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Neuroscience

चूहों में मॉडलिंग स्ट्रोक: बाहरी कैरोटिड धमनी के माध्यम से क्षणिक मध्य मस्तिष्क धमनी Occlusion

Published: May 24, 2021 doi: 10.3791/62573
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Institute for Stroke and Dementia Research, LMU Munich, 2Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy)

Summary

मध्य मस्तिष्क धमनी ऑक्क्यूज़न (एमसीएओ) के विभिन्न मॉडलों का उपयोग प्रायोगिक स्ट्रोक अनुसंधान में किया जाता है। यहां, बाहरी कैरोटिड धमनी (ईसीए) के माध्यम से क्षणिक एमसीएओ के एक प्रयोगात्मक स्ट्रोक मॉडल का वर्णन किया गया है, जिसका उद्देश्य मानव स्ट्रोक की नकल करना है, जिसमें सहज थक्का लाइसिस या थेरेपी के कारण सेरेब्रोवैस्कुलर थ्रोम्बस को हटा दिया जाता है।

Abstract

स्ट्रोक मृत्यु का तीसरा सबसे आम कारण है और विकसित देशों में अधिग्रहीत वयस्क विकलांगता का प्रमुख कारण है । आज तक, चिकित्सीय विकल्प स्ट्रोक के बाद पहले घंटे के भीतर स्ट्रोक रोगियों के एक छोटे से अनुपात तक ही सीमित हैं। उपन्यास चिकित्सकीय रणनीतियों की बड़े पैमाने पर जांच की जा रही है, विशेष रूप से चिकित्सीय समय खिड़की को लम्बा करने के लिए । इन वर्तमान जांचों में स्ट्रोक के बाद महत्वपूर्ण रोगविज्ञानी रास्तों का अध्ययन शामिल है, जैसे स्ट्रोक के बाद सूजन, एंजियोजेनेसिस, न्यूरोनल प्लास्टिसिटी, और पुनर्जनन। पिछले दशक में, स्वतंत्र अनुसंधान समूहों के बीच प्रयोगात्मक परिणामों और वैज्ञानिक निष्कर्षों की खराब प्रजनन क्षमता के बारे में चिंता बढ़ रही है । तथाकथित "प्रतिकृति संकट" को दूर करने के लिए, सभी प्रक्रियाओं के लिए विस्तृत मानकीकृत मॉडल की तत्काल आवश्यकता है। "इम्यूनोस्ट्रोक" अनुसंधान कंसोर्टियम (https://immunostroke.de/) के भीतर एक प्रयास के रूप में, क्षणिक मध्य मस्तिष्क धमनी ऑक्क्लुसेशन (एमसीएओ) का एक मानकीकृत माउस मॉडल प्रस्तावित है। यह मॉडल फिलामेंट को हटाने पर रक्त प्रवाह की पूरी बहाली की अनुमति देता है, जो मानव स्ट्रोक के एक बड़े हिस्से में होने वाले चिकित्सीय या सहज थक्के लाइसिस का अनुकरण करता है। इस "फिलामेंट" स्ट्रोक मॉडल और इसके कार्यात्मक विश्लेषण के लिए उपकरणों की शल्य प्रक्रिया साथ वीडियो में प्रदर्शित कर रहे हैं।

Introduction

स्ट्रोक दुनिया भर में मौत और विकलांगता के सबसे आम कारणों में से एक है । यद्यपि स्ट्रोक के मुख्य रूप से दो अलग-अलग रूप हैं, इस्कीमिक और रक्तस्राविक, सभी स्ट्रोक मामलों में से 80-85% इस्कीमिक1हैं। वर्तमान में, इस्कीमिक स्ट्रोक वाले रोगियों के लिए केवल दो उपचार उपलब्ध हैं: रीकॉम्बिनेंट ऊतक प्लाज्मिनोजेन एक्टिवेटर (आरटीपीए) या यांत्रिक थ्रोम्बेक्टॉमी के साथ औषधीय उपचार। हालांकि, संकीर्ण चिकित्सीय समय खिड़की और कई बहिष्कार मापदंड के कारण, रोगियों की केवल एक चुनिंदा संख्या इन विशिष्ट उपचार विकल्पों से लाभान्वित हो सकती है। पिछले दो दशकों में, प्रीक्लिनिकल और ट्रांसलेशनल स्ट्रोक अनुसंधान ने न्यूरोप्रोटेक्टिव दृष्टिकोणों के अध्ययन पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि, नैदानिक परीक्षणों तक पहुंचने वाले सभी यौगिकों ने अब तक रोगी2के लिए कोई सुधार नहीं दिखाया है।

चूंकि इन विट्रो मॉडल स्ट्रोक के सभी मस्तिष्क इंटरैक्शन और रोगविज्ञानी तंत्र को सही ढंग से पुन: पेश नहीं कर सकते हैं, इसलिए पशु मॉडल प्रीक्लिनिकल स्ट्रोक अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, एक ही पशु मॉडल में मानव इस्कीमिक स्ट्रोक के सभी पहलुओं की नकल करना संभव नहीं है, क्योंकि इस्कीमिक स्ट्रोक एक अत्यधिक जटिल और विषम रोग है। इस कारण से विभिन्न प्रजातियों में समय के साथ अलग-अलग इस्कीमिक स्ट्रोक मॉडल विकसित किए गए हैं। सेरेब्रल आर्टेरियोल्स के फोटोथ्रोम्बोसिस या मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) के स्थायी डिस्टल ऑक्क्लुस का आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले मॉडल होते हैं जो नियोकॉर्टेक्स3,4में छोटे और स्थानीय रूप से परिभाषित घावों को प्रेरित करते हैं। उन लोगों के अलावा, सबसे अधिक इस्तेमाल किया स्ट्रोक मॉडल शायद तथाकथित "फिलामेंट मॉडल," जिसमें एमसीए के एक क्षणिक occlusion हासिल की है । इस मॉडल में एमसीए की उत्पत्ति के लिए एक सीवन फिलामेंट का क्षणिक परिचय होता है, जिससे मस्तिष्क रक्त प्रवाह में अचानक कमी आती है और बाद में घटाव और कॉर्टिकल मस्तिष्क क्षेत्रों का बड़ा इंफेक्शन5 होताहै। हालांकि अधिकांश स्ट्रोक मॉडल एमसीए ऑक्लसियन 6की नकल करते हैं, "फिलामेंट मॉडल" इस्कीमिक समय के सटीक परिसीमन की अनुमति देता है। फिलामेंट हटाने द्वारा रिफ्यूजन सहज या चिकित्सीय (आरटीपीए या यांत्रिक थ्रोम्बेक्टॉमी) क्लॉट लाइसिस के बाद मस्तिष्क रक्त प्रवाह बहाली के मानव नैदानिक परिदृश्य की नकल करता है। आज तक, इस "फिलामेंट मॉडल" के विभिन्न संशोधनों का वर्णन किया गया है। सबसे आम दृष्टिकोण में, पहले लोंगा एट अलद्वारा वर्णित है। 19895में, एक सिलिकॉन-लेपित फिलामेंट एमसीए 7 की उत्पत्ति के लिए आम कैरोटिड धमनी (सीसीए) के माध्यम से पेश कियाजाताहै। हालांकि यह एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला दृष्टिकोण है, यह मॉडल रिफ्यूजन के दौरान रक्त प्रवाह की पूर्ण बहाली की अनुमति नहीं देता है, क्योंकि पीसीए को फिलामेंट को हटाने के बाद स्थायी रूप से लिगामेंट किया जाता है।

पिछले एक दशक में, अनुसंधान समूहों की बढ़ती संख्या इस "फिलामेंट मॉडल का उपयोग कर चूहों में स्ट्रोक मॉडलिंग में रुचि है." तथापि, इस मॉडल की काफी परिवर्तनशीलता और प्रक्रियाओं के मानकीकरण की कमी प्रायोगिक परिणामों और वैज्ञानिक निष्कर्षों की उच्च परिवर्तनशीलता और खराब पुनरुत्पादनता के कुछ कारण हैंजोअब तक2,8रिपोर्ट किए गए हैं । वर्तमान "प्रतिकृति संकट" का एक संभावित कारण, अनुसंधान प्रयोगशालाओं के बीच कम प्रजनन क्षमता की चर्चा करते हुए, एक ही प्रयोगात्मक पद्धति9का उपयोग कर अनुसंधान समूहों के बीच गैर तुलनीय स्ट्रोक infarct संस्करणों है । वास्तव में, पहले प्रीक्लिनिकल यादृच्छिक नियंत्रित मल्टीसेंटर परीक्षण अध्ययन10आयोजित करने के बाद, हम इस बात की पुष्टि करने में सक्षम थे कि इस प्रायोगिक स्ट्रोक मॉडल के पर्याप्त मानकीकरण की कमी और बाद के परिणाम पैरामीटर स्वतंत्र प्रयोगशालाओं के बीच प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में प्रजनन क्षमता की विफलता के मुख्य कारण थे11 . परिणामस्वरूप infarct आकार में इन कठोर मतभेदों, एक ही स्ट्रोक मॉडल का उपयोग करने के बावजूद, उचित न केवल पुष्टित्मक अनुसंधान के लिए एक खतरा पैदा करते हैं, लेकिन यह भी मजबूत और प्रजनन मॉडल की कमी के कारण वैज्ञानिक सहयोग के लिए ।

इन चुनौतियों के प्रकाश में, हम विकसित करने और विस्तार से एक मानकीकृत क्षणिक MCAo मॉडल के लिए प्रक्रिया का वर्णन करने के रूप में "इम्यूनोस्ट्रोक" अनुसंधान कंसोर्टियम (https://immunostroke.de/) के भीतर सहयोगात्मक अनुसंधान के प्रयासों के लिए इस्तेमाल किया उद्देश्य । इस कंसोर्टियम का उद्देश्य स्ट्रोक वसूली के मशीनी सिद्धांतों में अंतर्निहित मस्तिष्क-प्रतिरक्षा बातचीत को समझना है। इसके अलावा, स्ट्रोक परिणाम विश्लेषण के लिए हिस्टोलॉजिकल और संबंधित कार्यात्मक तरीके प्रस्तुत किए जाते हैं। सभी विधियां इम्यूनोस्ट्रोक कंसोर्टियम की सभी शोध प्रयोगशालाओं में उपयोग की जाने वाली स्थापित मानक परिचालन प्रक्रियाओं पर आधारित हैं।

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Protocol

इस वीडियो में रिपोर्ट किए गए प्रयोगों को प्रायोगिक जानवरों के उपयोग के लिए राष्ट्रीय दिशानिर्देशों का पालन करते हुए आयोजित किया गया था, और प्रोटोकॉल को जर्मन सरकारी समितियों (रेजियुंग वॉन ओबरबायर्न, म्यूनिख, जर्मनी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। दस सप्ताह पुराने पुरुष C57Bl/6J चूहों का इस्तेमाल किया गया और नियंत्रित तापमान (22 ± 2 डिग्री सेल्सियस) के तहत रखे गए थे, एक 12 घंटे प्रकाश अंधेरे चक्र अवधि और पेल्ड भोजन और पानी विज्ञापन libitum के लिए उपयोग के साथ ।

1. सामग्री और उपकरणों की तैयारी

  1. ऑपरेशन क्षेत्र के तापमान और संज्ञाहरण के दौरान माउस शरीर के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने के लिए गर्मी कंबल को कनेक्ट करें।
  2. ऑटोक्लेव कैंची और संदंश, 70% इथेनॉल समाधान तैयार करें और उपलब्ध रखें डीएक्सेनथेनॉल आई मरहम, कपास के कई टुकड़े, और 5-0 लेपित लट पॉलिएस्टर सीवन उपयोग के लिए तैयार हैं। जानवर के चीरा साइट को हाइड्रेटेड रखने के लिए 0.9% नमकीन समाधान (सुई के बिना) के साथ 1 मिली सिरिंज तैयार करें। एनेस्थीसिया गैस (100% O2+ आइसोफलुने) तैयार करें।
  3. 10 माइक्रोल पिपेट टिप (3-5 मिमी लंबाई) की नोक को काटकर लेजर डॉप्लर जांच के लिए एक धारक तैयार करें।
    नोट: सभी उपकरणों को गर्म मनका स्टरलाइजर का उपयोग करके निष्फल किया जाता है। सतहों को माइक्रोबियल कीटाणुनाशक स्प्रे के साथ सर्जरी से पहले और बाद में कीटाणुरहित भी किया जाता है। सर्जरी से पहले, चूहों के सिर और छाती के आसपास के क्षेत्र घाव कीटाणुशोधन स्प्रे से कीटाणुरहित होते हैं।

2. लेजर डॉप्लर की तैयारी

  1. सर्जरी से पहले माउस को एनाल्जेसिया इंजेक्ट करें (4 मिलीग्राम/किलो कारप्रोफेन और 0,1 मिलीग्राम/किलो बुप्रेनोरफिन, इंट्रापेरिटोनेली)।
  2. सहज शरीर आंदोलन और वाइब्रिसे की समाप्ति तक 4% की आइसोफ्लुने प्रवाह दर के साथ इंडक्शन चैंबर में रखकर माउस को एनेस्थेटाइज करें।
  3. माउस को एनेस्थीसिया मास्क में अपनी नाक के साथ ऑपरेशन क्षेत्र में प्रवण स्थिति में रखें। एक और मिनट के लिए 4% पर आइसोफ्लुन एकाग्रता बनाए रखें, तो इसे कम करने और 2% पर रखें ।
  4. माउस शरीर के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने के लिए संबंधित प्रतिक्रिया-नियंत्रित हीटिंग पैड सेट करें, और पूरे सर्जिकल प्रक्रियाओं में तापमान की निगरानी करने के लिए धीरे-धीरे गुदा जांच डालें।
  5. दोनों आंखों पर डिप्रेमी आई मरहम लगाएं।
  6. 70% इथेनॉल के साथ बाईं आंख और कान के आसपास की त्वचा और बालों को कीटाणुरहित करें।
  7. खोपड़ी की हड्डी को बेनकाब करने के लिए बाएं कान और आंख (1 सेमी लंबी) के बीच खोपड़ी को काटें।
  8. कट और खोपड़ी के नीचे एमसीए कल्पना करने के लिए लौकिक मांसपेशी रिटायर।
  9. गोंद के साथ फिक्स लेजर डॉप्लर जांच पकड़े टिप के बाहरी भाग/ फिर, टिप धारक के चारों ओर घाव को बंद करने के लिए त्वचा को गोंद करें। प्रक्रिया को गति देने के लिए हार्डनर गोंद की 2-3 बूंदें लगाएं। सुनिश्चित करें कि लेजर डॉप्लर फाइबर चिपका नहीं है और आसानी से किसी भी समय टिप धारक से हटाया जा सकता है।

3. क्षणिक एमसीएओ मॉडल (ऑक्सक्लूशन)

  1. माउस को रीढ़ की स्थिति में बदल दें। संज्ञाहरण शंकु में थूथन रखो और टेप के साथ पंजे को ठीक करें।
  2. छाती के आसपास की त्वचा और बालों को कीटाणुरहित करें और गर्दन में 2 सेमी लंबी मिडलाइन चीरा लगाएं।
  3. त्वचा और उपमंडीबुलर ग्रंथियों को अलग करने के लिए संदंश का उपयोग करें। स्टर्नोमास्टोइड मांसपेशी को पकड़ने के लिए रिट्रैक्टर्स का उपयोग करें, सर्जिकल क्षेत्र का पर्दाफाश करें और बाएं आम कैरोटिड धमनी (सीसीए) ढूंढें। सीसीए को संयोजी ऊतक और आसपास की नसों (वागल तंत्रिका को नुकसान पहुंचाए बिना) से मुक्त करें और विभाजन से पहले क्षणिक लिगेशन करें।
  4. बाहरी कैरोटिड धमनी (ईसीए) को विच्छेदन करें और सबसे डिस्टल दृश्यमान हिस्से में एक स्थायी गाँठ बांधें। ईसीए के नीचे एक और सीवन रखें, विभाजन के करीब, और बाद में उपयोग किए जाने के लिए एक ढीली गाँठ तैयार करें।
  5. आंतरिक कैरोटिड धमनी (आईसीए) को विच्छेदन करें और उस पर एक माइक्रोवैस्कुलर क्लिप रखें, विभाजन पर 5 मिमी। सुनिश्चित करें कि वागल तंत्रिका को नुकसान न पहुंचाए।
  6. तंग और ढीले लिगेशन के बीच ईसीए में एक छोटा सा छेद काटें; पूरे ईसीए में कटौती न करने के लिए सावधान रहें।
  7. फिलामेंट का परिचय दें और इसे सीसीए की ओर आगे बढ़ाें। उस स्थिति में फिलामेंट को शीघ्र ही सुरक्षित करने और माइक्रोवैस्कुलर क्लिप को हटाने के लिए रक्तस्राव से बचने के लिए ल्यूमेन के चारों ओर ईसीए में ढीले लिगेशन को कस लें।
  8. माइक्रोवैस्कुलर क्लिप निकालें और आईसीए के माध्यम से फिलामेंट डालें जब तक कि एमसीए की उत्पत्ति लेजर डॉप्लर द्वारा मापा गया सेरेब्रल रक्त प्रवाह में तेज कमी (>80%) का पता लगाकर न पहुंच जाए। ईसीए के चारों ओर गाँठ को और मजबूत करके इस स्थिति में फिलामेंट को ठीक करें।
    नोट: जब फिलामेंट उचित दिशा की ओर जाता है, तो यह सुचारू रूप से आगे बढ़ता है, और कोई प्रतिरोध नहीं देखा जाना चाहिए।
  9. फिलामेंट प्रविष्टि से पहले और बाद में लेजर डॉप्लर मूल्यों को रिकॉर्ड करें।
  10. रिट्रैक्टर को हटा दें और घाव को सटाने से पहले स्टर्नोमास्टोइड मांसपेशी और उपमंडीबुलर ग्रंथियों को स्थानांतरित करें। लेजर डॉप्लर जांच निकालें, और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक वसूली कक्ष में जानवर जगह (फिलामेंट हटाने तक)।

4. क्षणिक MCAo मॉडल (Reperfusion)

  1. सहज शरीर आंदोलन और वाइब्रिसे की समाप्ति तक 4% की आइसोफ्लुने प्रवाह दर के साथ इंडक्शन चैंबर में रखकर माउस को एनेस्थेटाइज करें।
  2. दोनों आंखों पर डिप्रेमी आई मरहम लगाएं।
  3. माउस को एनेस्थीसिया मास्क में अपने स्नाउट के साथ ऑपरेशन क्षेत्र में प्रवण स्थिति में रखें। एक और मिनट के लिए 4% पर आइसोफ्लुन एकाग्रता बनाए रखें, तो इसे कम करने और 2% पर रखें । टेप के साथ जानवर के पंजे को ठीक करें।
  4. जांच धारक में लेजर डॉप्लर जांच डालें।
  5. घाव सीवन को हटा दें, त्वचा और उपमंडीबुलर ग्रंथियों को अलग करने के लिए संदंश का उपयोग करें। स्टर्नोमास्टोइड मांसपेशी को धीरे-धीरे खींचने और सर्जिकल क्षेत्र का पर्दाफाश करने के लिए रिट्रैक्टर का उपयोग करें।
  6. ईसीए सीवन को ढीला करें जो फिलामेंट को मजबूत करता है, और धीरे-धीरे फिलामेंट खींचता है। हटाने के दौरान फिलामेंट के सिलिकॉन-रबर कोटिंग को नुकसान पहुंचाने से बचें।
  7. कसकर ईसीए सीवन टाई।
  8. लेजर डॉप्लर डिवाइस (रिप्रेरण से पहले प्रारंभिक मूल्य का >80%) में सेरेब्रल रक्त प्रवाह में वृद्धि की पुष्टि करें।
  9. फिलामेंट हटाने से पहले और बाद में रिकॉर्ड लेजर डॉप्लर मूल्य।
  10. सीसीए से विभाजन से पहले क्षणिक लिगेशन खोलें।
  11. रिट्रैक्टर को हटा दें, और घाव को टांका लगाने से पहले स्टर्नोमास्टोइड मांसपेशी और उपमंडीबुलर ग्रंथियों को स्थानांतरित करें। संज्ञाहरण से ठीक होने के लिए 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक वसूली कक्ष में जानवर रखें।
  12. वसूली के बाद, चूहों को तापमान नियंत्रित कमरे में उनके पिंजरों में वापस करें।
  13. सर्जरी के बाद 3 दिन तक पिंजरे के फर्श पर छोटे पेट्री व्यंजनों में गीले भोजन छर्रों और हाइड्रोजेल जोड़कर जानवरों की देखभाल करें।
  14. सर्जरी के बाद 3 डी के लिए हर 12 घंटे में एनाल्जेसिया इंजेक्ट करें (4 मिलीग्राम/किलो कार्प्रोफेन और ०.१ मिलीग्राम/किलो बुप्रेनोरफिन) ।

5. शाम ऑपरेशन

  1. ऊपर वर्णित सभी प्रक्रियाओं को करें, जिसमें धमनियों का बंधन और फिलामेंट (चरण 1-3.7) की शुरूआत शामिल है।
  2. इसके सम्मिलन के तुरंत बाद फिलामेंट निकालें। फिर, पशु को 1 घंटे के लिए रिकवरी चैंबर में रखें।
  3. जानवर को फिर से ऑपरेशन क्षेत्र में रखें, और पूर्ण मस्तिष्क रक्त प्रवाह बहाली सुनिश्चित करने के लिए सीसीए के क्षणिक बंधन को हटा दें।
  4. घाव को सीवन करें, और संज्ञाहरण से उबरने के लिए जानवर को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक रिकवरी कक्ष में रखें। वसूली के बाद, चूहों को तापमान नियंत्रित कमरे में उनके पिंजरों में वापस करें।
  5. सर्जरी के बाद 3 दिन तक पिंजरे के फर्श पर छोटे पेट्री व्यंजनों में गीले भोजन छर्रों और हाइड्रोजेल जोड़कर जानवरों की देखभाल करें।
  6. सर्जरी के बाद 3 डी के लिए हर 12 घंटे में एनाल्जेसिया इंजेक्ट करें (4 मिलीग्राम/किलो कार्प्रोफेन और ०.१ मिलीग्राम/किलो बुप्रेनोरफिन) ।

6. न्यूरोस्कोर

  1. दिन के एक ही समय में हमेशा न्यूरोस्कोर करें, और व्यक्तिगत सर्जनों के बीच "तटस्थ गंध" बनाए रखने के लिए सर्जिकल कपड़ों का उपयोग करें।
  2. परीक्षण से पहले चूहों को कमरे में 30 मिनट के लिए "खुला" पिंजरे के साथ आराम करने दें।
  3. 30 s के लिए तालिका 1 और तालिका 2 में प्रत्येक आइटम का निरीक्षण करें।

7. इंट्राकार्डिएक परफ्यूजन

  1. फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) -हेपरिन (2 यू/एमएल) युक्त 20 एमएल सिरिंज तैयार करें और गुरुत्वाकर्षण चालित परफ्यूजन की सुविधा के लिए इसे बेंच से 1 मीटर ऊपर रखें । (वैकल्पिक: पीबीएस, पीएच 7.4 में 4% पीएफए युक्त 20 एमएल सिरिंज का उपयोग करके 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ इंट्राकार्डिएक परफ्यूजन करें।
  2. केटामाइन और जाइलाज़ीन (क्रमशः 120 और 16 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) के 100 माइक्रोल इंजेक्ट करें। 5 मिनट रुको और सहज शरीर आंदोलन और वाइब्रेसा की समाप्ति की पुष्टि करें।
  3. जानवर को एक रीढ़ की स्थिति में ठीक करें, और पेट के शरीर की सतह को 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित करें।
  4. पेट में 3 सेमी लंबा चीरा बनाएं; दिल को पूरी तरह से कल्पना करने के लिए डायाफ्राम, पसलियों और उरोस्थि को काटें।
  5. सही एट्रियम में एक छोटा सा चीरा बनाएं, और परफ्यूजन कैनुला को बाएं वेंट्रिकल में डालें।
  6. पीबीएस-हेपरिन के 20 एमएल के साथ पर्फ्यूज।
  7. परफ्यूजन के बाद, जानवर को काटना और मस्तिष्क को हटा दें।
  8. पाउडर सूखी बर्फ पर मस्तिष्क फ्रीज और आगे का उपयोग करने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

8. इनफाक्टिट वॉल्यूम्री

  1. क्रायोसेक्शनिंग के लिए, हर 400 माइक्रोन में दिमाग को 20-माइक्रोन-मोटी वर्गों में काटने के लिए क्रायोस्टेट का उपयोग करें। स्लाइड्स पर सेक्शन रखें, और स्लाइड्स को इस्तेमाल होने तक −80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
  2. क्रेसिल वायलेट (सीवी) धुंधला
    1. हिलाते हुए और हीटिंग (60 डिग्री सेल्सियस) 0.5 ग्राम सीवी एसीटेट द्वारा एच2ओ के 500 एमएल में तब तक धुंधला समाधान तैयार करें जब तक कि क्रिस्टल भंग न हो जाएं। समाधान ठंडा होने के बाद, इसे एक अंधेरी बोतल में स्टोर करें। हर उपयोग से पहले 60 डिग्री सेल्सियस तक फिर से गरम करें और फ़िल्टर करें।
    2. स्लाइड्स में देखें कमरे के तापमान में 30 मिनट तक सूखते हैं। उन्हें 15 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में विसर्जित करें, 1 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में, और फिर 1 मिनट के लिए 50% इथेनॉल में।
    3. 2 मिनट के लिए आसुत पानी में स्लाइड विसर्जित; आसुत पानी को ताज़ा करें और स्लाइड को 1 मिनट के लिए पानी में रखें। इसके बाद, 60 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए पहले से गर्म धुंधला समाधान में स्लाइड विसर्जित करें। स्लाइड्स को 1 मिनट के लिए आसुत पानी में दो बार धोएं।
    4. 2 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में स्लाइड विसर्जित करें। उन्हें 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में रखें; 100% इथेनॉल को ताज़ा करें और स्लाइड को फिर से इथेनॉल में 2 मिनट के लिए रखें। इसके बाद स्लाइड्स को बढ़ते मीडियम से कवर करें।
    5. विश्लेषण(चित्रा 4C)
      1. स्लाइड्स को स्कैन करें और निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके एडिमा को सही करने के लिए स्वानसन विधि12 द्वारा अप्रत्यक्ष इनफारेक्ट वॉल्यूम का विश्लेषण करें:
        (इस्कीमिक क्षेत्र) = (इस्कीमिक क्षेत्र) ((इप्सिलाटरल गोलार्द्ध) (कॉन्ट्रालेटरल गोलार्द्ध))

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Representative Results

यहां वर्णित मॉडल आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले "फिलामेंट" स्ट्रोक मॉडल का एक संशोधन है, जिसमें एमसीए(चित्रा 1)की उत्पत्ति को क्षणिक रूप से ब्लॉक करने के लिए ईसीए के माध्यम से सिलिकॉन-लेपित फिलामेंट शुरू करना शामिल है। फिलामेंट को हटाने के बाद, केवल ईसीए में रक्त प्रवाह स्थायी रूप से बंद हो जाता है, जिससे सीसीए और आईसीए के पूर्ण पुनर्नैनीकरण की अनुमति होती है। यह मानव रोगियों में सफल औषधीय थ्रोम्बोलिसिस या यांत्रिक थ्रोम्बेक्टॉमी के बाद देखी गई स्थिति के समान मस्तिष्क(चित्रा 2)के पर्याप्त रिफ्यूजन की अनुमति देता है। इसके अलावा, यह काम एमसीए क्षेत्र पर खोपड़ी में लेजर डॉप्लर जांच से जुड़े कैनुला को ठीक करके दोनों ऑक्स्यूज़न और रिफ्यूजन प्रक्रियाओं के दौरान मस्तिष्क रक्त प्रवाह को मापने के लिए एक विधि का भी वर्णन करता है।

एक प्रशिक्षित सर्जन द्वारा किए जाने पर शल्य चिकित्सा प्रक्रिया की समग्र मृत्यु दर <5% है। MCAo के बाद शुरुआती समय बिंदुओं पर, जानवर आम तौर पर गंभीर आसनीय और आंदोलन घाटे, सामान्य कमजोरी, और शरीर के वजन में हानि13मौजूद हैं। ये गंभीर घाटे क्षणिक हैं, और जानवर लगभग 1 सप्ताह के बाद बेहतर गतिविधि दिखाते हैं; इस प्रकार, फोकल न्यूरोलॉजिकल लक्षणों के लिए घाटे अधिक विशिष्ट हैं।

एमसीए ऑक्क्क्यूज़न के बाद व्यवहार घाटे का आकलन समग्र न्यूरोस्कोर14द्वारा किया गया था ; सर्जरी के बाद सामान्य और फोकल घाटे को 24 एच और 3 डी मापा गया। जनरल न्यूरोस्कोर 5 वस्तुओं(तालिका 1)को एकीकृत करता है, जिसमें फर, कान, आंख, मुद्रा और सहज गतिविधि का मूल्यांकन शामिल है, जिसमें अधिकतम स्कोर 18 है। फोकल न्यूरोस्कोर में 7 आइटम(टेबल 2)शामिल हैं, जिनमें शरीर की समरूपता, चाल, चढ़ाई, चक्कर व्यवहार, अग्रभाग समरूपता, अनिवार्य साइकिलिंग और मूंछ प्रतिक्रिया शामिल है, जिसमें अधिकतम स्कोर 28 है। समग्र पैमाने 0 (कोई घाटा) से 46 (गंभीर हानि) तक होता है। स्ट्रोक जानवरों ने समग्र और फोकल न्यूरोस्कोर में एक महत्वपूर्ण परिवर्तन प्रस्तुत किया, लेकिन नकली जानवरों(चित्र 3)की तुलना में सामान्य न्यूरोस्कोर में नहीं।

स्ट्रोक प्रेरण के बाद कोरोनल सीरियल मस्तिष्क वर्ग 24 एच के क्रेसिल वायलेट स्टेनिंग का उपयोग करके इनफारेक्ट वॉल्यूमरी भी किया गया था। इनफारक्ट वॉल्यूम का मतलब 61.69मिमी 3था, जो प्रभावित मस्तिष्क गोलार्द्ध(चित्र 4)का 48% का प्रतिनिधित्व करता है। जब एक प्रशिक्षित सर्जन द्वारा किया जाता है, तो इस स्ट्रोक मॉडल की समग्र परिवर्तनशीलता कम होती है, जिसमें <6% की भिन्नता का गुणांक होता है। घाव क्षेत्र में सोमाटोसेंसरी और मोटर कॉर्टेक्स के साथ-साथ स्ट्राइटम(चित्र 4)जैसी उपकॉर्टिकल संरचनाएं शामिल हैं।

Figure 1

चित्रा 1:पहुंच और इंट्राल्यूमिनल एमसीए ऑक्क्यूशन के लिए योजना। फिलामेंट (बिंदीदार रेखा) ईसीए में समीपस्थ और डिस्टल सीवन नॉट के बीच डाला जाता है और आईसीए के साथ उन्नत होता है जब तक कि यह एमसीए की उत्पत्ति तक नहीं पहुंच जाता (इनसेट देखें)। एक बार जगह में, ईसीए फिलामेंट को ठीक करने के लिए एक सीवन के साथ लिगा हो जाता है। संक्षिप्त: एसीए = पूर्वकाल मस्तिष्क धमनी; बीए = बेसिलर धमनी; सीसीए = आम कैरोटिड धमनी; ईसीए = बाहरी कैरोटिड धमनी; आईसीए = आंतरिक कैरोटिड धमनी; एमसीए = मध्य मस्तिष्क धमनी; पीसीए = पीछे धमनी संवाद; पीटीजी = पीटीरीगोपालटाइन धमनी। इस आंकड़े को जैकमैन एट अल से संशोधित किया गयाहै । 15. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:ऑक्सफ्यूजन और रिफ्यूजन के दौरान रक्त प्रवाह। रक्त प्रवाह फिलामेंट प्रविष्टि से पहले और बाद में और फिलामेंट हटाने से पहले और बाद में पंजीकृत है। अर्क के दौरान रक्त प्रवाह में कमी और रिफ्यूजन के दौरान रक्त प्रवाह की बहाली देखी गई। हर रंग एक जानवर का प्रतिनिधित्व करता है। संक्षिप्त रूप: एमसीए = मध्य मस्तिष्क धमनी; सीबीएफ = सेरेब्रल रक्त प्रवाह; A.U. = मनमानी इकाइयां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:tMCAo के बाद कार्यात्मक घाटे के लिए न्यूरोस्कोर। (ए)कुल,(बी)फोकल, और(सी)जनरल न्यूरोस्कोर से पहले और 24 घंटे और 3 डी tMCAo के बाद । खुली सलाखों: दिखावा; काले सलाखों: tMCAo । n = 10 प्रति समूह। * पी < 0.05। संक्षिप्त रूप: tMCAo = क्षणिक मध्य मस्तिष्क धमनी occlusion; बीएल = tMCAo से पहले। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:वॉल्यूमेट्रिक इनफाक्ट विश्लेषण और इनफाक्ट परिणाम 24 घंटे tMCAo के बाद। (ए)प्रतिनिधि क्रेसिल वायलेट-दाग कोरोनल मस्तिष्क वर्गों टीएमसीएओ के बाद 24 घंटे में हर ४०० माइक्रोन । धराशायी रेखाएं घाव क्षेत्र का सीमांकन करती हैं। (ख)टीएमसीएओ के बाद 10 दिमाग (प्रत्येक एक व्यक्ति मस्तिष्क का प्रतिनिधित्व करने वाला प्रत्येक डॉट) की इनफाक्ट वॉल्यूम का विश्लेषण । क्षैतिज लाल रेखा मतलब (61.69 मिमी3)का प्रतिनिधित्व करती है, त्रुटि सलाखों मानक विचलन (3.78 मिमी3)का संकेत देती है। (ग)क्रेसिल वायलेट कोरोनल सेक्शन से इनफाक्ट वॉल्यूम कैलकुलेशन के लिए रिप्रेजेंटेटिव इमेज । नीला = कॉन्ट्रालेटरल गोलार्द्ध; लाल = Ipsilateral गोलार्द्ध; पीला धारीदार क्षेत्र = इस्कीमिक क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

स्कोरिंग का समय-बिंदु अंक
जनरल न्यूरोस्कोर बाल 0. बाल साफ और साफ
1. 2 शरीर के अंगों (नाक और आंखों) में स्थानीयकृत पिलोरेक्शन और गंदे बाल
2. >2 शरीर के अंगों में पिलोएरेक्शन और गंदे बाल
कान (एक खुली बेंच शीर्ष पर माउस) 0. सामान्य (कान पार्श्व और पीछे फैला रहे हैं, वे शोर के बाद सीधा द्वारा प्रतिक्रिया)
1. पार्श्व में फैला है लेकिन पीछे नहीं (एक या दोनों), वे शोर पर प्रतिक्रिया
2. 1 के रूप में ही। शोर के लिए कोई प्रतिक्रिया नहीं।
आंखें (OBT पर माउस) 0. खुला, साफ और जल्दी से आसपास के वातावरण का पालन करें
1. खुला और जलीय बलगम की विशेषता। धीरे-धीरे आसपास के वातावरण का पालन करें
2. खुला और अंधेरे बलगम की विशेषता
3. एलिपसॉइडल आकार और अंधेरे बलगम की विशेषता
4. बंद
आसन (हथेली पर माउस रखें और धीरे से स्विंग करें) 0. माउस हथेली के समानांतर पीठ के साथ ईमानदार स्थिति में खड़ा है। झूले के दौरान यह तेजी से खड़ा होता है।
1. माउस हम्पबैक खड़ा है। झूले के दौरान, यह स्थिरता हासिल करने के लिए शरीर को सपाट कर देता है।
2. सिर या धड़ का हिस्सा हथेली पर स्थित है।
3. माउस एक तरफ स्थित है, मुश्किल से ईमानदार स्थिति को ठीक करने में सक्षम है।
4. माउस एक प्रवण स्थिति में निहित है, ईमानदार स्थिति को ठीक करने में सक्षम नहीं है।
स्पॉन्टेनोस गतिविधि (ओबीटी पर माउस) 0. माउस सतर्क है और सक्रिय रूप से पड़ताल करता है।
1. माउस सतर्क लगता है, लेकिन यह शांत और सुस्त है।
2. माउस रुक-रुक कर और सुस्ती से पड़ताल करता है।
3. माउस सोनोलेंट और सुन्न है, कुछ आंदोलन मौके पर हैं।
4.No सहज आंदोलन
सामान्य स्कोरिंग के लिए कुल स्कोर
(सामान्य =0 अधिकतम = 18)

तालिका 1: जनरल न्यूरोस्कोर। पशुओं को 0 और 4 अंक के बीच प्राप्त, गंभीरता के आधार पर, पांच सामांय घाटे में से प्रत्येक के लिए मापा । इसके बाद विभिन्न क्षेत्रों पर स्कोर 0 से 18 तक कुल सामान्य स्कोर प्रदान करने के लिए जोड़े जाते हैं । इस तालिका को क्लार्क एट अल14 से संशोधित किया गया है । संक्षिप्त नाम: OBT = खुला बेंचटॉप।

स्कोरिंग का समय-बिंदु अंक
फोकल न्यूरोस्कोर शरीर समरूपता (OBT पर माउस, नाक-पूंछ लाइन का निरीक्षण करें) 0. सामान्य (शरीर: सामान्य मुद्रा, पीठ से ऊंचा ट्रंक, सामने और शरीर के नीचे झुकाव के साथ। पूंछ: सीधे)
1. मामूली विषमता (शरीर: शरीर के नीचे झुकाव और हिंडलिंब के साथ एक तरफ झुक जाता है। पूंछ: थोड़ा तुला)
2. मध्यम विषमता (शरीर: सामने और हिंडलिम्ब्स के साथ एक तरफ झुक जाता है। पूंछ: थोड़ा तुला)
3. प्रमुख विषमता (शरीर: तुला, एक तरफ OBT पर निहित है । पूंछ: तुला)
4. चरम विषमता (शरीर: अत्यधिक तुला, एक तरफ लगातार OBT पर निहित है। पूंछ: अत्यधिक तुला)
चाल (ओबीटी पर माउस। मनाया अशान्त) 0. सामान्य (चाल लचीला, सममित और त्वरित है)
1. कठोर, अनम्य (हम्पबैक्ड वॉक, सामान्य माउस की तुलना में धीमा)
2. लंगड़ा, असममित आंदोलनों के साथ
3. कांप, बहती, गिरने
4. अनायास नहीं चलता है (जब धीरे से माउस धक्का से उत्तेजित 3 कदम से अधिक नहीं चलता है)
चढ़ाई (45ओ सतह पर माउस। माउस को मनोरंजक सतह के केंद्र में रखें) 0. सामान्य (माउस जल्दी चढ़ते हैं)
1. तनाव के साथ चढ़ते हैं, अंग कमजोरी मौजूद
2. ढलान पर रखती है, पर्ची या चढ़ाई नहीं करता है
3. ढलान नीचे स्लाइड, असफल को रोकने के लिए असफल प्रयास
4. तुरंत स्लाइड, असफल होने से रोकने के लिए कोई प्रयास नहीं
चक्कर व्यवहार (OBT पर माउस, मुक्त अवलोकन) 0. अनुपस्थित चक्कर व्यवहार
1. मुख्य रूप से एक तरफ बदल जाता है
2. एक तरफ हलकों, हालांकि लगातार नहीं
3. एक तरफ लगातार हलकों
4. धुरी, लहराते, या कोई आंदोलन
फोरलिम्ब समरूपता (पूंछ से निलंबित माउस) 0. सामान्य
1. प्रकाश विषमता: कॉन्ट्रालेटरल अग्रभाग का हल्का फ्लेक्सन
2. चिह्नित विषमता: कॉन्ट्रालेटरल अंग के चिह्नित फ्लेक्सन, शरीर थोड़ा ipsilateral पक्ष पर झुकता है
3. प्रमुख विषमता: कॉन्ट्रालेटरल फोरलिम्ब ट्रंक का पालन करता है
4. मामूली विषमता, कोई शरीर/अंग आंदोलन
अनिवार्य चक्कर (बेंच पर अग्रभाग, पूंछ द्वारा निलंबित हिंडलिम्ब्स: यह कॉन्ट्रालेटरल अंग पक्षाघात की उपस्थिति का पता चलता है) 0. अनुपस्थित। दोनों अग्रभाग का सामान्य विस्तार
1. एक तरफ मुड़ने की प्रवृत्ति (माउस दोनों अग्रभाग तक फैली हुई है, लेकिन अधिमानतः एक तरफ मुड़ना शुरू कर देती है)
2. एक तरफ हलकों (माउस स्वस्थ चूहों की तुलना में एक धीमी आंदोलन के साथ एक तरफ बदल जाता है)
3. एक तरफ सुस्त धुरी (माउस एक पक्ष की ओर बदल जाता है एक पूरा चक्र प्रदर्शन करने में नाकाम रहने)
4. अग्रिम नहीं करता है (ट्रंक के सामने का हिस्सा बेंच, धीमी और संक्षिप्त आंदोलनों पर निहित है)
मूंछ प्रतिक्रिया (OBT पर माउस) 0. सामान्य
1. प्रकाश विषमता (माउस धीरे-धीरे वापस ले लेता है जब कॉन्ट्रालेटरल साइड पर उत्तेजित होता है)
2. प्रमुख विषमता (कोई प्रतिक्रिया नहीं जब कॉन्ट्रालेटरल पक्ष को उत्तेजित किया गया)
3. अनुपस्थित प्रतिक्रिया विपरीत, धीमी प्रतिक्रिया जब ipsilaterally उत्तेजित
4. अनुपस्थित प्रतिक्रिया द्विपक्षीय
फोकल घाटे के लिए कुल स्कोर
(सामान्य =0 अधिकतम = 28)

तालिका 2: फोकल न्यूरोस्कोर। पशुओं को मापा सात सामांय घाटे में से प्रत्येक के लिए गंभीरता के आधार पर 0 और 4 अंक के बीच प्राप्त किया । इसके बाद विभिन्न क्षेत्रों पर स्कोर 0 से 28 तक कुल फोकल स्कोर प्रदान करने के लिए जोड़े जाते हैं । इस तालिका को क्लार्क एट अल14 से संशोधित किया गया है । संक्षिप्त नाम: OBT = खुला बेंचटॉप।

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Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल एक मानकीकृत क्षणिक एमसीएओ मॉडल स्थापित करने के लिए एक जर्मन मल्टीसेंटर रिसर्च कंसोर्टियम ("इम्यूनोस्ट्रोक") के आम सहमति समझौते के आधार पर एक प्रयोगात्मक स्ट्रोक मॉडल का वर्णन करता है। एमसीए की उत्पत्ति के लिए ईसीए के माध्यम से सिलिकॉन-लेपित फिलामेंट शुरू करके स्थापित क्षणिक एमसीएओ मॉडल एक परिसीमित ऑक्सफ्यूजन अवधि के बाद धमनी पुनरस्फूधन प्राप्त करने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले स्ट्रोक मॉडलों में से एक है। इसलिए, इस प्रक्रिया को अनुवादात्मक रूप से प्रासंगिक स्ट्रोक मॉडल माना जा सकता है।

वीडियो में प्रस्तुत "फिलामेंट मॉडल" में अन्य पहले वर्णित स्ट्रोक मॉडल की तुलना में कुछ फायदे हैं, जैसे कि क्रैनियोटॉमी की आवश्यकता नहीं है और क्षणिक रूप से ऑक्सफ्यूड पोत का पूर्ण अर्क प्राप्त करना है। हालांकि, शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप की जटिलता को एक सीमा माना जा सकता है, क्योंकि इसमें आक्रामक सर्जरी और श्वासनली और वागल तंत्रिका के करीब निकटता में विभिन्न धमनियों का सटीक हेरफेर शामिल है। एनेस्थेटिक्स के लिए जानवर का लंबा एक्सपोजर भी विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक हो सकता है, क्योंकि न्यूरोप्रोटेक्शन और स्ट्रोक परिणाम पर एनेस्थेटिक्स का प्रभाव पहले से ही16अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है। अंत में, इस शल्य प्रक्रिया की जटिलता के बावजूद, यह लगभग 20 मिनट में पूरा किया जा सकता है जब एक प्रशिक्षित सर्जन द्वारा प्रदर्शन किया ।

पहले वर्णित "फिलामेंट" स्ट्रोक प्रोटोकॉल17के विपरीत, यहां वर्णित विधि भी ऑक्सक्यूशन और रिफ्यूजन चरणों के दौरान मस्तिष्क रक्त प्रवाह के माप की अनुमति देती है। रिफ्यूजन के दौरान रक्त प्रवाह की निगरानी स्ट्रोक रिफ्यूजन चोट18को रोकने के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर हो सकता है, जो थ्रोम्बोसेड जहाजों के पुनर्नैनीकरण के लिए फार्माकोलॉजिक या एंडोवैस्कुलर हस्तक्षेप से गुजर रहे रोगियों में हानिकारक परिणाम पैदा करने के लिए जाना जाता है। एमसीएओ19के बाद मस्तिष्क रक्त प्रवाह बहाली के परिणामों के बीच विसंगतियों के बावजूद, स्ट्रोक के बाद रक्त प्रवाह बहाली की परिवर्तनशीलता मस्तिष्क में रोगविज्ञानी और जैव रासायनिक घटनाओं को प्रभावित कर सकती है, साथ ही इनफार्क मात्रा और स्ट्रोक चूहों के न्यूरोलॉजिकल घाटे20। इसलिए, इस मॉडल में, रक्त प्रवाह की पूर्ण बहाली और इसकी रिकॉर्डिंग चूहों के बीच प्रजनन योग्य इनफारेक्ट्स सुनिश्चित करने के लिए आवश्यकताएं हैं, विशेष रूप से ट्रांसलेशनल स्ट्रोक अध्ययनों में।

शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के दौरान समग्र मृत्यु दर 5% से कम है और मुख्य रूप से पूर्वनिर्धारित बहिष्कार मानदंडों के कारण संवेदनाहारी जटिलताओं, रक्तस्राव या बलिदान के कारण होती है। हालांकि, यह स्ट्रोक मॉडल स्ट्रोक प्रेरण के बाद पहले 24-48 घंटे के भीतर एक मध्यम मृत्यु दर प्रस्तुत करता है, जो स्ट्रोक चूहों की पर्याप्त पलटन प्राप्त करने के लिए प्रति प्रयोग आवश्यक जानवरों की संख्या में वृद्धि कर सकता है। इनफाक्ट वॉल्यूम के संदर्भ में, यह मॉडल बड़े इनफाक्ट्स को प्रेरित करता है, जिसमें गोलार्द्ध के 50% तक घाव शामिल होते हैं। यह कॉर्टिकल और उपकॉर्टिकल क्षेत्रों सहित विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों को प्रभावित करने वाला मस्तिष्क एडिमा भी पैदा करता है।

स्ट्रोक मॉडल की कम परिवर्तनशीलता और उच्च प्रजनन क्षमता प्राप्त करने के लिए, कई अपवर्जन मानदंडों को ध्यान में रखा जाना चाहिए, जिनमें शामिल हैं: 1) ऑपरेशन समय > 20 मिनट; 2) सीसीए (चरण 3.3) में रक्त प्रवाह में कमी का >20% है; 3) ऑक्लूजन के दौरान रक्त प्रवाह में कमी प्रारंभिक पूर्व-ऑक्सीकरण मूल्य का 80% <; और 4) पूर्व-रिफ्यूजन मूल्य की तुलना में रिफ्यूजन दर <80% के बाद रक्त प्रवाह 10 मिनट बढ़ जाता है। एक अनुभवी और प्रशिक्षित सर्जन के लिए, ऑपरेशन समय मापदंड के कारण किसी भी जानवर को बाहर नहीं रखा जाता है। हालांकि, 10-15% जानवर सीसीए लिगेशन पर रक्त प्रवाह में 20% की कमी दिखाते हैं, और 5-10% क्रमशः ऑक्सीकरण या रिफ्यूजन के दौरान रक्त प्रवाह में पर्याप्त कमी या वृद्धि नहीं दिखाते हैं। इसलिए, इन मानदंडों के आधार पर जानवरों को छोड़कर सफलता की दर लगभग 75-85% है।

इसके अलावा, बीमारी, दर्द या असुविधा व्यवहार के लिए नियंत्रित करने के लिए एमसीएओ (शरीर के वजन, तापमान और बुनियादी शारीरिक व्यवहार) के बाद जानवरों की दैनिक जांच की जाती है। इस सामान्य देखभाल के अलावा, फोकल ब्रेन इस्केमिया के बाद विशिष्ट व्यवहार विश्लेषण के लिए कई परीक्षण विकसित किए गए हैं, सभी ज्ञात परीक्षणों के बावजूद, जैसे कि रोटारोड परीक्षण21,चिपचिपा लेबल परीक्षण22,कॉर्नर टेस्ट23,या सिलेंडर परीक्षण24। यहां, इस स्ट्रोक मॉडल की स्थापना के लिए चयनित जानवरों का मूल्यांकन फोकल और सामान्य घाटे के लिए किया गया था, क्योंकि फिलामेंट मॉडल फोकल (संवेदी या मोटर) घाटे25से स्वतंत्र साइटोकिन-बीमारी व्यवहार को भी प्रेरित करता है। एक साथ लिया, "फिलामेंट" स्ट्रोक मॉडल यहां वर्णित बुनियादी और अनुवाद स्ट्रोक अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान मॉडल है । इस मॉडल को प्रयोगशालाओं में स्ट्रोक मॉडल को मिलाने के लिए उपयोग किए जाने वाले मानकीकृत स्ट्रोक मॉडल के रूप में प्रस्तावित किया गया है।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी हितों की है ।

Acknowledgments

हम सुझावों और चर्चाओं के लिए इम्यूनोस्ट्रोक संघ (2879 के लिए, प्रतिरक्षा कोशिकाओं से स्ट्रोक रिकवरी तक) के हमारे सभी सहयोग भागीदारों को धन्यवाद देते हैं। इस काम को ड्यूश फोर्चुंग्स्जेमीस्चफ्ट (डीएफजी, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) सिस्टम न्यूरोलॉजी के लिए म्यूनिख क्लस्टर के ढांचे के भीतर जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति के तहत (EXC २१४५ SyNergy-आईडी 390857198) और अनुदान के तहत ली-2534/6-1, LI-2534/7-1 और LL-112/1-1 ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
45° ramp H&S Kunststofftechnik height: 18 cm
5/0 threat Pearsalls 10C103000
5 mL Syringe Braun
Acetic Acid Sigma Life Science 695092
Anesthesia system for isoflurane Drager
Bepanthen pomade Bayer
C57Bl/6J mice Charles River 000664
Clamp FST 12500-12
Clip FST 18055-04
Clip holder FST 18057-14
Cotons NOBA Verbondmitel Danz 974116
Cresyl violet Sigma Life Science C5042-10G
Cryostat Thermo Scientific CryoStarNX70
Ethanol 70% CLN Chemikalien Laborbedorf 521005
Ethanol 96% CLN Chemikalien Laborbedorf 522078
Ethanol 99% CLN Chemikalien Laborbedorf ETO-5000-99-1
Filaments Doccol 602112PK5Re
Fine 45 angled forceps FST 11251-35
Fine forceps FST 11252-23
Fine Scissors FST 14094-11
Glue Orechseln BSI-112
Hardener Glue Drechseln & Mehr BSI-151
Heating blanket FHC DC Temperature Controller
Isoflurane Abbot B506
Isopentane Fluka 59070
Ketamine Inresa Arzneimittel GmbH
Laser Doppler Perimed PF 5010 LDPM, Periflux System 5000
Laser Doppler probe Perimed 91-00123
Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 Apotheke Innestadt Uni Munchen P32799
Recovery chamber Mediheat
Roti-Histokit mounting medium Roth 6638.1
Saline solution Braun 131321
Scalpel Feather 02.001.30.011
Silicon-coated filaments Doccol 602112PK5Re
Stereomicropscope Leica M80
Superfrost Plus Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Vannas Spring Scissors FST 15000-00
Xylacine Albrecht

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References

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Llovera, G., Simats, A., Liesz, A. Modeling Stroke in Mice: Transient Middle Cerebral Artery Occlusion via the External Carotid Artery. J. Vis. Exp. (171), e62573, doi:10.3791/62573 (2021).

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