Summary
流感嗜血杆菌 诱发呼吸道炎症。本文将重点介绍如何使用流式细胞术和共聚焦显微镜来确定吞噬细胞和淋巴细胞对该细菌的免疫反应。
Abstract
流感嗜血杆菌 （Hi）是一种普遍存在于一系列呼吸系统疾病中的细菌。可以使用各种不同的测定/技术来评估对该细菌的呼吸道免疫/炎症反应。流式细胞术和共聚焦显微镜是基于荧光的技术，可以详细表征生物反应。可以使用不同形式的Hi抗原，包括细胞壁成分，杀死/灭活制剂和活细菌。Hi是一种苛刻的细菌，需要富集培养基，但通常很容易在标准实验室环境中生长。Hi刺激的组织样本可以从外周血、支气管镜检查或切除的肺（例如，在接受肺癌手术治疗的患者中）获得。可以使用流式细胞术全面评估巨噬细胞和中性粒细胞功能，并测量各种参数，包括吞噬作用、活性氧和细胞内细胞因子产生。淋巴细胞功能（例如，T细胞和NK细胞功能）可以使用流式细胞术进行特异性评估，主要用于细胞内细胞因子的产生。Hi感染是中性粒细胞（NET）和巨噬细胞（MET）产生细胞外陷阱的有效诱导剂。共聚焦显微镜可以说是评估NET和MET表达的最佳方法，也可用于评估蛋白酶活性。肺对 流感嗜血杆菌 的免疫力可以使用流式细胞术和共聚焦显微镜进行评估。
Introduction
流感嗜血杆菌 （Hi）是一种正常的共生细菌，存在于大多数健康成人的咽部。Hi可能具有多糖胶囊（A-F型，例如B型或HiB型）或缺乏胶囊并且不可分型（NTHi）1。这种细菌的粘膜定植始于儿童早期，并且存在不同定植菌株的更替2。这种细菌也能够侵入上呼吸道和下呼吸道;在这种情况下，它可以诱导免疫反应和炎症的激活3，4。这种炎症反应可能导致临床疾病并导致各种重要的呼吸系统疾病，包括鼻窦炎、中耳炎、支气管炎、囊性纤维化、肺炎和慢性阻塞性肺病 （COPD）。这些情况大多是由于NTHi菌株2引起的。本文将介绍使用流式细胞术和共聚焦显微镜评估对Hi的呼吸免疫反应的方法。
下面描述的方法已改编自成熟的技术，这些技术已被修改以评估对Hi的炎症反应。选择适当的抗原形式的Hi是该评估的关键部分。抗原制剂的范围从细胞壁成分到活细菌。为了建立和标准化检测，最初使用外周血样本可能非常有帮助。
流式细胞术能够在细胞水平上测量一个样品的各种参数和功能测定。与其他更通用的方法（例如酶联免疫吸附测定（ELISA）或ELISspot）相比，该技术的优点是可以评估特定的细胞反应（例如，活性氧（ROS）的产生或细胞内细胞因子的产生）。
细胞外陷阱由中性粒细胞（NET）5，6，7和其他细胞如巨噬细胞（MET）8表达。它们越来越被认为是一种关键的炎症反应，特别是在肺部感染中9.它们可以通过共聚焦荧光显微镜进行评估。该技术可以明确识别NET/MET，并将其表达与其他形式的细胞死亡区分开来6。
流式细胞术和共聚焦显微镜都是基于荧光的测定。它们的成功取决于生物样品的最佳过滤方案。这些方法确实需要一些时间来学习，并且需要适当的监督专业知识。所涉及的仪器的购买和运行成本也很高。使用它们的最佳环境包括主要大学和三级转诊医院。
本协议中使用的方法可转移用于研究涉及呼吸系统疾病的其他类似生物（例如， 卡他莫沙菌 和 肺炎链球菌）。NTHi还与其他常见的呼吸道细菌相互作用10。
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Protocol
这项工作得到了莫纳什健康人类研究伦理委员会的批准。该协议遵循人类研究伦理委员会的指导方针。
1.抗原制剂
注意：三种不同的抗原制剂可用于评估对Hi的免疫反应。这些是1）亚细胞成分（通常来自细菌细胞壁）;2）灭活和灭活细菌;3）活细菌。在开始任何实验之前确定每种抗原制剂的使用。
- 亚细胞成分
- 从来源获取亚细胞成分，包括商业制剂、内部开发的组分和/或其他研究人员。
注意：可以使用通常来自细菌细胞壁的亚细胞成分，包括外膜蛋白，例如P6和脂低糖（LOS）11，12。这些亚细胞成分通常来源于专门的中心。对它们如何制作的描述超出了本文的范围。建议直接与该领域的专家联系以获得这些组件。
- 从来源获取亚细胞成分，包括商业制剂、内部开发的组分和/或其他研究人员。
- 杀死/灭活的细菌
- 从适当的样本（例如痰液或支气管镜检查）中获取细菌。使用适当的微生物学实验室确认该菌株为 流感嗜血杆菌 。对 流感嗜血杆菌 样本进行分型，以确认它们是不可分型的（由专业微生物学实验室）。
- 为了获得代表性抗原，请使用多种NTHi菌株（至少5株，每种菌株的量大致相同）来制备混合抗原。将菌株储存在-70°C的微量离心管中的甘油肉汤中。
注意：在这个实验中，使用了十种不同的菌株。 - 将菌株（一次一个微量离心管）解冻到巧克力琼脂平板上，并在含有5%CO2的37°C培养箱中生长过夜。将细菌加入 500 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中并洗涤两次（以 300 x g 离心 5 分钟）。使用麦克法兰标准品10或分光光度计13将NTHi等分至10 8 mL的浓度（使用5 mL容器或等效物）。
- 通过将细菌置于温度为56°C的水浴中10分钟来加热灭活细菌。
- 使用连续超声设置以中低档速度对细菌进行超声处理 30 秒。
- 将适当体积的样品分装到微量离心管中。对于 108 mL 的样品，使用 50 μL 的等分试样（即每 mL 20 个样品），在 -70 °C 下冷冻直至需要14。
- 活细菌
- 首先，如步骤1.2.1中所述表征活细菌。使用一种特征明确的菌株。确保菌株也储存在-70°C的甘油肉汤中作为储备。
- 在富含的培养基（如巧克力琼脂平板或肉汤）上培养细菌。
- 要使用巧克力琼脂平板，请使用无菌撒布机至少每 3-4 天传播一次细菌。
- 或者，使用富含因子 X（血红素）和 V（β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）的脑心输液 （BHI） 肉汤来培养细菌。将过夜平板中的NTHi接种在补充有血红素和β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（均为10μg/ mL）的BHI肉汤中，并在37°C下在5%CO2 培养箱中培养过夜。
注意：这具有可重复性，更高的菌落形成单位（CFU）计数的优点，并且所有细菌都处于对数生长的相似阶段（在平板上，细菌活力可能更大，具体取决于培养物中的位置）13，15。
- 将 100 个细菌的多重感染 （MOI） 用于一个细胞，以引发强烈的免疫反应，同时保持细胞活力。使用麦克法兰标准10 或分光光度计13 来评估细菌的数量。
- 确保用于活NTHi测定的培养基不含任何人类血清，因为这将杀死细菌16。动物血清样本（例如胎牛血清）通常不会引起任何问题。
注意：使用下面描述的方法分析标准组织样本，例如外周血，支气管镜样本（特别是支气管肺泡灌洗（BAL））和切除的肺组织。将带有Hi抗原的样品孵育10分钟至24小时或更长时间。
2.流式细胞术评估吞噬功能
注意：该测定需要溶液中的细胞，通常在全血或使用BAL液中进行。该测定是从先前发表的基于使用灭活的 金黄色葡萄球菌 制剂和Pansorbin17的方案修改而来的。灭活的全血和固定 的流感嗜血杆菌 取代了Pansorbin17。
- 在室温下以1：1的比例将杀死，灭活的NTHi（1.2）与碘化丙啶（PI）以100μg/ mL在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中混合30分钟。以 450 x g 离心 5 分钟，然后在 500 μL PBS 中洗涤。以 450 x g 旋转 5 分钟，并将沉淀重悬于 500 μL PBS 中。
- 将 450 μL 外周血（来自人类受试者的静脉穿刺）与 50 μL 灭活的 PI 标记 的流感嗜血 杆菌在 37 °C 的水浴中在 5 mL 管中孵育 20 分钟。
- 从水浴中取出样品，加入 5 μL 二氢罗丹明-1，2，3 （DHR）。涡旋10秒，然后将其放回水浴中再放置10分钟。
- 从水浴中取出样品，并用 10：1（即 5 mL）的 0.8% 氯化铵（150 mM NH4Cl、1 mM NaHCO3 和 0.1 mM EDTA）溶液裂解红细胞（500 μL 体积，如上述步骤 2.2 中列出的）。
注意：或者，可以使用自动化系统，例如 Q-prep。 - 在一小时内在流式细胞仪上分析样品。分析每个样品中至少3，000-5，000个细胞（来自每个感兴趣的子集），以获得具有代表性的结果（图1）。
- 为了分析样品的吞噬作用，确定具有摄入标记细菌的细胞比例（测量具有荧光染色的细胞比例）。
- 通过 DHR 的氧化来量化 ROS，从而产生荧光信号（比较基线样品和受激发样品之间中位荧光的变化）。
注意：中性粒细胞更细，侧向散射更多，而巨噬细胞更大，前向散射更多。 - 通过大小（巨噬细胞较大）和粒度（中性粒细胞更细）在形态上区分中性粒细胞和巨噬细胞。
注意：中性粒细胞和巨噬细胞的特定标志物通常不使用，尽管CD14可用于标记血液单核细胞。流式细胞术可用于区分单核细胞和巨噬细胞的不同功能形式（例如，M1 和 M2 亚群）18。
- 根据需要修改测定（例如，使用活的未标记NTHi刺激吞噬细胞并通过DHR切割测量ROS表达）。
- 通过密度梯度离心分离外周血单核细胞。将血液分层在指定的聚合物上以进行密度梯度离心，并以2300× g 旋转30分钟。使用移液管去除单核层，用PBS洗涤两次，并以每毫升106 个细胞的速度将细胞重悬于PBS中。
- 作为替代方案，使用 BAL 巨噬细胞。
- 将单核细胞/巨噬细胞以 106 个细胞/mL 的浓度悬浮在培养基 （RPMI） 中。如步骤1.3中所述，以100：1的MOI感染活NTHi1小时。
- 按照步骤2.3中的说明将DHR添加到悬浮液中10分钟。使用流式细胞术进行ROS分析。
3.外周血淋巴细胞功能的评估
- 使用全血或单核细胞制剂进行流式细胞术测定14.
- 通过静脉穿刺从每个受试者身上获取样本。从锂肝素管中的外周静脉收集 4 mL 血液，并将样品分成等分试样以进行对照和抗原刺激。
- 向两个样品中添加共刺激抗体（抗CD28和CD49d，1μL/mL）。将NTHi加入抗原样品中，并在37°C和5%CO2 下孵育1小时。对于杀死的NTHi制备，将200μL抗原添加到2mL血液中。对于活NTHi，将MOI为100：1的活NTHi细胞添加到白细胞中（通过血细胞计数器测量）。
- 将高尔基体封闭剂布雷菲尔丁A（10μL / mL）加入样品中，并再孵育5小时。
注意：阻断高尔基体可防止细胞因子输出到细胞外。 - 如果使用全血，则用0.8%氯化铵裂解红细胞（步骤2.4），仅将白细胞留在溶液中。使用500μL1%-2%多聚甲醛固定白细胞1小时。
- 通过血细胞计数器计数细胞，用100μL0.1%皂苷透化106 个细胞15分钟，并用荧光标记的抗体孵育细胞。洗涤细胞并使用流式细胞仪进行分析。
注意：荧光标记抗体的数量将特定于每种细胞因子。按照制造商的说明进行操作。通常，将100μL溶液中的106 个细胞染色1小时。大多数商业获得的抗体足以进行25-100次测试。 - 通过门控相关淋巴细胞群（细胞由CD45，然后由CD3，然后通过CD4或CD8表达门控）来确定抗原反应细胞的比例，如图 2所示。对未刺激的细胞进行背景染色，以分析所有要分析的细胞因子。筛选 100，000 个细胞以分析每种细胞因子的刺激细胞和对照。
4.肺组织中淋巴细胞功能/炎症介质的评估
- 通常不可能从支气管镜检查中获得足够的淋巴细胞;因此，使用肺叶切除术样本中的肺组织。肺组织样本的优化需要与解剖病理学服务部门密切联系。确保组织距离肿瘤至少 3 cm，并且是没有明显肺气肿的细胞组织（由病理学家确定）。
- 将肺组织分解成细胞悬液，然后才能用于流式细胞术测定。化学消化肺组织（例如，用胶原酶）或机械分解肺组织。
注意：组织的机械解聚可能是优选的，因为这与更好的细胞表面染色（例如，CD3 / 4标记）有关19。- 从病理学家处获取肺叶切除术样本（通常从接受肺癌治疗的患者获得）。将约20-40克样品切成3-5毫米3 段。将它们放入无菌 50 μL 腔室中，然后使用适当的解聚器进行机械破碎。
- 组织解聚后，如步骤2.4所述，用0.8%NH4Cl裂解红细胞。
- 将细胞重悬于无菌RPMI中（体积取决于细胞数量，通常为10-20mL），然后通过100μm无菌尼龙网过滤。使用台盼蓝排除方法计算活细胞的数量。
- NTHi感染检测
- 将肺细胞重悬至每管 4 x 106 个 细胞/mL 的最终细胞浓度（对照和刺激样品）。
- 在 1 mL RPMI 中使用 4 x 10 6-6 x 106 细胞的悬浮液用于（阴性）对照管。对NTHi管使用相同量（任何其他样品都可以用作SEB的阳性对照）。以每个细胞 100 个细菌的 MOI 感染 NTHi 管中的细胞。松开盖子旋转半圈，以允许气体在管中转移。
- 将细胞放入试管旋转器中，并在37°C下孵育它们，同时以12rpm旋转。
- 为了防止细胞因子的细胞外输出，在刺激后1小时向细胞悬液中加入高尔基体阻滞剂（Brefeldin A），最终浓度为10μg/ mL。返回细胞悬液，在旋转时再孵育16-22小时（步骤4.3.3）。
- 用含有 500 μL 含有 1% 牛血清白蛋白 （BSA） 和 0.01% NaN3 的 PBS 洗涤细胞悬液。分别如步骤3.5和步骤3.6中所述固定和透化细胞。
- 添加用于细胞内细胞因子染色的抗体（抗体的选择由研究者确定，如步骤3.6中的注释中所列）。对细胞悬液进行染色以寻找特定的人淋巴细胞表面标志物（例如，CD45，CD3等）1小时。用PBS洗涤细胞，如步骤3.5-3.6中所述固定并透化它们。
- 用细胞内细胞因子染色抗体（例如IFN-γ和TNF-α或IL-13和IL-17A）孵育细胞1小时。
注意：建议先染色表面标志物，然后对细胞内进行染色，因为固定会导致抗体结合的表面蛋白的构象变化。 - 在流式细胞仪上采集数据之前，用 500 μL PBS 洗涤细胞并重悬于 100 μL PBS 中。
- 磁珠阵列测定可以联合用于分析步骤3.2中描述的上清液（在没有布雷菲尔丁A的情况下执行此操作）。这允许分析各种不同的炎症介质（可能多达40-50个介质）。以100μL等分试样收集上清液并储存在-70°C直至准备好进行分析。或者，可以使用多重化学发光测定20。
- 使用多重磁珠阵列分析解冻的样品。按照制造商的说明，使用储存的上清液分析细胞因子的产生。
- 在流式细胞仪上采集多重微球阵列。使用相关软件进行下游数据分析。
注意：该磁珠阵列测定也可以对外周血和/或BAL样品的上清液进行。
5. 共聚焦显微镜评估肺蛋白水解
注意：荧光共聚焦显微镜与流式细胞术互补，可用于评估蛋白酶和ROS炎症反应。NET和MET等细胞外陷阱由细胞外染色质（DNA）与其他炎症介质组成，特别是蛋白酶，如中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和基质金属蛋白酶（MMP）。它们可以使用共聚焦显微镜在BAL和肺组织中进行评估，Sharma，R.等人之前已经描述了这一点21。
- 使用共聚焦显微镜和 原位 酶图15，17评估肺组织中的直接蛋白酶表达（如步骤4.2.1中所述）。
- 使用新鲜或冷冻的未固定肺组织。将切割成 4 μm 厚度的切片安装在超级霜冻/粘附载玻片上。将切片在1x反应缓冲液中预热5分钟。
- 直接在单个载玻片上添加荧光素标记的明胶底物（每切片 30 μg/mL），以通过金属蛋白酶的作用测量蛋白水解。
- 将载玻片置于水平位置，并在37°C的避光加湿室中孵育1小时。
- 在安装前在1x反应缓冲液中冲洗切片。
- 作为阴性对照，仅向切片中加入不含荧光明胶的反应缓冲液。
- 使用共聚焦显微镜通过检查测定底物的裂解。使用 ImageJ 确定有蛋白水解证据的肺区域。为此，测量淬灭样品背景上方染色的肺区域。作为另一种对照，使用不添加荧光明胶的肺组织15。
注意：每个样本至少在 10 个高功率视场 （FOV） 上执行此操作。
- 通过3-硝基酪氨酸（一种有毒氧化应激产物）的免疫反应性测量肺组织中的细胞外ROS表达13。
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Representative Results
代表性结果表明如何通过流式细胞术和共聚焦显微镜评估/定量对NTHi的炎症免疫反应。解释结果的一个关键部分是对照样品和受激发样品之间的荧光比较。通常需要进行一些初步实验来优化样品的染色。可以同时检测多少种不同的颜色取决于流式细胞仪/共聚焦显微镜上可用的通道数。结果显示用于评估1）ROS产生，2）人肺组织的细胞内细胞因子染色和3） 原位 酶图测量肺蛋白水解。
图1 显示了单核细胞产生ROS的表示。ROS的测量是通过氧化DHR123产生荧光。对细胞进行门控，并通过流式细胞术评估其中位数荧光。将受激发样品的中位数荧光与对照进行比较。
图2 显示了来源于人肺组织的淋巴细胞在细胞内产生细胞因子。在进行流式细胞术测定以评估炎症介质的产生（例如淋巴细胞产生的细胞因子）之前，需要将肺组织分解成单细胞悬液。肺组织可以机械分解或化学消化，例如通过胶原酶。机械分解方法可以产生更好的结果，特别是在保留细胞表面染色（例如，CD3和CD4）方面。过滤样品对于排除可能干扰分析的碎片非常重要。
图3 显示了通过 原位 酶谱测量的蛋白酶活性的表达。未固定的组织用于评估蛋白酶活性。这些样品通常在-70°C下冷冻直至分析。测量具有蛋白酶荧光的组织面积，并在对照样品和受刺激样品之间比较结果。
图1：单核细胞产生ROS。 （A）该面板显示了外周血单核细胞（PBMC）的门控策略，其中前向散射和侧散射用于定义吞噬细胞群。在图（B）中，吞噬细胞群通过CD14表达进一步定义以标记单核细胞。分析该单核细胞群在对照（C）和受刺激样品（D）中的DHR荧光。 请点击此处查看此图的大图。
图2：肺组织中的细胞因子产生。 首先使用流式细胞术分析细胞对白细胞标志物CD45（A）的表达。然后进一步分析该群体的CD3表达（B）和CD4 / CD8表达（C）。评估CD3 / CD4 +细胞在对照（D）和NTHi刺激样品（E）中的细胞内细胞因子产生。 请点击此处查看此图的大图。
图3：肺原位酶图。图（A）显示了染色质/DAPI在肺组织切片中的表达。图（B）显示荧光染色，表明存在MMP活性。图（C）显示合并的图像，表明MMP活性也与染色质的表达共定位。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
这里列出的方法使用基于荧光的流式细胞术和共聚焦显微镜技术，可以结合使用以获得有关炎症性肺对Hi反应的详细信息。
建立要使用的Hi的适当抗原制剂至关重要，建议在这方面获得微生物学家的具体意见。Live Hi 会引起更强的反应，而杀死 Hi 准备和 Hi 组件更标准化，更容易存储。PI只会标记死细菌22;其他染料如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）可用于标记活细菌以进行吞噬作用测定23。应进行一系列初步实验以优化适当的抗原。对于使用实时NTHi，MOI为100：1是最佳的;较低的MOI可能不会诱导明确的免疫反应，而较高的MOI可能对细胞有毒。然而，剂量-反应曲线可以提供有用的信息并且可能非常有价值，特别是对于该技术的初始优化24。作为阳性对照，可以使用商业获得的灭活金 黄色葡萄球菌 抗原形式，其也用PI标记，如上所述用于ROS/吞噬测定。对于T细胞测定，葡萄 球菌 超级抗原E（SEB）的刺激可用作阳性对照19，25。
需要明确建立获取BAL和/或肺组织样本的方案。BAL 样本在不同的运算符之间可能差异很大。用于右中叶灌洗的手持式注射器产生良好的效果26。从肺叶切除术样本中获取肺组织样本需要与病理学家建立合作关系。肺组织样本应与肿瘤有一些边缘（理想情况下至少为3-4厘米）。较大的样本（例如，至少 25-50 g）将产生更多的细胞，以及更近端且无明显肺气肿的样本。肺组织的机械分解非常耗时，每个样品通常需要至少 3-3 小时19，27。
应进行初步实验以优化流式细胞术和共聚焦显微镜的不同荧光团的染色。需要关注的领域包括确定最佳染色组合、染色/浓缩以及细胞/组织处理以最大限度地提高活力28.与其他液体样本（如血液或BAL）相比，肺组织的使用可能与更多的组织碎片有关，这可能对流式细胞术不同细胞群的分化有一定影响。抗体的适当选择需要在初步实验中确定和优化。对于淋巴细胞的表面标记，抗CD3和CD4可用于T辅助细胞，抗CD3和CD8可用于细胞毒性T细胞，抗CD3和CD56可用于NK细胞。要研究的细胞内细胞因子的选择取决于感兴趣的介质和可以在流式细胞仪29上分析的参数/颜色的数量。在肺组织中处理巨噬细胞的一个具体挑战是它们的高水平自发荧光30;这个问题可以通过比较受刺激的细胞与背景对照和添加特定的炎症标志物（如蛋白酶和组蛋白）来解决。
这些技术的局限性是需要经过适当培训和熟练的工作人员来执行实验。还需要完善的流式细胞术和显微镜检查设施。人体组织样本的使用具有显著的变异性，尤其是在使用肺组织时;这可能需要一系列初步实验来优化测定（特别是在背景染色问题上）。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢Monash Health临床免疫学的工作人员对这项工作的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
References
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