Summary
L'iniezione della vena porta di organoidi del cancro del colon-retto (CRC) genera metastasi epatiche ricche di stroma. Questo modello murino di metastasi epatiche CRC rappresenta uno strumento utile per studiare le interazioni tumore-stroma e sviluppare nuove terapie dirette dallo stroma come le terapie geniche mediate da virus adeno-associate.
Abstract
Le metastasi epatiche del cancro del colon-retto (CRC) sono una delle principali cause di morte correlata al cancro. I fibroblasti associati al cancro (CAS), un componente importante del microambiente tumorale, svolgono un ruolo cruciale nella progressione del CRC metastatico e predicono una prognosi sfavorevole del paziente. Tuttavia, vi è una mancanza di modelli murini soddisfacenti per studiare la diafonia tra cellule tumorali metastatiche e CAF. Qui, presentiamo un metodo per indagare su come la progressione delle metastasi epatiche è regolata dalla nicchia metastatica e possibilmente potrebbe essere limitata dalla terapia diretta dallo stroma. L'iniezione della vena porta di organoidi CRC ha generato una reazione desmoplastica, che ha ricapitolato fedelmente l'istologia ricca di fibroblasti delle metastasi epatiche CRC umane. Questo modello era tessuto-specifico con un carico tumorale più elevato nel fegato rispetto a un modello di iniezione intra-splenica, semplificando le analisi di sopravvivenza del topo. Iniettando organoidi tumorali che esprimono luciferasi, la cinetica di crescita tumorale potrebbe essere monitorata mediante imaging in vivo . Inoltre, questo modello preclinico fornisce una piattaforma utile per valutare l'efficacia delle terapie mirate al mesenchima tumorale. Descriviamo i metodi per esaminare se la consegna mediata da virus adeno-associati di un gene stromale che inibisce il tumore agli epatociti potrebbe rimodellare il microambiente tumorale e migliorare la sopravvivenza del topo. Questo approccio consente lo sviluppo e la valutazione di nuove strategie terapeutiche per inibire le metastasi epatiche del CRC.
Introduction
Il cancro del colon-retto (CRC) è una delle principali cause di mortalità per cancro in tutto il mondo1. Più della metà dei pazienti con CRC sviluppa metastasi epatiche che si verificano attraverso la disseminazione della vena porta1. Attualmente, non ci sono terapie efficaci in grado di curare metastasi epatiche avanzate e la maggior parte dei pazienti soccombe alla malattia metastatica.
La nicchia metastatica o il microambiente tumorale svolge un ruolo chiave nell'attecchimento e nella crescita delle cellule CRC disseminate2. I fibroblasti associati al cancro (CAS), un componente importante del microambiente tumorale, promuovono o frenano la progressione del cancro attraverso la secrezione di fattori di crescita, il rimodellamento della matrice extracellulare (ECM) e la modulazione dei paesaggi immunitari e dell'angiogenesi 3,4,5. I CAF conferiscono anche resistenza alle chemioterapie e alle immunoterapie3. Inoltre, i CAS regolano l'inizio e la progressione delle metastasi epatiche CRC e predicono la prognosi nei pazienti con CRC 3,6,7,8. Pertanto, i fattori correlati alla CAF potrebbero essere sfruttati per lo sviluppo di strategie terapeutiche per inibire le metastasi epatiche CRC. Tuttavia, la mancanza di modelli murini soddisfacenti per studiare lo stroma tumorale metastatico è stato un grosso ostacolo allo sviluppo di terapie mirate allo stroma.
Attualmente, i modelli animali per studiare le metastasi epatiche CRC includono modelli CRC primari che sviluppano spontaneamente metastasi epatiche e modelli di trapianto di cellule tumorali nel fegato. I modelli murini CRC primari, come i modelli murini geneticamente modificati e l'iniezione del colon di cellule tumorali, raramente mostrano metastasi al fegato 9,10,11,12. Inoltre, anche se si osserva una metastasi epatica, questi modelli mostrano una lunga latenza dall'induzione del tumore primario alle metastasi e potenzialmente muoiono di carico tumorale primario12. Per generare in modo efficiente metastasi epatiche CRC, le cellule CRC coltivate vengono trapiantate nel fegato utilizzando tre approcci di iniezione: iniezione intra-splenica, iniezione intra-parenchimale diretta nel fegato e iniezione della vena porta. Le cellule tumorali iniettate per via intraschiena si diffondono nella vena splenica, nella vena porta e, infine, nel fegato13,14. Tuttavia, l'iniezione intra-splenica produce un rapporto di assunzione del tumore inferiore rispetto ad altri modelli di trapianto15,16. Con l'iniezione intra-splenica, la rimozione chirurgica della milza viene eseguita per evitare la crescita del cancro nella milza, che può potenzialmente compromettere la maturazione delle cellule immunitarie17. Inoltre, l'iniezione intra-splenica può anche provocare una crescita tumorale involontaria nella milza e nella cavità addominale18, complicando le analisi delle metastasi epatiche. L'iniezione intra-parenchimale diretta nel fegato induce efficacemente metastasi epatiche 16,19,20. Tuttavia, questo approccio non ricapitola completamente una fase biologica delle metastasi epatiche che si verifica naturalmente attraverso la diffusione della vena porta. Utilizzando l'iniezione diretta nel fegato, l'ingresso di cellule tumorali in un non-portale, ma la circolazione sistemica può anche provocare più metastasi polmonari di grandi dimensioni16. Sebbene la maggior parte dei pazienti con metastasi epatiche CRC mostri più noduli tumorali nel fegato21, l'iniezione diretta in un lobo epatico specifico genera una singola massa tumorale 19,20. L'iniezione della vena porta o l'iniezione della vena mesenterica, sebbene tecnicamente impegnativa, consente una consegna efficiente delle cellule tumorali nel fegato in un modo che ricapitola i modelli di crescita osservati nei pazienti17. Questa strategia può ridurre al minimo la possibilità di metastasi secondarie e consente una rapida crescita delle cellule tumorali nel fegato, semplificando le analisi di sopravvivenza dei topi.
Storicamente, le linee cellulari del cancro del colon-retto come MC-38 di topo, HT-29 umano e SW-620 sono state utilizzate per generare modelli murini di metastasi epatiche22,23. Tuttavia, queste linee cellulari di cancro del colon-retto non inducono una reazione stromale desmoplastica. Il basso contenuto stromale nei tumori rende difficile indagare i ruoli biologici dei fibroblasti associati al cancro. I recenti progressi negli organoidi CRC e nel loro trapianto hanno offerto piattaforme utili per valutare i ruoli vitali dello stroma nella progressione del cancro24. Il trapianto di fegato di organoidi CRC genera un microambiente tumorale ricco di fibroblasti e ha fornito nuove informazioni sulla ricerca stromale 6,25. Attualmente, l'iniezione di organoidi della vena portale o mesenterica è diventata un approccio gold standard per generare metastasiepatiche CRC 6,25,26,27,28. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, nessun documento precedente ha descritto metodi dettagliati per l'iniezione della vena porta di tumoroidi del colon-retto. Qui, presentiamo una metodologia per l'utilizzo dell'iniezione della vena porta di organoidi CRC per sviluppare una nuova terapia diretta dallo stroma mediata da virus adeno-associato (AAV).
Gli epatociti sono un importante costituente del microambiente tumorale metastatico nel fegato e svolgono un ruolo fondamentale nella progressione del cancro metastatico29. Ispirati dal successo degli approcci di terapia genica AAV per indurre l'espressione proteica negli epatociti in pazienti non neoplastici30,31, abbiamo studiato un approccio simile ma volto a modificare il microambiente tumorale del fegato in CRC25. Come tale, descriviamo anche qui l'iniezione della vena della coda di AAV8 per indurre l'espressione di proteine antitumorali per modificare il microambiente tumorale del fegato. Il sierotipo AAV8, designato dalla scelta della proteina del capside virale durante la produzione del virus, porta ad un'elevata efficienza di trasduzione in particolare degli epatociti (cioè l'espressione genica mirata nel microambiente tumorale del fegato)32. Abbiamo precedentemente dimostrato che Islr (superfamiglia di immunoglobuline contenente ripetizione ricca di leucina) è un gene specifico del CAF che induce la segnalazione della proteina morfogenetica ossea (BMP), riduce la crescita dei tumori del CRC e promuove la differenziazione delle cellule staminali intestinali Lgr5+ 25. Abbiamo testato se la sovraespressione mediata da AAV8 del gene stromale che trattiene il cancro, Islr, negli epatociti potesse attenuare la progressione delle metastasi epatiche eseguendo l'iniezione della vena porta di tumori CRC in topi trattati con AAV8-Islr.
In questo articolo, descriviamo prima la procedura di iniezione della vena della coda dell'AAV tropico epatico. Quindi, descriviamo un metodo per la preparazione delle cellule tumorali e l'iniezione della vena porta nei topi trattati con AAV. Infine, presentiamo approcci per monitorare la progressione del tumore metastatico per valutare l'efficacia delle terapie dirette dallo stroma.
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Protocol
Tutte le procedure animali in questo articolo sono state esaminate e approvate dal Comitato etico animale del South Australian Health and Medical Research Institute (numero di approvazione, SAM322).
1. Iniezione della vena della coda del virus adeno-associato
NOTA: il virus adeno-associato (AAV) deve essere trattato come un rischio biologico secondo le linee guida di livello 1 per la biosicurezza. Si prega di fare riferimento al protocollo pubblicato per la preparazione, la purificazione e la titolazione AAV33. Hepatocyte-tropic AAV, AAV834, che codifica per il gene promotore del citomegalovirus (CMV) -Islr , è stato utilizzato in questo studio25. Per indurre la sovraespressione mediata da AAV, il dosaggio di AAV potrebbe richiedere un'ottimizzazione a seconda dell'attività del promotore, del gene e del peso del topo.
- Diluire il vettore AAV in aliquote da 150 μL contenenti 1,0 x 1011 genomi virali, utilizzando soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) e tenerla sul ghiaccio. I dispositivi di protezione individuale devono essere indossati per maneggiare l'AAV.
NOTA: il ciclo ripetuto di congelamento e disgelo riduce il titolo del virus e deve essere evitato. La soluzione virale madre deve essere conservata in un congelatore a -80 °C. - Accendere una scatola termica (camera di riscaldamento animale) per preriscaldare a 35 °C.
- Tenere un topo e applicare una crema per anestesia topica su tutta la lunghezza della coda almeno 15 minuti prima dell'iniezione della vena della coda.
NOTA: Questo è un passaggio facoltativo e potrebbe non essere necessario se non è richiesto dal comitato etico animale dell'istituto. Seguire il protocollo approvato dal comitato etico animale locale. In questo esperimento25, un topo Rosa26-Cas9 è stato utilizzato per l'iniezione di AAV e la successiva iniezione di vena porta di organoidi CRC. Dato che i tumoroidi utilizzati in questo studio sono stati derivati da un topo Rosa26-Cas9 (background genetico C57BL / 6 x 129), questo ceppo di topo è stato utilizzato anche come ricevente immunocompetente e sinergico del trapianto di tumore. Sono stati utilizzati topi Rosa26-Cas9 maschi e femmine (da 6 a 24 settimane). - Posizionare il mouse nella heat box. Lasciare il mouse per un massimo di 15 minuti per riscaldare e dilatare le vene della coda.
- Fissare delicatamente il mouse in un dispositivo di ritenuta per roditori. Posizionare la coda sotto una lampada di calore per garantire la piena dilatazione delle vene della coda.
- Aspirare 150 μL di AAV diluito (preparato al punto 1.1) in una siringa sterile a basso spazio morto con un ago da 27-30 G.
- Spostare la lampada di calore e identificare la vena laterale della coda situata ai lati della coda. Metti una leggera tensione sulla coda con le dita in modo che la coda diventi dritta.
- Inserire lentamente 2-3 mm dell'ago, smussare, nella vena. L'ago deve essere quasi parallelo alla coda (fino a 15° dalla coda).
NOTA: l'afflusso di sangue nella siringa può essere osservato se l'ago si trova con successo nella vena. - Iniettare lentamente. Se si avverte una resistenza o si osserva gonfiore della pelle, rimuovere l'ago e reinserirlo sopra il primo sito o nell'altra vena laterale.
- Attendere circa 5 s dopo il completamento dell'iniezione, quindi rimuovere lentamente l'ago. Applicare immediatamente una leggera pressione sul sito di iniezione con una garza pulita o un tovagliolo di carta fino a quando il sanguinamento non si ferma.
- Rilasciare delicatamente il mouse nella sua gabbia. Monitorare l'animale per assicurarsi che il sanguinamento si sia fermato.
NOTA: La sovraespressione genica nel fegato può essere valutata da 1 a 2 settimane dopo l'iniezione della vena di coda AAV. Ciò può essere confermato, ad esempio, dall'ibridazione in situ dell'RNA (ISH), dall'immunoistochimica (IHC), dal western blotting o dalla reazione a catena quantitativa della polimerasi in tempo reale (qRT-PCR; Figura 1A,B). In uno studioprecedentemente pubblicato 25, AAV8-Islr è stato utilizzato per sovraesprimere il gene Islr del topo negli epatociti e la sovraespressione è stata rilevata dall'RNA ISH (Figura 1A,B).
2. Preparazione cellulare per organoidi del cancro del colon-retto
NOTA: gli organoidi CRC utilizzati per questo esperimento contengono esclusivamente cellule epiteliali. La coltura e la generazione di organoidi CRC è stata precedentemente descritta25,35. In breve, le normali cellule epiteliali del colon sono state isolate dal colon di un topo Rosa26-Cas9 utilizzando un tampone di isolamento della cripta (5 mM EDTA (etilendiamminotetraacetato) in PBS ghiacciato), e quindi incorporate nel mezzo della matrice della membrana basale e coltivate nel mezzo di crescita organoide come descritto nel riferimento35. Quindi, le mutazioni di Apc e Trp53 sono state introdotte nelle cellule epiteliali del colon sovraesprimendo RNA a guida singola che colpiscono Apc e Trp53 utilizzando il protocollo di espressione del lentivirus. I cloni di singoli organoidi sono stati selezionatia mano 25. UnpcΔ/Δe Trp53Δ/Δ organoidi per il cancro del colon (tumoroidi AP), sono stati iniettati come 5,0 x 105 cellule singole in 100 μL di PBS con 10 μM Y-27632 nella vena porta per topo, con coltura organoide e preparazione monocellulare descritta di seguito.
- Coltivare gli organoidi CRC nelle cupole medie della matrice della membrana basale in una piastra a 24 pozzetti o in un piatto da 10 cm 3-5 giorni prima dell'iniezione della vena porta per ottenere organoidi di diametro 50-400 μm.
- Preparare una quantità sufficiente di soluzione di distacco cellulare aggiungendo Y-27632 a 10 μM di concentrazione, sufficiente a digerire il numero di organoidi coltivati per l'iniezione. Preriscaldare a bagnomaria a 37 °C.
NOTA: La soluzione di distacco cellulare utilizzata in questo protocollo è una miscela enzimatica di dissociazione cellulare ricombinante ed è utilizzata come sostituto della tripsina in coltura organoide (vedere Tabella dei materiali). Riduce il danno cellulare causato dalla dissociazione cellulare rispetto alla tripsina36. Y-27632 è un inibitore della Rho chinasi e inibisce la morte cellulare indotta dalla dissociazione, aumentando così la sopravvivenza di una singola cellula37.- Per l'iniezione in un massimo di cinque topi, preparare due tubi contenenti 40 mL della soluzione di distacco cellulare per digerire 10-24 x 50 μL di cupole a matrice di membrana basale con ogni cupola contenente circa 300 organoidi (diametro 50-400 μm), cioè ogni topo viene iniettato con 2-4,8 cupole di organoidi (equivalenti a circa 600-1440 organoidi). Il numero di organoidi necessari per ottenere un numero di cellule sufficiente dipende dalla linea organoide e quindi dovrebbe essere ottimizzato.
NOTA: Il secondo tubo da 40 ml consente una digestione ripetuta con soluzione di distacco di cellule fresche per ottenere singole cellule dissociate.
- Per l'iniezione in un massimo di cinque topi, preparare due tubi contenenti 40 mL della soluzione di distacco cellulare per digerire 10-24 x 50 μL di cupole a matrice di membrana basale con ogni cupola contenente circa 300 organoidi (diametro 50-400 μm), cioè ogni topo viene iniettato con 2-4,8 cupole di organoidi (equivalenti a circa 600-1440 organoidi). Il numero di organoidi necessari per ottenere un numero di cellule sufficiente dipende dalla linea organoide e quindi dovrebbe essere ottimizzato.
- Aspirare accuratamente il mezzo organoide da ciascun pozzetto.
- Aggiungere 1 mL di PBS ghiacciato a ciascun pozzetto in una piastra da 24 pozzetti. Se si utilizza un piatto di 10 cm, aggiungere 10 ml di PBS ghiacciato al piatto.
- Graffiare il mezzo della matrice della membrana basale usando una punta della pipetta P1000. Trasferire il PBS/liquame medio in un tubo centrifugo da 15 ml.
- Risciacquare ogni pozzetto con la stessa quantità di PBS per raccogliere i frammenti della matrice della membrana basale e aggiungerli ai tubi da 15 ml.
- Incubare per 5 minuti su ghiaccio. Questa incubazione aiuta a sciogliere il mezzo della matrice della membrana basale.
- Centrifugare il tubo a 400 x g per 5 min a 4 °C.
- Aspirare il surnatante assicurandosi di non disturbare il mezzo pellettato e le cellule.
- Aggiungere 5 mL di soluzione di distacco cellulare preriscaldata preparata al punto 2.2 al pellet, risospesare il pellet 10 volte e ricollocarlo in un tubo da 50 mL contenente una soluzione di distacco cellulare fresca e preriscaldata.
- Posizionare il tubo nel bagno d'acqua a 37 °C. Incubare per 5 min.
- Centrifugare il tubo a 400 x g per 3 min a 4 °C.
- Ripetere i passaggi 2.9-2.11.
NOTA: La digestione enzimatica ripetuta consente l'efficiente dissociazione cellulare in singole cellule. - Controllare se gli organoidi sono dissociati in singole cellule pipettando 100 μL in una piastra a 96 pozzetti e osservando al microscopio. Se molti organoidi mostrano grumi cellulari costituiti da più di quattro cellule, può essere necessaria un'incubazione più lunga con la soluzione di distacco cellulare e una dissociazione fisica mediante triturazione con una pipetta da 10 ml.
- Una volta che la maggior parte delle cellule sono singole cellule, aggiungere 4 ml di siero bovino fetale (FBS) nella sospensione cellulare da 40 ml per interrompere la digestione. Risciacquare un filtro cellulare da 40 μm con 5 ml di PBS.
- Passare la sospensione cellulare attraverso il filtro cellulare in un tubo di raccolta da 50 ml per rimuovere eventuali grumi cellulari.
- Centrifugare il tubo a 400 x g per 5 min a 4 °C.
- Aspirare il surnatante. Aggiungere 10 mL di PBS freddo al pellet di cella e trasferirlo in un tubo centrifugo da 15 mL.
- Centrifugare il tubo a 400 x g per 5 min a 4 °C.
- Aspirare il surnatante. Sospendere il pellet in PBS freddo da 500 μL con 10 μM Y-27632. Contare le celle.
- Regolare la concentrazione cellulare a 5,0 x 105 celle singole/100 μL, utilizzando PBS con 10 μM Y-27632. Posizionare il tubo sul ghiaccio fino a quando non viene eseguita l'iniezione della vena porta.
NOTA: Si raccomanda di iniettare cellule dissociate entro 4 ore dalla dissociazione.
3. Iniezione della vena porta di organoidi CRC
NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici e le garze chirurgiche devono essere autoclavati o sterilizzati prima dell'intervento chirurgico. Questo protocollo è stato modificato da un precedente protocollo17. In questo esperimento25, l'iniezione della vena porta è stata eseguita utilizzando topi Rosa26-Cas9 trattati con AAV-mRuby2 o AAV-Islr nella fase 1.
- Preparare un'area chirurgica asettica utilizzando tende sterili su una piastra riscaldante.
- Preparare strumenti chirurgici (forbici e pinze), spugna chirurgica ed emostatica, sutura di poliglactina 4-0, cotton fioc, cucitrici cutanee, applicatore di pinzatrici, soluzione salina, buprenorfina e ago da 33 G attaccato a una siringa Hamilton. Tagliare la spugna emostatica in pezzi di 1,0 cm x 1,0 cm.
- Regolare la posizione della sorgente luminosa per illuminare l'area chirurgica.
- Iniettare 0,1 mg/kg di peso corporeo di buprenorfina per via sottocutanea a un topo per la gestione chirurgica del dolore.
- Anestetizzare il topo con isoflurano in una camera di anestesia. La concentrazione di isoflurano per induzione e mantenimento è di solito rispettivamente del 5% e del 2,5%. Verificare l'assenza di una reazione al pizzicamento delle dita dei piedi prima di iniziare la procedura successiva.
- Rasare il centro all'addome superiore del mouse con un rasoio elettrico. La rasatura deve essere eseguita in un'area distante dall'area chirurgica asettica per evitare che i capelli contaminino il sito.
- Pulire il sito di incisione alternando Betadine ed etanolo all'80% per sterilizzare l'area chirurgica. Ripeti tre volte.
- Posizionare il mouse su una piastra riscaldante in posizione supina con anestesia isoflurano di mantenimento. Posizionare un drappo chirurgico con un foro sopra l'addome del topo.
- Sollevare la pelle addominale con una pinza e fare un'incisione cutanea di 2-3 cm sulla linea mediana con le forbici, tagliando solo la pelle (non il peritoneo sottostante). L'incisione dovrebbe variare dal medio addome al processo xifoideo dello sterno. L'incisione non dovrebbe andare oltre l'estremità inferiore del processo xifoide.
- Sollevare completamente la parete peritoneale con una pinza e fare un'incisione simile di 2-3 cm al peritoneo con le forbici. Evitare di tagliare l'intestino e il diaframma.
- Immergere la garza chirurgica con soluzione salina calda e posizionarla sul lato sinistro dell'incisione (sul lato sinistro del corpo del topo; alla destra del chirurgo).
- Estrarre delicatamente gli organi interni (intestino tenue e crasso) usando un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione salina. Posizionare l'intestino sulla garza imbevuta di soluzione salina.
NOTA: l'intestino sinistro del topo (cioè l'intestino alla destra del chirurgo) deve essere estratto per primo, quindi l'intestino destro del topo (cioè l'intestino alla sinistra del chirurgo) può essere estratto. - Regolare la posizione dell'intestino per visualizzare la vena porta. Coprire l'intestino con un'ulteriore garza bagnata per mantenere l'intestino umido.
- Tirare delicatamente l'intestino sul lato sinistro con la garza bagnata e applicare una leggera tensione a sinistra. Ciò facilita la visualizzazione della vena porta (Figura 2A).
NOTA: Se la visualizzazione della vena porta è difficile, regolare delicatamente la posizione dello stomaco con un batuffolo di cotone bagnato potrebbe aiutare la visualizzazione. - Pipettare delicatamente la sospensione tumoraleide più volte per ottenere una sospensione cellulare omogenea. Aspirare lentamente 100 μL della sospensione cellulare in una siringa Hamilton attaccata a un ago da 33 G. Evitare bolle d'aria.
- Inserire lentamente l'ago, smussare, nella vena porta. La profondità di inserimento lungo l'ago deve essere di 3-4 mm, con l'angolo dell'ago quasi parallelo alla vena porta.
NOTA: L'iniezione deve essere eseguita nella parte ben visualizzata della vena porta (di solito fino a 2 cm di distanza dall'ilo epatico). Evitare il movimento dell'ago dopo che è stato completamente inserito nella vena porta. - Iniettare cellule tumorali per 30 s. L'iniezione deve essere eseguita lentamente per prevenire l'occlusione della vena porta. Se l'iniezione ha successo, il colore del fegato cambia temporaneamente da rosso a bianco.
- Rimuovere l'ago lentamente. Applicare immediatamente una leggera pressione sul sito di iniezione con un batuffolo di cotone asciutto e attendere 5 minuti.
- Rimuovere il batuffolo di cotone e contemporaneamente applicare una spugna emostatica sul sito di iniezione. Tenere la spugna emostatica con un batuffolo di cotone o una pinza e applicare una leggera pressione per altri 5 minuti.
- Rimuovere la pressione sulla spugna emostatica e confermare che non vi è sanguinamento dal sito di iniezione.
NOTA: La spugna emostatica bioassorbibile non ha bisogno di essere rimossa. Cercare di rimuovere la garza potrebbe causare un nuovo sanguinamento dal sito di iniezione. - Se si verifica sanguinamento, eseguire immediatamente l'emostasi da pressione con un batuffolo di cotone per circa 10 minuti. Quindi, applicare una spugna emostatica aggiuntiva per altri 5 minuti.
NOTA: Se si osserva una perdita di sangue incontrollabile, il topo deve essere eutanasia secondo il protocollo approvato dal comitato etico animale dell'istituto. - Rimuovere le garze chirurgiche sull'intestino. Utilizzando una siringa riempita con 5 ml di soluzione salina, spruzzare soluzione salina all'intestino per prevenire l'adesione degli organi.
NOTA: Non applicare soluzione salina al sito di iniezione della vena porta. Ciò potrebbe causare un nuovo sanguinamento. - Posizionare delicatamente l'intestino all'interno della cavità addominale.
- Suturare il peritoneo usando 4-0 suture di poliglattina.
- Sollevare entrambi i lati della pelle con una pinza. Applicare le cucitrici cutanee per chiudere l'incisione cutanea. Fare attenzione a non pinzare l'intestino.
- Spegnere l'isoflurano ma mantenere il flusso di ossigeno in funzione. Monitorare attentamente il mouse. Quando il mouse si sveglia, metti il mouse in una gabbia vuota su una piastra riscaldante. Il mouse in genere si risveglia entro 5 minuti.
- Monitorare attentamente il mouse fino a quando non è cosciente e deambulante normalmente.
- Iniettare per via sottocutanea 0,1 mg/kg di buprenorfina al topo 4 ore dopo l'intervento chirurgico.
- Iniettare 0,1 mg/kg di buprenorfina nel topo ogni 24 ore per i successivi 2 giorni.
- Monitorare attentamente i topi ogni giorno per una settimana dopo l'intervento chirurgico. Controllare le suture e la guarigione delle ferite.
- giorni dopo l'intervento chirurgico, rimuovere le cucitrici della pelle usando un dispositivo di rimozione della pinzatrice.
4. Valutazione della cinetica di crescita tumorale mediante imaging bioluminescente in vivo
NOTA: Se i tumoroidi che esprimono Firefly vengono utilizzati per iniezione, la progressione del tumore metastatico può essere monitorata settimanalmente mediante imaging in vivo come descritto38,39. La luciferasi espressa dalle cellule tumorali potrebbe suscitare risposte immunitarie contro le cellule tumorali e limitare la crescita tumorale40. Pertanto, è necessaria cautela nell'analisi dei fenotipi immunitari e della progressione del cancro in un modello murino utilizzando cellule tumorali che esprimono luciferasi.
- Preparare una soluzione da 30 mg/mL di D-luciferina utilizzando PBS sterile. Proteggilo dalla luce. La D-luciferina deve essere conservata in aliquote a -20 °C fino all'uso.
- Rasare l'addome e il torace con un rasoio elettronico. Questo può essere fatto fino a 1 giorno prima dell'imaging in vivo .
- Iniettare 150 mg/kg di peso corporeo di D-luciferina per via intraperitoneale nei topi (cioè, se il peso corporeo del topo è di 30 g, iniettare 150 μL della soluzione di D-luciferina).
- Metti i topi in una camera di anestesia e anestetizzali. Utilizzare il 5% di isoflurano per l'induzione e il 2%-3% per la manutenzione.
- min più tardi, posizionare i topi in posizione laterale (lato destro verso l'alto). Acquisire immagini di bioluminescenza utilizzando un sistema di imaging in vivo (IVIS) come descritto in precedenza38,39.
NOTA: i topi sono più stabili in posizione laterale rispetto alla posizione supina. Pertanto, una posizione laterale è preferibile per ottenere un'immagine di luminescenza da un piano focale coerente. - Metti i topi in una gabbia vuota e monitora il loro recupero.
- Definire le regioni di interesse sulla parte superiore dell'addome utilizzando Living Image Software come descritto38. Quantificare il flusso totale come surrogato del numero di cellule tumorali.
5. Analisi di sopravvivenza e raccolta dei tessuti
- Monitorare attentamente i topi per i sintomi clinici delle metastasi come un addome disteso.
- Eutanasia di un topo per inalazione di CO2 una volta raggiunti endpoint umani.
NOTA: utilizzare un endpoint dello studio approvato dal comitato etico animale dell'istituto. Per determinare un endpoint umano, è stato utilizzato un foglio di cartella clinica; i punteggi sono stati calcolati da un punto dato per la presenza di ciascuna delle seguenti osservazioni: perdita di peso > 15%, postura curva, pelo arruffato, disidratazione, diminuzione del movimento, addome disteso o smorfia facciale. Una volta raggiunto un punteggio di 3, i topi sono stati umanamente eutanasizzati. - Immediatamente dopo l'eutanasia, eseguire la fissazione della perfusione transcardica con 30-50 ml di formalina al 10% in una cappa aspirante, come descritto41. Fare diverse piccole incisioni (fino a 1 cm ciascuna) con le forbici nella parte normale del fegato prima della perfusione per generare sbocchi per sangue e formalina. Al momento della perfusione, il colore del fegato cambierà da rosso a marrone.
NOTA: Se le micrometastasi in aree epatiche macroscopicamente normali sono oggetto di studio, si consiglia ai ricercatori di non tagliare il fegato, ma di tagliare invece la vena cava superiore. Tuttavia, quando abbiamo usato questo metodo, la fissazione del fegato sembra più scarsa rispetto al taglio del fegato. Soprattutto se si prevede di eseguire l'ibridazione dell'RNA in situ (ISH) su sezioni epatiche, si consiglia di praticare incisioni nel fegato prima dell'iniezione intra-cardiaca di formalina, come descritto sopra. Ciò consente una fissazione sufficiente del tessuto epatico, con conseguente conservazione dell'integrità dell'RNA per l'ISH. - Posizionare il fegato e i tessuti polmonari in formalina al 10% e fissarsi durante la notte. Sostituire la formalina con etanolo al 70%, seguita dall'incorporamento di paraffina.
- Eseguire la colorazione di ematossilina ed eosina per valutare istologicamente l'area del tumore. Eseguire immunoistochimica per marcatori stromali di interesse. Eseguire la colorazione Picro-Sirus Red per valutare le aree collagene-positive.
NOTA: Il software ImageJ42 può essere utilizzato per quantificare i dati di immunoistochimica e di colorazione Picro-Sirius Res. Una funzione di deconvoluzione del colore e lo strumento di fibrosi MRI possono essere utilizzati per valutare rispettivamente le aree positive alla 3,3'-diaminobenzidina (DAB) e le aree rosso-positive di Picro-Sirio.
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Representative Results
Per indurre la sovraespressione mediata da AAV di un gene stromale che trattiene il tumore, Islr 4,25,43,44, negli epatociti, abbiamo iniettato per via endovenosa Islr-encoding AAV8. 1,0 x 1011 genomi virali (vg) di AAV8-Islr, o come controllo, AAV8-mRuby2, è stato iniettato nella vena della coda del topo adulto (Figura 1A). Due settimane dopo l'iniezione della vena della coda, i fegati sono stati raccolti per convalidare la sovraespressione di Islr negli epatociti. Abbiamo eseguito l'ibridazione in situ RNAscope45 e confermato che i segnali 3,3'-Diaminobenzidina (DAB)+ sono stati osservati in tutto il fegato (Figura 1B). Nessun segnale DAB+ è stato rilevato nel fegato da un topo trattato con AAV8-mRuby2.
Abbiamo praticato la procedura di iniezione della vena porta iniettando inchiostro Indiano (diluizione 1:1000 in PBS). Dopo aver praticato un'incisione nella parte superiore dell'addome, l'intestino è stato delicatamente estratto dallo spazio addominale per consentire la visualizzazione della vena porta (Figura 2A). L'iniezione della vena porta di inchiostro indiano ha consegnato l'inchiostro in tutto il fegato, ma non al polmone (Figura 2B). Se l'inchiostro viene erroneamente iniettato in altri vasi come la vena cava inferiore (IVC) o l'aorta addominale, la circolazione sistemica dell'inchiostro altera il colore polmonare in nero. L'inchiostro indiano aiuta anche a identificare la quantità di perdite dalla vena porta, che indica la diffusione pancreatica o peritoneale.
Due settimane dopo l'iniezione della vena della coda di AAV-mRuby2, gli organoidi del cancro del colon ApcΔ/Δ e Trp53Δ/Δ (tumoroidi AP) sono stati dissociati in singole cellule e iniettati nella vena porta del topo (Figura 3A). Per confermare la crescita del tumore metastatico e valutare l'istologia, abbiamo raccolto i fegati 3-4 settimane dopo l'iniezione della vena porta (cioè, in un punto temporizzato piuttosto che in un endpoint umano), prima che la necrosi prominente confondesse le analisi istopatologiche. Macroscopicamente, l'iniezione della vena porta di tumoroidi ha provocato più noduli tumorali bianchi nel fegato (Figura 3B). Abbiamo scoperto che l'iniezione intra-splenica dello stesso numero di cellule di tumoroidi non ha generato una grande massa tumorale metastatica. Ciò suggerisce che l'approccio di iniezione della vena porta ha indotto in modo più efficiente le metastasi epatiche rispetto al modello di iniezione intra-splenica. La colorazione di ematossilina ed eosina delle metastasi epatiche CRC indotte dall'iniezione della vena porta ha dimostrato istopatologia di adenocarcinoma tubulare moderatamente differenziato accompagnato da una reazione stromale desmoplastica e necrosi (Figura 3C). Questa istologia ricca di stroma ha ricapitolato fedelmente quella delle metastasi epatiche CRC umane (Figura 3C), rendendo questo modello adatto per la ricerca traslazionale che indaga lo stroma tumorale metastatico. Inoltre, l'immunoistochimica per l'actina del muscolo alfa-liscio (αSMA), un marcatore ben consolidato per i CAF, ha mostrato che circa il 7% delle aree tumorali erano αSMA-positive, confermando la presenza di CAF in questo modello murino (Figura 3D,E). La colorazione rossa di Picro-Sirius che macchia il collagene46 ha dimostrato un abbondante ECM nel mesenchima tumorale con circa il 13% delle aree tumorali positive al collagene (Figura 3D,E). L'immunoistochimica per EPCAM, un marcatore di lignaggio epiteliale, ha rivelato che il CRC metastatico ha mostrato un germogliamento tumorale (una singola cellula tumorale o un cluster cellulare di fino a quattro cellule tumorali) che è una caratteristica del cancro del colon-retto a prognosi sfavorevole47 (Figura 3F). L'indice di marcatura di Ki67 nel CRC metastatico era di circa l'80%, indicando che la maggior parte delle cellule tumorali sono mitoticamente attive (Figura 3G,H).
Abbiamo eseguito analisi di sopravvivenza del topo e della cinetica della crescita tumorale in questo modello preclinico. I topi della nostra prima coorte pilota hanno mostrato una sopravvivenza mediana di 57 giorni dopo l'iniezione di tumoroide nella vena porta (N = 4 topi; Figura 4A). Questo è stato successivamente replicato nei gruppi25 iniettati AAV8-mRuby2 di controllo più grande. All'endpoint umano (come mostrato in NOTE, fase 5.2), 3 topi su 4 nel gruppo pilota hanno dimostrato ascite, che si osserva anche nei pazienti con metastasiepatiche avanzate 48. Per valutare la crescita del tumore, è stato utilizzato il sistema di imaging in vivo (IVIS) per misurare la luminescenza derivata dal tumore (Figura 4B,C). I segnali di bioluminescenza sono stati osservati all'interno della parte superiore dell'addome, suggerendo una crescita tumorale specifica del fegato (Figura 4B). Se si osservano segnali IVIS nell'addome inferiore, ciò indica una disseminazione peritoneale o metastasi secondarie agli organi addominali. L'imaging settimanale in vivo ha permesso una valutazione longitudinale della crescita tumorale in ciascun topo (Figura 4C), rendendo più facile monitorare un effetto terapeutico nel nostro successivo studio più ampio. Il tasso di assunzione del tumore è stato del 100% (4/4 topi) come valutato dai segnali IVIS. In questo esperimento, non sono state osservate metastasi polmonari macroscopicamente evidenti al momento della raccolta dei tessuti (0/4 topi).
Infine, abbiamo studiato se la consegna diretta agli epatociti mediata da AAV di un gene CAF che trattiene il cancro, Islr 4,25, potesse inibire la crescita delle metastasi epatiche CRC in questo modello murino preclinico. In particolare, i topi trattati con AAV8-Islr hanno mostrato una migliore sopravvivenza del topo e una diminuzione dei segnali IVIS dai tumori (Figura 5A-C)25. L'immunoistochimica per Smad 1/5/8 fosforilato ha dimostrato che la sovraespressione epatocitaria di ISLR, un potenziatore di segnalazione BMP, ha aumentato la segnalazione BMP nei tumori metastatici (Figura 5D). Il trattamento con AAV8-Islr ha ridotto il numero di cellule proliferanti Ki67+ nelle metastasi epatiche CRC (Figura 5E). Per la descrizione completa dei risultati, fare riferimento a Kobayashi et al., Gastroenterologia, 202125. I nostri dati collettivi indicano che la somministrazione mediata da AAV8 di un gene inibitorio del tumore agli epatociti, un costituente vitale dello stroma29 del tumore metastatico epatico, potrebbe essere un efficace approccio preventivo / terapeutico per le metastasi epatiche CRC (Figura 5F).
Figura 1: AAV8-Islr somministrato dalla vena della coda genera una sovraespressione di Islr nel fegato. (A) Schema sperimentale che mostra l'iniezione della vena caudale di AAV8, seguita dall'iniezione della vena porta di organoidi del cancro del colon-retto (CRC). ISH, ibridazione in situ; IHC, immunoistochimica; qRT-PCR, reazione a catena quantitativa in tempo reale della polimerasi. (B) Immagini rappresentative. L'ibridazione dell'RNA in situ per Islr è stata eseguita utilizzando fegati di topi trattati con AAV8-Islr o AAV8-mRuby2. I fegati sono stati raccolti 2 settimane dopo l'iniezione della vena della coda. Barre di scala, 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: L'iniezione della vena porta di inchiostro indiano provoca la sua consegna al fegato, ma non al polmone. (A) Immagini rappresentative che mostrano l'anatomia dell'addome superiore dopo laparotomia. Si noti che, per la visualizzazione della vena porta, l'intestino viene portato al di fuori della cavità addominale. L'immagine a destra mostra un'annotazione anatomica di ciascun organo e vaso. La freccia gialla indica il sito di iniezione. IVC, Vena cava inferiore. (B) Immagini rappresentative del fegato e del polmone dopo l'iniezione della vena porta di inchiostro indiano. Le punte di freccia gialle indicano vasi macchiati con l'inchiostro dell'India. Barre della scala, 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: L'iniezione della vena porta di organoidi del cancro del colon-retto genera metastasi epatiche ricche di stroma. (A) Schema sperimentale che mostra l'iniezione della vena porta di organoidi del cancro del colon ApcΔ/Δ e Trp53Δ/Δ (tumori AP). Barra della scala, 200 μm. T, tumoroidi. (B) Immagini macroscopiche rappresentative dei fegati che sono state raccolte 3-4 settimane dopo l'iniezione della vena porta (a sinistra) o l'iniezione intra-splenica (a destra). 5,0 x 105 singole cellule da tumoroidi AP sono state iniettate nella vena porta o nella milza. L'iniezione intra-splenica è stata eseguita come descritto13. I noduli bianchi indicano tumori. T, Tumore; N, Fegato normale. (C) Immagini rappresentative di colorazione di ematossilina ed eosina (H & E) delle metastasi epatiche CRC dal modello murino di iniezione della vena porta (sinistra e centro) e umano (destra). T, Tumore; N, Fegato normale; S, Stroma; Nec, Necrosi. La linea tratteggiata gialla indica un confine tra il tumore e il fegato normale (a sinistra). (D ed E) Immunoistochimica (IHC) per l'actina della muscolatura alfa-liscia (αSMA; sinistra) e la colorazione rossa Picro-Sirius (destra). (D) Immagini rappresentative. (E) Quantificazione delle aree αSMA-positive (a sinistra) e delle aree rosso-positive di Picro-Sirio (a destra). N = 4 mouse, 5 HPF (High Power Fields; 400x)/mouse. (F) Immagine rappresentativa che mostra l'immunoistochimica per EPCAM, un marcatore di cellule epiteliali. Le linee tratteggiate verdi denotano il germogliamento del tumore. (G e H) Immunoistochimica per Ki67, un marcatore di proliferazione cellulare. (G) Immagine rappresentativa. (H) Percentuale di cellule Ki67+ nelle cellule epiteliali totali. Le cellule epiteliali sono state visualizzate mediante controcolorazione dell'ematossilina. N = 4 mouse, 5 HPF/mouse. In (B)-(H), tutti i tessuti epatici di topo sono stati raccolti 3-4 settimane dopo l'iniezione di tumoroidi AP. Media ± S.E.M. Ogni punto rappresenta un valore medio di 5 HPF da un mouse (E e H). Le barre della scala rappresentano 1 cm (B), 1 mm (C; sinistra), 100 μm (C; centrale e destra) e 50 μm (D, F e G). Si noti che lo studio con tessuti umani è stato approvato dal Comitato Etico della Nagoya University Graduate School of Medicine (2017-0127). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi di sopravvivenza e analisi cinetica della crescita tumorale mediante imaging in vivo . (A) Curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier. N = 4 topi. (B,C) Il sistema di imaging in vivo (IVIS) è stato utilizzato per valutare la cinetica di crescita del tumore. (B) Un'immagine rappresentativa. L'area nella casella rossa è stata utilizzata per la quantificazione. (C) Cinetica di crescita. Vengono mostrati i segnali di luciferasi da ciascun topo. N = 4 topi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: La somministrazione genica mediata da AAV8 di Islr agli epatociti aumenta la segnalazione BMP, riduce la proliferazione tumorale e migliora la sopravvivenza del topo in un modello di iniezione della vena porta di metastasi epatiche CRC. (A) Curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier. Due settimane dopo l'iniezione della vena della coda di AAV-Islr o AAV-mRuby2, è stata eseguita l'iniezione della vena porta di tumoroidi CRC. (B e C) I segnali di luciferasi derivati da tumoroidi sono stati valutati utilizzando IVIS. (B) Immagine rappresentativa. (C) Quantificazione dei segnali IVIS. N = 5 (AAV-mRuby2) e 8 (AAV-Islr) topi. Media ± S.E.M. (D) Immagini rappresentative. Immunoistochimica (IHC) per Smad 1/5/8 fosforilato (pSmad1/5/8). Smad1/5/8 è una molecola a valle della segnalazione della proteina morfogenetica ossea (BMP) che viene fosforilata all'attivazione della segnalazione BMP49. N = 4 topi ciascuno. (E) Immagini rappresentative. Immunoistochimica per Ki67. N = 4 topi ciascuno. (F) Sintesi grafica. La consegna genica diretta dagli epatociti mediata da AAV di un gene stromale che trattiene il cancro potrebbe servire come strategia terapeutica per inibire la metastagenesi del CRC. La sovraespressione mediata da AAV8 di Islr negli epatociti ha rimodellato la nicchia metastatica aumentando la segnalazione BMP e limitando la progressione delle metastasi CRC. Per informazioni dettagliate, fare riferimento a Kobayashi et al., Gastroenterologia, 202125. Log-rank test (A) e ANOVA (analisi della varianza) a due vie con test di confronto multiplo post-hoc di Sidak alla settimana 3 (C). Scale bars, 50 μm. Figure 5A-C è stata ristampata da Gastroenterology, Vol 160(4), Kobayashi et al., The Balance of Stromal BMP Signaling Mediated by GREM1 and ISLR Drives Colorectal Carcinogenesis, Pages 1224-1239.e30, Copyright (2021), con il permesso di Elsevier. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo studio, abbiamo dimostrato che l'iniezione della vena porta di organoidi CRC di topo genera in modo riproducibile metastasi epatiche ricche di fibroblasti che imitano le caratteristiche istologiche delle metastasi epatiche CRC umane. Inoltre, se combinato con terapie dirette dallo stroma come la terapia genica mediata da AAV8, questo modello preclinico funge da strumento utile per valutare gli effetti terapeutici sulla sopravvivenza del topo e sulla crescita del tumore.
Ci sono, almeno, due passaggi critici nel protocollo. In primo luogo, è importante preparare una sospensione unicellulare di tumoroidi tripatinizzando completamente gli organoidi e utilizzando un filtro a rete per rimuovere i grumi cellulari. La dissociazione incompleta dei tumoroidi provoca aggregazioni cellulari di grandi dimensioni, la cui iniezione può occludere la vena porta. Ciò causa infarto del fegato e morte animale22. In secondo luogo, durante l'iniezione della vena porta, è imperativo ridurre al minimo il sanguinamento dalla vena porta. L'ago deve essere inserito correttamente nella vena porta. Per evitare la puntura dell'altro lato della vena porta, l'angolo dell'ago inserito deve essere mantenuto quasi parallelo alla vena porta. Per evitare la lacerazione della vena porta durante l'iniezione, l'ago non deve essere spostato una volta inserito completamente nella vena porta. Immediatamente dopo aver rimosso l'ago dalla vena porta, è fondamentale applicare una pressione sul sito di iniezione con un batuffolo di cotone per almeno 5 minuti.
Il numero di cellule per l'iniezione deve essere modificato in base al topo ricevente (ad esempio, topo immunocompetente vs immunodeficiente) e tumorigenicità della linea organoide. Nei nostri esperimenti, l'iniezione di 5,0 x 105 cellule singole in sospensione da 100 μL è stata sufficiente per generare metastasi epatiche in topi immunocompetenti. Aumentare il numero di cellule potrebbe aumentare il rischio di embolia nella vena porta e la morte degli animali14, e quindi dovrebbe essere attentamente considerato. Dato che gli articoli precedenti utilizzavano 5 x 10da 4 a 5 x 105 cellule in 100 μL per l'iniezione tumoroide nella vena portale o mesenterica 25,26,27,28, riteniamo che questo intervallo di numeri cellulari sarebbe un buon punto di partenza per l'ottimizzazione.
Una limitazione dell'approccio di iniezione della vena porta è che non ricapitola completamente l'intera cascata di metastagenesi del CRC. Le metastasi epatiche del cancro richiedono cinque passaggi principali: (1) invasione delle cellule tumorali nel sito primario, (2) intravaso nel vaso, (3) sopravvivenza cellulare nella circolazione portale, (4) stravaso dalla vena porta al parenchima epatico e (5) colonizzazione nella nicchia metastatica50. Il modello di iniezione della vena porta consente solo l'indagine delle fasi (3)-(5). Per ottenere informazioni sugli altri processi metastatici, è necessario utilizzare altri modelli come modelli in vitro e / o un modello murino CRC primario notch1-mutante che spesso metastatizza al fegato51.
Il significato del metodo di iniezione della vena porta rispetto ai metodi esistenti include la crescita specifica del fegato e un carico tumorale più elevato. La disseminazione peritoneale in altri modelli di iniezione e la crescita del tumore primario in modelli CRC primari possono confondere l'analisi della progressione delle metastasi epatiche. Al contrario, il nostro approccio alla vena porta genera rapidamente tumori specifici del fegato, semplificando la sopravvivenza e le analisi della crescita tumorale.
Uno dei principali vantaggi del trapianto di organoidi rispetto all'iniezione di linea cellulare è che l'iniezione di vena porta di tumoroidi ha generato il microambiente tumorale ricco di fibroblasti che fenocopia una caratteristica desmoplastica del CRC metastatico umano. Le condizioni di coltura organoide ricapitolano le caratteristiche del microambiente tumorale e supportano le popolazioni di cellule staminali intestinali, incluso l'incorporamento di cellule in un ECM 3D ricco e complesso con una combinazione definita di fattori di crescita24,52. Ciò si traduce in propagazione delle cellule tumorali in un modo che preserva il paesaggio genetico del tumore diorigine 52,53. Al contrario, la tradizionale coltura 2D di linee cellulari tumorali è associata alla selezione clonale e ad alterazioni genomiche/trascrittomiche aberranti che non riflettono fedelmente le caratteristiche dei tumori originali54. Ipotizziamo che le condizioni di coltura relativamente dure per la coltura 2D delle linee cellulari tumorali costringano le cellule ad adattarsi alla mancanza di segnali ECM / fattore di crescita che possono quindi causare tumori poveri di stroma in vivo, poiché le cellule non richiedono più segnali derivati dallo stroma per la sopravvivenza.
Combinando il modello di iniezione della vena porta organoide con la terapia genica mediata da AAV8, abbiamo scoperto che la consegna di un carico utile inibitorio del cancro agli epatociti prima della colonizzazione delle cellule tumorali nel fegato potrebbe modificare la nicchia (pre-)metastatica per inibire la crescita delle metastasi CRC25. Incoraggiante, gli studi clinici hanno dimostrato che il trasferimento genico in vivo mediato da AAV al fegato induce l'espressione a lungo termine di un transgene e potrebbe essere una modalità efficace e sicura per il trattamento di malattie genetiche non neoplastiche 30,31,55. In futuro, sfruttare gli epatociti per prevenire le metastasi epatiche attraverso l'approccio AAV potrebbe avere un potenziale valore clinico nei pazienti oncologici ad alto rischio di metastasi.
In sintesi, il nostro articolo mostra che il trapianto di organoidi CRC attraverso la vena porta genera metastasi epatiche ricche di fibroblasti, che possono essere sfruttate per lo sviluppo di strategie terapeutiche mirate allo stroma. Accoppiando l'iniezione della vena porta con la terapia diretta dallo stroma come la consegna genica mediata da AAV, si possono identificare nuovi bersagli stromali per frenare la progressione delle metastasi CRC.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato da sovvenzioni del National Health and Medical Research Council (APP1156391 a D.L.W., S.L.W.) (APP1081852 a D.L.W., APP1140236 a S.L.W., APP1099283 a D.L.W.,); Cancer Council SA Beat Cancer Project per conto dei suoi donatori e del governo statale dell'Australia meridionale attraverso il Dipartimento della Salute (MCF0418 to S.L.W., D.L.W.); una sovvenzione in aiuto per la ricerca scientifica (B) (20H03467 a M.T.) commissionata dal Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia del Giappone; AMED-CREST (Japan Agency for Medical Research and Development, Core Research for Evolutional Science and Technology (19gm0810007h0104 e 19gm1210008s0101 to A.E.); il Project for Cancer Research and Therapeutic Evolution (P-CREATE) da AMED (19cm0106332h0002 a A.E.); Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (a H.K.), Takeda Science Foundation Fellowship (a H.K.), Greaton International Ph.D. Scholarship (a H.K.), Lions Medical Research Foundation Scholarship (a K.G.).
Ringraziamo il Dr. Leszek Lisowski presso vector and genome Engineering Facility (VGEF), Children's Medical Research Institute (CMRI) (NSW, AUSTRALIA) per la produzione di vettori AAV ricombinanti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formalin | Sigma | HT501128 | |
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 33-gauge needle | TSK | LDS-33013 | For portal vein injection |
| 4-0 vicryl suture | ETHICON | J494G | |
| 40-µm cell strainer | Corning | 431750 | |
| 5 mL Syringe | BD | 302130 | Used to apply saline to the intestine after portal vein injection |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| 50 mL syringe | TERUMO | SS*50LE | Luer lock syringe for perfusion fixation |
| 70% Isopropyl alcohol wipe | Briemar | 5730 | |
| Anaesthesia machine | Darvall | 9356 | |
| αSMA antibody | DAKO | M0851 | Clone 1A4. 1/500 dilution for immunohistochemistry |
| Buprenorphine | TROY | N/A | ilium Temvet Injection, 300 µg/ml Buprenorphine |
| Cotton buds | Johnson & Johnson | N/A | Johnson's pure cotton bud applicators. Need to be autoclaved before use. |
| D-luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| Electric shaver | Sold by multiple suppliers | ||
| Forceps | Sold by multiple suppliers | ||
| Hamilton syringe | HAMILTON | 81020 | For portal vein injection |
| Heat box (animal warming chamber) | Datesand | MK3 | |
| Heat lamp | Sold by multiple suppliers | ||
| Hemostatic sponge | Pfizer | 09-0891-04-015 | Gelfoam absorbable gelatin sponge, USP, 12-7 mm |
| India ink | Talens | 44727000 | |
| Injection syringe and needle | BD | 326769 | For tail vein injection |
| Islr probe (RNAscope) | ACD | 450041 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3244 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software | Perkin Elmer | 128113 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| MRI fibrosis tool | N/A | N/A | https://github.com/MontpellierRessourcesImagerie/imagej_macros_and_scripts/wiki/MRI_Fibrosis_Tool |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| RNAscope kit | ACD | 322300 | |
| Rodent restrainer | Sold by multiple suppliers | ||
| Rosa26-Cas9 mouse | The Jackson Laboratory | 024858 | |
| Saline | Pfizer | PHA19042010 | |
| Scissors | Sold by multiple suppliers | ||
| Skin staplers | Able Scientific | AS59028 | 9 mm wound clips |
| Stapler applicator | Able Scientific | AS59026 | 9 mm wound clip applicator |
| Stapler remover | Able Scientific | AS59037 | Wound clip remover |
| Surgical drape | Multigate | 29-220 | |
| Surgical gauze | Sentry Medical | GS001 | |
| Topical anesthesia cream | EMLA | N/A | EMLA 5% cream, 25 mg/g lignocaine and 25 mg/g prilocaine |
| TrypLE Express | Gibco | 12605028 | Recombinant cell-dissociation enzyme mix |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
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