영향을 미치지 않도록 신속하게 수행해야 CD34+ 세포의 해동에 지불해야한다. 또한 세럼의 흔적을 남기지 않도록 세정 단계를 신중하게 수행해야합니다. 세포 파종 밀도는 MKP 경로 및 MK 성숙에 대한 최적의 CD34 헌신을 위해 엄격하게 선택되었기 때문에 존중되어야합니다(그림 3A).
MK의 분화 및 성숙을 따르기 위해 세포 표현 프로토콜이 제안된다. 이 프로토콜은 비교적 기본적이지만, 사이토미터에서 신뢰할 수 있는 설정을 보장하기 위해 매일 분석할 수 있는 라벨이 없는 단일 라벨링 튜브와 단일 라벨링 튜브를 모두 갖도록 하는 것이 중요합니다. 문화가 원활하게 실행되도록 하기 위해 절차에 따라 증식 정보를 수집하는 것이 중요합니다. D7에서 평균 증식은 2~4배13사이이다. 이 증식은 각 LRF가 8명의 기증자에게서 세포를 포함하기 때문에 실험 사이 거의 다릅니다. 변이를 더욱 매끄럽게 하기 위해 4~8개의 LRF를 병렬로 획득한 세포를 결합할 수 있다.
가벼운 현미경검사법에 의한 세포의 형태를 볼 수 있지만 온도 변화에 민감하기 때문에 세포를 매일 관찰해서는 안 됩니다. 인큐베이터에서 세포를 제거할 때 프로플라시트가 파손되지 않도록 느린 움직임을 해야 합니다.
혈소판 방출에 관해서는, 5 배 연속 파이펫이 필요합니다. 덜 하는 것은 최적의 혈소판 방출을 보장 하지 않습니다 하 고 더 많은 일을 그들의 기능에 해로운12. 이 단계에서 가장 중요한 측면은 정밀하고 규칙적인 움직임을 사용하여 혈소판 방출14,15,16에필요한 정규 흐름을 생성하는 것이다. 따라서 5회 연속 파이펫팅 방법은 문헌에 기재된 수율에 따라 만족스러운 성능 결과로 간단하고 쉽게 수행할 수 있다. 방출된 혈소판의 수는 도 4B에도시된 유동 세포측정 분석의 전략을 사용하여 섹션 3.3에서 언급된 바와 같이 결정될 수 있다. 방출 된 혈소판의 품질은 울트라 구조 (형태, 크기, 과립 함량) 및 기능 (hemostasis)의 관점에서 새크라멘토 등에서 잘 문서화되어 있으며, 이러한 배양 된 혈소판은 네이티브 혈소판(13)과매우 유사하다는 것을 입증합니다.
여기에 설명된 프로토콜은 소량 배양에 특히 적합하지만 대규모 배양에는 적용되지 않습니다. 따라서 소분자, 작용제 또는 길항제를 첨가하여 혈소판 생산을 관장하는 분자 및 세포 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 혈소판 생물 발생의 연구를 위한 최적의 방법입니다. 또한, MK 약정, MK 성숙 및 혈소판 생산을 조절하는 메커니즘을 더욱 탐구하기 위해 CRISPR-Cas9 게놈 편집 방법을 사용하여 CD34+ HP를 유전자 조작할 수 있게 되었습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 ANR (기관 국가 드 라 Recherche) 그랜트 ANR- 17-CE14-0001-1에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anti-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anti-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anti-CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount Tubes | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, human | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.OR | Or equivalent material |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | Or equivalent material |
| Cryotubes | Dutscher | 55002 | Or equivalent material |
| Dextran from leuconostoc spp | Sigma | 31392-50g | Or equivalent material |
| DMSO Hybri-max | Sigma | D2650 | |
| EDTA 0.5 M | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1,5 mL | Dutscher | 616201 | Or equivalent material |
| Filtration unit Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Flow Cytometer | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human LDL | Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| Inserts | Fenwal | R4R1401 | Or equivalent material |
| Laminar flow hood | Holten | NA | Archived product |
| LS Columms | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | Or equivalent material |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| Poches de transferts 600ml | Macopharma | VSE4001XA | |
| Pre-Separation Filters (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Stemcell technologies | #72344 | |
| StemSpan Expansion Supplement (100x) | Stemcell technologies | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µm PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | Thermos scientific | SH3007103 | |
| Syringues 30 mL | Terumo | SS*30ESE1 | Or equivalent material |
| Syringe filters Millex 0,22µM PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| Tubes 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | Or equivalent material |
| Tubes 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | Or equivalent material |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | Or equivalent material |
References
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