Summary
Este protocolo descreve como fazer uma simples câmara de observação de comportamento drosophila adulto, e como tirar fotografias/vídeos de alta definição da morfologia ou comportamento de diferentes tipos de moscas de frutas na câmara de observação através de métodos relativamente simples e acessíveis.
Abstract
Drosophila melanogaster é um modelo muito poderoso em pesquisa biológica, mas um modelo ruim para fotografia ou videografia. Este artigo descreve um método simples, mas eficaz, para observar e documentar o comportamento ou morfologia das moscas. Moscas foram colocadas em uma câmara de observação translúcida c.a. Ø15 x 5mm (sem comida dentro) ou Ø15 x 12 mm (com um pedaço de alimento de 8 mm de altura dentro). Depois de cobrir com um filtro de vídeo ultravioleta (UV)/claro com transmissão de luz alta, a câmara foi colocada sob um microscópio estéreo de zoom de 5-50x, e mini luzes de vídeo de diodo emissor de luz (LED) foram colocadas em ambos os lados do microscópio para iluminar a câmara para obter luz uniforme, macia, brilhante e quase livre de sombras. Em seguida, uma câmera digital compacta com zoom óptico de 3-5x, que pode gravar vídeo de alta definição ou de maior resolução de 1080 P (a uma taxa de quadros de ≥30 fps), foi conectada à ocular do microscópio através de um suporte, e fotografias ou vídeos foram tirados pela ocular. Ajustando o botão de zoom do microscópio estéreo de zoom, foi muito fácil rastrear as moscas e tirar imagens panorâmicas ou detalhadas de close-up conforme necessário, enquanto a câmera gravava tudo sob o microscópio. Como as moscas podem ficar em qualquer posição na câmara, elas podem ser observadas e registradas de todas as direções. As fotografias ou vídeos feitos são de boa qualidade de imagem. Este método pode ser usado tanto para pesquisa científica quanto para ensino.
Introduction
Drosophila melanogaster é um modelo de destaque em pesquisa biológica; no entanto, é um modelo ruim para fotografia ou videografia, pois é muito pequeno para uma câmera ou uma filmadora e muito grande para um microscópio composto1. Apesar de excelentes pesquisas descritas na literatura, a maioria dos estudos apenas forneceu imagens borradas e não claras, em vez de fotografias claras e nítidas com detalhes claros que ilustram o comportamento da mosca sendo descrito. Além disso, embora os comportamentos de mosca tenham sido extensivamente estudados (por exemplo, namoro e luta), a maioria desses artigos tem usado ilustrações para explicar suas pesquisas aos leitores.
Este artigo descreve uma abordagem simples e econômica. Usando este método, não só os diversos comportamentos de Drosophila podem ser observados, mas também todos os detalhes que podem ser observados sob um microscópio de zoom estéreo podem ser gravados de forma clara e acentuada. Claro, este método também pode ser usado para registrar a morfologia das moscas, pois quando elas entram em um estado de sono ou semissono, o modelo estacionário permite que o usuário tire uma fotografia ou uma pilha de fotografias com diferentes planos focais para obter uma ampla profundidade de foto de campo. Esses métodos podem ser realizados sem tecnologia complicada e equipamentos caros ou até mesmo excelentes habilidades manuais.
O componente de vídeo deste artigo mostra vídeos de vários comportamentos típicos de moscas. O objetivo de mostrar esses vídeos é duplo: um deles é deixar o público saber o que pode ser capturado e apresentar a qualidade da imagem obtida usando este método; o outro é deixar que novos alunos que se interessam por Drosophila, mas até agora não tiveram a oportunidade de realmente observar o comportamento das moscas entender o comportamento das moscas (como namoro, luta) através desses vídeos claros em vez de ilustrações ou imagens borradas.
Vídeo suplementar: Fruit Fly Behavior: Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
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Protocol
1. Construção do sistema de observação/documentação
NOTA: Os materiais necessários para construir o sistema de observação/documentação do comportamento da mosca são mostrados na Figura 1, e o sistema concluído é mostrado na Figura 2. O protocolo para construir o sistema e como usá-lo são descritos abaixo.
- Faça um fly behavior observation chamber (FBOC).
- Obtenha um recipiente pequeno e translúcido (não transparente) para fazer um FBOC de diâmetro de tamanho (Ø) 15 mm x 20 mm. Use uma tampa de garrafa plástica translúcida de tamanho ~Ø17 mm x 22 mm para fazer um FBOC, ou corte uma seção de ~17 mm da extremidade grossa de uma ponta de pipeta de 5 mL para fazer um FBOC.
- Despeje 1% de ágar no FBOC para ajustar sua profundidade. Se o alimento precisar ser colocado no FBOC (veja o método de preparo do alimento), despeje o ágar para obter uma profundidade de 12 mm. Se a comida não precisar ser colocada no FBOC, despeje o ágar a uma profundidade de 5 mm para rastrear o paradeiro das moscas de frutas com mais facilidade.
- Se usar uma ponta de pipeta para fazer um FBOC, coloque a seção de ponta de pipeta de corte em uma placa de Ø35 mm ou uma placa de Petri de Ø60 mm. Despeje o gel de 1% de ágar na placa de Petri até uma espessura de ~5 mm, espere o ágar se solidificar e sele o fundo do FBOC. Em seguida, despeje o gel de ágar no FBOC até a espessura desejada.
- Faça uma base FBOC furando um furo de ~10 mm de profundidade no centro de um pedaço de uma folha de espuma de etilamina de 60 mm x 60 mm x 15 mm com o mesmo diâmetro do FBOC. Insira o FBOC no orifício.
NOTA: A base FBOC mantém o FBOC estável e impede que ele tombe e facilite o movimento do FBOC para rastrear as moscas durante a observação e a videografia. - Faça comida de mosca, se necessário, com levedura média2,dieta artificial3, ou sacarose pura/glicose (use 1% de ágar como agente de gelagem), dependendo da finalidade da observação.
- Para determinar visualmente se as moscas estão se alimentando e aumentar o contraste entre moscas e seu ambiente, adicione corantes alimentares (ver a Tabela de Materiais) ao alimento até uma concentração final de 12,5 mg/100mL.
NOTA: Os abdômens das moscas mudam de cor imediatamente após a alimentação. - Despeje a comida preparada em uma placa de Petri a uma altura de 8 mm. Após a solidificação, use uma lâmina de barbear para cortar um pedaço de alimento de tamanho 8 mm x 4 mm x 8 mm, e coloque-o em um pedaço de plástico (como o invólucro de doces).
- Corte a comida em uma pirâmide quadrangular ou pirâmide de frustum quadrangular, como mostrado na Figura 3,para permitir a observação e o registro do comportamento da mosca de diferentes ângulos à medida que as moscas pousam na comida aleatoriamente. Use o plástico sob o alimento para evitar que o corante no alimento se difunda no ágar no FBOC. Use pinças para colocar a comida no centro do FBOC.
- Para determinar visualmente se as moscas estão se alimentando e aumentar o contraste entre moscas e seu ambiente, adicione corantes alimentares (ver a Tabela de Materiais) ao alimento até uma concentração final de 12,5 mg/100mL.
- Em algumas observações comportamentais, certifique-se de que as moscas estão famintas com antecedência. Despeje 1% de gel de ágar (1 g de água de ágar/100 mL, 600 μL de ácido propínico) em uma garrafa vazia limpa até uma espessura de 1-2 cm, e coloque em temperatura ambiente por 1-2 h. Transfira moscas para a garrafa e coloque a 25 °C por ≥36 h.
NOTA: As moscas podem absorver água do gel de ágar, portanto não há necessidade de adicionar água de tempos em tempos4,5. - Transfira uma ou mais moscas para o FBOC usando um aspirador. Se usar um aspirador é difícil, esfriar e inativar as moscas em gelo esmagado, classifique-as em uma bolsa de gelo e transfira-as para o FBOC como descrito anteriormente6.
NOTA: O uso do congelamento facilita muito a transferência de moscas; as moscas geladas podem recuperar a consciência dentro de 1 min, muito mais rápido do que aquelas anestesiadas com CO2. Embora o resfriamento possa ter efeitos prejudiciais sobre o comportamento das moscas, por exemplo, aumento da latência de cópula de moscas de 5 min7 a 40 min8, isso não muda o comportamento da mosca (como o comportamento de namoro). Assim, o método de refrigeração pode ser usado para transferir moscas para observação geral (como experimentos de ensino) e videografia. No entanto, se as observações forem usadas em um relatório científico, é fortemente recomendável não expor as moscas a nenhuma anestesia. - Depois de transferir as moscas para o FBOC, cubra-a com um filtro UV/claro de 30-40 mm para que a câmera forme um complexo FBOC(Figura 4). Coloque o complexo FBOC sob o estereótipo para observação.
NOTA: Para obter imagens claras e nítidas, recomenda-se fortemente o uso de filtro UV/claro de alta qualidade com alta transmissão de luz (>98%) e sinalização reduzida. Consulte algumas sugestões descritas anteriormente9,10; embora não haja necessidade de comprar filtros caros, evite cobrir o FBOC com vidro, como a tampa de uma placa de Petri. - Ilumine o FBOC. Monte luzes de vídeo mini LED para piscar suportes de suporte de sapato quente e colocá-los nos lados esquerdo e direito do FBOC (Figura 2). Acenda as luzes led e coloque o brilho em 100% e a temperatura da cor para 5000-5600 K.
NOTA: As mini luzes de vídeo LED com luz escurecida, temperatura de cor de 5600 K podem fornecer iluminação uniforme, brilhante, quase sem sombra. Usando a fonte de luz superior que vem com o microscópio estéreo, o iluminador LED Ring Light ou o iluminador de fibra óptica não produziram resultados satisfatórios. É melhor usar fonte de alimentação contínua (transformadores) para luzes de vídeo LED. - Observação e videografia do comportamento da mosca
- Acenda as luzes de vídeo LED e ajuste o microscópio de zoom estéreo até que a borda do FBOC possa ser claramente vista a olho nu. Mova o FBOC para o centro do campo de visão.
- Conecte o grampo do adaptador de câmera digital do telescópio universal a uma ocular do microscópio estéreo e, em seguida, conecte uma câmera digital compacta ao adaptador com segurança, girando alternadamente o parafuso de fixação da câmera e o parafuso de fixação da câmera(Figura 2).
- Ligue a câmera digital e gire os botões de ajuste fino horizontal/vertical até que a borda do FBOC apareça claramente no centro do campo de visão circular brilhante na tela LCD da câmera. Gire o mostrador de modo para o modo auto-prioridade de abertura, pressione o foco no seletor multi, escolha o macro close-upe pressione o botão OK. Mova o interruptor de zoom da extremidade grande angular para a extremidade telefoto, e amplie na imagem circular até que sua parte central preencha a tela LCD completa. Pressione o botão de gravação do filme para iniciar a gravação (pressione o botão novamente para terminar a gravação).
NOTA: Se a imagem estiver muito escura ou muito brilhante, pressione a lateral do mostrador de controle perto do ícone de compensação de exposição(Figura 1),e gire o mostrador para alterar o valor de exposição (EV) sugerido pela câmera para alcançar o efeito desejado. EVs positivos tornam a imagem mais brilhante, e EVs negativos tornam a imagem mais escura. A imagem deve ser uniforme, brilhante, sem vinheta. - Gire o botão de foco do microscópio até que as moscas do FBOC estejam claramente visíveis. Escolha o comportamento de tempo de voo para observação ou gravação de vídeo. Gire o botão de zoom para ampliar e sair para obter a ampliação desejada para observação ou gravação de vídeo.
NOTA: Este método de tirar imagens sob o microscópio através das oculares é aplicável a qualquer microscópio com oculares. Para tirar fotos de resultados experimentais, use uma câmera que pode filmar em formato RAW, pois os arquivos de imagem RAW são preferíveis aos JPEGs. Use a tela LCD da câmera como um visor para observar o comportamento das moscas de frutas e garantir que o microscópio de zoom estéreo tenha pelo menos 5-50x de zoom.
2. Protocolos de observação e videografia do comportamento da mosca
- Preparando as moscas
- Cultura as moscas em meio de fubá a 25 °C com 60% de umidade e um ciclo claro/escuro de 12 horas. Recolher moscas dentro de 6 dias após a eclosão para observação (exceto namoro e comportamento de luta).
NOTA: Aqui, o meio foi composto por 1000 mL de água, 105 g de farinha de fubá, 75 g de sacarose, 15 g de ágar, 40 g de fermento em pó, 28 mL de parabeno de metila de 10% (w/v em 95% de etanol) e 6,25 mL de ácido propício.
- Cultura as moscas em meio de fubá a 25 °C com 60% de umidade e um ciclo claro/escuro de 12 horas. Recolher moscas dentro de 6 dias após a eclosão para observação (exceto namoro e comportamento de luta).
- Recuperando a consciência da anestesia ao esfriar
- Esfrie as moscas como descrito anteriormente. 6 Transfira o Drosophila da caixa de gelo para o FBOC usando pinças. Registo do processo da mosca da inatividade à postura normal em vídeo.
- Voar sono, alimentação, excreção e comportamento social
- A fome voa por 36 h. Transfira 4-6 moscas de frutas para o FBOC com comida manchada. Observe e grave o comportamento da mosca em vídeo.
NOTA: Moscas que permanecem imóveis por mais de 5 minutos exibem comportamento sono11. Drosophila pode dormir em alimentos ou em uma parede FBOC vertical (o corpo é perpendicular à parede da câmara de observação). Embora o corpo não se mova enquanto dorme, o abdômen pode ser visto como ondulante. O comportamento alimentar se manifesta quando a mosca estende sua proboscis, move-se sobre a comida enquanto amamenta constantemente, e seu abdômen fica azul. Durante a alimentação em grupo ou outras atividades, moscas frutíferas esticam seus pés para tocar os corpos de outras moscas frutíferas de forma amigável. Isso é um comportamento social.
- A fome voa por 36 h. Transfira 4-6 moscas de frutas para o FBOC com comida manchada. Observe e grave o comportamento da mosca em vídeo.
- Comportamento de preparação de moscas
- Esfrie as moscas como descrito6. Jogue as moscas congeladas em pó de ágar, e role para cobri-las com pó de ágar. Transfira as moscas para o FBOC. Observe e grave o comportamento de preparação.
NOTA: Quando a mosca-das-frutas recupera a consciência do congelamento, ela rapidamente se livrará do pó de ágar de seu corpo e limpará cada parte de seu corpo com suas pernas12,13. O comportamento de aliciamento também pode ser visto durante a alimentação, namoro e outros comportamentos.
- Esfrie as moscas como descrito6. Jogue as moscas congeladas em pó de ágar, e role para cobri-las com pó de ágar. Transfira as moscas para o FBOC. Observe e grave o comportamento de preparação.
- Voar namoro e comportamento de luta
- Coletar moscas femininas e masculinas como descrito anteriormente7. Para observar o comportamento de namoro de moscas, coloque uma mosca fêmea e um macho voam para o FBOC para observar e registrar 6 comportamentos de namoro (bem sucedidos e fracassados).
- Para observar o comportamento de luta das moscas, coloque dois machos no FBOC. Observe e regise seu comportamento de empurrar e empurrar uns aos outros.
- Comportamento de criação de ovos de mosca
- Prepare moscas fêmeas como descrito anteriormente5. Transfira 4 moscas fêmeas para fboc com comida.
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Representative Results
Fotografe através de um filtro UV para imagens claras e nítidas
Realize um experimento simples para observar a diferença entre um filtro UV e um vidro comum no laboratório. Pegue um frasco de cultura de mosca, remova a rolha, coloque-a sob um microscópio de dissecação estéreo e cubra-o (alternadamente) com um filtro UV e uma tampa de placa de Petri. As fotografias tiradas nesses dois casos são mostradas na Figura 5. A fotografia tirada através do filtro UV é clara e nítida, muito semelhante à fotografia tirada quando o frasco de cultura não é coberto. A qualidade da foto tirada através do vidro da placa de Petri é muito ruim mesmo quando o foco é preciso. O vidro comum (ou folha de acrílico) não é revestido, a transmissão mais alta é de 92%14,15, e o filtro claro/UV com revestimento multicamadas tem uma transmissão de luz de 98-99%.
Assim, a imagem filmada através de vidro comum (ou folha de acrílico) não é tão clara quanto a imagem filmada através do filtro claro/UV. Outro defeito importante do vidro comum, como a tampa de um prato de laboratório, é sua superfície irregular. Pode ser visto na Figura 5 que devido à irregularidade da superfície de vidro, parte da foto é clara e parte borrada. Portanto, filtros claros/UV devem ser usados em vez de usar folhas de vidro ou acrílico comuns para cobrir o FBOC. O filtro UV usado neste protocolo (Figura 5) era barato (~$10), sem marca, e sua transmissão de luz desconhecida. Em outras palavras, mesmo que seja um filtro UV barato, a imagem capturada através dele pode ser muito mais clara e nítida do que a capturada através de vidro comum.
Boa qualidade sem equipamentos caros
O comportamento da mosca foi registrado com uma câmera somente JPEG com um sensor consideravelmente menor (1/2.3'). Resolução de vídeo é de 1920 x 1080 pixels (a 30 frames per second, fps); a qualidade do filme é satisfatória. Um filtro UV barato foi usado para cobrir o FBOC, e o microscópio de zoom estéreo não foibranded. O custo da luz LED (por exemplo, LED-p120 GODOX) foi de aproximadamente US$ 70 para dois pacotes (veja a Tabela de Materiais). Em outras palavras, o equipamento utilizado era muito econômico; no entanto, a qualidade do vídeo é boa, mostrando claramente o panorama de alguns comportamentos das moscas, como namoro e briga, e os detalhes de alguns comportamentos, como oviposition e excreção. Em outras palavras, mesmo que seja um filtro UV barato, a imagem capturada através dele pode ser mais clara e nítida do que a capturada através de vidro comum.
Figura 6 é uma fotografia tirada da gravação de vídeo mostrando os detalhes de cada parte do corpo da mosca. Obviamente, o uso de uma câmera e um microscópio estéreo com melhor qualidade de imagem renderá vídeos ou fotografias com maior qualidade de imagem. Se a câmera tem uma taxa de quadros de ≥60 fps com boa qualidade de imagem, muito mais detalhes podem ser capturados em maior clareza no comportamento com muita ação ou movimento. Outra vantagem deste sistema é que, como a câmera está conectada a um microscópio estéreo de zoom, é muito fácil filmar de fotos panorâmicas a close-up usando o sistema de zoom.
Gravação completa
Observação e videografia são geralmente feitas a partir do topo; no entanto, como as moscas podem permanecer em qualquer parte do FBOC: a parede vertical do FBOC, a superfície de alimentos inclinadas e até mesmo o filtro UV (com o abdômen voltado para cima), e seus corpos são perpendiculares a essas superfícies, seu comportamento pode ser observado e documentado a partir de múltiplos ângulos de visão. Por exemplo, pode ser claramente visto na Figura 7 que a mosca fêmea está constantemente esfregando o ovipositor com suas pernas traseiras durante o processo de colocação de ovos. Este detalhe do comportamento de colocação de ovos não pode ser visto claramente do lado5.
Figura 1: Equipamentos fotográficos e outros acessórios utilizados para construir o sistema de observação e documentação do comportamento da mosca. Abreviação: LED = diodo emissor de luz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Sistema deobservação e gravação de comportamento drosophila. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ilustração do tamanho e forma dos alimentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Ilustração do complexo FBOC. Abreviação: FBOC = câmara de observação de comportamento de mosca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Comparação entre as fotografias tiradas através do filtro UV, através da tampa da placa de Petri de laboratório, e tirada diretamente sem qualquer cobertura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Uma imagem tirada da gravação de vídeo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Uma perspectiva incomum para observar o comportamento de colocação de ovos de moscas de frutas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A luz está no centro da fotografia e da videografia e é o fator decisivo para a obtenção de imagens de alta qualidade16. Aqui, duas luzes de vídeo LED com brilho ajustável e temperatura de cor foram usadas como iluminadores, e um material translúcido foi selecionado para fazer o FBOC. Os painéis de luz LED em ambos os lados forneceram brilho suficiente, e o material translúcido suavizou e espalhou luz, eventualmente produzindo luz uniforme, macia e brilhante para iluminar as moscas no FBOC, sem produzir áreas expusedas ou subexpostas desagradáveis. A iluminação ideal pode ser alcançada sem equipamentos de iluminação sofisticados e caros. Aqui, o filtro UV/claro utilizado tinha transmissão de luz muito alta e baixo reflexo para cobrir o FBOC, e a perda de luz é muito pequena. Essas medidas garantiram imagens claras e nítidas.
Conectamos uma câmera digital à ocular do microscópio de zoom estéreo através de um suporte e tiramos fotos ou vídeos através da ocular. Todas as imagens que poderiam ser observadas sob o microscópio poderiam ser gravadas. Ao girar o botão de foco e levantar o microscópio, foi muito fácil rastrear as moscas no espaço estreito do FBOC e ampliar ou sair conforme necessário para registrar detalhes locais ou dinâmica geral, o que não pode ser alcançado usando um gravador de vídeo ou câmera para videografia direta do FBOC. Ao mesmo tempo, a câmera pode ser selecionada de acordo com os requisitos de qualidade da imagem. Na verdade, uma câmera digital pode ser conectada a qualquer microscópio com uma ocular através de um suporte. O autor correspondente deste artigo tem registrado com sucesso resultados experimentais desta forma por muitos anos.
A câmera digital compacta usada para registrar o comportamento de moscas de frutas deve ter zoom óptico de 3-5x (zoom digital não deve ser usado para gravação de vídeo). A extremidade telefoto dessas câmeras (~100 mm de distância focal) é usada para ampliar a imagem no centro do campo de visão para toda a tela, de modo que a imagem final obtida é uma imagem agradável sem vinheta ao seu redor. Se uma câmera tiver apenas uma lente de foco fixa grande angular, ou uma lente de zoom óptico acima de 7x, haverá vinhetas mais ou menos desagradáveis ao redor da imagem capturada. Nem câmeras de reflexo de lente única digital nem filmadoras são adequadas para o método descrito neste artigo. A câmera deve ser capaz de gravar vídeo com uma resolução de pelo menos 1080 P a 30 fps. Se a câmera não puder ser alimentada por energia contínua, mais baterias sobressalentes devem ser compradas para substituição a qualquer momento.
As moscas podem ficar em um avião em qualquer ângulo, seus corpos são perpendiculares a esta superfície. Mesmo dormindo, eles podem ficar imóveis na parede da garrafa de cultura vertical. Portanto, ao fotografar de cima para baixo, desde que lhes forneçamos um avião em um ângulo apropriado, o comportamento da mosca-das-frutas pode ser observado e fotografado em todas as direções, sem a necessidade de filmar seu comportamento a partir do lado de um FBOC. Esta é a razão para o projeto da pirâmide alimentar quadrangular.
No entanto, neste sistema, a câmera não pode se concentrar e travar as moscas e atirar automaticamente à medida que se movem através do quadro. O experimentador deve sempre usar as funções de foco e zoom do microscópio estéreo para rastrear as moscas para fotografar. É por essa razão que o diâmetro do FBOC deve ser pequeno, e a profundidade do FBOC deve ser rasa, para que o experimentador possa rastrear rapidamente as moscas das frutas em movimento. Alguns comportamentos podem precisar ser registrados no escuro17,18. Este artigo não discute esses aspectos do comportamento da mosca.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Professor Li Xiangdong e ao fotógrafo Sr. Cheng Jing por discussões e sugestões úteis. Este trabalho foi apoiado pelo Projeto Exploratório (20200101) do Centro experimental de demonstração de ensino de Ciências da Vida da Universidade Agrícola da China.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| compact camera, Nikon P310 | Nikon | 3-5x optical zoom, cam record 1080 P HD video | |
| ethylamine foam | 60 mm x 60 mm x 15 mm | ||
| Food Blue No 1 | CAS 3844-45-9 | ||
| mini LED lights and transformer | GODOX | LED-P120 | have 5000-5600 K color temperature |
| small container (e.g. bottle cap) | about Ø 15 mm x 20 mm | ||
| UV / Clear filter | high-quality UV/Clear filter with high transmittance, 30-40 mm | ||
| zoom stereo microscope | 5-50x zoom |
References
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