Summary
Verschiedene Modelle des mittleren Hirnarterienverschlusses (MCAo) werden in der experimentellen Schlaganfallforschung eingesetzt. Hier wird ein experimentelles Schlaganfallmodell der transienten MCAo über die Arteria carotis externa (ECA) beschrieben, das darauf abzielt, den menschlichen Schlaganfall nachzuahmen, bei dem der zerebrovaskuläre Thrombus aufgrund einer spontanen Gerinnsellyse oder -therapie entfernt wird.
Abstract
Schlaganfall ist die dritthäufigste Todesursache und die Hauptursache für erworbene Behinderungen bei Erwachsenen in Industrieländern. Bisher beschränken sich die Therapiemöglichkeiten auf einen kleinen Teil der Schlaganfallpatienten innerhalb der ersten Stunden nach dem Schlaganfall. Neuartige Therapiestrategien werden intensiv untersucht, insbesondere um das therapeutische Zeitfenster zu verlängern. Diese aktuellen Untersuchungen umfassen die Untersuchung wichtiger pathophysiologischer Signalwege nach einem Schlaganfall, wie z.B. Entzündungen nach einem Schlaganfall, Angiogenese, neuronale Plastizität und Regeneration. In den letzten zehn Jahren hat die Besorgnis über die schlechte Reproduzierbarkeit von experimentellen Ergebnissen und wissenschaftlichen Erkenntnissen in unabhängigen Forschungsgruppen zugenommen. Um die sogenannte "Replikationskrise" zu überwinden, werden detaillierte standardisierte Modelle für alle Abläufe dringend benötigt. Im Rahmen des Forschungskonsortiums "ImmunoStroke" (https://immunostroke.de/) wird ein standardisiertes Mausmodell des transienten mittleren Hirnarterienverschlusses (MCAo) vorgeschlagen. Dieses Modell ermöglicht die vollständige Wiederherstellung des Blutflusses nach Entfernung des Filaments und simuliert die therapeutische oder spontane Gerinnsellyse, die bei einem großen Teil der menschlichen Schlaganfälle auftritt. Der chirurgische Ablauf dieses "Filament"-Schlaganfallmodells und Werkzeuge zu seiner Funktionsanalyse werden im begleitenden Video demonstriert.
Introduction
Schlaganfall ist eine der häufigsten Ursachen für Tod und Behinderung weltweit. Obwohl es hauptsächlich zwei verschiedene Formen des Schlaganfalls gibt, ischämische und hämorrhagische, sind 80-85% aller Schlaganfallfälle ischämisch1. Derzeit stehen nur zwei Behandlungen für Patienten mit ischämischem Schlaganfall zur Verfügung: pharmakologische Behandlung mit rekombinantem Gewebeplasminogenaktivator (rtPA) oder mechanischer Thrombektomie. Aufgrund des engen therapeutischen Zeitfensters und mehrerer Ausschlusskriterien kann jedoch nur eine ausgewählte Anzahl von Patienten von diesen spezifischen Behandlungsmöglichkeiten profitieren. In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich die präklinische und translationale Schlaganfallforschung auf die Erforschung neuroprotektiver Ansätze konzentriert. Alle Verbindungen, die klinische Studien erreichten, haben jedoch bisher keine Verbesserungen für den Patienten gezeigt2.
Da In-vitro-Modelle nicht alle Gehirninteraktionen und pathophysiologischen Mechanismen des Schlaganfalls genau reproduzieren können, sind Tiermodelle für die präklinische Schlaganfallforschung von entscheidender Bedeutung. Es ist jedoch nicht möglich, alle Aspekte des ischämischen Schlaganfalls beim Menschen in einem einzigen Tiermodell nachzuahmen, da der ischämische Schlaganfall eine hochkomplexe und heterogene Erkrankung ist. Aus diesem Grund wurden im Laufe der Zeit verschiedene ischämische Schlaganfallmodelle bei verschiedenen Arten entwickelt. Photothrombose der Hirnarteriolen oder permanenter distaler Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCA) sind häufig verwendete Modelle, die kleine und lokal definierte Läsionen im Neokortex induzieren3,4. Neben diesen ist das am häufigsten verwendete Schlaganfallmodell wahrscheinlich das sogenannte "Filamentmodell", bei dem eine vorübergehende Okklusion von MCA erreicht wird. Dieses Modell besteht aus einer vorübergehenden Einführung eines Nahtfilaments in den Ursprung der MCA, was zu einer abrupten Verringerung des zerebralen Blutflusses und dem anschließenden großen Infarkt subkortikaler und kortikaler Hirnregionen führt5. Obwohl die meisten Schlaganfallmodelle MCA-Okklusionen nachahmen 6,erlaubt das "Filamentmodell" eine genaue Abgrenzung der ischämischen Zeit. Die Reperfusion durch Filamententfernung ahmt das menschliche klinische Szenario der wiederherstellung des zerebralen Blutflusses nach spontaner oder therapeutischer (rtPA oder mechanische Thrombektomie) Gerinnsellyse nach. Bisher wurden verschiedene Modifikationen dieses "Filamentmodells" beschrieben. In dem gebräuchlichsten Ansatz, der zuerst von Longa et al.beschrieben wurde. 19895wird ein siliziumbeschichtetes Filament über die gemeinsame Halsschlagader (CCA) zum Ursprung des MCA7eingeführt. Obwohl es sich um einen weit verbreiteten Ansatz handelt, erlaubt dieses Modell keine vollständige Wiederherstellung des Blutflusses während der Reperfusion, da das CCA nach der Entfernung des Filaments dauerhaft ligiert ist.
In den letzten zehn Jahren haben sich immer mehr Forschungsgruppen dafür interessiert, den Schlaganfall bei Mäusen mit diesem "Filamentmodell" zu modellieren. Die erhebliche Variabilität dieses Modells und die fehlende Standardisierung der Verfahren sind jedoch einige der Gründe für die hohe Variabilität und schlechte Reproduzierbarkeit der bisher berichteten experimentellen Ergebnisse und wissenschaftlichen Erkenntnisse2,8. Eine mögliche Ursache der aktuellen "Replikationskrise", die sich auf die geringe Reproduzierbarkeit zwischen Forschungslabors bezieht, sind die nicht vergleichbaren Schlaganfall-Infarktvolumina zwischen Forschungsgruppen, die die gleiche experimentelle Methodik verwenden9. Tatsächlich konnten wir nach der Durchführung der ersten präklinischen randomisierten kontrollierten multizentrischen Studienstudie10bestätigen, dass das Fehlen einer ausreichenden Standardisierung dieses experimentellen Schlaganfallmodells und die nachfolgenden Ergebnisparameter die Hauptgründe für das Versagen der Reproduzierbarkeit in präklinischen Studien zwischen unabhängigen Laborswaren 11 . Diese drastischen Unterschiede in den resultierenden Infarktgrößen stellen trotz verwendung des gleichen Schlaganfallmodells zu Recht nicht nur eine Bedrohung für die bestätigende Forschung, sondern auch für wissenschaftliche Kooperationen dar, da es an robusten und reproduzierbaren Modellen mangelt.
Vor dem Hintergrund dieser Herausforderungen wollten wir das Verfahren für ein standardisiertes transientes MCAo-Modell, wie es für die gemeinsamen Forschungsanstrengungen innerhalb des Forschungskonsortiums "ImmunoStroke" (https://immunostroke.de/) verwendet wird, detailliert entwickeln und detailliert beschreiben. Dieses Konsortium zielt darauf ab, die Gehirn-Immun-Interaktionen zu verstehen, die den mechanistischen Prinzipien der Schlaganfall-Genesung zugrunde liegen. Darüber hinaus werden histologische und verwandte funktionelle Methoden zur Schlaganfall-Outcome-Analyse vorgestellt. Alle Methoden basieren auf etablierten Standardarbeitsanweisungen, die in allen Forschungslabors des ImmunoStroke-Konsortiums verwendet werden.
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Protocol
Die in diesem Video berichteten Experimente wurden nach den nationalen Richtlinien für die Verwendung von Versuchstieren durchgeführt, und die Protokolle wurden von den deutschen Regierungskomitees (Regierung von Oberbayern, München, Deutschland) genehmigt. Zehn Wochen alte männliche C57Bl/6J-Mäuse wurden verwendet und unter kontrollierter Temperatur (22 ± 2 °C) mit einer 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklusperiode und Zugang zu pelletierter Nahrung und Wasser ad libitum untergebracht.
1. Vorbereitung des Materials und der Instrumente
- Schließen Sie die Wärmedecke an, um die Temperatur des Operationsbereichs und die Körpertemperatur der Maus während der Narkose bei 37 ° C zu halten.
- Autoklavschere und Pinzette, 70% ige Ethanollösung vorbereiten und Dexpanthenol Augensalbe, mehrere Baumwollstücke und 5-0 beschichtete geflochtene Polyesternaht gebrauchsfertig halten. Bereiten Sie eine 1-ml-Spritze mit 0,9% iger Kochsalzlösung (ohne Nadel) vor, um die Einschnittstelle des Tieres hydratisiert zu halten. Bereiten Sie das Anästhesiegas (100%O2 + Isofluran) vor.
- Bereiten Sie einen Halter für die Laser-Dopplersonde vor, indem Sie die Spitze einer 10 μL Pipettenspitze (3-5 mm Länge) schneiden.
HINWEIS: Alle Instrumente werden mit einem Heißperlensterilisator sterilisiert. Oberflächen werden auch vor und nach der Operation mit einem mikrobiellen Desinfektionsspray desinfiziert. Vor der Operation werden die Bereiche um Kopf und Brust von Mäusen mit einem Wunddesinfektionsspray desinfiziert.
2. Vorbereitung des Laserdopplers
- Der Maus wird 30 min vor der Operation eine Analgesie injiziert (4 mg/kg Carprofen und 0,1 mg/kg Buprenorphin intraperitoneal).
- Betäuben Sie die Maus, indem Sie sie mit einer Isofluran-Flussrate von 4% in die Induktionskammer legen, bis die spontane Körperbewegung und Vibrissae aufhören.
- Legen Sie die Maus in Bauchlage in den Operationsbereich mit der Nase in die Anästhesiemaske. Halten Sie die Isoflurankonzentration für eine weitere Minute bei 4%, reduzieren Sie sie dann und halten Sie sie bei 2%.
- Stellen Sie das zugehörige rückkopplungsgesteuerte Heizkissen ein, um die Körpertemperatur der Maus bei 37 ° C zu halten, und führen Sie die Rektalsonde vorsichtig ein, um die Temperatur während des gesamten chirurgischen Eingriffs zu überwachen.
- Tragen Sie Dexpanthenol Augensalbe auf beide Augen auf.
- Desinfizieren Sie die Haut und die Haare, die das linke Auge und Ohr umgeben, mit 70% Ethanol.
- Schneiden Sie die Kopfhaut zwischen dem linken Ohr und dem Auge (1 cm lang) ab, um den Schädelknochen freizulegen.
- Schneiden und ziehen Sie den Schläfenmuskel zurück, um die MCA unter dem Schädel zu visualisieren.
- Fixieren Sie mit Klebstoff den äußeren Teil der Spitze, der die Laser-Dopplersonde / -faser auf der Oberseite der linken MCA mit Klebstoff hält. Kleben Sie dann die Haut, um die Wunde um den Spitzenhalter zu schließen. Tragen Sie 2-3 Tropfen Härterkleber auf, um den Prozess zu beschleunigen. Achten Sie darauf, dass die Laser-Dopplerfaser nicht verklebt ist und jederzeit leicht aus dem Spitzenhalter entfernt werden kann.
3. Transientes MCAo-Modell (Okklusion)
- Drehen Sie die Maus in Rückenlage. Stecken Sie die Schnauze in den Anästhesiekegel und fixieren Sie die Pfoten mit Klebeband.
- Desinfizieren Sie die Haut und die Haare, die die Brust umgeben, und machen Sie einen 2 cm langen Mittellinienschnitt im Nacken.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut und die submandibulären Drüsen auseinander zu ziehen. Verwenden Sie Retraktoren, um den Musculus sternomastoideus zu halten, das Operationsfeld freizulegen und die linke gemeinsame Halsschlagader (CCA) zu finden. Sezieren Sie das CCA frei von Bindegewebe und umgebenden Nerven (ohne den Vagusnerv zu schädigen) und führen Sie vor der Verzweigung eine vorübergehende Ligatur durch.
- Sezieren Sie die äußere Halsschlagader (ECA) und binden Sie einen permanenten Knoten am distalsten sichtbaren Teil. Legen Sie eine weitere Naht unter die ECA, in der Nähe der Bifurkation, und bereiten Sie einen losen Knoten vor, der später verwendet werden kann.
- Sezieren Sie die Arteria carotis interna (ICA) und legen Sie einen mikrovaskulären Clip darauf, 5 mm über der Bifurkation. Achten Sie darauf, den Vagusnerv nicht zu beschädigen.
- Schneiden Sie ein kleines Loch in die ECA zwischen den engen und den losen Ligaturen; Achten Sie darauf, nicht den gesamten EuRH zu kürzen.
- Führen Sie das Filament ein und bringen Sie es in Richtung CCA voran. Straffen Sie die lose Ligatur in der ECA um das Lumen, um das Filament kurz in dieser Position zu sichern und Blutungen beim Entfernen des mikrovaskulären Clips zu vermeiden.
- Entfernen Sie den mikrovaskulären Clip und führen Sie das Filament durch die ICA ein, bis der Ursprung des MCA erreicht ist, indem Sie eine starke Reduktion (>80%) des zerebralen Blutflusses feststellen, wie mit dem Laser-Doppler gemessen. Befestigen Sie das Filament in dieser Position, indem Sie den Knoten um die ECA weiter festziehen.
HINWEIS: Wenn das Filament in die entsprechende Richtung geht, schreitet es sanft voran und es sollte kein Widerstand beobachtet werden. - Zeichnen Sie Laser-Dopplerwerte vor und nach dem Einsetzen des Filaments auf.
- Entfernen Sie den Retraktor und verlegen Sie den Musculus sternomastoideus und die submandibulären Drüsen, bevor Sie die Wunde nähen. Entfernen Sie die Laser-Dopplersonde und legen Sie das Tier für 1 h (bis zur Filamententfernung) in eine Aufwachkammer bei 37 °C.
4. Transientes MCAo-Modell (Reperfusion)
- Betäuben Sie die Maus, indem Sie sie mit einer Isofluran-Flussrate von 4% in die Induktionskammer legen, bis die spontane Körperbewegung und Vibrissae aufhören.
- Tragen Sie Dexpanthenol Augensalbe auf beide Augen auf.
- Legen Sie die Maus in Bauchlage in den Operationsbereich mit der Schnauze in die Anästhesiemaske. Halten Sie die Isoflurankonzentration für eine weitere Minute bei 4%, reduzieren Sie sie dann und halten Sie sie bei 2%. Befestigen Sie die Pfoten des Tieres mit Klebeband.
- Führen Sie die Laser-Dopplersonde in den Sondenhalter ein.
- Entfernen Sie die Wundnaht, ziehen Sie mit einer Pinzette die Haut und die submandibulären Drüsen auseinander. Verwenden Sie Retraktoren, um den Musculus sternomastoideus sanft zu ziehen und das Operationsfeld freizulegen.
- Lösen Sie die ECA-Naht, die das Filament festzieht, und ziehen Sie das Filament vorsichtig. Vermeiden Sie es, die Silikon-Gummi-Beschichtung des Filaments während der Entfernung zu beschädigen.
- Binden Sie die ECA-Naht fest.
- Bestätigen Sie die Erhöhung des zerebralen Blutflusses im Laser-Doppler-Gerät (>80% des Anfangswertes vor der Reperfusion).
- Zeichnen Sie Laser-Dopplerwerte vor und nach der Filamententfernung auf.
- Öffnen Sie die transiente Ligatur vor der Verzweigung vom CCA.
- Entfernen Sie den Retraktor und verlegen Sie den Musculus sternomastoideus und die submandibulären Drüsen, bevor Sie die Wunde nähen. Legen Sie das Tier für 1 h in eine Aufwachkammer bei 37 °C, um sich von der Narkose zu erholen.
- Nach der Genesung bringen Sie die Mäuse in ihre Käfige in einem temperaturkontrollierten Raum zurück.
- Kümmern Sie sich um die Tiere, indem Sie bis zum 3. Tag nach der Operation Nassfutterpellets und Hydrogel in kleinen Petrischalen auf dem Käfigboden hinzufügen.
- Injizieren Sie die Analgesie alle 12 h für 3 d nach der Operation (4 mg/kg Carprofen und 0,1 mg/kg Buprenorphin).
5. Scheinoperation
- Führen Sie alle Verfahren wie oben beschrieben durch, einschließlich der Ligatur der Arterien und der Einführung des Filaments (Schritte 1-3.7).
- Entfernen Sie das Filament sofort nach dem Einsetzen. Dann legen Sie das Tier für 1 h in die Aufwachkammer.
- Legen Sie das Tier wieder in den Operationsbereich und entfernen Sie die vorübergehende Ligatur des CCA, um eine vollständige Wiederherstellung des zerebralen Blutflusses zu gewährleisten.
- Nähen Sie die Wunde und legen Sie das Tier für 1 h in eine Aufwachkammer bei 37 ° C, um sich von der Narkose zu erholen. Nach der Genesung bringen Sie die Mäuse in ihre Käfige in einem temperaturkontrollierten Raum zurück.
- Kümmern Sie sich um die Tiere, indem Sie bis zum 3. Tag nach der Operation Nassfutterpellets und Hydrogel in kleinen Petrischalen auf dem Käfigboden hinzufügen.
- Injizieren Sie die Analgesie alle 12 h für 3 d nach der Operation (4 mg/kg Carprofen und 0,1 mg/kg Buprenorphin).
6. Neuroscore
- Führen Sie den Neuroscore immer zur gleichen Tageszeit durch und verwenden Sie chirurgische Kleidung, um einen "neutralen Geruch" zwischen den einzelnen Chirurgen aufrechtzuerhalten.
- Lassen Sie die Mäuse vor dem Test 30 Minuten im Raum mit einem "offenen" Käfig ruhen.
- Beobachten Sie jeden Punkt in Tabelle 1 und Tabelle 2 für 30 s.
7. Intrakardiale Perfusion
- Bereiten Sie eine 20-ml-Spritze vor, die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) -Heparin (2 U / ml) enthält, und legen Sie sie 1 m über die Bank, um die schwerkraftgetriebene Perfusion zu erleichtern. (OPTIONAL: Intrakardiale Perfusion mit 4% Paraformaldehyd (PFA) unter Verwendung einer 20 ml Spritze mit 4% PFA in PBS, pH 7,4).
- Injizieren Sie intratrperitoneal 100 μL Ketamin und Xylazin (120 bzw. 16 mg/kg Körpergewicht). Warten Sie 5 Minuten und bestätigen Sie die Beendigung der spontanen Körperbewegung und Vibrissae.
- Fixieren Sie das Tier in Rückenlage und desinfizieren Sie die Bauchkörperoberfläche mit 70% Ethanol.
- Machen Sie einen 3 cm langen Schnitt in den Bauch; Schneiden Sie das Zwerchfell, die Rippen und das Brustbein ab, um das Herz vollständig zu visualisieren.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof und führen Sie die Perfusionskanüle in den linken Ventrikel ein.
- Perfuse mit 20 ml PBS-Heparin.
- Enthaupten Sie das Tier nach der Perfusion und entfernen Sie das Gehirn.
- Das Gehirn auf pulverisiertem Trockeneis einfrieren und bis zur weiteren Anwendung bei -80 °C lagern.
8. Infarkt-Volumetrie
- Verwenden Sie für die Kryosektion einen Kryostaten, um die Gehirne alle 400 μm in 20 μm dicke Abschnitte zu schneiden. Legen Sie die Schnitte auf Folien und lagern Sie die Folien bis zur Verwendung bei −80 °C.
- Kresylviolett (CV) Färbung
- Die Färbelösung wird durch Rühren und Erhitzen (60 °C) 0,5 g CV-Acetat in 500 mLH2O hergestellt,bis die Kristalle gelöst sind. Nachdem die Lösung abgekühlt ist, bewahren Sie sie in einer dunklen Flasche auf. Auf 60 °C aufwärmen und vor jedem Gebrauch filtrieren.
- Lassen Sie die Objektträger 30 min bei Raumtemperatur trocknen. Tauchen Sie sie für 15 min in 95% Ethanol, 1 min in 70% Ethanol und dann für 1 min in 50% Ethanol.
- Tauchen Sie die Objektträger für 2 Minuten in destilliertes Wasser; Erfrischen Sie das destillierte Wasser und legen Sie die Objektträger für 1 min in das Wasser. Anschließend tauchen Sie die Objektträger für 10 min bei 60 °C in die vorgewärmte Färbelösung. Waschen Sie die Objektträger zweimal in destilliertem Wasser für 1 min.
- Tauchen Sie die Objektträger für 2 Minuten in 95% Ethanol. Legen Sie sie in 100% Ethanol für 5 min; erfrischen Sie das 100% Ethanol und legen Sie die Objektträger für 2 min erneut in das Ethanol. Anschließend decken Sie die Dias mit einem Montagemedium ab.
- Analyse (Abbildung 4C)
- Scannen Sie die Dias und analysieren Sie das indirekte Infarktvolumen mit der Swanson-Methode12, um Ödeme mithilfe der folgenden Gleichung zu korrigieren:
(Ischämische Fläche) = (ischämische Region)-((ipsilaterale Hemisphäre)-(kontralaterale Hemisphäre))
- Scannen Sie die Dias und analysieren Sie das indirekte Infarktvolumen mit der Swanson-Methode12, um Ödeme mithilfe der folgenden Gleichung zu korrigieren:
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Representative Results
Das hier beschriebene Modell ist eine Modifikation des häufig verwendeten "Filament"-Hubmodells, das darin besteht, ein siliziumbeschichtetes Filament durch die ECA einzuführen, um den Ursprung der MCA vorübergehend zu blockieren (Abbildung 1). Nach dem Entfernen des Filaments wird nur der Blutfluss in der ECA dauerhaft gestoppt, was eine vollständige Rekanalisierung der CCA und ICA ermöglicht. Dies ermöglicht eine adäquate Reperfusion des Gehirns (Abbildung 2), ähnlich der Situation, die nach erfolgreicher pharmakologischer Thrombolyse oder mechanischer Thrombektomie bei menschlichen Patienten beobachtet wird. Darüber hinaus beschreibt diese Arbeit auch eine Methode zur Messung des zerebralen Blutflusses sowohl während okklusions- als auch bei Reperfusionsverfahren durch Fixierung einer Kanüle, die mit der Laser-Dopplersonde am Schädel über dem MCA-Territorium verbunden ist.
Die Gesamtsterblichkeitsrate des chirurgischen Eingriffs beträgt <5%, wenn sie von einem ausgebildeten Chirurgen durchgeführt wird. Zu frühen Zeitpunkten nach MCAo weisen Tiere im Allgemeinen schwere Haltungs- und Bewegungsdefizite, allgemeine Schwäche und Körpergewichtsverlust auf13. Diese schweren Defizite sind vorübergehend und die Tiere zeigen nach etwa 1 Woche eine verbesserte Aktivität; Daher sind die Defizite spezifischer für fokale neurologische Symptome.
Verhaltensdefizite nach MCA-Okklusion wurden durch den zusammengesetzten Neuroscore14beurteilt; Allgemeine und fokale Defizite wurden 24 h und 3 d nach der Operation gemessen. Der allgemeine Neuroscore integriert 5 Items (Tabelle 1), einschließlich der Bewertung von Fell, Ohren, Augen, Haltung und spontaner Aktivität, mit einer maximalen Punktzahl von 18. Der fokale Neuroscore umfasst 7 Items (Tabelle 2), darunter die Bewertung von Körpersymmetrie, Gang, Klettern, Kreisverhalten, Vordergliedsymmetrie, Zwangszyklus und Schnurrhaarreaktion, mit einer maximalen Punktzahl von 28. Die zusammengesetzte Skala reicht von 0 (keine Defizite) bis 46 (schwere Beeinträchtigungen). Schlaganfalltiere zeigten eine signifikante Veränderung im zusammengesetzten und fokalen Neuroscore, aber nicht im allgemeinen Neuroscore, im Vergleich zu Scheintieren (Abbildung 3).
Die Infarktvolumetrie wurde auch unter Verwendung der Kresylviolettfärbung von koronalen seriellen Hirnschnitten 24 h nach Schlaganfallinduktion durchgeführt. Der Mittelwert des Infarktvolumens betrug 61,69mm3,was 48% der betroffenen Gehirnhälfte entspricht (Abbildung 4). Wenn es von einem ausgebildeten Chirurgen durchgeführt wird, ist die Gesamtvariabilität dieses Schlaganfallmodells gering, mit einem Variationskoeffizienten von <6%. Der Läsionsbereich umfasst den somatosensorischen und motorischen Kortex sowie subkortikale Strukturen wie das Striatum (Abbildung 4).
Abbildung 1: Schema für den Zugang und die intraluminale MCA-Okklusion. Das Filament (gepunktete Linie) wird zwischen den proximalen und distalen Nahtknoten in die ECA eingeführt und entlang der ICA vorgeschoben, bis sie den Ursprung der MCA erreicht (siehe Einschub). Einmal an Ort und Stelle, wird die ECA mit einer Naht ligiert, um das Filament zu fixieren. Abkürzungen: ACA = Arteria cerebralis anterior; BA = Arteria basilaris; CCA = Arteria carotis communis; ECA = Arteria carotis externa; ICA = Arteria carotis interna; MCA = mittlere Hirnarterie; PCA = posteriore kommunizierende Arterie; PTG = Arteria pterygopalatine. Diese Figur wurde von Jackman et al. 15. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Blutfluss während der Okklusion und Reperfusion. Der Blutfluss wird vor und nach dem Einsetzen des Filaments und vor und nach der Filamententfernung registriert. Eine Verringerung des Blutflusses wurde während des Verschlusses und der Wiederherstellung des Blutflusses während der Reperfusion beobachtet. Jede Farbe repräsentiert ein Tier. Abkürzungen: MCA = mittlere Hirnarterie; CBF = zerebraler Blutfluss; A.U. = beliebige Einheiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Neuroscore für funktionelle Defizite nach tMCAo. (A) Gesamter, (B) fokaler und (C) allgemeiner Neuroscore vor und 24 h und 3 d nach tMCAo. Offene Bars: Schein; Schwarze Balken: tMCAo. n=10 pro Gruppe. *p < 0,05. Abkürzungen: tMCAo = transienter mittlerer Hirnarterienverschluss; BL = vor tMCAo. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Volumetrische Infarktanalyse und Infarktergebnis 24 h nach tMCAo. (A) Repräsentative kresylviolett-gefärbte koronale Hirnschnitte alle 400 μm bei 24 h nach tMCAo. Gestrichelte Linien grenzen den Läsionsbereich ab. (B) Analyse des Infarktvolumens von 10 Gehirnen (jeder Punkt repräsentiert ein einzelnes Gehirn) 24 h nach tMCAo. Die horizontale rote Linie stellt den Mittelwert dar (61,69 mm3),Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (3,78 mm3)an. (C) Repräsentatives Bild für die Berechnung des Infarktvolumens aus einem kresylvioletten Koronalschnitt. Blau = Kontralaterale Hemisphäre; Rot = Ipsilaterale Hemisphäre; Blass gestreifte Fläche = ischämische Region. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Zeitpunkt der Wertung | Punktzahl | ||
| Allgemeiner Neuroscore | Haar | 0. Haare ordentlich und sauber | |
| 1. Lokalisierte Piloerection und schmutzige Haare in 2 Körperteilen (Nase und Augen) | |||
| 2. Piloerection und schmutziges Haar in >2 Körperteilen | |||
| Ohren (Maus auf offener Tischplatte) | 0. Normal (Ohren sind seitlich und hinten gestreckt, sie reagieren mit aufrichten nach Geräuschen) | ||
| 1. Seitlich gedehnt, aber nicht hinter (einer oder beide), reagieren sie auf Geräusche | |||
| 2. Wie 1. KEINE Reaktion auf Lärm. | |||
| Augen (Maus auf OBT) | 0. Öffnen, reinigen und der Umgebung schnell folgen | ||
| 1. Offen und durch wässrigen Schleim gekennzeichnet. Folgen Sie langsam der Umgebung | |||
| 2. Offen und durch dunklen Schleim gekennzeichnet | |||
| 3. Ellipsoid geformt und gekennzeichnet durch dunklen Schleim | |||
| 4. Geschlossen | |||
| Haltung (die Maus auf die Handfläche legen und sanft schwingen) | 0. Die Maus steht in aufrechter Position mit dem Rücken parallel zur Handfläche. Während des Schwungs steht es schnell. | ||
| 1. Die Maus steht bucklig. Während des Schwungs flacht es den Körper ab, um Stabilität zu gewinnen. | |||
| 2. Der Kopf oder ein Teil des Stammes liegt auf der Handfläche. | |||
| 3. Die Maus liegt auf einer Seite und kann die aufrechte Position kaum wiederherstellen. | |||
| 4. Die Maus liegt in einer Bauchlage und kann die aufrechte Position nicht wiederherstellen. | |||
| Spontaneos Aktivität (Maus auf OBT) | 0.Die Maus ist aufmerksam und erkundet aktiv. | ||
| 1. Die Maus scheint wachsam zu sein, aber sie ist ruhig und träge. | |||
| 2. Die Maus erkundet intermittierend und träge. | |||
| 3. Die Maus ist schläfrig und taub, wenige Bewegungen auf der Stelle. | |||
| 4.No spontane Bewegungen | |||
| Gesamtpunktzahl für die allgemeine Bewertung | |||
| (normal=0 max=18) | |||
Tabelle 1: Allgemeiner Neuroscore. Die Tiere erhielten je nach Schweregrad zwischen 0 und 4 Punkte für jedes der fünf gemessenen allgemeinen Defizite. Die Punktzahlen in den verschiedenen Bereichen werden dann addiert, um eine Gesamtpunktzahl von 0 bis 18 zu erhalten. Diese Tabelle wurde von Clark et al.14 geändert. Abkürzung: OBT = open benchtop.
| Zeitpunkt der Wertung | Punktzahl | ||
| Fokaler Neuroscore | Körpersymmetrie (Maus auf OBT, beobachten Sie die Nose-Tail-Linie) | 0. Normal (Körper: normale Haltung, Rumpf von der Bank angehoben, mit Vorder- und Hinterbeinen, die unter den Körper geneigt sind. Schwanz: gerade) | |
| 1. Leichte Asymmetrie (Körper: lehnt sich auf eine Seite mit Vorder- und Hinterbeinen, die sich unter den Körper lehnen. Schwanz: leicht gebeugt) | |||
| 2. Moderate Asymmetrie (Körper: lehnt sich mit ausgestreckten Vorder- und Hinterbeinen auf eine Seite. Schwanz: leicht gebeugt) | |||
| 3. Prominente Asymmetrie (Körper: gebeugt, auf einer Seite liegt auf dem OBT. Schwanz: gebogen) | |||
| 4. Extreme Asymmetrie (Körper: stark gebeugt, auf einer Seite liegt ständig auf dem OBT. Schwanz: stark gebogen) | |||
| Gang (Maus auf OBT. Ungestört beobachtet) | 0. Normal (Gang ist flexibel, symmetrisch und schnell) | ||
| 1. Steif, unflexibel (buckliger Gang, langsamer als normale Maus) | |||
| 2. Hinkend, mit asymmetrischen Bewegungen | |||
| 3. Zittern, Treiben, Fallen | |||
| 4. Geht nicht spontan (wenn durch sanftes Drücken der Maus stimuliert, geht sie nicht länger als 3 Schritte) | |||
| Klettern (Maus auf einer 45-stufigen Fläche. Platzieren Sie die Maus in der Mitte der Greiffläche) | 0. Normal (Maus klettert schnell) | ||
| 1. Klettert mit Anstrengung, Gliedmaßenschwäche vorhanden | |||
| 2. Hält sich am Hang fest, rutscht nicht aus oder klettert nicht | |||
| 3. Rutscht den Hang hinunter, erfolgloser Versuch, ein Scheitern zu verhindern | |||
| 4. Folien sofort, keine Anstrengung, um ein Scheitern zu verhindern | |||
| Kreisverhalten (Maus auf OBT, freie Beobachtung) | 0. Fehlendes Kreisverhalten | ||
| 1. Überwiegend einseitige Kurven | |||
| 2. Kreise zur Seite, wenn auch nicht ständig | |||
| 3. Kreist ständig zur Seite | |||
| 4. Schwenken, Schwanken oder keine Bewegung | |||
| Vordergliedmaßensymmetrie (Maus am Schwanz aufgehängt) | 0. Normal | ||
| 1. Leichte Asymmetrie: leichte Beugung des kontralateralen Vorderbeins | |||
| 2. Ausgeprägte Asymmetrie: ausgeprägte Beugung der kontralateralen Extremität, der Körper beugt sich leicht auf der ipsilateralen Seite | |||
| 3. Prominente Asymmetrie: kontralaterales Vorderbein haftet am Rumpf | |||
| 4. Leichte Asymmetrie, keine Körper-/Gliedmaßenbewegung | |||
| Obligatorisches Kreisen (Vorderbeine auf der Bank, Hinterbeine am Schwanz aufgehängt: Es zeigt das Vorhandensein der kontralateralen Gliedmaßenlähmung) | 0. Abwesend. Normale Ausdehnung beider Vorderbeine | ||
| 1. Tendenz, sich zur Seite zu drehen (die Maus streckt beide Vorderbeine aus, beginnt sich aber vorzugsweise zu einer Seite zu drehen) | |||
| 2. Kreise zu einer Seite (die Maus dreht sich mit einer langsameren Bewegung im Vergleich zu gesunden Mäusen zur Seite) | |||
| 3. Schwenkt träge zur Seite (die Maus dreht sich zu einer Seite und schafft es nicht, einen vollständigen Kreis auszuführen) | |||
| 4. Kommt nicht voran (der vordere Teil des Rumpfes liegt auf der Bank, langsame und kurze Bewegungen) | |||
| Whisker-Reaktion (Maus auf dem OBT) | 0. Normal | ||
| 1. Leichte Asymmetrie (die Maus zieht sich langsam zurück, wenn sie auf der kontralateralen Seite stimuliert wird) | |||
| 2. Prominente Asymmetrie (keine Reaktion bei Stimulation auf die kontralaterale Seite) | |||
| 3. Fehlende Reaktion kontralateral, langsame Reaktion, wenn ipsilateral stimuliert | |||
| 4. Fehlende bilaterale Antwort | |||
| Gesamtpunktzahl für fokale Defizite | |||
| (normal=0 max=28) | |||
Tabelle 2: Fokaler Neuroscore. Die Tiere erhielten zwischen 0 und 4 Punkte, abhängig von der Schwere für jedes der sieben gemessenen allgemeinen Defizite. Die Punktzahlen in den verschiedenen Bereichen werden dann addiert, um eine Gesamtpunktzahl von 0 bis 28 zu erhalten. Diese Tabelle wurde von Clark et al.14 geändert. Abkürzung: OBT = open benchtop.
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Discussion
Das vorliegende Protokoll beschreibt ein experimentelles Schlaganfallmodell, das auf der Konsensvereinbarung eines deutschen multizentrischen Forschungskonsortiums ("ImmunoStroke") zur Etablierung eines standardisierten transienten MCAo-Modells basiert. Das transiente MCAo-Modell, das durch die Einführung eines siliziumbeschichteten Filaments durch die ECA zum Ursprung des MCA etabliert wurde, ist eines der am häufigsten verwendeten Schlaganfallmodelle, um eine arterielle Reperfusion nach einer begrenzten Verschlussperiode zu erreichen. Daher kann dieses Verfahren als translational relevantes Schlaganfallmodell betrachtet werden.
Das im Video vorgestellte "Filamentmodell" hat einige Vorteile im Vergleich zu anderen zuvor beschriebenen Schlaganfallmodellen, wie z.B. keine Kraniotomie zu benötigen und eine vollständige Reperfusion des vorübergehend verschlossenen Gefäßes zu erreichen. Die Komplexität des chirurgischen Eingriffs könnte jedoch als Einschränkung angesehen werden, da er eine invasive Chirurgie und eine präzise Manipulation der verschiedenen Arterien in unmittelbarer Nähe der Luftröhre und des Vagusnervs umfasst. Die lange Exposition des Tieres gegenüber Anästhetika könnte ebenfalls ein kritischer Faktor sein, da der Einfluss von Anästhetika auf die Neuroprotektion und das Schlaganfallergebnis bereits gut dokumentiert ist16. Schließlich kann dieser chirurgische Eingriff trotz der Komplexität dieses chirurgischen Eingriffs in ca. 20 minuten abgeschlossen werden, wenn er von einem ausgebildeten Chirurgen durchgeführt wird.
Im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen "Filament"-Schlaganfallprotokollen17erlaubt die hier beschriebene Methode auch die Messung des zerebralen Blutflusses während der Okklusions- und Reperfusionsphase. Die Überwachung des Blutflusses während der Reperfusion könnte ein wichtiger Parameter sein, um eine Schlaganfall-Reperfusionsverletzung zu verhindern18, von der bekannt ist, dass sie bei Patienten, die sich pharmakologischen oder endovaskulären Eingriffen zur Rekanalisation der thrombosierten Gefäße unterziehen, schädliche Folgen hat. Trotz der Diskrepanzen zwischen den Folgen der wiederherstellung des zerebralen Blutflusses nach MCAo19kann die Variabilität der Wiederherstellung des Blutflusses nach einem Schlaganfall die pathophysiologischen und biochemischen Ereignisse im Gehirn sowie das Infarktvolumen und die neurologischen Defizite von Schlaganfallmäusen beeinflussen20. Daher sind in diesem Modell die vollständige Wiederherstellung des Blutflusses und seine Aufzeichnung Voraussetzungen, um reproduzierbare Infarkte bei Mäusen zu gewährleisten, insbesondere in translationalen Schlaganfallstudien.
Die Gesamtmortalität während des chirurgischen Eingriffs beträgt weniger als 5% und wird hauptsächlich durch anästhetische Komplikationen, Blutungen oder Opfer aufgrund vordefinierter Ausschlusskriterien verursacht. Dieses Schlaganfallmodell zeigt jedoch eine moderate Mortalitätsrate innerhalb der ersten 24-48 h nach Schlaganfallinduktion, was die Anzahl der Tiere erhöhen könnte, die pro Experiment benötigt werden, um eine adäquate Kohorte von Schlaganfallmäusen zu erreichen. In Bezug auf das Infarktvolumen induziert dieses Modell große Infarkte, wobei Läsionen bis zu 50% der Hemisphäre umfassen. Es produziert auch Hirnödeme, die verschiedene Gehirnregionen betreffen, einschließlich kortikaler und subkortikaler Regionen.
Um eine geringe Variabilität und hohe Reproduzierbarkeit des Hubmodells zu erreichen, sollten mehrere Ausschlusskriterien berücksichtigt werden, darunter: 1) Betriebszeit > 20 min; 2) >20% der Blutflussreduktion, wenn CCA ligatiert ist (Schritt 3.3); 3) Verringerung des Blutflusses während der Okklusion < 80% des anfänglichen Präokklusionswertes; und 4) Der Blutfluss steigt 10 Minuten nach der Reperfusionsrate <80% im Vergleich zum Wert vor der Reperfusion. Für einen erfahrenen und ausgebildeten Chirurgen sind aufgrund des Operationszeitkriteriums keine Tiere ausgeschlossen. 10-15% der Tiere zeigen jedoch eine 20%ige Verringerung des Blutflusses bei CCA-Ligatur und 5-10% zeigen keine ausreichende Verringerung oder Erhöhung des Blutflusses während der Okklusion bzw. Reperfusion. Daher liegt die Erfolgsquote nach Ausschluss von Tieren auf der Grundlage dieser Kriterien bei etwa 75-85%.
Darüber hinaus werden Tiere täglich nach MCAo (Körpergewicht, Temperatur und grundlegendes physiologisches Verhalten) auf Krankheit, Schmerz oder Unbehagen untersucht. Zusätzlich zu dieser allgemeinen Versorgung wurden mehrere Tests zur spezifischen Verhaltensanalyse nach fokaler Hirnischämie entwickelt, trotz aller bekannten Tests zur Beurteilung sensomotorischer Dysfunktionen, wie der Rotarod-Test21, Sticky-Label-Test22, Corner-Test23oder der Cylinder-Test24. Hier wurden tiere, die für die Etablierung dieses Schlaganfallmodells ausgewählt wurden, auf fokale und allgemeine Defizite untersucht, da das Filamentmodell unabhängig von fokalen (sensorischen oder motorischen) Defiziten auch ein Zytokin-Krankheitsverhalten induziert25. Zusammengenommen ist das hier beschriebene "Filament"-Schlaganfallmodell ein wertvolles Modell für die Grundlagen- und translationale Schlaganfallforschung. Dieses Modell wird als standardisiertes Schlaganfallmodell vorgeschlagen, um Die Schlaganfallmodelle laborübergreifend zu harmonisieren.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken allen kooperationspartnern der ImmunoStroke Consortia (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) für Anregungen und Diskussionen. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie im Rahmen des Munich Cluster for Systems Neurology (EXC 2145 SyNergy - ID 390857198) und im Rahmen der Grants LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 und LL-112/1-1 gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xylacine | Albrecht |
References
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