Neuroscience

שימוש בציפוי בסיס ובמיניסקופ מעוגן מראש עם עדשה אובייקטיבית למחקר חולף בסידן בעכברים

Published: June 5, 2021 doi: 10.3791/62611

Yi-Tse Hsiao¹, Angela Yu-Chi Wang¹, Ting-Yen Lee¹, Ching-Yuan Chang¹

¹Department of Veterinary Medicine, School of Veterinary Medicine, National Taiwan University

Summary

התכווצות המלט הדנטלי במהלך הריפוי מחליפה את לוחית הבסיס. פרוטוקול זה ממזער את הבעיה על ידי יצירת בסיס ראשוני של המלט הדנטלי שמשאיר מקום למלט את לוח הבסיס. שבועות לאחר מכן, ניתן לקבע את לוח הבסיס במקומו על פיגום זה באמצעות מלט חדש קטן, ובכך להפחית את התכווצותו.

Abstract

מדעני מוח משתמשים במיקרוסקופים זעירים (מיניסקופים) כדי לצפות בפעילות עצבית אצל בעלי חיים המתנהגים בחופשיות. צוות המיניסקופים של אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס (UCLA) מספק משאבים פתוחים לחוקרים לבנות מיניסקופים בעצמם. V3 UCLA Miniscope הוא אחד המיניסקופים הפופולריים ביותר בקוד פתוח הנמצאים כיום בשימוש. הוא מאפשר הדמיה של הארעיות הפלואורסצנטית הנפלטת מתאי עצב מהונדסים גנטית דרך עדשה אובייקטיבית המושתלת בקליפת המוח השטחית (מערכת בעלת עדשה אחת), או באזורים עמוקים במוח באמצעות שילוב של עדשת ממסר המושתלת במוח העמוק ועדשה אובייקטיבית המעוגנת מראש במיניסקופ כדי לצפות בתמונה המועברת (מערכת בעלת שתי עדשות). אפילו בתנאים אופטימליים (כאשר תאי עצב מבטאים מחוונים פלואורסצנטיים ועדשת הממסר הושתלה כראוי), שינוי נפח של מלט השיניים בין לוחית הבסיס לבין חיבורו לגולגולת בעת ריפוי צמנטי יכול לגרום לחוסר התאמה עם מרחק שונה בין עדשת המטרה לעדשת הממסר, וכתוצאה מכך איכות התמונה ירודה. לוח בסיס הוא לוח המסייע להרכיב את המיניסקופ על הגולגולת ומקבע את מרחק העבודה בין עדשת המטרה לעדשת הממסר. לפיכך, שינויים בנפח הצמנט הדנטלי סביב לוחית הבסיס משנים את המרחק בין העדשות. הפרוטוקול הנוכחי נועד למזער את בעיית חוסר ההתאמה הנגרמת כתוצאה משינויי נפח בצמנט הדנטלי. הפרוטוקול מפחית את חוסר ההתאמה על ידי בניית בסיס ראשוני של מלט דנטלי במהלך השתלת עדשת ממסר. זמן ההחלמה לאחר ההשתלה מספיק לביסוס של צמנט דנטלי כדי לרפא את לוחית הבסיס לחלוטין, כך שניתן יהיה לקבע את פלטת הבסיס על פיגום זה באמצעות כמה שפחות מלט חדש. במאמר הנוכחי נתאר אסטרטגיות לציפוי בסיס בעכברים כדי לאפשר הדמיה של פעילות עצבית עם עדשה אובייקטיבית המעוגנת במיניסקופ.

Introduction

כתבי פעילות פלואורסצנטית אידיאליים להדמיה של הפעילות העצבית מכיוון שהם רגישים ויש להם טווחים דינמיים גדולים ^1,2,3. לכן, מספר גדל והולך של ניסויים משתמשים במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לצפות ישירות בפעילות העצבית 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ^,¹⁶. המיקרוסקופ הפלואורסצנטי הממוזער הראשון של פוטון אחד (מיניסקופ) תוכנן בשנת 2011 על ידי מארק שניצר ואחרים^. מיניסקופ זה מאפשר לחוקרים לעקוב אחר הדינמיקה הפלואורסצנטית של תאי המוח הקטן בבעלי חיים המתנהגים בחופשיות⁵ (כלומר, ללא כל ריסון פיזי, ריסון ראש, הרגעה או הרדמה לבעלי החיים). נכון לעכשיו, ניתן ליישם את הטכניקה כדי לפקח על אזורי מוח שטחיים כגון קליפת המוח 6,8,15,16; אזורים תת-קורטיקליים כגון ההיפוקמפוס הגבי 8,11,13,14 וסטריאטום ^6,17; ואזורי מוח עמוקים כגון היפוקמפוס הגחון 14, אמיגדלה 10,18 וההיפותלמוס ^8,12.

בשנים האחרונות פותחו מספר מיניסקופים בקוד פתוח⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁷^,¹⁹. החוקרים יכולים להרכיב את המינסקופ מבחינה כלכלית אם הם פועלים לפי ההנחיות שלב אחר שלב שסופקו על ידי צוות המיניסקופ של אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס (UCLA)⁴^,⁷^,¹¹^,¹³. מכיוון שניטור אופטי של פעילות עצבית מוגבל על ידי מגבלות העברת האור⁷ אל האוכלוסייה העצבית המעניינת וממנה, תוכנן מיניסקופ הדורש עיגון מראש של עדשת אינדקס שבירה הדרגתי אובייקטיבי (GRIN) (או עדשה אובייקטיבית) בתחתית המיניסקופ כדי להגדיל את שדה הראייה המועבר מעדשת GRIN ממסר (או עדשת ממסר)⁶^,⁷^,⁸^,¹⁰^,¹⁶^,¹⁷. עדשת ממסר זו מושתלת באזור מוח המטרה כך שהפעילות הפלואורסצנטית של אזור מוח המטרה מועברת על פני השטח של עדשת הממסר⁶^,⁷^,⁸^,¹⁰^,¹⁶^,¹⁷. בערך 1/4 מתקופה סינוסואידלית מלאה של אור עוברת דרך עדשת GRIN אובייקטיבית (~ 0.25 גובה) (איור 1A1), והתוצאה היא תמונה פלואורסצנטית מוגדלת⁶^,⁷. עדשת האובייקט לא תמיד קבועה בתחתית המיניסקופ וגם אין צורך בהשתלת עדשת הממסר⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵. באופן ספציפי, ישנן שתי תצורות: אחת עם עדשה אובייקטיבית קבועה במיניסקופ ועדשת ממסר המושתלת במוח⁸^,¹⁰^,¹²^,¹⁴^,¹⁶ (איור 1B1) ועוד אחת עם עדשה אובייקטיבית נשלפת בלבד⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵ (איור 1B2). בתכנון המבוסס על המטרה הקבועה ושילוב עדשת הממסר המושתלת, אותות הפלואורסצנטיות מהמוח מובאים לפני השטח העליונים של עדשת הממסר (איור 1A1)⁷^,⁸^,¹⁰^,¹²^,¹⁴^,¹⁶. לאחר מכן, עדשת האובייקט יכולה להגדיל ולשדר את שדה הראייה מהמשטח העליון של עדשת הממסר (איור 1A2). מצד שני, עיצוב עדשת GRIN אובייקטיבית נשלפת גמיש יותר, מה שאומר שהשתלה מוקדמת של עדשת ממסר למוח אינה חובה (איור 1B2)⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵. בעת שימוש במיניסקופ המבוסס על עיצוב עדשה אובייקטיבית נשלפת, החוקרים עדיין צריכים להשתיל עדשה באזור מוח המטרה, אך הם יכולים להשתיל עדשה אובייקטיבית⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵ או עדשת ממסר במוח⁶^,⁷. הבחירה של עדשת מטרה או עדשת ממסר להשתלה קובעת את תצורת המיניסקופ שבה על החוקר להשתמש. לדוגמה, V3 UCLA Miniscope מבוסס על עיצוב עדשת GRIN אובייקטיבית נשלפת. חוקרים יכולים לבחור אם להשתיל ישירות עדשה אובייקטיבית באזור המעניין במוח ולהרכיב את המיניסקופ "הריק" על עדשת האובייקט⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵ (מערכת עדשה אחת; איור 1B2) או להשתיל עדשת ממסר במוח ולהרכיב מיניסקופ המעוגן מראש בעדשה אובייקטיבית⁶^,⁷ (מערכת שתי עדשות; איור 1B1). לאחר מכן המיניסקופ פועל כמצלמת פלואורסצנטיות כדי ללכוד תמונות בשידור חי של פלואורסצנטיות עצבית המיוצרת על ידי מחוון סידן מקודד גנטית¹^,²^,³. לאחר חיבור המיניסקופ למחשב, ניתן להעביר תמונות פלואורסצנטיות אלה למחשב ולשמור אותן כקטעי וידאו. חוקרים יכולים לחקור את הפעילות העצבית על ידי ניתוח השינויים היחסיים בפלואורסצנטיות עם כמה חבילות ניתוח²⁰^,²¹ או לכתוב את הקודים שלהם לניתוח עתידי.

V3 UCLA Miniscope מספק למשתמשים גמישות להחליט אם לצלם פעילות עצבית^{עם מערכת} עדשה אחת או שתיים 7. בחירת מערכת ההקלטה מבוססת על עומק וגודל אזור המטרה במוח. בקצרה, מערכת עדשה אחת יכולה לצלם רק שטח שטחי (פחות מ-2.5 מ"מ עומק) וגדול יחסית (גדול מכ-1.8 x 1.8 מ"מ²) מכיוון שהיצרנים מייצרים רק גודל מסוים של עדשה אובייקטיבית. לעומת זאת, מערכת של שתי עדשות יכולה להיות מיושמת על כל אזור במוח המטרה. עם זאת, צמנט השיניים להדבקת לוח הבסיס נוטה לגרום לחוסר התאמה עם מרחק משתנה בין עדשת המטרה לעדשת הממסר, וכתוצאה מכך איכות התמונה ירודה. אם משתמשים במערכת של שתי עדשות, יש למקד במדויק שני מרחקי עבודה כדי להשיג את איכות ההדמיה האופטימלית (איור 1A). שני מרחקי העבודה הקריטיים האלה הם בין תאי העצב והמשטח התחתון של עדשת הממסר, ובין המשטח העליון של עדשת הממסר לבין המשטח התחתון של עדשת המטרה (איור 1A1). כל אי-התאמה או מיקום שגוי של העדשה מחוץ למרחק העבודה גורמים לכשל בהדמיה (איור 1C2). לעומת זאת, מערכת עדשה אחת דורשת מרחק עבודה מדויק אחד בלבד. עם זאת, גודל העדשה האובייקטיבית מגביל את היישום שלה לניטור אזורי מוח עמוקים (עדשת האובייקט המתאימה למיניסקופ היא בערך 1.8 ~ 2.0 מ"מ 6,11,13,15). לכן, השתלת עדשה אובייקטיבית מוגבלת לתצפית על פני השטח ואזורי מוח גדולים יחסית, כגון קליפת המוח 6,15 ו dorsal cornu ammonis 1 (CA1) בעכברים^11,13 . בנוסף, יש לשאוף שטח גדול של קליפת המוח כדי לכוון ל-CA1^11,13 הגבי. בגלל המגבלה של תצורת עדשה אחת המונעת הדמיה של אזורי מוח עמוקים, מערכות מיניסקופ מסחריות מציעות רק עיצוב משולב של עדשה אובייקטיבית/עדשת ממסר (שתי עדשות). מצד שני, ניתן לשנות את המיניסקופ V3 UCLA למערכת עדשה אחת או שתי עדשות מכיוון שהעדשה האובייקטיבית שלו ניתנת להסרה 6,11,13,15. במילים אחרות, משתמשי V3 UCLA miniscope יכולים לנצל את העדשה הנשלפת על ידי השתלתה במוח (יצירת מערכת עדשה אחת), בעת ביצוע ניסויים הכוללים תצפיות מוח שטחיות (פחות מ -2.5 מ"מ עומק), או על ידי עיגון מראש שלה במיניסקופ והשתלת עדשת ממסר במוח (יצירת מערכת שתי עדשות), בעת ביצוע ניסויים הכוללים תצפיות מוח עמוקות. ניתן ליישם את מערכת שתי העדשות גם לצורך התבוננות שטחית במוח, אך על החוקר לדעת את מרחקי העבודה המדויקים בין עדשת האובייקט לעדשת הממסר. היתרון העיקרי של מערכת עם עדשה אחת הוא שיש סיכוי נמוך יותר לפספס את מרחקי העבודה מאשר במערכת עם שתי עדשות, בהתחשב בכך שיש שני מרחקי עבודה שצריך לכוון אליהם במדויק כדי להשיג איכות הדמיה אופטימלית במערכת של שתי עדשות (איור 1A). לכן, אנו ממליצים להשתמש במערכת עדשה אחת לתצפיות מוח שטחיות. עם זאת, אם הניסוי דורש הדמיה באזור המוח העמוק, על החוקר ללמוד להימנע מחוסר התאמה של שתי העדשות.

הפרוטוקול הבסיסי לתצורת שתי עדשות של מיניסקופים לניסויים כולל השתלת עדשה וציפוי בסיס 8,10,16,17. ציפוי בסיס הוא הדבקה של לוחית בסיס על ראשה של חיה כך שהמיניסקופ יכול בסופו של דבר להיות מותקן על גבי החיה ולצלם בווידיאו את אותות הפלואורסצנטיות של תאי עצב (איור 1B). הליך זה כולל שימוש במלט דנטלי כדי להדביק את לוחית הבסיס על הגולגולת (איור 1C), אולם התכווצות של מלט דנטלי יכולה לגרום לשינויים בלתי מתקבלים על הדעת במרחק בין עדשת הממסר המושתלת לעדשת האובייקט ^8,17. אם המרחק המוסט בין שתי העדשות גדול מדי, לא ניתן להביא תאים למיקוד.

פרוטוקולים מפורטים לניסויי דימות סידן בעומק המוח באמצעות מיניסקופים כבר פורסמו⁸^,¹⁰^,¹⁶^,¹⁷. מחברי פרוטוקולים אלה השתמשו במערכת Inscopix⁸^,¹⁰^,¹⁶ או עיצובים מותאמים אישית אחרים¹⁷ ותיארו את ההליכים הניסיוניים לברירה ויראלית, ניתוח וחיבור לוחית בסיס. עם זאת, לא ניתן ליישם את הפרוטוקולים שלהם במדויק על מערכות קוד פתוח אחרות, כגון מערכת V3 UCLA Miniscope, NINscope⁶ופינצ'סקופ.,¹⁹. חוסר התאמה של שתי העדשות יכול להתרחש במהלך ההקלטה בתצורה של שתי עדשות עם UCLA Miniscope עקב סוג של מלט דנטלי המשמש להצמדת לוחית הבסיס לגולגולת⁸^,¹⁷ (איור 1C). הפרוטוקול הנוכחי נחוץ מכיוון שהמרחק בין עדשת הממסר המושתלת לעדשת האובייקט נוטה להשתנות עקב התכווצות לא רצויה של מלט דנטלי במהלך הליך ציפוי הבסיס. במהלך ציפוי הבסיס, יש למצוא את מרחק העבודה האופטימלי בין עדשת הממסר המושתלת לבין עדשת האובייקט על ידי התאמת המרחק בין המיניסקופ לחלק העליון של עדשת הממסר, ולאחר מכן יש להדביק את לוח הבסיס במיקום אידיאלי זה. לאחר קביעת המרחק הנכון בין עדשת האובייקט לעדשת הממסר המושתלת, ניתן לקבל מדידות אורך ברזולוציה תאית (איור 1B; in vivo הקלטה). מכיוון שהטווח האופטימלי של מרחקי עבודה של עדשת ממסר הוא קטן (50 - 350 מיקרומטר)⁴^,⁸התכווצות צמנט מוגזמת במהלך הריפוי עלולה להקשות על שמירת עדשת האובייקט ועדשת הממסר המושתלת בטווח המתאים., מטרת העל של דו"ח זה היא לספק פרוטוקול לצמצום בעיות ההתכווצות⁸^,¹⁷ המתרחשים במהלך הליך ציפוי הבסיס וכדי להגדיל את שיעור ההצלחה של הקלטות מיניסקופ של אותות פלואורסצנטיים בתצורה של שתי עדשות. הקלטה מוצלחת של מיניסקופ מוגדרת כהקלטה של שידור חי של שינויים יחסיים ניכרים בפלואורסצנטיות של נוירונים בודדים בחיה המתנהגת בחופשיות. למרות שלמותגים שונים של מלט דנטלי יש שיעורי התכווצות שונים, חוקרים יכולים לבחור מותג שנבדק בעבר⁶^,⁷^,⁸^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,²². עם זאת, לא כל מותג קל להשגה במדינות / אזורים מסוימים בשל תקנות היבוא של חומרים רפואיים. לכן, פיתחנו שיטות לבדוק את שיעורי ההתכווצות של צמנטים דנטליים זמינים, וחשוב לספק פרוטוקול חלופי הממזער את בעיית ההתכווצות. היתרון על פני פרוטוקול ציפוי הבסיס הנוכחי הוא עלייה בשיעור ההצלחה של הדמיית סידן עם כלים וצמנט שניתן להשיג בקלות במעבדות. המינסקופ של UCLA משמש כדוגמה, אך הפרוטוקול חל גם על מיניסקופים אחרים. בדוח זה, אנו מתארים הליך ממוטב של ציפוי בסיס וגם ממליצים על כמה אסטרטגיות להתאמת מערכת שתי עדשות המיניסקופ של UCLA (איור 2A). שתי דוגמאות להשתלה מוצלחת (n = 3 עכברים) ודוגמאות להשתלה כושלת (n = 2 עכברים) עבור תצורת שתי עדשות עם המיניסקופ של UCLA מוצגות יחד עם הדיונים מסיבות ההצלחות והכישלונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי הוועדה הלאומית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת טייוואן (אישור מספר: NTU-109-EL-00029 ו- NTU-108-EL-00158).

1. הערכת שינוי נפח של צמנט דנטלי

הערה: שינויים בנפח הצמנט הדנטלי מתרחשים במהלך תהליך הריפוי. בדוק את שינויי הנפח של צמנט דנטלי לפני ההשתלה וציפוי הבסיס. חוקרים יכולים לבדוק כל מותג של מלט דנטלי ולהשתמש במותג עם שינוי הנפח הנמוך ביותר כדי לקבע את לוח הבסיס. דוגמה לכך מוצגת באיור 3.

שוקלים 0.5 גרם מכל אבקת מלט דנטלית ומערבבים אותה עם התמיסה המתאימה לה (1 מ"ל).
הערה: יחס אבקה/נוזל המומלץ בהוראות צמנט דנטלי הוא 0.5 גרם אבקה עד 0.25 מ"ל של התמיסה לקבלת צורה מוצקה. פרוטוקול בדיקה זה מדלל את היחס ל -0.5 גרם / מ"ל כך שניתן לשאוף את התערובת בצורה נוזלית על מנת למדוד את שינוי הנפח בקצות פיפטה.
השתמש בקצות פיפטה 0.1-10 μL כדי להסיר 2.5 μL מתערובת המלט הדנטלית, ולאחר מכן אטם את קצה פיפטה עם דבק מרפא קל.
הניחו את הקצוות על מתלה, סמנו את המפלסים העליונים ביותר של תערובת הצמנט הדנטלי ומדדו את רמת תערובת הצמנט הדנטלי לאחר 40 דקות (סרטון משלים S1).
בנוסף למעקב אחר שינויי המפלס במהלך ריפוי הצמנט הדנטלי בקצוות, מדדו את צפיפות הצמנט הדנטלי היבש שנותרה. כדי לחשב את הצפיפות, למדוד את משקל הצמנט הדנטלי ולמדוד את הנפח עם עקרון ארכימדס.
1. בקיצור, מניחים את שארית המלט הדנטלי היבש בכוס מלאה במים, ושוקלים את המים שעולים על גדותיהם.
השתמש במלט הדנטלי עם התכווצות מינימלית עבור כל הפרוטוקולים המפורטים להלן.

2. הרדמה, השתלה כירורגית, הזרקה ויראלית וציפוי בסיס דמה

הרדמה
הערה: הדו"ח הנוכחי נועד לייעל את הליך הניתוח וציפוי הבסיס עבור המינסקופ של UCLA; לכן, ההנחה הייתה כי הטיטר הנגיפי האופטימלי להדבקת אזורי המטרה במוח היה ידוע. את השיטות למציאת הטיטר הנגיפי האופטימלי ניתן למצוא בשלבים 1 עד 5 של Resendez et al.⁸. לאחר שהדילול הנגיפי עבר אופטימיזציה, ניתן להתחיל בהשתלה כירורגית.
1. הכניסו את העכבר למיכל אינדוקציה וספקו חמצן (100% בקצב זרימת אוויר של 0.2 ליטר/דקה). Preoxygenate העכבר במשך 5 עד 10 דקות.
2. יש לתת 5% איזופלורן מעורבב עם 100% חמצן (קצב זרימת אוויר: 0.2 ליטר/דקה) עד שהעכבר מתחיל לאבד את שיווי משקלו ובסופו של דבר מורדם.
3. הסר את העכבר מתא ההשראות והזריק אטרופין (0.04 מ"ג / ק"ג; הזרקה תת עורית), כדי למנוע הצטברות של רוק ובופרנורפין (0.03 מ"ג / ק"ג; הזרקה תת עורית) כמשכך כאבים.
4. לגלח את ראשו של העכבר.
5. יש לעטות מסכה, חלוק סטרילי וכפפות. הכינו חלל סטרילי וכלי ניתוח סטריליים לניתוח. ייצב את ראש העכבר (לשמור על הרדמה עם 3 עד 2.5% isoflurane במהלך שלב זה) על המכשיר stereotaxic. לאחר הליכי משככי כאבים והרדמה, ודא כי מוטות האוזניים מייצבים היטב את הראש. ספק תמיכה תרמית.
6. ודא כי הראש מוגדר במצב ישר, לעקר את הראש מגולח עם betadine, ולאחר מכן לרסס את הראש עם xylocaine (10%), משכך כאבים מקומי.
7. החל משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש.
  הערה: השתמש במשחת עיניים להגנה על העיניים במהלך כל אירועי ההרדמה כדי למנוע פגיעה עינית.
8. בדוק את רפלקס הכאב העמוק של בעל החיים על ידי צביטת כפו האחורית. ברגע שהחיה לא מראה רפלקס נסיגה מכפות, המשיכו בהליכים כירורגיים.
9. בצע חתך קטן לאורך מישור הקשת האמצעית של הגולגולת (החל מכ-2 מ"מ קדמי לברגמה וכלה כ-6 מ"מ אחורי לברגמה). לאחר מכן, נקו את רקמת החיבור בגולגולת, ועגנו שלושה ברגי נירוסטה לעצמות הקדמיות והאינטרקודקודיות השמאליות.
  1. בשלב זה, להפחית את isoflurane ל 1-2%. עקוב אחר קצב הנשימה במהלך כל ההליך הכירורגי. אם קצב הנשימה איטי מדי (כ-1/s, תלוי בבעל החיים), יש להפחית את ריכוז האיזופלורן.
10. ביצוע קרניוטומיה להשתלת עדשת הממסר תחת מיקרוסקופ כירורגי או סטריאומיקרוסקופ באמצעות מקדח בור בקוטר קצה 0.7 מ"מ. השתמש במיקרו-מקדחה כדי לתפוס את מקדח הבור ולצייר קווי מתאר של אזור המעגל המיועד (אין צורך לחדור את העובי המלא של הקלבריום).
  הערה: עדשת הממסר המשמשת בפרוטוקול הנוכחי הייתה בקוטר של 1.0 מ"מ, אורך ~ 9.0 מ"מ גובה של 1, וטווח מרחק עבודה של ~ 100 מיקרומטר - 300 מיקרומטר; לכן, craniotomy היה בקוטר של 1.2 מ"מ.
  1. להעמיק בעדינות את קווי המתאר עד לחשיפת הדורה.
  2. מכינים 3 מ"ל מלח סטרילי במזרק 3 מ"ל ומקררים אותו בדלי קרח. לעתים קרובות לשטוף את האזור החשוף עם 0.1 מ"ל של מלח מן המזרק כדי לקרר את האזור ולמנוע נזקי חום ודימום.
11. קוטפים קלות ומקלפים את הדורה בעזרת מחט 27 גרם.
12. שימו סימן על מחט קהה 27G במרחק של 1 מ"מ מהקצה והשתמשו בה כדי לשאוף בזהירות את קליפת המוח כדי ליצור חלון להשתלת עדשה 8,11,13,17 (איור 2B1). במידת הצורך, הכינו מחט קהה על ידי שחיקה של קצה מחט הזרקה 27 גרם עם נייר זכוכית. לאחר מכן, חברו את המחט למזרק, חברו את המזרק לצינור וחברו את הצינור למקור יניקה ליצירת ואקום.
  הערה: עדשת הממסר קהה ותדחוס את רקמת המוח כאשר היא ממוקמת באזור המוח העמוק. לפיכך, שאיפה של קליפת המוח מפחיתה נזק לרקמות עקב השתלת עדשת ממסר. עובי קליפת המוח הוא כ-1 מ"מ בעכברים, אך קשה לדמיין אותה תחת סטריאומיקרוסקופ. הסימן יוצר נקודת ציון המאפשרת לקבוע את עומק המחט בצורה מדויקת יותר מאשר במיקרוסקופ בלבד. בנוסף, ניתן לקבוע אם אזור קליפת המוח הגיע או עבר בהתאם להתנגדות; החלק העליון של קליפת המוח מרגיש רך יחסית, בעוד שהאזור התת-קליפתי מרגיש צפוף. לכן, ברגע שהמרקם מתחיל להרגיש צפוף יותר, הפסיקו את השאיפה (איור 2B3).
13. מכינים 3 מ"ל מלח סטרילי במזרק 3 מ"ל ומקררים אותו בדלי קרח. לשטוף את האזור עם מלוחים כדי לעצור את הדימום ולהקטין את האפשרות של בצקת המוח.
הזרקת וירוס הקשור לאדנו (AAV)
הערה: AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE שימש בניסוי הנוכחי. jGCaMP7s הוא אינדיקטור סידן מקודד גנטית הפולט פלואורסצנטיות ירוקה³. מכיוון שהמחקר הנוכחי השתמש בעכבר מסוג פרא כנבדק, היה צורך בווקטור נגיפי כדי להדביק את תאי העצב בגן מחוון הסידן הפלואורסצנטי הירוק ולאפשר את הביטוי. חוקרים המשתמשים בעכברים טרנסגניים המבטאים את מחוון הסידן הירוק-פלואורסצנטי כנבדקים שלהם יכולים לדלג על פרוטוקול 2.2.
1. הרכיבו את המחט הפנימית של צנתר תוך ורידי 20G (i.v.) על הזרוע הסטריאוטקסית ונקבו באיטיות (~100 - 200 מיקרומטר לדקה) את המוח בקואורדינטות המתאימות (אותן קואורדינטות המשמשות במהלך השתלת עדשת ממסר) (איור 2B3).
2. מורידים את מחט המיקרו-הזרקה במהירות של 100-200 מיקרומטר לדקה לתוך CA1 הגחוני ומחדירים (~ 25 nL/min) 200 nL של וקטור הנגיף לאזור המטרה (-3.16 מ"מ AP, 3.25 מ"מ ML ו--3.50 מ"מ DV מהברגמה).
3. המתן 10 דקות כדי לאפשר לווירוס להתפזר ולמזער את הזרימה חזרה.
4. משוך (~ 100-200 מיקרומטר / דקה) את מחט המיקרו-הזרקה.
השתלת עדשת ממסר
1. יש לחטא את עדשת הממסר עם 75% אלכוהול^10,16 ולאחר מכן לשטוף במי מלח ללא פירוגן. משרים את העדשה במי מלח קרים ללא פירוגן עד להשתלה.
  הערה: עדשה קרה ממזערת בצקת במוח כאשר היא ממוקמת במוח.
2. החזיקו את עדשת הממסר באמצעות מהדק מיקרו-בולדוג (איור 2B3) ששיניו כוסו בצינורות מתכווצים בחום.
  הערה: מהדק הבולדוג יכול להחזיק היטב את העדשה מבלי לפגוע בה. עיין Resendez et ^al.8 עבור השיטה להפוך את מהדק בולדוג מכוסה אבובים.
3. מקם באיטיות (~ 100 - 200 מיקרומטר לדקה) את עדשת הממסר על גבי אזור המטרה (-3.16 מ"מ AP, 3.50 מ"מ ML ו- -3.50 מ"מ DV מהברגמה) וייצב אותה עם מלט דנטלי.
ציפוי בסיס דמה
הערה: מטרת "ציפוי בסיס דמה" במהלך ניתוח ההשתלה היא ליצור בסיס צמנט דנטלי על מנת להפחית את כמות המלט הדנטלי שיש למרוח במהלך הליך ציפוי הבסיס האמיתי מספר שבועות לאחר מכן. באופן זה ממוזער הסיכון לשינוי בנפח הצמנט הדנטלי.
1. הדקו את עדשת האובייקטיבי בתחתית המיניסקופ והרכיבו את לוח הבסיס על המיניסקופ (בשלב זה, הרכבת עדשת המטרה, לוח הבסיס והמיניסקופ המעוגנים טרם הונחה מעל גולגולת העכבר).
2. עטפו 10 ס"מ של סרט פרפין סביב החלק החיצוני של לוח הבסיס (איור 4A).
3. החזיקו את המיניסקופ עם בדיקת הזרוע הסטריאוטקסית באמצעות חימר דבק רב פעמי.
4. יישרו את עדשת האובייקט על גבי עדשת הממסר עם רווח קטן ככל האפשר בין העדשות (איור 4B).
5. השתמשו במלט דנטלי כדי לאבטח את מיקום לוחית הבסיס (כך שהמלט נוגע רק בסרט הפרפין).
6. כאשר המלט הדנטלי התייבש, הסירו את הסרט.
7. הסר את לוח הבסיס ואת המיניסקוף. בסיס הצמנט הדנטלי חלול (איור 4B).
8. כדי להגן על עדשת הממסר מפני פעילויות יומיומיות ומפני שריטות על-ידי העכבר, אטמו את עדשת הממסר עם מעט גומי סיליקון יציקה עד לכיסוי עדשת הממסר, וכסו את גומי הסיליקון בשכבה דקה של מלט דנטלי (איור 4B).
9. נתקו את העכבר מהמכשירים הסטריאוטקסיים והכניסו את העכבר לתא התאוששות.
10. הזריקו קרפרופן (5 מ"ג/ק"ג; הזרקה תת-עורית) או מלוקסיקאם (1 מ"ג/ק"ג; הזרקה תת-עורית) לשיכוך כאבים וצפטזידים (25 מ"ג/ק"ג; הזרקה תת-עורית) למניעת זיהום.
  הערה: השימוש באנטיביוטיקה אינו חלופה לטכניקה אספטית. אנטיביוטיקה פרי-ניתוחית (כלומר, ceftazidime) עשויה להיות מסומנת בנסיבות מסוימות, כגון ניתוחים ארוכי טווח או מיקום של שתלים כרוניים.
11. התבוננו בחיה עד שהיא חוזרת להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה.
12. עכברי בית בנפרד ומזריקים meloxicam (1 מ"ג / ק"ג; הזרקה תת עורית; q24h) במשך שבוע כדי להקל על כאבים לאחר הניתוח. בדוק את בעל החיים כל יום לאחר הניתוח כדי לוודא שהוא אוכל, שותה ועושה את צרכיו כרגיל.
13. בצע ציפוי בסיס לאחר 3 שבועות או יותר.

3. ציפוי בסיס

הערה: בדרך כלל, לא ניתן לבצע את הליך ציפוי הבסיס (איור 5) תוך 2-3 שבועות מההליך הראשוני עקב זמן ההתאוששות והדגירה הנגיפית. הליכי האינדוקציה עבור ציפוי בסיס דומים לאלה המתוארים בשלבים 2.1.1 עד 2.1.8. עם זאת, ציפוי בסיס אינו הליך פולשני, ובעל החיים דורש רק טשטוש קל. לכן, 0.8-1.2% isoflurane מספיק, כל עוד החיה לא יכול לנוע על מסגרת סטריאוטקסית. בנוסף, הרדמה איזופלורנית קלה יחסית יכולה גם לעזור להקל על ביטוי הארעיות הפלואורסצנטית של נוירונים במהלך ניטור⁸ (וידאו משלים S2).

חותכים בזהירות את השכבה הדקה של גג הבטון הדנטלי עם רונגור עצם ומסירים את גומי הסיליקון. נקו את פני השטח של עדשת הממסר עם 75% אלכוהול.
הדקו בורג קבוע לצד לוח הבסיס כדי לקבע אותו לתחתית המיניסקופ (איור 5A1).
הערה: יש להדק היטב את לוח הבסיס מתחת לתחתית המיניסקוף, מכיוון שההבדל בין לוח בסיס מהודק ללוח בסיס מהודק קלות עלול לגרום למרחק לא עקבי.
כוונן את שקופית המיקוד כך שתהיה במרחק של כ- 2.7 - 3 מ"מ מהמארז הראשי (איור 5A2).
הערה: למרות שניתן לכוונן את האורך עוד יותר במהלך הליך ציפוי הבסיס, קבע אותו לכ- 2.7 מ"מ, מכיוון שהתאמת אורך המיניסקופ והאורך האופטימלי בין עדשת הממסר המושתלת לעדשה האובייקטיבית המעוגנת מראש מבלבלת מאוד.
חבר את המיניסקופ ללוח איסוף הנתונים וחבר אותו ליציאת USB 3.0 (או גירסה מתקדמת יותר) במחשב.
הפעל את תוכנת רכישת הנתונים שפותחה על ידי צוות UCLA.
התאם את החשיפה ל- 255, את הרווח ל- 64x ואת נורית העירור ל- 5%. הגדרות אלה מומלצות לציפוי בסיס ראשוני; ההגדרות הספציפיות ישתנו בהתאם לאזורי המוח ולרמות הביטוי של מחוון הסידן המקודד גנטית.
לחץ על לחצן התחבר כדי לחבר את המיניסקופ לתוכנת איסוף הנתונים ולצפות בשידור החי.
ישרו את עדשת המיניסקופ האובייקטיבית לעדשת הממסר ביד והתחילו לחפש את אותות הפלואורסצנטיות (איור 5B₁).
הערה: בתחילה, חיפוש ידני של אות הפלואורסצנטיות מאפשר התאמות. מכיוון שנעשה שימוש במערכת AAV כדי לבטא את מחוון הסידן המקודד גנטית, הן סוג המקדם והן הסרוטיפ AAV השפיעו על יעילות הטרנספקציה^23,24. חוקרים צריכים לבדוק את הביטוי של מחוון הסידן על ידי מציאת נוירונים בודדים המראים שינויים פלואורסצנטיים לפני שימשיכו בניסויים עתידיים.
קדח את המלט הדנטלי בכל מקום שבו הוא חוסם את המיניסקופ (אופציונלי).
צפה בשידור החי של תוכנת רכישת הנתונים והשתמש בשולי עדשת הממסר כציון דרך (סרטון משלים S2). השוליים של עדשת הממסר נראים כעיגול אפור דמוי ירח על הצג (איור 5B1; חיצים לבנים).
לאחר מציאת עדשת הממסר, כוונן בזהירות את הזוויות והמרחקים השונים של המיניסקופ עד למציאת אותות הפלואורסצנטיים.
הערה: התמונות של תאי העצב לבנות יותר מהרקע. צורה עצבית מדויקת מצביעה על כך שהנוירונים שוכבים בצורה מושלמת על מישור המוקד של עדשת הממסר. תאי עצב עגולים מצביעים על כך שהם היו קרובים למישור המוקד. הצורה העצבית שונה ברחבי המוח, כאן CA1 הגחוני מוצג כדוגמה.
אם אף תא עצב לא מציג שינויים בפלואורסצנטיות כפונקציה של הזמן, אטמו מחדש את הבסיס עם גומי סיליקון. פלואורסצנטיות אינה נצפתה מכיוון שתקופת הדגירה תלויה גם ברכוש הנגיף^23,24. בצע את שלבים 3.1-3.12 לאחר שבוע נוסף. (זה אופציונלי).
החזיקו את המיניסקופ במיקום האופטימלי והזיזו את הזרוע הסטריאוטקסית עם חימר דבק לשימוש חוזר לכיוון המיניסקופ (איור 5B2). הצמידו את המיניסקופ לזרוע הסטריאוטקסית בעזרת חימר דבק רב פעמי.
כוונן מעט את זרועות x, y ו- z כדי לחפש את התצוגה הטובה ביותר (סרטון משלים S2). לאחר מכן, התאימו את הזווית בין פני השטח של עדשת האובייקט לבין עדשת הממסר על ידי סיבוב מוט האוזן, מוט השן או חימר דבק לשימוש חוזר על ציר z. ביטוי נגיפי והשתלת עדשה מוצלחים כאשר לפחות תא אחד מציג ארעיות פלואורסצנטית (איור 6A; וידאו משלים S2) במהלך ציפוי הבסיס (אשר תלוי גם באזור המוח, כגון CA1).
הערה: אם הצג מציג רק תאים לבנים אך לא ארעיים, קיימת סיבה נוספת (ראה איור 6B,C, סרטונים משלימים S4,S5, המקטע תוצאות ומקטע פתרון בעיות).
צמנט את לוחית הבסיס (איור 5B2) עם מלט דנטלי.
עקוב אחר אזור העניין במהלך המלט כדי להבטיח שהמיקום האופטימלי אינו משתנה.
השתמשו בכמות הקטנה ביותר האפשרית של מלט תוך הדבקה חזקה של לוחית הבסיס על בסיס המלט הדנטלי (איור 5B2). מרחו שכבה שנייה ושלישית של מלט סביב לוח הבסיס אך היזהרו שלא להשפיע על עדשת GRIN.
הערה: מריחת מלט על לוח הבסיס קלה יותר בשלב זה מכיוון שבסיס לוח הבסיס נוצר במהלך הליך ציפוי הדמה.
נתקו בזהירות את המיניסקופ מלוח הבסיס כאשר המלט נרפא. לאחר מכן, הברג את מכסה המגן.
העבירו את בעל החיים לכלוב התאוששות. התבוננו בחיה עד שהיא חוזרת להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה.
עכברי בית בנפרד. ודאו שהוא אוכל, שותה ועושה את צרכיו כרגיל בכל יום. המתן 5 ימים עד שהעכבר יתאושש לחלוטין ולאחר מכן בדוק את הדמיית הסידן.
הערה: יש רק כמות קטנה של מלט דנטלי המחזיק את לוחית הבסיס. לכן, אם לוחית הבסיס זזה במידה ניכרת מאז הליך ציפוי הבסיס, הסר את המלט הדנטלי באמצעות מקדחה בצע שוב את הליך ציפוי הבסיס.
מרדימים (על ידי הזרקה תוך צפקית של קטמין (87 מ"ג / ק"ג) / קסילזין (13 מ"ג / ק"ג) תערובת) ומנקבים²⁵ את החיה כאשר כל הניסויים נעשים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הערכת שינוי נפח הצמנט הדנטלי
מכיוון שנפח הצמנט הדנטלי משתנה במהלך תהליך הריפוי, זה עשוי להשפיע באופן משמעותי על איכות ההדמיה, בהתחשב בכך שמרחק העבודה של עדשת GRIN הוא בערך 50 עד 350 מיקרומטר ^4,8. לכן, שני צמנטים דנטליים זמינים מסחרית נבדקו במקרה זה, טמפרון וטוקוסו, לפני הליך ההשתלה וציפוי הבסיס (איור 5). תחילה נבדקו סרטונים כדי לקבוע אם המלטים התכווצו ולאחר מכן השוו את נפחי המלט כאשר התייבשו לחלוטין. אותו ריכוז ונפח של התערובות הראשוניות של צמנטים דנטליים הועמסו לתוך קצות פיפטה וצולמו בווידיאו (וידאו משלים S1). סרטון S1 הראה כי שני הצמנטים התכווצו במהלך תהליך הייבוש. Tokuso הפגין ביצועים טובים יותר מאשר Tempron (כלומר, היה לו נפח גדול יותר מאשר Tempron גם לאחר התכווצות): איור 3B; נפח ממוצע של טמפרון: 0.93 ± 0.07 מ"ל; נפח ממוצע של Tokuso: 1.18 ± 0.07 מ"ל; מבחן T: p = 0.048, t₍₆₎= 2.46, מה שמרמז על כך שהוא התכווץ פחות. גם צפיפות המלט נבדקה 4 פעמים לאחר ייבוש מלא. לטוקוסו הייתה צפיפות ממוצעת נמוכה יותר מאשר לטמפרון (צפיפות ממוצעת של טמפרון: 1.07 ± 0.12 גרם/מ"ל; צפיפות ממוצעת של טוקוסו: 0.93 ± 0.08 גרם/מ"ל; מבחן t: p = 0.38, t₍₆₎= -0.94), מה שמרמז על כך שהיה לו קצב התכווצות נמוך יותר. לכן, טוקוסו שימש לשלבי ההשתלה וציפוי הבסיס הבאים. המטרה בתיאור הניסוי לעיל אינה להמליץ על מותגים כלשהם אלא להזכיר לנסיינים למצוא מלט דנטלי שאינו עובר שינוי נפח ניכר בעת הריפוי.

מדידת הזזה של תמונה
ביצענו סימולציה של ציפוי בסיס דמה ונהלי ציפוי בסיס מקוריים על אובייקט קבוע כדי לחקור אם הליך ציפוי בסיס הדמה גורם לשינוי קטן יותר במיקום לוחית הבסיס מאשר ההליך המקורי. נעשה שימוש בדבק לריפוי קל כדי לקבע מחט מזרק 23 G בקוטר 2.5 ס"מ במרכז לוחית בסיס עם 1 ס"מ בולטת מחוץ ללוח הבסיס (איור 3C). לאחר מכן, ציפוי הבסיס דמה על ידי החזקת המחטים עם זרוע של מכשיר סטריאוטקסי. במקום להשתמש בחיות מעבדה, הודבקה מדבקה על שולחן המכשיר הסטריאוטקסי. מחט המזרק ניקבה את המדבקה, ובכך ייצגה את המיקום המקורי. לאחר מכן, המחט הוגבהה ב-0.5 מ"מ והחלו ניתוחי הסימולציה. בניתוח המחקה את הליך ציפוי הבסיס^החד פעמי 8, נמרח צמנט דנטלי עד שכיסה את לוחית הבסיס, שהייתה 1 ס"מ מעל המדבקה. לאחר מכן, הייתה תקופת המתנה של שעתיים עד שהמלט יחלים לפני שדחפו בעדינות את המחט כדי לנקב שוב את המדבקה. מכיוון שהדבק לריפוי קל לא ייצב לחלוטין את המחט, ניתן היה לדחוף את המחט עמוק יותר כדי ליצור חור נוסף, המייצג את מיקום לוחית הבסיס לאחר שהמלט הדנטלי התייבש. המרחק בין החור הראשוני לחור השני נמדד כדי לכמת את שינוי המיקום של המחט. התוצאות הראו כי לוח בסיס של 1 ס"מ מעל הגולגולת הביא לשינוי מיקום של 1.76 ± 0.14 מ"מ, אך ציפוי בסיס הדמה הביא לשינוי של 0.75 ± 0.17 מ"מ בלבד (איור 3D; מרחק הזזה ממוצע של ציפוי בסיס חד פעמי לעומת ציפוי בסיס דמה; מבחן t: p < 0.01, t₍₈₎= 6.03).

בנוסף, היינו סקרנים לדעת אם גובה המלט הדנטלי ישפיע על השינוי. לכן, בדקנו גובה קצר יותר (איור 3E; 0.5 ס"מ מעל) באמצעות הליך ציפוי הבסיס החד-פעמי. לוחית הבסיס שהייתה מעוגנת 0.5 ס"מ מעל הגולגולת זזה משמעותית פחות מלוחית הבסיס 1 ס"מ מעל הגולגולת (איור 3F; מרחק הזזה ממוצע: 0.43 ± 0.11 לעומת 1.76 ± 0.14 מ"מ; מבחן t: p < 0.01, t₍₈₎ = 9.73). הנתונים הצביעו על מתאם חיובי בין גובה לוחית הבסיס מעל הגולגולת לבין המרחק שלוח הבסיס זז. מכיוון שהליך ציפוי בסיס הדמה מלווה בשלב בסיס שני המשתמש רק בכמות מינימלית של מלט דנטלי, נתונים אלה תומכים גם בהשערה כי ציפוי בסיס דמה מסייע לשפר את הדיוק של הליך ציפוי הבסיס.

הדמיה באמצעות מערכת מיניסקופ בעלת שתי עדשות
על-ידי מעקב אחר הפרוטוקולים הכירורגיים של עירוי נגיפי, ציפוי בסיס דמה וציפוי בסיס (איור 2, איור 4, איור 5), צפינו בארעיות פלואורסצנטית של תאי עצב בודדים בשלושה עכברים (n = 3/5) (איור 6A, וידאו משלים S3) במהלך הליך ציפוי הבסיס ולאחר הליך ציפוי הבסיס בזמן שהעכברים נעו בחופשיות, מה שאישר שמרחק העבודה בין עדשות המטרה לעדשות הממסר נשאר זהה (איור 6A1 לעומת איור 6A3, חל שינוי קל בלבד במיקום) לאחר שהמלט הדנטלי התייבש לחלוטין. כאן, אנו מספקים קטעי וידאו של ציפוי הבסיס של עכבר אחד (וידאו משלים S2; עכבר #5) והדמיית סידן לאחר מכן בזמן שעכברים נעו בחופשיות (וידאו משלים S3; עכבר #3, #4, #5; נתונים גולמיים). שים לב שתוכנת רכישת הנתונים עבור V3 אינה מכילה פונקציות לחיסור הרקע, וניתן לשפר את הניגודיות של הווידאו על ידי עיבוד לא מקוון). עבור וידאו משלים S2, בוצע חיפוש ידני עבור אותות פלואורסצנטיים ולאחר מכן המיניסקופ היה מחובר לזרוע סטריאוטקסית עבור התאמות עדינות. במהלך החיטוט נצפו כמה מעברים פלואורסצנטיים (וידאו משלים S2; איור 6A). ארעי הוא שינוי חלק בבהירות בכתמים אפורים או לבנים, ולא דפוס ירי הדומה לאור מהבהב; איורים 6A ₁ עד 6A₂ מציגים תמונות של ארעיים. הסרטון של עכברים המתנהגים בחופשיות הראה שינוי מרחבי מקובל בהשוואה לאזור העניין במהלך הליך ציפוי הבסיס (סרטון משלים S3). שולי התאים לא יכלו להשתפר באופן משמעותי בשלב זה מכיוון שלא יכולנו להתאים את המרחק בין תחתית עדשת הממסר לבין תאי העצב הפעילים. יש לציין כי בעיות מסוימות עשויות להתרחש לעתים קרובות במהלך הליך ציפוי הבסיס, כולל היעדר דבר מלבד רקע אחיד (איור 6B; וידאו משלים S4) או נראות של שולי תאים לבנים ללא מעברים פלואורסצנטיים (איור 6C; סרטון משלים S5). שתי דוגמאות לתוצאות שליליות מסופקות גם כן (n = 2/5) (איור 6B,C, סרטונים משלימים S4, S5). הסיבות האפשריות לכשלים נבחנות בחלק הדיון. ההליכים הכירורגיים עבור שני עכברים אלה בוצעו ללא שימוש במחט בקוטר 1 מ"מ כדי לנקות את המסלול; לפיכך, עדשת הממסר הושתלה ישירות. אנו מציעים כי בעכבר #2, עדשת הממסר עשויה לדחוס את הנוירונים ולגרור כמה נוירונים למטה, וכתוצאה מכך נוירונים פגומים. לכן, לא נמצאו ארעיות פלואורסצנטית.

איור 1: מנגנונים של המיניסקופ והפגמים שבדרך כלל גורמים לכשל בהדמיה . (A) דיאגרמת קריקטורה של עדשת הממסר ועדשת האובייקט המציגה את המנגנונים הדרושים להדמיה של תאים פלואורסצנטיים במערכת בעלת שתי עדשות. גלי האיתות של כל עדשה מדגישים את החשיבות והמנגנון הכרוך במציאת מרחק עבודה כדי לדמיין את התאים הפלואורסצנטיים. (א1) עדשת GRIN הממסר ממוקמת מעל נוירוני המטרה במרחק העבודה. מכיוון שגובה עדשת הממסר הוא 0.5*N (כאשר N הוא מספר שלם), העדשה מאפשרת הדמיה של נוירוני המטרה על ידי העברת אור, ומביאה את אותות הפלואורסצנטיות המקוריים לחלק העליון של עדשת הממסר. לאחר מכן, בערך 1/4 מתקופה סינוסואידלית מלאה של אור עוברת דרך עדשת GRIN אובייקטיבית (~ 0.25 גובה) והתוצאה היא תמונה מוגדלת. (א2) עדשת האובייקט משדרת את התמונות לחיישן מוליך-למחצה (CMOS) משלים של מתכת-תחמוצת-מוליכים למחצה הממוקם בחלק העליון (הלוח הירוק בדיאגרמה) של המיניסקופ. (B) דיאגרמה מצוירת המציגה את ההבדלים בהליכי השתלת עדשת GRIN בין מערכת (B1) בעלת שתי עדשות לבין (B2) מערכת בעלת עדשה אחת. באופן כללי, ההבדל העיקרי הוא שמערכת העדשה האחת משתמשת ישירות בעדשה האובייקטיבית שלה כדי לדמיין את פני השטח של המוח; כתוצאה מכך, עדשת האובייקט צריכה להיות מושתלת על גבי נוירוני המטרה. (C) לעומת זאת, במערכת שתי העדשות, לשם השוואה, מושתלת במוח עדשת ממסר נוספת והעדשה האובייקטיבית מעוגנת מראש במיניסקופ. (ג1) צורת לוחית הבסיס של גרסת V3 של UCLA Miniscope עלולה לגרום לשינוי לא אחיד לאחר שהמלט הדנטלי מתייבש לחלוטין. (ג2) שינוי זה גורם לחוסר התאמה או סטייה ממרחק העבודה בין עדשת הממסר לעדשת המטרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: פרוטוקולים ששונו ופרוטוקולים כירורגיים מפורטים כדי לשפר את שיעור ההצלחה של מערכת המיניסקופים בעלת שתי העדשות. (א1) פרוטוקול כירורגי שונה למערכת שתי עדשות. המיקומים של ההזרקה הנגיפית, והשתלת עדשת GRIN ממסר מוצגים. ציפוי בסיס דמה מאפשר למרחק העבודה להקיף במדויק את תאי העצב המעניינים ומפחית את הסטת המיקום הקשורה להליך ציפוי הבסיס (A2). לפיכך, (A3) ההסתברות לדימות תאים פלואורסצנטיים בעכברים המתנהגים בחופשיות גדלה. (B) תמונה מצוירת של השלבים להזרקה ויראלית, ומיקום עדשת GRIN ממסר. (ב1) ראשית, סמנו את מחט השאיפה בעט בקוטר של כ-1 מ"מ (לניסויים בעכברים) מהקצה כדי לסייע בהערכת עומק השאיפה של קליפת המוח. לאחר מכן, שאפו את רקמת החיבור וקליפת המוח (בעומק של כ-1 מ"מ בעכברים) מהמוח. (ב2) השתמש בהיפוקמפוס הגחוני כאזור המטרה להשתלת עדשת ממסר; יש לציין שכפיס המוח הקשוח הוא ציון הדרך לעצירת השאיפה של אזור קליפת המוח. את המרקם הסיבי של כפיס המוח ניתן לראות מתחת לסטריאומיקרוסקופ במהלך השאיפה. (ב3) שנית, נקבו את נקודת העניין עם מחט פנימית של צנתר 20 גרם (קוטר של כ-1 מ"מ; הקוטר דומה לזה של עדשת הממסר) כדי לפנות מסלול לפני עירוי נגיפי. מתחת לסטריאומיקרוסקופ, שקע (עיגול מקווקו בתמונה) שנוצר על ידי המחט צריך להיות גלוי. הורידו את מחט המיקרו-הזרקה והעבירו את עדשת הממסר לשקע (או רק 250 מיקרומטר ממרכז השקע). לבסוף, מקמו את עדשת GRIN הממסר (במחקר הנוכחי השתמשנו בעדשת ממסר בקוטר 1 מ"מ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: מדידת שינוי הנפח של מלט דנטלי נרפא. (A) דוגמה עם מלט דנטלי נרפא של שני מותגים. החיצים השחורים מציינים את הרמות המקוריות לאחר ערבוב האבקה והתמיסה. החצים הלבנים מציינים את הרמות לאחר 10, 20 ו -40 דקות של ריפוי. החיצים האדומים מצביעים על תחתית הקצוות, שהיו חתומים בדבק מרפא אור. (B) נפחים ממוצעים של הצמנטים הדנטליים הנותרים לאחר שהם התייבשו לחלוטין. סרגלי השגיאה וסרגלי השגיאה הם האמצעים ± SEMs. * מציין מובהקות (P < 0.05) כפי שנקבע על ידי מבחן t של התלמיד. (C) איורים ותצלום המסבירים את השיטה המשמשת למדידת שינוי המיקום של לוח הבסיס. מחט הודבקה דרך לוחית הבסיס ושימשה להדמיית הליך ציפוי הבסיס המקורי (ציפוי בסיס חד שלבי) והליך ציפוי בסיס הדמה. החיצים האדומים והשחורים מייצגים את מיקומי המחט לפני ואחרי ריפוי המלט הדנטלי. (D) שינויי מרחק ממוצעים של קצה המחט (E) איורים של השיטה המשמשת למדידת היחס בין לוחית הבסיס מעל גובה הגולגולת לבין שינוי המיקום. (F) שינויי מרחק ממוצעים של קצה המחט. סרגלי השגיאה וסרגלי השגיאה הם האמצעים ± SEMs. ** מציין מובהקות (P < 0.01) כפי שנקבע במבחן t של התלמיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: הליך מפורט של ציפוי בסיס דמה (מבוצע מיד לאחר השתלת עדשת ממסר). (A1) קריקטורה תלת-שלבית של עדשה אובייקטיבית, לוח בסיס והרכבת סרט פרפין על המיניסקוף. (א2) גרסת צילום של ההרכבה. (ב1) קריקטורה המציגה את הליך ציפוי בסיס הדמה. ראשית, המינסקופ המורכב מיושר עם עדשת הממסר. מיקום עדשת האובייקט קרוב ככל האפשר לעדשת הממסר. שנית, מלט דנטלי מתווסף לפרפילם המקיף את לוח הבסיס ומוחל על הגולגולת כדי ליצור תבנית נשית לציפוי בסיס עתידי. לאחר מכן, לוחית הבסיס מוסרת, וגומי סיליקון יציקה (ורוד) מתווסף ומעליו מלט דנטלי כדי להגן על העובש הנשי ועדשת הממסר. לאחר מכן מאפשרים לבעל החיים להתאושש מההרדמה. לאחר 3 שבועות לפחות, מתבצע הליך ציפוי הבסיס. (ב2) גרסת צילום של (B1). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: שלבים להליך ציפוי הבסיס. (א1) חבר את לוח הבסיס וכוונן ידנית את מחוון המיקוד ל- 2.7 עד 3 מ"מ. הגדרה של 2.7 עד 3 מ"מ (במיקום המוצג בתמונה) נראית כמקום הטוב ביותר להתחיל בו לפני חיפוש ידני אחר התאים הפלואורסצנטיים. (ב1) התרשים המצויר הראשון ממחיש את חשיבות האורך בין עדשת האובייקט לעדשת הממסר להדמיית התאים הפלואורסצנטיים (תאים פלואורסצנטיים נצפים בדרך כלל במרחק שבין 0.5 ל -2 מ"מ). לפני הופעת התא הפלואורסצנטי, החוקר צריך לראות את השוליים של עדשת הממסר (חצים בתמונה העליונה). כדאי לכוונן תחילה ידנית את העדשה למיקום הצפייה האופטימלי מכיוון שקל יותר לבצע התאמות מהירות ביד. (ב2) הניחו חימר דבק רב פעמי על גשושית הזרוע הסטריאוטקסית, ולאחר מכן ייצבו את המיניסקופ על ידי הדבקתו על הזרוע עם חימר דבק רב פעמי. בשלב זה, אזור העניין אולי השתנה, אך ניתן לתקן זאת בקלות על ידי התאמה קלה של הזרוע הסטריאוטקסית וחמר הדבק הרב פעמי. לאחר בדיקה ומציאת האזור האופטימלי של עניין, להוסיף כמות קטנה של מלט שיניים (מיוצג באדום). הדביקו את פלטת הבסיס עם כמה שפחות מלט דנטלי. יש להפריד בין המיניסקופ לפלטת הבסיס לאחר שהמלט הדנטלי מתייבש. אם לוח הבסיס אינו יציב מספיק, הוסף מלט דנטלי נוסף. (C) תרשים זה ממחיש את החשיבות של כל צעד להשגת הצלחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: דוגמאות להצלחה וכישלון במהלך הליך ציפוי הבסיס. (A) דוגמה להדמיה מוצלחת במהלך הליך ציפוי הבסיס. עדשת הממסר התמקדה בהיפוקמפוס הגחוני. חולפים פלואורסצנטיים הבחינו כאשר בעל החיים היה תחת הרדמה עם איזופלורן (ראה גם וידאו משלים S2). (א2) הניגודיות הוגדלה לשיפור הראות. הקווים המקווקווים האדומים מציינים כלי דם. (א3) פלואורסצנטיות חולפת חמישה ימים לאחר ציפוי הבסיס כאשר העכבר # 2 התנהג בחופשיות בכלוב הביתי שלו (ראה גם וידאו משלים S3; התמונות של עכברים #3 ו #4 מסופקים גם וידאו משלים S3). רק שינוי קל בעמדה התרחש. (ב1) דוגמה לכישלון. במהלך ציפוי הבסיס הבחינו רק באזורים לבנים/אפורים הומוגניים שלא היו דמויי תאים בצורתם (ראו גם סרטון משלים S4). (ב2) עדשת הממסר פספסה את אזור המטרה והייתה ממוקמת מעל אזור ללא תאים נגועים. (ג1) דוגמה נוספת לכישלון. בעכבר זה, למרות שנצפו תאים עגולים רבים, לא נצפו מעברים פלואורסצנטיים במהלך ציפוי הבסיס (לאחר שלושה שבועות של דגירה ובזמן שהעכבר היה מורדם/מורדם). יתר על כן, לא הופעלו מעברים פלואורסצנטיים כאשר הליך ציפוי הבסיס בוצע שוב (בשבוע החמישי לדגירה) או אפילו כאשר בעל החיים התנהג בחופשיות. התמונה התקבלה במהלך ציפוי הבסיס בשבוע החמישי של הדגירה (ראו גם סרטון משלים S5). (ג2 ו-ג3) עדשת הממסר החמיצה את השכבה הפירמידלית של ההיפוקמפוס הגחוני. הנקודות הכחולות הן גרעינים שהוכתמו ב-DAPI. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

בעיה	סיבה אפשרית	תמיסה
היה הדמיה טובה בעת baseplating אבל לגמרי לא בפוקוס למחרת	שינוי נפח בעת ריפוי הצמנט הדנטלי בין גולגולת הנבדק ללוחית הבסיס	המשך "ציפוי בסיס דמה" לאחר הליך השתלת עדשה כפי שהוצע בדו"ח הנוכחי. בחרו צמנט דנטלי עם פחות שינוי נפח.
בעל אזורים לבנים/אפורים הומוגניים ללא כל צורה דמוית תא במהלך ציפוי הבסיס (ראה גם סרטון משלים S4)	A. עדשת הממסר פספסה את אזור המטרה B. ביטוי גרוע של מחוון פלואורסצנטיות C. שכח להתקין עדשה אובייקטיבית מתחת למיניסקופ שבו מחוון הפלואורסצנטיות מבוטא בפועל	א. שימוש בעדשות דמה לביצוע ניתוחים. בדוק את הקואורדינטות של עדשת הדמה לאחר ההשתלה בפועל B. מצא טיטר ויראלי אופטימלי לניסויי הדמיית סידן (התייחס Resendez et al. 2016). אם מסיבה כלשהי, לא ניתן לבצע בדיקות מקדימות, אנו ממליצים למתחילים לנסות תחילה טיטר גבוה יותר. (ראה סעיף דיון לפרטים) ג. בורג על עדשת GRIN אובייקטיבית (~ 0.25 גובה. לדוגמה: אדמונד אופטיקה; מלאי #64-519) בתחתית המיניסקופ.
התבוננו בתאים רבים אך ללא דינמיקה פלואורסצנטית במהלך ציפוי הבסיס	A. נוירונים לא בריאים או נוירונים מתים B. סוג דק דליל של תאי עצב ג. מצב הרדמה עמוקה	א. יש להקפיד על כל הליך כירורגי. השתמש במחט מזרק חדשה הדומה לקוטר עדשת הממסר שלך כדי לחתוך תחילה את נתיב העירוי / ההשתלה כדי לשחרר את הלחץ על ידי השתלת עדשה. להחדיר לאט את הנגיף ולהשתיל לאט את העדשה. B. המתינו זמן רב יותר כדי לעקוב אחר פעילויות תאי העצב או צבטו מעט את הזנב כדי לגרות את העכבר. ג. ציפוי בסיס אינו הליך פולשני, ובעל החיים זקוק רק לטשטוש. לכן, שמירה על 1.2 ~ 0.8% איזופלורן מספיקה, כל עוד החיה אינה מסוגלת לנוע על המסגרת הסטריאוטקסית.

טבלה 1: תרשים פתרון בעיות.

סרטון משלים S1: בדיקת נפח צמנט דנטלי. ההפרש בין הנפח נמדד בתחילת הכנת הצמנט הדנטלי לבין הנפח לאחר שהמלט התייבש. נבדקו שני מותגים של מלט דנטלי (למשל, Tempron ו-Tokuso Curefast). כדי לבדוק את נפח המלט הדנטלי לאחר התייבשותו, נשקלו 0.5 גרם מכל אבקת צמנט דנטלי וערבבו עם התמיסה המתאימה לו (1 מ"ל). לאחר מכן, קצות פיפטה 0.1-10 μL הועמסו עם 2.5 μL של תערובת מלט שיניים נאטמו עם דבק מרפא אור. לאחר מכן, הקצוות הונחו על מתלה, המשטחים של תערובות המלט הדנטלי סומנו וצולמו בווידיאו במשך 40 דקות. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

סרטון משלים S2: הדגמות של הליך ציפוי הבסיס. הזווית בין פני השטח של עדשת האובייקט לבין עדשת הממסר הותאמה על ידי סיבוב מוט האוזן, מוט השיניים או חימר דבק רב פעמי על ציר z. שולי עדשת הממסר נראו כעיגול אפור דמוי ירח על הצג. ביטוי ויראלי מוצלח והשתלת עדשה צריכים לחשוף לפחות דינמיקה פלואורסצנטית אחת (חיצים) במהלך ציפוי הבסיס. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

סרטון משלים S3: הדגמות של דינמיקה פלואורסצנטית בעכברים המתנהגים בחופשיות. מעברי פלואורסצנטיות מעכברים #3, #4 ו- #5. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

וידאו משלים S4: דוגמה לכישלון. רקע אחיד הופיע במהלך הליך ציפוי הבסיס. שים לב כי השינוי בבהירות לא היה בגלל הארעיות הפלואורסצנטית של תאים בודדים; זה נגרם על ידי הליך החיפוש. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

סרטון משלים S5: הדגמה של דוגמה נוספת לכישלון. במהלך הליך ציפוי הבסיס התרחש מחסור במעברים פלואורסצנטיים, אך עדיין נראו כמה שולי תאים עגולים. שים לב כי השינוי בבהירות לא נגרם על ידי מעברים פלואורסצנטיים של תאים בודדים; זה נגרם על ידי הליך החיפוש. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הדו"ח הנוכחי מתאר פרוטוקול ניסויי מפורט עבור חוקרים המשתמשים במערכת UCLA Miniscope בעלת שתי עדשות. הכלים שתוכננו בפרוטוקול שלנו הם זולים יחסית לכל מעבדה המעוניינת לנסות הדמיית סידן in vivo . פרוטוקולים מסוימים, כגון הזרקה ויראלית, השתלת עדשות, ציפוי בסיס דמה וציפוי בסיס, יכולים לשמש גם עבור גרסאות אחרות של מערכת המיניסקופים כדי לשפר את שיעור ההצלחה של הדמיית סידן. מלבד בעיות כלליות בהזרקה ויראלית, והשתלת עדשה שיש לתקן ללא קשר לגרסת המיניסקוף, המבנה של לוח הבסיס של UCLA עלול לגרום לשינוי מיקום, מה שיכול להוביל למרחקי עבודה לא תואמים בין עדשת המטרה לעדשת הממסר (איור 1C). פרוטוקול ניסויי שונה פותח כדי למזער את שינוי המיקום של שתי העדשות (איורים 2, איור 4, איור 5). הדמיית סידן מוצלחת יכולה להיות מושגת באמצעות שילוב של ביטוי נגיפי מוצלח, השתלת עדשה והליכי ציפוי בסיס (איור 5C). שימוש במערכת של שתי עדשות כדי לצפות באזורים עמוקים במוח דורש רמה גבוהה של דיוק בהליכי ציפוי הבסיס מכיוון שגם המיקומים היחסיים של עדשת הממסר המושתלת והעדשה האובייקטיבית צריכים להיות מדויקים. דו"ח זה לא רק מציג פרוטוקול הפותר בעיות ציפוי בסיס, אלא גם דן בכמה טיפים להזרקה ויראלית והשתלת עדשות. בהמשך נדון תחילה בהליכי ציפוי הבסיס, ולאחר מכן בהזרקה הנגיפית ובהליכי השתלת העדשה, ונתאר כמה דוגמאות לכשלים (איור 6).

ציפוי בסיס
גרסת V3 של UCLA Miniscope היא כיום העיצוב הנפוץ ביותר וניתן להזמין אותה באינטרנט. לוח הבסיס של גרסה זו מורכב משני קצוות ללא קירות (איור 1C1), אולם צורתו יכולה לגרום לשינוי לא אחיד (איור 1C1, C2) לאחר שהמלט הדנטלי יבש לחלוטין. הליכי ציפוי בסיס הדמה בפרוטוקול שלנו (איור 4) ממזערים את בעיות חוסר היישור והזזת לוחות הבסיס מאחר שהם משתמשים בסרט פרפין כדי להפחית את השטח הזמין לצמנט הדנטלי במהלך ציפוי בסיס אמיתי (איור 5B). השטח שנותר עדיין מספיק למציאת מיקום הדמיה אופטימלי במהלך הליך ציפוי הבסיס האמיתי. לכן, החוקר יכול להדביק את לוחית הבסיס עם כמה שפחות מלט דנטלי (איור 5B2). בנוסף, הליך ציפוי בסיס דמה אורך זמן מועט יחסית (כ-15 עד 20 דקות) מכיוון שהוא אינו דורש מרחק מושלם בין עדשת האובייקט לעדשת הממסר כדי להשיג. עם זאת, ציפוי בסיס דמה הוא רק אחד הגורמים העיקריים להדמיית סידן מוצלחת; לדוגמה, במהלך ניטור אותות פלואורסצנטיים, נוירונים עשויים להיראות מטושטשים אם הם מעט מחוץ למישור העבודה (תלוי במרחק העבודה של עדשת הממסר; לעתים קרובות בערך 100 ~ 300 מיקרומטר). היכולת לשפר את מרחק העבודה מוגבלת, שכן מרחק העבודה של הנוירונים נקבע מראש על ידי הליך השתלת עדשת הממסר. ניסוי בוצע ללא הליך בסיס דמה ואזור העניין תמיד הוחמץ (בארבעה מתוך ארבעה עכברים) לאחר ציפוי בסיס חד פעמי. לכן, פתרונות אלה פותחו כדי לצמצם את בעיית ההתכווצות. כמה מלטים דנטליים מרפאים אור עשויים למנוע את הבעיה של התכווצות במהלך הריפוי כי הם לרפא מהר מאוד; צמנטים אלה עשויים לסייע לחוקרים להתאים את המרחק במהלך הליך ציפוי הבסיס. למרות שטווח אורכי הגל להפעלת מדדי הסידן ולריפוי הצמנט הדנטלי שונה, יש למנוע הלבנה במהלך הליך ציפוי הבסיס. על מנת למנוע הלבנה, טווח אורכי הגל הנוצרים על ידי מקור האור צריך להיות צר למדי כדי למנוע תגובות צולבות בין מדדי הסידן לבין צמנט השיניים מרפא האור. לכן, השימוש במלט דנטלי מרפא אור אינו מומלץ להליך ציפוי הבסיס. בנוסף, כמה מותגים ספציפיים של צמנטים דנטליים משמשים לעתים קרובות להדבקת לוחות בסיס על ידי צוותי מחקר אחרים 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22 . תכונות ההתכווצות הנמוכה של צמנטים אלה עשויות לפתור את הבעיה, אך לא הייתה לנו הזדמנות לבדוק מותגים אלה בשל קשיים ברכישה (ייבוא) שלהם. מוצרים ברמה רפואית עשויים להיות כפופים לתקנות יבוא בהתאם למדינה/אזור. אם חוקרים מתקשים לגשת לצמנטים המוזכרים בספרות 6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22^, הפרוטוקול שלנו יפתור את בעיית התכווצות המלט הדנטאלי.

בנוסף לבעיית ההתכווצות, שחיקה מבנית יכולה להתרחש במיניסקופ עצמו ועל לוח הבסיס (במיוחד המגנטים בלוח הבסיס) במהלך ניסויים רבים. כל רווח קטן שנוצר כתוצאה מהרכבה מפחית את יציבות המרחק בין שתי העדשות. שוב, דיוק לאורך כל הנתיב האופטי הוא המפתח להדמיה של סידן חולף בעכברים המתנהגים בחופשיות באמצעות מיניסקופ.

פתרון בעיות של הזרקה/השתלת עדשה ויראלית
לפני החדרת הנגיף לאזור המוח, מומלץ להרכיב מחט חדשה על הזרוע הסטריאוטקסית ולנקב לאט את המוח בקואורדינטות המתאימות. מכיוון שהמחט החדשה חדה מאוד, ניקוב זה משמש כשלב הכנה לניקוי הנתיב (או חיתוך נתיב) עבור מחט המיקרו-הזרקה ועדשת הממסר בפועל וממזער את הנזק לרקמות, שיכול להיגרם כתוצאה מדחיסה ממחט המיקרו-הזרקה או מעדשת הממסר. המחט החדה חותכת נתיב לעדשת הממסר הקהה; לכן, יש להוריד את קצה המחט לאותן קואורדינטות עם עדשת הממסר. המחט הפנימית של צנתר 20 גרם I.V נבחרה מכיוון שהיה לה קוטר של 1 מ"מ, שהיה דומה לקוטר עדשת הממסר שלנו. ניתן להשתמש במד מחט שונה בהתאם לקוטר עדשת הממסר.

אף על פי שהמחקר הנוכחי לא התמקד בתכונות ובטיטרים של וקטורים נגיפיים, הגורמים האלה עדיין קריטיים להדמיית סידן מוצלחת (איור 5C). יש צורך לבדוק מראש את איכות הביטוי של וקטור ויראלי. שלבים 1 עד 5 של הפרוטוקול של Resendez et al. מספקים שיטות מפורטות לזיהוי טיטר נגיפי אופטימלי עבור ניסויי הדמיית סידן⁸. אם מסיבה כלשהי לא ניתן לבצע בדיקות מקדימות, מומלץ למתחילים לנסות תחילה טיטר גבוה יחסית. אחד החסרונות של שימוש titer viral גבוהה iscytotoxicity⁸. נוירונים מתים מעוררים אוטופלואורסצנטיות ונראים ככתמים לבנים בהירים מתחת למיניסקופ⁸. אולם תאי עצב מתים אלה הם ציוני דרך טובים למתחילים למצוא ולתרגל את הליך ציפוי הבסיס. מצד שני, למרות עירוי של וירוס titer נמוך יש סיכון נמוך יותר להרוג תאים, פלואורסצנטיות עשוי להיות מוסווה על ידי הרקע אם התאים אינם מראים כל transients פלואורסצנטי במהלך הליך baseplating. קשה להצביע על הסיבות לכישלון מכיוון שנוירוני המטרה עלולים להתפספס עקב השתלת עדשת ממסר או בגלל הביטוי הלקוי של וקטור הנגיפי. קביעת הסיבה מבלבלת מאוד ללא אישור היסטולוגי. לכן, מומלץ להשתמש בנגיפים בעלי טיטר גבוה יחסית אם לא ניתן לבדוק מראש את הווקטורים הנגיפיים.

Resendez et al. ממליצים להחדיר את מחט microinjection 250 מיקרומטר לרוחב הגחון למיקום של העדשה. התצפיות שלנו הראו כי עירוי של הנגיף באותו עומק כמו עדשת הממסר יכול גם להוביל לביטוי של אותות סידן טובים. אנו מציעים כי בשל האפשרות של זיהום והתפשטות, החדרת הנגיף באותו עומק כמו הקואורדינטה של עדשת הממסר היא אופטימלית להפחתת נזק לרקמות והגדלת דיוק המרחק בין הנוירונים הנגועים לבין עדשת הממסר. Resendez et al ממליצים גם לבצע הזרקה ויראלית, והשתלת עדשה במהלך אותו ניתוח בהתחשב בטווח הצר של מרחקי העבודה בין תאי המטרה לבין עדשת הממסר⁸. עם זאת, חלק מהחוקרים עוקבים אחר פרוטוקול שבו שלב העירוי הנגיפי ושלב השתלת העדשה נערכים בהפרש של שבועיים (או יותר)^18,26. הארכת הזמן בין השלבים מפחיתה את זמן הפעולה הבודד. אולם בפרוטוקול הזה שני השלבים האלה אוחדו לניתוח אחד, מאחר שבפרוטוקול של ניתוח אחד, המנתח יכול לעקוב אחר המיקום בין מחט המיקרו-הזרקה לעדשת הממסר בעת הורדתן לאזור המטרה, מה שמקטין את הסיכוי לכשל במיקוד (איור 2B3).

עבור שני עכברים (עכברים #1 ו-#2), השימוש במחט ליצירת נתיב עבור העדשה הושמט גם הוא, ובעכבר #2 נצפו כתמים אפורים עגולים דמויי תא (איור 6C). עם זאת, דינמיקה פלואורסצנטית (וידאו משלים S5) לא נצפתה. לאחר שבחנו את פרוסת המוח של הדוגמה הזו (איור 6C2, C3), הנחנו שעדשת הממסר גררה חלק מהתאים למטה בזמן הורדת הדלת. תאי עצב נגררים אלה לא היו בריאים, ולכן לא הורגשה פעילות במהלך הליך ציפוי הבסיס או במהלך הניסוי.

היה לנו עכבר אחד עם אות אפור הומוגני לחלוטין וללא תמונות דמויות תא נראות לעין במהלך תהליך ציפוי הבסיס (איור 6B1). לאחר הקרבת העכבר נצפו פרוסות המוח שלו. הבחינו כי העדשה נמצאת בצד המדיאלי של השכבה הפירמידלית המעוקלת; אזור המטרה (איור 6B2) הוחמץ לחלוטין. ניסיונות כושלים אלה היו חוויות קריטיות שהובילו אותנו לשנות את פרוטוקול הניתוח שלנו ובסופו של דבר להצליח עם שלושה עכברים (וידאו משלים S3).

מחט מיקרו-הזרקה
כפיס המוח הוא מערכת סיבית קשיחה המכסה את ההיפוקמפוס הגבי. בגלל קשיחותו, הוא מתנגד לחדירה על ידי מחט מיקרו-הזרקה שטוחה. לכן, אנו ממליצים להשתמש במחט מיקרו-הזרקה עם קצה משופע. סוג זה של מחט לא רק מפחית את הנזק לרקמות, אלא גם מקטין את האפשרות של כישלון להחדיר את הנגיף לאזור המטרה עקב חסימה על ידי סיבים סמוכים. סיכמנו את הבעיות הנ"ל בתרשים פתרון בעיות (טבלה 1).

מסגרת זמן
מסגרת הזמן של ההליך כולו מסוכמת באיור 2A, עם ימים כיחידות. בפירוט, חלק הניתוח (הזרקה ויראלית, השתלת עדשת ממסר, ציפוי בסיס דמה) עשוי להימשך 3 שעות למתחילים או 1.5 שעות לחוקרים מיומנים מספיק. לעכברים יש גודל גוף קטן וחילוף חומרים מהיר, והם רגישים יותר לבעיות בריאותיות הנגרמות על ידי תקופות ארוכות בהרדמה מאשר מינים גדולים יותר²⁷. החוקרים צריכים לשאוף לשמור על הזמן המושקע בניתוח מתחת ל -3 שעות. ציפוי בסיס אמיתי יכול להתבצע לאחר 3 עד 6 שבועות של ביטוי מחוון סידן. הליך זה עשוי להימשך שעה אחת. ניתן להמשיך את תצפית פעילות הסידן האורכית שלאחר מכן במשך יותר מחודש.

מסקנות
UCLA Miniscope הוא מכשיר קוד פתוח להדמיית סידן in vivo . ללא לוח בסיס או מודול עדשה מוכן, מותקן מראש, אנשים המבצעים ניסויים צריכים להיות מסוגלים להשיג במדויק את המרחק האופטימלי בין עדשת המטרה לעדשת הממסר במהלך הליך ציפוי הבסיס. הקושי המוגבר בשימוש במערכת UCLA Miniscope בעלת שתי העדשות טמון בשינוי הנפח של הצמנט הדנטלי. ביצענו אופטימיזציה של הפרוטוקולים המקוריים ומזערנו את הפגמים שנגרמו על ידי הבעיות שהוזכרו לעיל, ובכך הגדלנו את שיעור ההצלחה של הדמיית סידן עם מערכת UCLA Miniscope בעלת שתי עדשות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

זה לא מחקר שנתמך על ידי התעשייה. המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים כספיים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.7-mm drill bit	#19008-07	Fine Science Tools; USA	for surgery
0.1–10 μl pipette tips	104-Q; QSP	Fisher Scientific; Singapore	for testing dental cement
20 G IV cathater	#SR-OX2032CA	Terumo Corporation; Tokyo, Japan	for surgery
27 G needle	AGANI, AN*2713R	Terumo Corporation; Tokyo, Japan	for surgery
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE	#104487-AAV9; 1.5*10^13	Addgene viral prep; MA, USA	for viral injection
Atropine sulfate		Astart; Hsinchu, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Baseplate	V3	http://miniscope.org	for dummy baseplating/baseplating
BLU TACK	#30840350	Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA	Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating
Bone Rongeur Friedman	13 cm	Diener; Tuttlingen, Germany	for baseplating
Buprenorphine		INDIVIOR; UK	for surgery
Carprofen	Rimadyl	Zoetis; Exton, PA	analgesia
Ceftazidime		Taiwan Biotech; Taiwan	prevent infection
Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope	purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq		for baseplating
Dental cement set	Tempron	GC Corp; Tokyo, Japan	for testing dental cement
Dental cement set	Tokuso Curefast	Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan	for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating
Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors	#51673	Stoelting Co; Illinois, USA	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Duratear ointment		Alcon; Geneva, Switzerland	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Ibuprofen		YungShin; Taiwan	analgesia
Isoflurane		Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Inscopix	nVista System	Inscopix; Palo Alto, CA	for comparison with V3 UCLA Miniscope
Ketamine		Pfizer; NY, NY	for euthanasia
Normal saline			for surgery
Micro bulldog clamps	#12.102.04	Dimedo; Tuttlingen, Germany	for lens implantation
Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge	#88400	Hamilton; Bonaduz, Switzerland	for viral injection
Molding silicone rubber	ZA22 Thixo	Zhermack; Badia Polesine, Italy	for dummy baseplating
Objective Gradient index (GRIN) lens	#64519	Edmund Optics; NJ, USA	for dummy baseplating/baseplating
Parafilm	#PM996	Bemis; Neenah, USA	for dummy baseplating
Portable Suction	#DF-750	Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan	for surgery
Relay GRIN lens	#1050-002177	Inscopix; Palo Alto, CA, USA	for dummy baseplating/baseplating
Stainless steel anchor screws	1.00 mm diameter, total length 3.00 mm		for surgery
Stereo microscope	#SL720	Sage Vison; New Taipei City, Taiwan	for surgery/dummy baseplating/baseplating
Stereotaxic apparatus	#51673	Stoelting; IL, USA	for surgery/dummy baseplating/baseplating
UV Cure Adhesive	#3321	Loctite; Düsseldorf, Germany	for testing dental cement
V3 UCLA Miniscope	purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components		for surgery/dummy baseplating/baseplating
Xylazine	X1126	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	for euthanasia
Xylocaine pump spray 10%		AstraZeneca; Södertälje, Sweden	for surgery