Summary
Detta dokument beskriver en magnetisk levitation-baserad metod som specifikt kan upptäcka förekomsten av antigener, antingen lösliga eller membranbundna, genom att kvantifiera förändringar i levitationshöjden för fångstpärlor med fasta densiteter.
Abstract
Den beskrivna metoden utvecklades utifrån principerna för magnetisk levitation, som separerar celler och partiklar baserat på deras densitet och magnetiska egenskaper. Densitet är en celltyp som identifierar egenskap, direkt relaterad till dess ämnesomsättning, differentiering och aktiveringsstatus. Magnetisk levitation möjliggör en ettstegsmetod för att framgångsrikt separera, avbilda och karakterisera cirkulerande blodkroppar och för att upptäcka anemi, sicklecellsjukdom och cirkulerande tumörceller baserat på densitet och magnetiska egenskaper. Detta tillvägagångssätt är också mottagligt för att upptäcka lösliga antigener som finns i en lösning genom att använda uppsättningar av låg- och högdensitet pärlor belagda med fångst och detektion antikroppar, respektive. Om antigenet finns i lösning, kommer det att överbrygga de två uppsättningarna pärlor, vilket genererar ett nytt pärlpärlorkomplex, som kommer att levitera mellan raderna av antikroppsbelagda pärlor. Ökad koncentration av målantigenet i lösningen kommer att generera ett större antal pärlpärlakomplex jämfört med lägre koncentrationer av antigen, vilket möjliggör kvantitativa mätningar av målantigenet. Magnetisk levitation är fördelaktig för andra metoder på grund av dess minskade provberedningstid och brist på beroende av klassiska avläsningsmetoder. Bilden som genereras fångas och analyseras enkelt med hjälp av ett standardmikroskop eller mobil enhet, till exempel en smartphone eller en surfplatta.
Introduction
Magnetisk levitation är en teknik som utvecklats för att separera, analysera och identifiera celltyper1,2,3, proteiner4,5 och opioider6 baserat enbart på deras specifika densitet och paramagnetiska egenskaper. Celltäthet är en unik, inneboende egenskap hos varje celltyp som är direkt relaterad till dess ämnesomsättning och differentieringsstatus7,8,9,10,11,12,13,14. Kvantifiering av subtila och övergående förändringar i celltäthet under steady state förhållanden, och under en mängd olika cellprocesser, kan ge en oöverträffad inblick i cellfysiologi och patofysiologi. Förändringar i celltätheten är förknippade med celldifferentiering15,16, cellcykelprogression9,17,18,19, apoptos20,21,22,23och malign omvandling24,25,26 . Därför kan kvantifiering av specifika förändringar i celltätheten användas för att skilja mellan celler av olika typer, samt diskriminera mellan samma typ av celler som genomgår olika aktiveringsprocesser. Detta möjliggör experiment som riktar sig till en viss cellunderpopulation, där dynamiska förändringar i densitet fungerar som en indikator på förändrad cellmetabolism27. Eftersom det har fastställts att en cell kan ändra sin densitet som svar på en föränderlig miljö7, är det absolut nödvändigt att mäta cellens kinetik i förhållande till dess densitet för att förstå den fullt ut, vilka nuvarande metoder kanske inte ger12. Magnetisk levitation å andra sidan möjliggör en dynamisk utvärdering av celler och deras egenskaper28.
Celler är diamagnetiska vilket innebär att de inte har ett permanent magnetiskt dipolmoment. Men när det utsätts för ett externt magnetfält genereras ett svagt magnetiskt dipolmoment i cellerna, i motsatt riktning mot det applicerade fältet. Således, om celler är upphängda i en paramagnetisk lösning och utsätts för ett starkt vertikalt magnetfält, kommer de att sväva bort från den magnetiska källan och stanna till en höjd, vilket främst beror på deras individuella densitet. Diamagnetisk levitation av ett objekt som är begränsat till ett minimum av ett inhomogent magnetfält är möjligt när de två följande kriterierna är uppfyllda: 1) partikelns magnetiska känslighet måste vara mindre än det omgivande mediets, och 2) den magnetiska kraften måste vara tillräckligt stark för att balansera partikelns flytkraft. Båda kriterierna kan uppfyllas genom att suspendera RBC i en magnetisk buffert och genom att skapa starka magnetiska fältgradienter med små, billiga, kommersiellt tillgängliga permanenta magneter1. Jämviktspositionen för en magnetiskt instängd partikel på en axel längs gravitationsriktningen bestäms av dess densitet (i förhållande till buffertens densitet), dess magnetiska känslighet (i förhållande till buffertens magnetiska känslighet) och signaturen för det applicerade magnetfältet. Eftersom lösningens densitet och magnetiska egenskaper är konstanta i hela systemet, kommer cellernas inneboende densitetsegenskaper att vara den viktigaste faktorn som bestämmer cellernas levitationshöjd, med tätare celler som svävar lägre jämfört med mindre täta celler. Detta tillvägagångssätt använder en uppsättning av två densitetsreferenspärlor (1,05 och 1,2 g/ml) som gör att vi kan använda exakt, ratiometrisk analys för densitetsmätningar. Genom att ändra koncentrationen av den magnetiska lösningen kan man isolera olika cellulära populationer, såsom RBC från WBC, eftersom densiteten hos cirkulerande celler är cellspecifik, vilket tar bort behovet av isoleringsprotokoll eller annan cellmanipulation.
Majoriteten av de detektionsmetoder som används inom biologiforskningen bygger på extrapolering av specifika bindande händelser till lätt att kvantifiera linjära signaler. Dessa avläsningsmetoder är ofta komplexa och involverar specialiserad utrustning och dedikerad vetenskaplig personal. Ett tillvägagångssätt som syftar till påvisande av antigener som finns antingen på plasmamembranet i celler eller extracellulära blåsor eller som är lösliga i plasma, med antingen en eller två antikroppsbelagda pärlor, beskrivs häri. Pärlorna måste vara av olika densitet från varandra och från de förhörda målen. Förekomsten av målantigenet i ett givet biofluid översätts till en specifik, mätbar förändring av levitationshöjden hos en antigenpositiv cell som är bunden till en detektionspärla. När det gäller lösliga antigener eller extracellulära blåsor är de bundna till både fångst- och detektionspärlor och bildar ett pärlpärlorkomplex snarare än pärlcellskomplex. Förändringen i levitationshöjd beror på den nya densiteten hos pärlcells- eller pärlpärlakomplexen. Förutom förändringen i levitationshöjden på komplexen, vilket indikerar närvaron av antigen i biofluiden, är antalet komplex också beroende av mängden mål, vilket gör magnetisk levitation också till ett kvantitativt tillvägagångssätt för antigendetektering24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det experimentella protokoll som användes i denna studie godkändes av Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB).
1. Instrumentinställning
OBS: Avbildning leviterande celler kräver två sällsynta jordartsmetallmagneter magnetiserade på z-axeln för att placeras med samma pol mot varandra för att generera ett magnetfält. Avståndet mellan magneterna kan anpassas beroende på magnetfältets intensitet och målens densitet. I detta fall separeras magneterna med ett 1 mm utrymme som är tillräckligt för införandet av ett 50 mm långt 1x1 mm kvadratiskt glaskapillärrör. Enheten skrevs ut med 3D-utskrift med en AutoCAD-design, som är tillgänglig på begäran.
- Lägg mikroskop på sidan, perfekt horisontellt.
OBS: Ett mikroskop som placeras i ett standardläge är inte direkt lämpligt för avbildning av leviterande föremål på grund av magneternas positioner med avseende på kondensor och objektiv. Denna begränsning kan kringgås genom att lägga mikroskopet på sidan, perfekt horisontellt så att kondensorn kan fokusera ljuset i kapillären och objektivet för att avbilda cellen som svävar mellan magneterna, samtidigt som Köhler-belysningskraven bibehålls. - Stöd och jämna stativet på ett brödbordsbord med 2 eller 3 labbuttag.
- För att begränsa vibrationer, stöd brödbordet med gummidämpande fötter.
- Ta bort scenen och ersätt den med ett kompakt labbuttag för justering av höjden på levitationsanordningen(y-axeln) och två enaxliga translationella steg; en för att justera fokus (z-axel), och den andra för skanning av kapillärröret.
- Fäst den magnetiska levitationsanordningen på labbuttaget med två optiska stolpar i miniserien.
2. Bindning av antikroppar mot karboxy-mikropartiklar/pärlor (Modifierad från ett protokoll av PolyAn)
OBS: Endast pärlor med låg densitet (1,05 g/ml) behöver beläggas för Rh(+) detektion, men både hög- och lågdensitetspärlor är belagda för detektion av extracellulära blåsor.
- Ta ut 1 mg ekvivalent av pärlfjädring och tillsätt i 0,5 ml aktiveringsbuffert (50 mM MES (MW195,2, 9,72 mg i 1 ml)) pH 5,0 och 0,001% Polysorbate-20).
- Tillsätt 12 μL nytillverkad 1,5 M EDC (MW 191,7, 0,28755 g i 1 ml) och 12 μL 0,3 M Sulfo-NHS (MW 217,14, 0,0651 g i 1 ml) i iskallt vatten.
- Placera rören på en orbital shaker och skaka kraftigt i 1 h vid rumstemperatur för att aktivera karboxylgrupperna på pärlor.
- Stoppa aktiveringen efter 1 h genom att tillsätta 0,5 ml kopplingsbuffert (10x PBS, eller 0,1 M fosfat pH 7-9).
- Pellet pärlorna genom att centrifugera vid 20 000 x g i 10 min, eller, om pärlorna inte kan pelleteras, använd ett 0,45 μm centrifugrörsfilter. Aspirera supernatanten eller genomströmningen.
- Tvätta pärlorna med 1 ml 10x PBS 3 gånger som i steg 2,5.
- Beräkna 25 μg antikropp per mg pärlor och blanda önskad antikropp med aktiverade pärlor till en slutlig antikroppskoncentration på 0,7-1,0 mg/ml i 10X PBS.
- Placera rören på en rörvippar som är inställd på låg hastighet. Rulla rör försiktigt vid rumstemperatur över natten för koppling.
- Upprepa steg 2.5 och tvätta pärlorna två gånger med 1 ml 10x PBS.
- Tvätta med 0,5 ml 1 M etanolamin (98% lager = 16,2 M) i buffertpH 8,0 med 0,02% Polysorbat-20 i 1 h vid rumstemperatur medan du försiktigt skakar.
- Upprepa steg 2.5 och tvätta pärlorna en gång i 1 ml DPBS. Pärlorna kan förvaras i 200 μL DPBS vid 4 °C tills det behövs.
PROTOKOLLET kan pausas här.
3. Insamling och beredning av blod för Rh(+) detektion
- Använd en 1-klicks lancing-enhet, pricka fingret på en Rh(+) donator och samla in 10 μL blod i 1 ml DPBS.
- Färga Rh+-cellerna med en fluorescerande plasmamembranfläck. Tillsätt valfritt 1 μL fluorescerande färgämne till 1 ml suspension av Rh+-celler (1:1000 utspädning).
- Inkubera cellerna med det fluorescerande färgämnet vid 37 °C i 15 min.
- Pellet cellerna genom att snurra vid 5 600 x g i 15 s och tvätta 3 gånger med 1 ml DPBS. Återsuspend i 1 ml HBSS med kalcium och magnesium (HBSS++).
- Använd en klick lancing-enheten, sticka fingret på en Rh(-) donator och samla in 2 μL blod.
OBS: Om du förbereder fler än 2 tillstånd, samla tillräckligt med blod för att tillsätta 1 μL Rh(-) blod till varje rör. - Förbered nödvändiga experimentella rör: Pärlor ensam, IgG kontroll, prov.
- Enbart pärlor: tillsätt 174 μL HBSS++, 1 μL IgG-kontrollpärlor, 1 μL högdensitetspärlor (1,2 g/ml) och 24 μL 500 mM Gd3+ (60 mM).
- IgG-kontroll: tillsätt 172 μL HBSS++, 1 μL IgG-kontrollpärlor, 1 μL högdensitetspärlor, 1 μL Rh-blod, 1 μL betsad Rh+ blodsupphängning och 24 μL 500 mM Gd3+.
- Provrör tillsätt 172 μL HBSS++, 1 μL anti-RhD-belagda pärlor, 1 μL högdensitetspärlor, 1 μL Rh-blod, 1 μL betsad Rh(+) blodsuspension och 24 μL 500 mM Gd3+.
OBS: Högdensitetspärlor läggs till Rh-prover för referens.
4. Isolering av PMN för cellseparationsdeparationsdemonstration
- Isolering av neutrofiler
- Dra 40 ml venöst blod i en 60 ml spruta som innehåller 6 ml natriumcitrat/citronsyra (0,15 M, pH 5,5) och 14 ml 6% Dextran-70.
- Vänta i 50 minuter på att blod ska sedimenteras.
- Lägg långsamt de buffy pälscellerna ovanpå 20 ml Ficoll-Paque genom att trycka de översta 18 ml genom bloduppsamlingsslangen i ett 50 ml-rör, vilket undviker förorening med sedimenterade RBC. Det rekommenderas att använda en ny bloduppsamlingsuppsättning, för att minimera föroreningen med kvarvarande RBC kvar i det ursprungliga bloduppsamlingsröret.
- Pellet de buffy coat cellerna genom centrifugering i 20 min vid 3000 x g. Neutrofiler och förorenande RBC kommer att pellet i botten av röret. PBMC kommer att bilda ett vitt lager ovanpå Ficoll-Paque.
- Överför neutrofilerna till ett nytt 50 ml-rör.
- Lyse eventuella kvarvarande RBC genom att inkubera neutrofilerna med 20 ml 0,2% kall NaCl-lösning i 25 sekunder, följt av ytterligare 20 ml 1,6% NaCl. Den slutliga konserten av NaCl bör vara 0,9% (isotonic).
- Centrifugera suspensionen i 10 min vid 3 000 x g.
- Ta bort supernatanten och återanvänd neutrofilerna till önskad koncentration.
-
Isolering av lymfocyter
- Plätera PBBC:er i RPMI med 5% värmeinaktiverat serum i 6-brunnskulturplattor.
- Inkubera plattorna i 1 h vid 37 °C. Monocyter kommer att hålla fast vid plattan, lymfocyter kommer att vara fritt flytande.
- Ta bort bufferten som innehåller lymfocyterna och tvätta den två gånger med RPMI.
- Återsuspend lymfocyterna vid önskad koncentration.
-
Etikett-RBC, PMN och lymfocyter.
- Märk varje celltyp med olika fluorescerande färgämne. Se till att varje färgämne fluorescerar i en annan kanal. Följ tillverkarens anvisningar för vart och ett av de valda färgämnena.
5. Generering av RBC extracellulära vesicles via komplementaktiveringen
- Få helblod genom venipuncture med hjälp av EDTA-rör.
- Skicka blod genom ett vitt blodcellsfilter och centrifugera sedan 3 gånger vid 500 x g i 10 minuter vardera för att isolera röda blodkroppar. Använd HBSS++ som tvättbuffert.
- Gör alikvoter på 100 μL packade RBC i 1,5 ml rör och gör volymen till 1 ml genom att tillsätta HBSS++.
- Tillsätt C5b,6 till en slutlig koncentration på 0,18 μg/ml i HBSS++, och virvla sedan.
- Sätt på en långsam skakapparat vid rumstemperatur i 15 min.
- Tillsätt C7-protein till en slutlig koncentration av 0,2 μg/ml. Blanda genom att vända röret försiktigt några gånger. Virvla inte från och med nu.
- Placera röret på en rörskakapparat med låg hastighet i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt C8-protein till en slutlig koncentration av 0,2 μg/ml och C9-protein till 0,45 μg/ml. Blanda genom att vända rören försiktigt några gånger.
- Inkubera vid 37 °C i 30 min.
- Centrifugera röret vid 10 000 x g i 10 minuter.
- Samla in den EV-innehållande supernatanten i ett nytt rör. Tremove inte supernatanten för nära cellpelleten.
6. Analysera celler på den magnetiska levitationsanordningen
- Utför instrumentstart enligt tillverkarens instruktioner.
- Lasta 50 μL prov i ett kapillärrör tills röret är fyllt. Försegla kapillärrörets ändar med kapillärförseglingsmedel och se till att det inte finns några luftbubblor närvarande.
- Ladda kapillärröret i hållaren mellan magneterna på toppen och botten. Justera scenen och fokusera för optimal visning.
OBS: Celler/ pärlor kan ta allt från 5-20 min för att nå sin magnetiska jämviktsposition baserat på deras densitet och koncentrationen av Gd3 +. Ju högre koncentration av Gd3+, desto kortare tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Magnetisk levitation fokuserar objekt med olika densiteter på olika levitationshöjder beroende på objektets densitet, dess magnetiska signatur, koncentrationen av paramagnetisk lösning och styrkan hos magnetfältet som skapas av två starka, sällsynta jordmagneter. Eftersom de två magneterna placeras ovanpå varandra kan leviterande prover endast ses, samtidigt som Köhler-belysningen bibehålls, med hjälp av ett mikroskop på sidan(figur 1). Den slutliga levitationshöjden som uppnås av varje celltyp kan enkelt ändras genom att ändra koncentrationen av den paramagnetiska lösningen. Figur 2 illustrerar separationen av de olika cirkulerande blodkropparna med hjälp av olika koncentrationer av gadolinium. De två pärltyperna med olika densiteter (1,05 och 1,2 g/ml) användes för att ge densitets levitationshöjder och storleksreferenser. Eftersom levitationshöjden för en viss celltyp beror på dess inneboende densitet, ger magnetisk levitation ett direkt sätt att isolera celler av intresse utan någon betydande manipulering24. Huvudsyftet med detta protokoll var att visa förmågan av magnetisk levitation att upptäcka förekomsten av membran bundna antigener, i detta fall Rh-faktorn, på cirkulerande röda blodkroppar. För detta experiment var pärlor med låg densitet belagda med antingen IgG kontroll antikropp eller anti-RhD. Prover framställdes sedan genom att spetsa blod från en Rh(-) donator med blod från en Rh(+) i ett förhållande av 1:1000. Anti-RhD(+) belagda pärlor eller kontroll IgG belagda pärlor lades till blodprovet och inkuberades i 10 minuter. Figur 3A visar IgG-kontrollprovet, som inte genererade några pärlröda blodkroppar. Därefter verifierades identiteten på de röda blodkroppar som fångats av Rh(+)-positiva pärlor genom att förfärga Rh(+) cellerna med en fluorescerande plasmamembranfläck och sedan avbildas med fluorescensmikroskopi(figur 3B). En positiv identifieringshändelse visas i figur 3C. Bindningen av anti-Rh-pärlan till Rh(+)-cellerna skapar ett pärlcellskomplex med en densitet mellan pärlornas och cellens, och svävar därför på en höjd som ligger mellan de obundna fångstpärlorna och negativa RBC. En närbild av pärlcellskomplexen avbildades under fluorescerande ljus för att bekräfta förekomsten av Rh(+) celler märkta med en fluorescerande plasma membran fläck. (Figur 3D). Figur 3E visar pärlpärlor som bildas mellan hög- och lågdensitetspärlor belagda med antikroppar mot CR1 och CD47, vilket indikerar förekomsten av extracellulära blåsor. Ett schema för pärlcellskomplexet visas i figur 3F.
Bild 1. Principer för magnetisk levitation: (A) Scheman för magnetfält. b)Ett mikroskop av forskningskvalitet tippat på sidan för att möjliggöra sidoavbildning av de mål som svävar i kapillärröret. c)Vinklad vy över den magnetiska levitationsapparaten under mikroskopmålet. (D)Magnetisk levitationsapparat frontalvy. (E) Scheman för den magnetiska levitationsapparaten med ett kapillärrör monterat mellan två magneter, fram- och sidovy. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2. Demonstration av cellspecifik densitetsjämvikt: (A) Pärlor med låg och hög densitet (1,05 och 1,2 g/ml) ensam vid 60 mM Gd3+ (sett på ett 10x-mål). (B) PMN som svävar över röda blodkroppar vid 21 mM Gd3 +, med ut ur fokus trombocyter cirkulerar (sett på ett 10x mål). (C) Helblod som svävar vid 60 mM Gd3 +, vilket är en koncentration som fokuserar på RBC (sett på ett 10x-mål). d)Denna siffra har ändrats från [Tasoglu, S. et al. Levitational bild cytometri med temporal upplösning. Avancerade material. 27 (26), 3901-3908, doi:10.1002/adma.201405660 (2015).] Densitetsseparation av RBC (röd), PMN (grön) och lymfocyter (blå) vid 40 mM Gd3+. Varje cellpopulation leviterade på en höjd baserat på deras inneboende densitet (sett på ett 10x-mål). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3. Påvisande av Rh-faktor i ett blodprov: (A) Rh(-) blod spetsat med Rh(+) blod och IgG kontrollpärlor. Inga pärlcellskomplex bildas (visas på ett 10x-mål). (B)IgG-kontrollprov under fluorescerande ljus som belyser Rh(+)-cellerna (sett på ett 10x-mål). (C) Rh(-) blod spetsat med Rh(+) blod och anti-RhD-belagda pärlor, som visar bildandet av pärlcellskomplex (sett på ett 10x-mål). (D) En närbild av ett pärlcellskomplex under fluorescerande ljus (sett på ett 10x-mål). (E) Anti-CR1 och anti-CD47 belagda pärlor som bildar komplex, vilket indikerar förekomsten av RBC härledda extracellulära blåsor (sett på ett 10x-mål). (F)Diagram som visar pärlcellskomplexet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gradientcentrifugering är för närvarande standardtekniken för att isolera subcellulära komponenter baserat på deras unika densitet. Detta tillvägagångssätt kräver dock användning av specialiserade gradientmedier samt centrifugutrustning. Den magnetiska levitationsmetoden som presenteras här möjliggör detaljerad undersökning av de morfologiska och funktionella egenskaperna hos cirkulerande celler, med minsta, om någon manipulering av cellerna, vilket ger en nära in vivo tillgång till cirkulerande celler.
Men när du använder magnetisk levitation är flera punkter värda att nämna. För det första måste mikroskopet som används för avbildning vara dedikerat till denna metod, eftersom installationen är tidskrävande och kräver att mikroskopet delvis demonteras, placeras perfekt horisontellt med optiken exakt i linje med magneterna och kapillärröret. För det andra kräver labbuttaget och de translationella stadierna som används för att justera kapillärglasets rörelser och fokus exakt positionering och fri rörlighet på var och en av de tre axlarna. Troligen är den mest kritiska justeringen av hela installationen att montera den magnetiska levitationsanordningen i översättningsstegen så att topp- och bottenmagneterna är perfekt anpassade till gravitationsvektorn såväl som perfekt horisontella. Varje avvikelse från dessa krav skulle skapa en vinkel mellan den magnetiska kraften och gravitationen som skulle driva cellerna mot båda sidor av kapillärröret, störa levitationsprocessen och göra resultaten otillförlitliga.
Den optimala koncentrationen av gadoliniumlösningen som används för leviterande celler måste justeras för celltypen och målet för experimentet. Förändringar i koncentrationen av gadoliniumlösningen kommer avsevärt att förändra levitationshöjden hos de celler som analyseras och måste därför hållas konstant från en uppsättning experiment till en annan. Om koncentrationen är för låg, beroende på målcellernas densitet, kanske de inte svävar alls, medan om den är för hög kommer det att begränsa intervallet av detekterbara förändringar som kan kvantifieras noggrant.
Leviterande strukturer kommer att skapa stabila band om de enda krafterna som verkar på dem är gravitation och magnetisk repulsion. Närvaron av ens en millimeterstor bubbla i kapillärröret kommer att skapa små cirkulära strömmar vid luft-vätskegränssnittet, vilket kommer att störa de svävande cellerna, vilket gör någon analys praktiskt taget omöjlig. När man lastar ett prov i ett kapillärrör, och sedan efter tätning, måste man se till att ingen luft finns, genom att undersöka kapillären under ett stereomikroskop eller lågeffektmål (4x).
Levitation av celler på en inställd höjd beror på att deras magnetiska signatur förblir densamma över tiden. Om de paramagnetiska gadoliniumjonerna från levitationsmediet kommer in i cellerna, antingen genom pinocytos eller ökad membranpermeabilitet, såsom under apoptos, kommer den ökade celltätheten mätt baserat på densitetsreferenspärlor att vara felaktig. Lyckligtvis har de flesta cirkulerande celler dåliga pinocytiska förmågor26, vilket gör denna metod till ett lämpligt tillvägagångssätt för att studera celler under långa tidsperioder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr. Getulio Pereira för hans hjälp med extracellulärt vesikelarbete.
Detta arbete stöddes av följande nationella hälsobidrag till ICG: RO1CA218500, UG3HL147353 och UG3TR002881.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); component of activation buffer |
| 50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness | K&J Magnetics | Custom | Magnets used for the magnetic levitation device |
| Capillary Tube Sealant (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Used to cap the ends of the capillary tubes |
| Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Used to wash beads |
| Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Used for adjusting the magnetic levitation device |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | Solution for bead suspensions |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Used during a wash step for beads |
| Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Used to stain Rh+ cells |
| Gadoteridol Injection | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells |
| HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Solution for sample preparation |
| Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | Used to generate RBC Evs |
| Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | Used to generate RBC Evs |
| Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | Used to generate RBC Evs |
| Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | Used to generate RBC Evs |
| Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Used to secure magnetic levitation device to lab jacks |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); used in antibody coupling reaction |
| Normal Rabbit IgG Control | R&D Systems | AB-105-C | Used to coat beads as a control condition |
| Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Component of coupling buffer, used for washing steps |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Component of activation buffer |
| Polystyrene Carboxyl Polymer | Bangs Laboratories | PC06004 | Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling |
| Rabbit RhD Polyclonal Antibody | Invitrogen | PA5-112694 | Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells |
| Research Grade Microscope | Olympus | Provis AX-70 | Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells |
| Rubber Dampening Feet | Thorlabs | RDF1 | Used to support the breadboard table |
| Square Boro Tubing | VitroTubes | 8100-050 | Capillary tube used for loading sample into Maglev |
| Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Used in antibody coupling reaction |
| Translational Stage | Thorlabs | PT1 | Used for focusing and for scanning capillary tube |
References
- Tasoglu, S., et al. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
- Durmus, N. G., et al.
- Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities. PLoS One. 10 (8), 0134400 (2015).
- Ashkarran, A. A., Suslick, K. S., Mahmoudi, M.
- Yaman, S., Tekin, H. C. Magnetic Susceptibility-Based Protein Detection Using Magnetic Levitation. Analytical Chemistry. 92 (18), 12556-12563 (2020).
- Abrahamsson, C. K., et al. Analysis of Powders Containing Illicit Drugs Using Magnetic Levitation. Angewandte Chemie Internation Edition in English. 59 (2), 874-881 (2020).
- Trajkovic, K., Valdez, C., Ysselstein, D., Krainc, D. Fluctuations in cell density alter protein markers of multiple cellular compartments, confounding experimental outcomes. PLoS One. 14 (2), 02117227 (2019).
- Hart, A., Edwards, C. Buoyant density fluctuations during the cell cycle of Bacillus subtilis. Archives of Microbiology. 147 (1), 68-72 (1987).
- Poole, R. K. Fluctuations in buoyant density during the cell cycle of Escherichia coli K12: significance for the preparation of synchronous cultures by age selection. The Journal General Microbiology. 98 (1), 177-186 (1977).
- Cass, C. E. Density-dependent fluctuations in membrane permeability in logarithmically growing cell cultures. Experimental Cell Research. 73 (1), 140-144 (1972).
- Grover, W. H., et al.
- Bryan, A. K., et al. Measuring single cell mass, volume, and density with dual suspended microchannel resonators. Lab on a Chip. 14 (3), 569-576 (2014).
- Gomer, R. H., Jang, W., Brazill, D. Cell density sensing and size determination. Development, Growth and Differentiation. 53 (4), 482-494 (2011).
- Neurohr, G. E., Amon, A. Relevance and Regulation of Cell Density. Trends in Cell Biology. 30 (3), 213-225 (2020).
- Maric, D., et al. Anatomical gradients in proliferation and differentiation of embryonic rat CNS accessed by buoyant density fractionation: alpha 3, beta 3 and gamma 2 GABAA receptor subunit co-expression by post-mitotic neocortical neurons correlates directly with cell buoyancy. European Journal of Neuroscience. 9 (3), 507-522 (1997).
- Maric, D., Maric, I., Barker, J. L. Buoyant density gradient fractionation and flow cytometric analysis of embryonic rat cortical neurons and progenitor cells. Methods. 16 (3), 247-259 (1998).
- Wolff, D. A., Pertoft, H. Separation of HeLa cells by colloidal silica density gradient centrifugation. I. Separation and partial synchrony of mitotic cells. Journal of Cell Biology. 55 (3), 579-585 (1972).
- Bienz, K., Egger, D., Wolff, D. A. Virus replication, cytopathology, and lysosomal enzyme response of mitotic and interphase Hep-2 cells infected with poliovirus. Journal of Virology. 11 (4), 565-574 (1973).
- Baldwin, W. W., Kubitschek, H. E. Buoyant density variation during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 158 (2), 701-704 (1984).
- Yurinskaya, V. E., et al. Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 16 (1-3), 15-22 (2005).
- Wyllie, A. H., Morris, R. G. Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment. American Journal of Pathology. 109 (1), 78-87 (1982).
- Morris, R. G., Hargreaves, A. D., Duvall, E., Wyllie, A. H. Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis. American Journal of Pathology. 115 (3), 426-436 (1984).
- Benson, R. S., Heer, S., Dive, C., Watson, A. J. Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis. American Journal of Physiology. 270 (4), Pt 1 1190-1203 (1996).
- Zipursky, A., Bow, E., Seshadri, R. S., Brown, E. J. Leukocyte density and volume in normal subjects and in patients with acute lymphoblastic leukemia. Blood. 48 (3), 361-371 (1976).
- Huber, C., et al. A comparative study of the buoyant density distribution of normal and malignant lymphocytes. British Journal of Haematology. 40 (1), 93-103 (1978).
- Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zanker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
- Andersen, M. S., et al. A Novel Implementation of Magnetic Levitation to Quantify Leukocyte Size, Morphology, and Magnetic Properties to Identify Patients with Sepsis. Shock. , (2018).
- Felton, E. J., et al. Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone. Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).
- Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity. Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).
