Summary
췌장의 생체 내 고해상도 이미징은 췌장 내 생체 내 이미징 창으로 촉진되었다.
Abstract
살아있는 작은 동물 모형에 있는 췌장의 생체 내 세포 분해능 화상 진찰은 기술적으로 도전적이고 있습니다. 복부 화상 진찰 창이 있는 최근 인트라바이탈 화상 진찰 연구 결과는 생체내 복부 기관에 있는 세포 역학의 시각화를 가능하게 했습니다. 그러나, 생리적 운동(예를 들어, 연동성 및 호흡)에 의해 쉽게 영향을 받을 수 있는 마우스 췌장의 연약한 시트 와 같은 아키텍처로 인해, 마우스 췌장에 있는 섬 또는 암세포를 식별, 추적 및 정량화하기 위해 세포 수준에서 몇 주 동안 생체 내 이미징에서 안정화된 세로를 수행하기가 어려웠다. 본명, 췌장 미세구조의 경도 경과 내인스탈 이미징을 위해 췌장을 창자로부터 공간적으로 분리할 수 있는 새로운 지지기반, 통합췌장 내 인트라바탈 이미징 창을 이식하는 방법을 설명한다. 이미징 창을 가진 생체 내 생체 내 이미징은 안정적인 시각화를 가능하게 하여 3주 동안 의 섬 추적과 미세 구조의 고해상도 3차원 이미징을 허용하며, 여기서 입증된 바와 같이 치열토성 췌장암 모델에서 입증된다. 우리의 방법을 사용하여, 추가 인트라바이탈 이미징 연구는 세포 수준에서 췌장을 포함하는 각종 질병의 병생리학을 해명할 수 있습니다.
Introduction
췌장은 소화관에 있는 외분 염 기능 및 혈 류로 호르몬을 분비의 내 분 비 기능을 가진 복 기관. 췌장의 고해상도 세포 화상 진찰은 췌장염, 췌장암 및 당뇨병 mellitus1을포함하여 췌장을 관련시키는 각종 질병의 병리생리학을 드러낼 수 있었습니다. 컴퓨터 단층 촬영, 자기 분해영상 및 초음파와 같은 기존의 진단 영상 도구는 임상 분야1,2에서널리 이용된다. 그러나, 이러한 이미징 양식은 구조적 또는 해부학적 변화만을 시각화하는 것으로 제한되며, 세포 또는 분자 수준에서의 변화는 결정될 수 없다. 인간내 당뇨병 또는 췌장암의 분자 변화가 진단3,4전에 10년 이상 시작할 수 있다는 점을 감안할 때, 잠기 기간 동안 분자 전환에서 췌장질환의 검출은 조기 진단과 적시개입을 제공할 가능성이 있다. 따라서, 해상도의 한계를 극복하고 기능에 대한 귀중한 통찰력을 제공하는 이미징은 당뇨병의 진행 중에 췌장암의 조기 진단 또는 섬 변경의 고급 식별을 제공함으로써 현저하게 주의를 얻을 것이다5.
특히 섬, 핵 이미징, 생물 발광 이미징 및 광학 일관성 단층 촬영과 함께 비침습적 섬 이미징 기술6으로제안되었다. 그러나 이러한 방법의 해상도는 수십 에서 수백 마이크로미터에 이르는 일반적인 값으로 실질적으로 낮으며, 섬내 셀룰러 수준에서 변화를 감지하는 제한된 기능을 제공합니다. 다른 한편으로는, 이전 의 고해상도 연구는 전 생체7,8 (예를 들어, 췌장의 슬라이스 또는 소화), 비 생리9 (예를 들어, 췌장의 외부화) 및 이성피 조건10,11,12 (예를 들어, 신장 캡슐 아래 이식, 간 내, 및 안과 의 안팎의 방안하에 이식) 및 안과 의 안하에 있는 안팎의 해석하에 수행되었다. 고해상도 이미징의 생체 내,생리학적 및 직교 모델을 확립할 수 있다면 췌장 섬 조사를 위한 중요한 플랫폼이 될 것이다.
살아있는 동물의 현미경 해상도 수준에서 병리학을 드러내는 인트라바이탈 이미징은 최근 큰 관심을 받고 있다13. 생체 내 이미징 방법 중, 마우스의 복부에 창을 이식하는 복부 이미징창(14)의개발은 새로운 발견(즉, 초기 간 전이의 사전 미세메타증 단계및 장 상피16)에서줄기 세포 유지 장치의 메커니즘을 발견할 수 있게 하였다. 복부 화상 진찰 창은 귀중한 결과를 제공하지만, 췌장에 대한이 창의 응용 프로그램과 췌장을 포함하는 질병에 기초한 그 결과 중요한 화상 진찰 연구는 광범위하게 조사되지 않았습니다.
인간 췌장의 잘 정의된 고체 장기 특성과는 달리, 마우스의 췌장은 확산분포된 연조직형구조(17)이다. 따라서 연동 및 호흡을 포함한 생리적 움직임에 끊임없이 영향을 받습니다. 췌장에 대한 복부 이미징 창의 적용에 대한 이전 연구는 배회가 배변(18)에의해 유도된 운동 유물로 인해 발생한다는 것을 입증했다. 심한 흐림은 마이크로 스케일 구조의 시각화 및 식별을 방해하는 결과 평균 이미지에서 관찰되었다.
본명, 췌장과 관련된 질병의 종방향 세포 수준 사건을 조사하기 위해19,20의 인포탈 현미경 검사법과 결합된 새로운 지지 기체 통합 췌장 내 인트라바이탈 이미징 창의 사용을 설명한다. 이전 연구18의방법론에 대한 상세한 설명 외에도 췌장과 관련된 다양한 질병에 대한 췌장 이미징 창의 확장된 적용이 이 논문에서 해결될 것이다. 이 프로토콜에서는 맞춤형 비디오 속도 레이저 스캐닝 공초점 현미경 시스템을 중요한 현미경 시스템으로 활용했습니다. 4개의 레이저 모듈(405, 488, 561, 640 nm의 파장)이 여기원으로 활용되었고, 밴드패스 필터(BPF1: FF01:FF01-442/46)를 통해 광증관(PMT)에 의해 4개의 방출 신호 채널이 검출되었다. BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). 레이저 스캐닝은 회전다각형 거울(X축)과 갈바노미터 스캐닝 미러(Y축)로 구성되어 비디오 속도 스캔(초당 30프레임)을 가능하게 했습니다. 인트라바이탈 현미경 검사법에 대한 자세한 정보는 이전 연구에서 기재되어있다(10,18,19,20,21,22,23).
우리의 이전 섬 연구18에서,우리는 성공적으로 안정적으로 섬이 GFP로 태그된 형질 마우스 모델 (MIP-GFP)24를 사용하여 살아있는 마우스에서 섬을 이미지화. 이 방법을 사용하면 1주일 동안 섬의 변경 내용을 고해상도 시각화할 수 있었습니다. 또한 당뇨병의 발병기 동안 기능 추적 또는 모니터링을 위한 췌장 섬의 장기 연구의 타당성을 건의하는 최대 3주 동안 동일한 섬의 이미징을 촉진했다18. 더욱이, 우리는 형광 췌장암세포(PANC-1 NucLight Red)25가 마우스의 췌장에 직접 이식되는 직소 췌장암 모델을 개발하였다. 췌장 내 인트라베이시브 이미징 창의 적용으로, 이 모형은 췌장암의 종양 미세 환경에서 세포 및 분자 병생리학을 조사하고 새로운 약 후보의 치료 감시를 위한 플랫폼으로 이용될 수 있었습니다.
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Protocol
이 논문에 설명된 모든 절차는 실험실 동물 관리 및 사용 가이드 8제1판(2011)26에 따라 진행되었으며, 한국과학기술원(KAIST)과 서울대학교 분당병원(SNUBH)의 기관동물관리 및 이용위원회의 승인을 받았습니다.
1. 창 및 기타 재료의 준비
- 복강(18)의 창자로부터 췌장을 한적한 폐적하기 위해 췌장 내 화상 진찰 창을 사용자 정의설계(도 1A,B). 창의 상세한 청사진은 이전 연구18의보충 그림에 설명된다.
- C57BL/6N 마우스를 사용 하 여, 8-12 주 된 남성, 중요 한 췌 장 이미징에 대 한. 알카 647 플루오로포어와 결합된 항 CD31 항체를 영상 촬영 전 2시간, 용기 라벨링18을목적으로 한다.
- 섬 연구를 위해, 섬이 형광 기자 단백질로 태그되는 형질 마우스 모델을 준비한다. 여기서, 우리는 MIP-GFP를 이용했는데, 여기서 녹색 형광 단백질은 마우스 인슐린 1 유전자 프로모터의 통제 하에 발현되었으며, 이는마우스(24)의모든 섬의 베타 세포에서 활성화된다.
- 췌장암 연구를 위해 형광 기자 단백질과 BALB/C 누드 마우스로 태그된 형질암세포를 준비하십시오. 이 연구에서는 PANC-1 NucLight 적색 세포가 사용되었습니다. PANC-1암세포(25)는 NucLight 적색 형광 프로브로 표지되었다.
- 모든 수술 도구, 커버 글래스(PEG 여부) 및 자동 클래브를 사용하여 이미징 창을 살균합니다.
- 페그 코팅을 커버 글래스에 적용하여 염증 반응을 방지하고 생체 적합성을 증가시며 장기적인 이미징에 적합합니다.
2. 수술
- 멸균 수술 플랫폼을 준비하고 70 %의 에탄올로 표면을 살균하십시오.
참고: 세로 이미징 세션의 경우 무균 기술이 필수적입니다. - 틸타민/졸라제팜(30 mg/kg)과 자일라진(10 mg/kg)을 혼합하여 쥐를 마취시합니다.
참고: 타일타민/졸라제팜의 사용은 고혈당증의 부작용 때문에 케타민 대신 에 권장 됩니다. 최적의 마취는 실험9,27의목적을 위해 선택되어야 한다. - 홈더믹 제어 가열 패드가 있는 직장 프로브를 사용하여 체온을 모니터링합니다.
- 마우스의 왼쪽 측면을 면도하고 교대술과 요오드 기반 스크럽의 세 라운드를 적용합니다.
참고: 디필 크림을 사용하는 경우 화학 적 화상을 피하기 위해 1 분 이상 방치하지 마십시오. - 마우스의 왼쪽 측면에 1.5cm 절개를 하고 피부와 근육을 해부합니다.
- 절개 여백에서 검은 색 또는 나일론 4-0 봉합사와 지갑 문자열 봉합사를 수행합니다.
- 절개에 마이크로 리트랙터를 사용하고 부드럽게 비장을 노출.
- 조심스럽게 링 집게로 비장을 풀링하고 췌장을 식별합니다.
- 창을 마우스 측면에 놓고 비장과 췌장을 창의 열린 공간을 통과합니다. 췌장의 조작은 출혈이나 췌장염을 일으킬 수 있으므로 매우 이방적이어야합니다.
- 화상 진찰 창의 접시에 췌장을 부드럽게 놓습니다. 비장은 창의 열린 공간에 배치됩니다.
- 암 세포 연구를 위해 PANC-1 NucLight Red(1.0 x 106 세포)를 췌장에 직접 주입하십시오.
참고: 직교 인간 췌장암 이종이식을 이미징하기 위해 PANC-1 또는 다른 인간 췌장암 세포와 같은 암세포의 직접 이식이 촉진될 수있다 28. 중요한 형광 현미경으로 시각화하기 위해 PANC-1 세포는핵(29)에라벨을 붙이는 NucLight Red lentiviral 시약을 사용하여 적색 형광 단백질로 변형되었다. 최대 사출 부피는 불확실하지만 췌장의 압력 효과를 피하기 위해 가능한 한 볼륨을 줄입니다. - 이미징 창의 여백에 N 부틸 시아노아크라일트 접착제 방울을 발라주세요.
- 적용된 접착제의 양을 최소화하려면 31 G 카테터 바늘을 사용하여 응용 프로그램에 사용하십시오. 낙하량이 크면 조직은 의도치 않게 창이나 덮개 유리를 부착합니다.
- 이미징 창의 여백에 12mm 원형 커버 글래스를 부드럽게 발라주세요.
- 봉합사 루프를 당겨 창의 측면 홈에 맞고 세 번 묶습니다.
- 이 마우스가 깨어있을 때 단단한 바늘의 중단을 방지하기 위해 매듭의 최대 근접 부위를 잘라.
- 마우스가 마취(2-3시간)에서 회복하고 케토프로펜(5 mg/kg, 동물의 목 또는 엉덩이의 밑에 느슨한 피부에 피하)을 주입하여 통증 완화를 허용합니다. 12시간마다 통증의 징후를 재평가하고 케토프로펜은 1-3일 동안 24시간마다 고려해야 합니다.
참고: 진통증은 포도당9에반응하여 인슐린 분비에 영향을 미친다. 진통제의 선택과 타이밍은 실험적 목적을 위해 개별화되어야 합니다. - 케이지에 있는 창의 접촉을 피하기에 충분한 침구로 마우스를 수용합니다. 창 수술없이 쥐와 집을 주택하지 마십시오.
3. 인트라바이탈 이미징
- 레이저 전원을 포함한 중요한 현미경을 켭니다.
- 가열 패드를 켜고 홈더믹 레귤레이션을 37 °C로 설정합니다.
참고: 또는 홈더믹 규정이 없는 경우 수동 가열 패드 나 램프를 자주 제어 할 수 있습니다. - 틸타민/졸라제팜(30 mg/kg)과 자일라진(10 mg/kg)의 혼합물로 근육 질증을 수행합니다.
참고: 타일타민/졸라제팜의 사용은 고혈당증의 부작용 때문에 케타민 대신 에 권장 됩니다. 최적의 마취는 실험9,27의목적을 위해 선택되어야 한다. - 주사를 위해 혈관 카테터를 삽입합니다.
- 지혈대 응용 프로그램의 대안으로 인덱스와 세 번째 손가락으로 꼬리의 근위 측에 압력을 가하십시오. 필요한 경우 꼬리를 램프로 가열합니다.
- 70% 에탄올 스프레이로 꼬리 정맥을 살균합니다.
- 측면 꼬리 정맥에 30 G 카테터를 삽입합니다. 혈액의 역류는 PE10 튜브에 시각화됩니다.
- 카테터에 실크 테이프를 바르면 안정화하십시오.
- FITC/TMR dextran 또는 기타 형광 프로브(알렉사 647와 결합된 안티 CD31의 25 μg)를 적절히 주입하여형광 프로브(18)의조합에 따라 적절히 주입한다.
참고: 형광 컨쥬게이드 항체 프로브의 경우 이미징 세션 전에 2h를 주입하십시오.
- 수술 플랫폼에서 이미징 단계로 마우스를 전송합니다.
- 직장 프로브를 삽입하여 홈더믹 가열 패드 시스템으로 체온을 자동으로 제어합니다.
- 췌장 이미징 창을 인트라비티 현미경설정(도 2)동안준비된 창 홀더에 삽입합니다. 반전된 현미경의 경우 창 홀더가 필요하지 않을 수 있습니다.
- 인트라바이탈 이미징을 수행합니다.
- 췌장 이미징의 경우 췌장 이미징 창(권장 시야: 2500 x 2500 μm)에서 췌장의 전체 보기를 스캔하기 위한 낮은 배율 목표 렌즈(예: 4x)로 시작합니다.
- 관심 영역을 결정한 후, 더 높은 배율 목표 렌즈(20x 또는 40x)로 전환하여 셀룰러 레벨 이미징(권장 시야: 500 x 500 μm 또는 250 x 250 μm)을 수행합니다. 이 실험에서, 측면 및 축 분해능은 각각 약 0.5 μm 및 3 μm이었다.
- z 스택 또는 시간 경과 이미징을 수행하여 세포 마이그레이션과 같은 3D 구조 또는 세포 수준 역학을 관찰합니다.
참고: 형질전환 동물의 세포를 발현하는 형광 단백질(MIP-GFP)을 이미징하기 위해, 30초의 간헐적인 488nm 레이저 노출은 최대 0.43mW의 전력을 가진 눈에 띄는 광표백 또는 조직 손상 없이 견딜 수 있었다. Alexa 647로 표시된 형광 단백질을 이미징하기 위해 640 nm 레이저 전력은 최대 0.17mW까지 눈에 띄는 광표백 또는 조직 손상 없이 견딜 수 있었습니다. 이 설정 위의 힘으로 장기간 흥분 레이저 노출광 독성에 의해 광 표백 또는 조직 손상으로 이어질 수 있습니다. 적절한 이득과 힘을 조정하여 관심 영역을 적절하게 이미지화합니다. 인트라베이티 현미경 검사법의 파라미터의 상세한 설정은 연구소에서 제조된 각 인트라베이티 현미경 검사법에 대해 개별화되어야 합니다.
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Representative Results
서포트베이스 통합 췌장 인내 영상 창과 결합된 인트라바이탈 현미경 검사는 마우스에 있는 췌장의 세로 세포 수준 이미징을 가능하게 합니다. 췌장 내 인트라바이탈 이미징 창을 가진 이 프로토콜은 고해상도 이미징을 획득하여 최대 3주 동안 개별 섬을 추적할 수 있는 장기 조직 안정성을 제공합니다. 그 결과, 확장된 시야를 위한 모자이크 이미징, z-스택 이미징의 3차원(3D) 재구성, 동일한 위치의 세로 추적을 달성할 수 있다. 또한, 당사의 중요 내 현미경 검사는 4개의 채널(405, 488, 561 및 647 nm)의 획득을 제공하여 상호 작용과 동시에 다중 세포 시각화를 가능하게 합니다.
예비 이미징의 경우, 창은 알렉사 647 플루오로호레와 결합된 항 CD31 항체를 정맥 주사한 C57BL/6N 마우스에 이식되었다. 췌장의 광역영상(도 3A)및 확대된 3D 이미징(도3B-D, 보충 비디오 1)은이 시스템으로 촉진되었다. 췌장 조직은 자가형으로 시각화되었고, 항 CD31 항체로 표지된 인접한 혈관분경을 확인시켰다. 연동또는 호흡으로 인한 진동이 확인되지 않아 신호 대 잡음 비율이 높은 평균이미징(도 4)이확인되었다. 췌장의 미세 스케일 해상도에서 시각화가 필요한 Acinar 세포는 평균화된 이미지에서 명확하게 시각화되었습니다.
섬 의 이미징을 위해, MIP-GFP 마우스가 이용되었다. 모자이크 이미징 방법을 사용하여, 고해상도 이미징을 이용한 넓은 시야는 인접한 혈관분과 함께 섬의 시각화를 가능하게하였다(도 5). 약 40-50개의 섬이 넓은 시야에서 확인되었다. 이러한 안정적인 이미징 방법은 이전 연구에서와 같이 최대 3주 동안 섬의 추적을 용이하게 할 수있다(그림 6)18.
암 세포 이미징의 경우, PANC-1 NucLight 적색 세포는 수술 중 마우스 췌장에 직접 이식되었다(도7). 이중 라벨링 전략이 사용되었으며, PANC-1 NucLight 적색 세포와 알렉사 647과 접합된 안티 CD31로 얼룩진 인근 선박으로 구성되었다. 우리의 프로토콜을 통해, 종양의 마진을 나타내는 췌장암(도7A)의넓은 현장 이미징과 단세포 수준에서 고해상도 3D 이미징이 달성되었다(도7B-D, 보충 비디오 2).
그림 1: 췌장 내화상 진찰 창의 디자인 및 사진. (A)췌장 내 화상 진찰 창의 3D 및 단면 보기. 크기와 직경의 상세한 청사진은 이전제18에설명되어 있다. (B)췌장 이미징 창의 전방 및 후방 사진. 저작권 2020 당뇨병 메탭 J. 2020 44:193-198에서 한국 당뇨병 협회. 대한당뇨병협회의 허가를 받아 전재. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 췌장 내화상 진찰 창의 구현 사진. 췌장 내 인트라비티 이미징 창은 XYZ 번역 단계에서 마우스에 이식되고 기울기 마운트에 부착된 이미징 챔버 홀더가 췌장 이미징 창에 연결됩니다. 저작권 2020 당뇨병 메탭 J. 2020 44:193-198에서 한국 당뇨병 협회. 대한당뇨병협회의 허가를 받아 전재. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: C57BL/6N 마우스의 대표적인 인트라비티 인브레인 췌장 이미징. (A)광역 영상 및(B)C57BL/6N 마우스에서 췌장(green) 및 그 마이크로바스큘라컬(red)의 3D 이미지를 확대하였다. 혈관은 알렉사 647 형광소와 결합 된 항 CD31 항체로 표시된다. (C)3D 재구성 된 이미지와(D)마우스 췌장의 표면 렌더링 이미지. 스케일 바: 200 μm(A) 및 50 μm(B-D). 또한 보충 비디오 1을참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 아시나르 세포와 인접한 혈관의 인트라베이티 이미징. C57BL/6N 마우스의 아시나르 세포(녹색) 및 인접한 혈관 (빨간색). 혈관은 알렉사 647 형광소와 결합 된 항 CD31 항체로 표시된다. 췌장 이미징 창으로 수행되는 조직 안정성은 높은 신호 대 잡음 비 이미지를 제공합니다. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: MIP-GFP 마우스에서 췌장 섬의 대표적인 인탈 이미징. MIP-GFP 마우스췌장에서 최대 강도 프로젝션 방법으로 처리된 섬(green) 및 인접 혈관(red)의 광면적 모자이크 및 확대 된 이미지. 혈관은 알렉사 647 형광소와 결합 된 항 CD31 항체로 표시된다. 스케일 바: 500 μm(넓은 면적) 및 50 μm(확대). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: MIP-GFP 마우스의 췌장에 있는 섬들의 경도 내 비등 화상 진찰. MIP-GFP 마우스의 췌장에서 최대 3주 동안 섬의 세로 이미지. 색상이 다른 각 화살표헤드는 동일한 섬을 나타냅니다. 스케일 바: 100 μm. 저작권 2020 당뇨병 메탭 J. 2020 44:193-198에서 한국 당뇨병 협회. 대한당뇨병협회의 허가를 받아 전재. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: 췌장암 모델의 대표적인 인트라바이탈 이미징. (A)광면적 영상 및(B)발비/c 누드 마우스에서 이식된 PANC-1 NucLight 적세포(red)의 3D 이미지를 확대하였다. 혈관(파란색)은 알렉사 647 플루오로포어와 결합된 항 CD31 항체로 라벨을 부착한다. (C)3D 재구성 된 이미지와(D)마우스 모델에서 췌장암의 표면 렌더링 이미지. 스케일 바: 500 μm(A) 및 50 μm(B-D). 또한 보충 비디오 2를참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 비디오 1: C57BL/6N 마우스에서 생체 내 3D 췌장 이미징. 생체 내 췌장의 생체 3D 이미징 (녹색) C57BL/6N 마우스 정맥 내 주입 항 CD31 항체와 결합 된 알렉사 647 플루오로포 (빨간색). 스케일 바는 비디오에 표시됩니다. 이 비디오는 그림 3C,D에 해당합니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보조 비디오 2: BALB/C 누드 마우스에서 생체 내 3D 췌장암(PANC-1 NucLight Red) 이미징. BALB/C 누드 마우스에 이식된 췌장암(red)의 생체 내 3D 이미징에서 알렉사 647 형광호레(blue)와 결합된 항 CD31 항체를 정맥주사하였다. 스케일 바는 비디오에 표시됩니다. 이 비디오는 그림 7C,D에 해당합니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서 설명된 프로토콜은 복부 화상 진찰 창에서 변형된 새로운 지지 기지 통합췌장 내 화상 진찰 창을 사용하여 췌장의 인트라비티 이미징으로 이루어져 있습니다. 위에서 설명한 프로토콜 중, 첫 번째 중요한 단계는 마우스에 있는 중요한 췌장 화상 진찰 창의 이식입니다. 창에 접착제를 적용하기 위해, 창의 여백과 커버 유리 사이에 접착제를 적용하는 것이 중요하지만 췌장 조직에는 그렇지 않으며, 이는 중요한 이미징을 현저히 방해할 수 있기 때문에. 유리와 조직 사이의 접착제 자체뿐만 아니라 접착이 조직에 직접 적용되는 경우 내부 먼지 입자는 이미징 중에 빛이 산란을 유도할 수 있습니다. 또한 접착제의 적용은 췌장에 독성 및 비생리적 영향을 미칠 수 있다.
두 번째 단계는 금속 지지 기판에 배치된 췌장 조직의 양입니다. 췌장 조직은 시트와 같은 구조이기 때문에 플레이트의 췌장 조직의 양을 제어해야합니다. 너무 큰 부피가 접시에 놓이면 링의 여백에 적용된 접착제가 조직을 부착할 수 있으며 질량 효과는 췌장의 관류를 방해할 수 있습니다. 반면에 볼륨이 너무 작으면 시각화할 수 있는 시야가 제한될 수 있습니다. 창에 수술의이 프로토콜은 일관된 표준을 충족하기 위해 여러 시험을 필요로 할 수 있습니다.
3 주 동안 장기 이미징의 경우 가장 우려되는 문제는 췌장 이미징 창에 잠재적 인 손상이었습니다. 췌장 이미징 창에서 커버 유리의 의도하지 않은 파괴는 장기 관찰 기간 동안 발생할 수 있습니다. 이를 방지하기 위해 창이 있는 마우스를 별도로 보관해야 하며 가장자리가 선명한 하드 오브젝트를 케이지에서 제거해야 합니다. 쥐의 안락사는 덮개 유리 휴식해야, 창 근처 염증의 심한 징후가있는 경우, 또는 동물이 곤경에 있는 것처럼 보이는 경우에 고려되어야 합니다. 우리의 경험에서, 췌장 화상 진찰 창을 가진 마우스는 수술 후에 복구가 적적절하고 그밖 합병증이 개발되지 않은 때 정상적으로 먹고 운동할 수 있었습니다.
복부 화상 진찰 창에 우리의 이전 경험에서, 우리는 고품질 세포 수준 화상 진찰뿐만 아니라 다일 동안 동일 반점의 종방향 추적을 취득하는 것을 실패했습니다. 다양한 복부 장기를 위한 다양한 플랫폼을 제공하는 복부 이미징 창에 비해 췌장 이미징 창은 췌장뿐만 아니라 장간, 비장 및 작은 장과 같은 운동에 부드럽고 쉽게 영향을 받는 다른 장기를 이미징하기 위해 더 지정됩니다. 그러나, 간과 신장 은 제한된 공간 때문에 췌장 화상 진찰 창에서 불가능할 지도 모릅니다.
형광 마우스, 세포 및 항체 프로브의 조합은 내피 세포와 섬 또는 암세포 사이의 동적 상호 작용의 시각화를 가능하게하지만, 여기에 설명된 프로토콜은 각각의 조건에 적합한 형광 표지 세포 또는 분자 프로브의 다른 조성물로 재현될 수 있었다. 더욱이, 인슐린 분비를 이용한 CpepSfGFP 기자 마우스와 같은 광범위한 응용분야가 예상되며,30,AAV8 매개 유전자 전달은 반응성 산소종(ROS)31,또는 직교 종양 모델32,33,34에서 종양을 종양, 종양 유전자, 발달,35개 등 종양 미세환경을 완전히 자극할 수 있다. 또한, 환자 유래 제노이식 모델은플랫폼(36)을사용하여 연구될 수 있다.
이 연구에서 해결해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 안정화를 위해 금속 베이스를 활용했을 때에도, 우리는 혈액 흐름에 영향을 미칠 수 있는 베이스 및 커버 유리에 의해 조직에 유도된 기계적 스트레스를 확인할 수 없었습니다. 그러나, 상기 수치에 묘사된 바와 같이, 형광-컨쥬게이트 항체(CD31) 또는 dextran의 정맥 주사는 구별할 수 없는 불응응영역이 없는 혈관을 적절히 표지하여 췌장 조직 내부의 정상적인 혈류에 기계적 스트레스의 최소한의 영향을 시사한다. 둘째, 접착제로 인한 불리한 반응은 췌장 조직에서 평가될 수 없었다. 그럼에도 불구 하 고, 우리는 추가 효과 피하기 위해 가능한 한 신중 하 게 접착제와 췌 장을 만지지 않도록 시도. 셋째, 위에서 설명한 바와 같이, 마취제의 의도하지 않은 영향은 이전 연구9,27에설명된 바와 같이 인슐린 민감도 및 분비에 영향을 미칠 수 있다. 우리의 경험에서, 케타민과 자일라진 유도 고혈당증의 혼합물 타일 타민의 혼합물에 비해, 졸라제팜, 그리고 자일라진. 인슐린 분비에 마취의 효력을 조사하는 추가 연구 결과는 수행되어야 하고 최소한의 부작용을 가진 적당한 마취는 각 실험에 따라 선택되어야 합니다. 넷째, 췌장의 화상 진찰은 꼬리 부분에 초점을 맞추고, 췌장의 머리 부분의 화상 진찰은 우리의 창으로 제한될 수 있었습니다.
요약하자면, 최대 몇 주 동안 세포 수준에서 췌장의 안정화 된 세로 이미징은 생체 내 췌장 이미징에 최적화 된 췌장 내 생체 이미징 창과 통합 된 이미징 시스템에 의해 촉진되었습니다. 인트라베이티드 이미징은 세포 생물학, 면역학 및 종양 생물학에 대한 동적 통찰력을 제공하기 때문에 이 프로토콜은 췌장과 관련된 다양한 질병의 병리학을 조사하는 유용한 방법이 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 SNUBH 연구 기금에서 14-2020-002호를 지원하고 한국정부(MSIT)가 지원하는 한국연구재단(NRF) 보조금(NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C305694)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window - custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder - custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
References
- Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A.
- Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. Technologies for imaging the normal and diseased pancreas. Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed. Diabetes Care. 31, Suppl 2 165-169 (2008).
- Baetens, D., et al. Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice. Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).
- Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Ravier, M. A., Rutter, G. A. Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes. Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).
- Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose. Science Reports. 11 (1), 603 (2021).
- Lee, E. M., et al. Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice. Islets. 10 (1), 25-39 (2018).
- Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. In vivo imaging of islet transplantation. Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).
- Mojibian, M., et al. Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).
- Pittet, M. J., Weissleder, R.
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).
- Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
- Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), 1024405 (2015).
- Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Park, I., et al. Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model. Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).
- Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy. Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).
- Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
- Hwang, Y., et al. In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver. Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas. International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).
- National Institutes of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).
- Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice. Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Cichocki, F., et al. GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity. Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
- Reissaus, C. A., et al. A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).
- Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma. Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).
- Bisht, S., Feldmann, G. Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L.
- Feig, C., et al.
- Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models. Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).
