Summary
Her presenterer vi den sykliske belastningsinduserte intraartikulære brusklesjonsmodellen av rottekneet, generert av 60 sykliske kompresjoner over 20 N, noe som resulterer i skade på femoral kondylarbrusk hos rotter.
Abstract
Patofysiologien ved primær artrose (OA) er fortsatt uklar. Imidlertid er en spesifikk underklassifisering av OA i relativt yngre aldersgrupper sannsynligvis korrelert med en historie med leddbruskskader og ligamentavulsjon. Kirurgiske dyremodeller av OA i kneet spiller en viktig rolle i å forstå utbruddet og progresjonen av posttraumatisk OA og hjelpe til med utviklingen av nye terapier for denne sykdommen. Imidlertid har ikke-kirurgiske modeller nylig blitt vurdert for å unngå traumatisk betennelse som kan påvirke evalueringen av intervensjonen.
I denne studien ble det utviklet en intraartikulær brusklesjonsrottemodell indusert av in vivo syklisk trykkbelastning, noe som tillot forskere å (1) bestemme optimal størrelse, hastighet og varighet av belastning som kunne forårsake fokal bruskskade; (2) vurdere posttraumatiske spatiotemporale patologiske forandringer i kondrocytt vitalitet; og (3) evaluere det histologiske uttrykket av destruktive eller beskyttende molekyler som er involvert i tilpasnings- og reparasjonsmekanismer mot felles trykkbelastninger. Denne rapporten beskriver den eksperimentelle protokollen for denne nye brusklesjonen i en rottemodell.
Introduction
Tradisjonelt har fremre korsbånd (ACL) transeksjon eller destabilisering av medial menisk blitt ansett som optimal for å undersøke posttraumatisk slitasjegikt (PTOA) hos små dyr. I de senere år har ikke-invasive sykliske kompresjonsmodeller blitt brukt til å studere PTOA. Denne modellen ble opprinnelig designet for å undersøke den avbrytende beinresponsen på mekanisk belastning1 og ble deretter modifisert som en ikke-kirurgisk dyremodell for PTOA-studier 2,3,4,5,6. Begrunnelsen er å kollidere leddbrusk ved å påføre en periodisk ekstern kraft, som utløser en rekke inflammatoriske responser. Denne modellen har imidlertid bare blitt brukt på mus, og den passende størrelsen på belastningen på større dyr har ikke blitt diskutert.
Et annet problem med den forrige modellen er at høyvolumprotokollen inkluderte for mange sykluser, noe som forårsaket overdreven fortykning av subchondral bein, en uønsket bivirkning, i flere prøver7. Derfor bledet utviklet en ny metode for syklisk kompresjon med passende størrelse for store dyr og en bivirkning med lavere belastning. Det overordnede målet med denne artikkelen er å beskrive protokollen til den ikke-invasive sykliske kompresjonsmodellen hos rotter og observere de representative resultatene av bruskdegenerasjon. Den nåværende protokollen vil hjelpe lesere som er interessert i anvendelsen av den ikke-invasive sykliske kompresjonsmodellen på rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen ble godkjent av Animal Research Committee of Kyoto University (godkjenningsnummer: Med kyo 17616).
1. Utfør in vivo syklisk kompresjon på rottekneet
- Indusere eksperimentell dyrebedøvelse
- Induser anestesi hos en 12 uker gammel Wistar-rotte (256,8 ± 8,7 g) ved innånding av 5 % isofluranoppløsning i anestesiboksen.
- Intraperitonealt injiser en blanding av tre bedøvelsesmidler9, inkludert medetomidin, midazolam og butorfanol, ved 2 mg/kg av rottekroppsvekten, og barber området rundt høyre kneledd. Bekreft tilstrekkelig bedøvelse ved mangel på pedalrefleks til en tå-klype.
- Monter den bedøvede rotten på fikseringsenheten.
- Plasser den bedøvede rotta liggende på magen på bunnplaten (figur 1), med høyre kne festet til et lite stykke harpiks med et konkavt spor. Plasser høyre bakre lem i hofteforlengelse, knefleksjon og ankelforlengelsesposisjoner, med kneet bøyd på ca. 140 °. Få plass til rottehælen på det kileformede sporet på den bevegelige armaturen.
- Flytt fikseringsenheten til testinstrumentet for stress/strekkfasthet (se materialtabellen). Når du har forsikret deg om at det ikke er kontakt med lastcellen, åpner du programvaren for kontroll av betjenings-/strekkprøvingsinstrumenter (Table of Materials) og klikker på kalibreringsknappen . Etter kalibrering festes toppen av rammen forsiktig til lastcellen. For å holde kneleddet tett festet til rammen, slå på dreieknappen på det bevegelige hovedbetjeningspanelet sakte til forhåndsbelastningen når 5 N.
- Bygg en lastemetode og sett opp trykktesten.
- På hovedmenyen klikker du på Opprett en ny metode | System-etikett . Sett Testmodus til Syklus, og Testtype til Komprimering. Klikk på sensoretiketten og velg Test-fanen for å kontrollere at grensen er innenfor 60 N. I tillegg velger du kategorien Stroke og kontrollerer at grensen er innenfor 500 mm.
MERK: Trinnet ovenfor stopper operasjonen umiddelbart hvis det er stor forskyvning på stresspunktet. - Under kontrolletiketten Testing velger du Vekstens opprinnelse for å starte hovedprogrammet med 0,3 %/full skala. Av de fire seksjonene i en lastesyklus, sett Stroke-hastigheten i kontroll i 1st og 3rd seksjoner til 1 mm / s. Sett Maksimal testkraft i 2.seksjon til 20 N, og Minimum testkraft i 4. seksjon til 5 N. Sett "Holdets varighet" til 0,5 s for toppbelastningen og 10 s for minimumsbelastningen (figur 2).
MERK: Siden dette trinnet definerer hver syklus, må du sørge for at leddflatene er i kontakt med hverandre og beveger seg med en rimelig hastighet og at bevegelsen opprettholdes. - I kategorien Forhåndsinnlasting nederst på siden må du kontrollere at Det er merket av for På, hastigheten på fjerning av avbøyning er satt til 100 mm/min, og maksimal kraft er 5 N. I Specimen-etiketten angir du materialet som metall.
MERK: Disse detaljerte innstillingene kan være spesifikke for hver produsent. - I hovedmenyen, under delen Velg metode og test , velger du metoden som nettopp ble bygget, og klikker på Start for å starte testen.
MERK: Tabellen nederst viser de faktiske målingene av toppbelastning og forskyvning. - Sett antall sykluser til 60.
MERK: Hele lasteøkten inkluderer 60 sykluser, som varer omtrent 12 minutter. I kontrollgruppen gjennomgikk rotter 5 N forspenning i 12 minutter forspenning under de samme forholdene.
- På hovedmenyen klikker du på Opprett en ny metode | System-etikett . Sett Testmodus til Syklus, og Testtype til Komprimering. Klikk på sensoretiketten og velg Test-fanen for å kontrollere at grensen er innenfor 60 N. I tillegg velger du kategorien Stroke og kontrollerer at grensen er innenfor 500 mm.
- Etter lasting, returner rotten til buret og overvåk til full gjenoppretting. Oppretthold en 12-12 timers lys-mørk tidsplan i buret med tilstrekkelig plass og mat ad libitum. Etter de nødvendige eksperimentelle perioder, ofre rotter med en overdose av blandingen av de tre bedøvelsesmidler injisert intraperitonealt eller karbondioksid innånding for analyse (1 h-8 uker).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et representativt resultat av de kortsiktige endringene (1 time og 12 timer) i kondrocytt levedyktighet i prøver utsatt for 20 N syklisk belastning ble oppnådd. Som vist i figur 3 økte antall døde kondrocytter (rød fluorescens) ved 12 timer etter traumer. Omvendt fortsatte antall levende kondrocytter (grønn fluorescens) å synke, med noen prøver som ikke inneholdt levende kondrocytter i det berørte området.
Histologi viste at leddbrusken i rotteknærne som gjennomgikk 20 N dynamisk belastning var skadet, og en fokal lesjonssone ble bekreftet i den laterale lårkondylen i alle prøvene (figur 4). Lesjonsstørrelsen økte imidlertid ikke gradvis i løpet av den 8-ukers observasjonsperioden. Grensen som korresponderte med grensesnittet til lesjonen og den upåvirkede brusken kunne observeres i det berørte området.
Figur 1: Fikseringsanordningen består av en bunnplate og et fikseringsapparat. Bunnplaten (lengde: 27,5 cm, bredde: 13 cm) har en harpiks konkav spor (lengde: 0,8 cm, bredde: 0,4 cm) på bakre side for å imøtekomme rottes bøyde kneledd. Fikseringsapparatet har et kileformet spor (sporbredde: 1,5 cm, spordybde: 1 cm) som har plass til rottehælen, som er nestet i bunnplaten mellom to metallstenger. Toppen av fikseringsapparatet vil være i direkte kontakt med lastcellen til testinstrumentet for stress / strekk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Lastprofil for én innlastingssyklus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Spatiotemporal vurdering av kondrocytt levedyktighet i lesjonsområdet. Etter ofring ble kneleddet dissekert og separert ved hjelp av små tang og saks. Løsninger av calcein AM og EthD-1 flekker ble fremstilt ved å fortynne det originale settet (Table of Materials) ved henholdsvis 1:500 og 1:4,000 i 5 ml PBS. Prøvene ble inkubert i 20 minutter ved romtemperatur. Kontrollprøver ble nedsenket i PBS under de samme forholdene. Fluorescensbilder ble oppnådd ved bruk av et fluorescensmikroskop (materialtabell) ved bruk av fluoresceinisotiocyanat (495 nm / 519 nm) og propidiumjodid (535 nm / 617 nm) kanaler. De vitale kondrocyttene viste grønn fluorescens, mens døde celler fluorescerte rødt. Sammenlignet med kondrocyttene i kontrollprøver (A), ble antall døde kondrocytter på det belastede rottekneet økt ved 1 time (B) og okkuperte det meste av området i det berørte området ved 12 timer (C). Grønn og rød fluorescens representerer regionene av henholdsvis levende og døde kondrocytter. Skala barer = 100 μm. Forkortelser: calcein AM = calcein acetoxymethyl ester; EthD-1 = ethidium homodimer-1; PBS = fosfatbufret saltvann. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representativ safranin O farging av lårkondylen i det lastede kneet. Et lysbilde som viser sagittalseksjonene av den laterale femorale kondylen, som ble farget med en safranin O / Fast Green og hematoxylinoppløsning. Sammenlignet med kontrollen ble safranin O-fargeintensiteten i det berørte området redusert etter belastning, og en klar kant (pil) av øvre/forkalket brusk ble observert. Skala barer = 100 μm. Forkortelse: w = uke. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For første gang viser den nåværende protokollen hvordan man etablerer en modell for belastningsindusert brusklesjon på den laterale femorale kondylen hos rotter, lik den intraartikulære skademodellen hos mindre gnagere som musen2. Belastningsprotokollen hos mus forårsaket imidlertid alvorlig osteofyttdannelse og korsbåndskader, noe som ikke var ideelt for å evaluere effekten av syklisk kompresjon. Den nåværende protokollen skapte en fokal brusklesjon hos rotter med mye lavere belastningskraft. Korrekte innstillinger for lastemetode er avgjørende for protokollen fordi bare riktig størrelse, hastighet og varighet av stress kan ødelegge brusk uten å skade beinvevet.
Innstilling av forskyvningsgrensen (protokolltrinn 1.3.1) er også avgjørende, da det umiddelbart stopper instrumentet i tilfelle ligamentbrudd eller hvis rotta våkner fra anestesi under lasteøkten. Den optimale maksimale belastningen og rottens alder gjenstår å bli bestemt. I de foreløpige forsøkene resulterte imidlertid en belastning på over 50 N i stor sannsynlighet for ACL-brudd i rottens knær. Videre er den nåværende modellen vanskelig å reprodusere hos eldre (>36 uker gamle) rotter, muligens på grunn av stivheten i brusk når veksten oppstår.
Selv om den destruktive belastningsgrensen for yngre rotter ikke ble bestemt, antas det at fremtidige studier bør holde maksimal belastning under 20 N for å observere eventuelle anabole effekter på brusk. Omfanget og lokaliseringen av lesjonsområdet var relativt enkelt å etablere, selv for de som var nye i feltet, som estimert av kondrocytt-degenerative volumet i hver prøve, som potensielt fokuserte på den påfølgende evalueringen av intervensjonen til et relativt smalt bruskområde.
Histologisk farging viste at omfanget av lesjonsområdet var relativt jevnt i løpet av observasjonsperioden på 8 uker. Imidlertid forverret Mankins score kontinuerlig mens matrisefargingen og cellefordelingspoengene økte i det berørte området. Videre var det et tydelig fargeavvik mellom mellomlaget og den forkalkede brusken, noe som illustrerte at bare brusk over tidevannsmerket ble påvirket av interartikulær kompresjon.
Tvert imot, bortsett fra mild fibrillering i sjeldne prøver, forble bruskens integritet stort sett intakt gjennom hele observasjonsperioden, noe som er forskjellig fra progressive OA-skademodeller10. Derfor kan en ikke-kirurgisk modell være bedre for vurdering av bruskgrensesnittkollisjonsinduserte fokale lesjoner, som er vanligere ved idrettsskader. I fremtiden vil dagens modell bli brukt til å vurdere effekten av medisinering eller fysioterapi, som hypertermibehandling og aerob leddøvelse, på traumatisk bruskskade. Videre kan kondrocyttanabolisme og katabolisme som respons på syklisk mekanisk stimulering også valideres in vivo hos dyr ved bruk av denne modellen.
Den nåværende protokollen hadde flere begrensninger. Først ble bare bruskskader på lateral femoral kondyle undersøkt. Lesjonen på lateral tibia bør også evalueres i fremtidige studier. For det andre var den lesjonsdelen av leddbrusken som ble studert i den nåværende protokollen ikke den viktigste bærende regionen under gange. På grunn av bruskens heterogenitet kan stivheten i intraartikulær brusk avvike fra den delen som er undersøkt i den nåværende studien. Dermed kan disse funnene bare brukes som referanse. Endelig viste modellen ingen signifikant progresjon av bruskdegenerasjon, noe som er et viktig trekk ved OA-utvikling. Videre studier kan kombinere invasiv kirurgi med forhåndslastede lesjoner for å observere spatiotemporale endringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet delvis av et JSPS KAKENHI-stipend (nummer JP18H03129 og JP18K19739).
Denne forskningen mottok også finansiering fra Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T), som støttes av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS), og National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) fra National Institutes of Health under prisnummer P2CHD086843. Innholdet er utelukkende forfatterens ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic Apparatus for Small Animals | SHINANO MFG CO.,LTD. | SN-487-0T | |
| Autograph AG-X | Shimadzu Corp | N.A. | Precision Universal / Tensile Tester |
| Fluoview FV10i microscope | Olympus Corp | N.A. | A fully automated confocal laser-scanning microscope |
| ISOFLURANE Inhalation Solution | Pfizer Japan Inc. | (01)14987114133400 | |
| LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit | Thermo Fisher Scientific Japan Inc | L3224 | A quick and easy two-color assay to determine viability of cells |
| TRAPEZIUM X Software | Shimadzu Corp | N.A. | Data processing software for Autograph AG-X |
References
- De Souza, R. L., et al. Non-invasive axial loading of mouse tibiae increases cortical bone formation and modifies trabecular organization: a new model to study cortical and cancellous compartments in a single loaded element. Bone. 37 (6), 810-818 (2005).
- Poulet, B., Hamilton, R. W., Shefelbine, S., Pitsillides, A. A. Characterizing a novel and adjustable noninvasive murine joint loading model. Arthritis and Rheumatism. 63 (1), 137-147 (2011).
- Wu, P., et al. Early response of mouse joint tissue to noninvasive knee injury suggests treatment targets. Arthritis and Rheumatism. 66 (5), 1256-1265 (2014).
- Poulet, B., et al. Intermittent applied mechanical loading induces subchondral bone thickening that may be intensified locally by contiguous articular cartilage lesions. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 940-948 (2015).
- Ko, F. C., et al. Progressive cell-mediated changes in articular cartilage and bone in mice are initiated by a single session of controlled cyclic compressive loading. Journal of Orthopaedic Research. 34 (11), 1941-1949 (2016).
- Adebayo, O. O., et al. Role of subchondral bone properties and changes in development of load-induced osteoarthritis in mice. Osteoarthritis Cartilage. 25 (12), 2108-2118 (2017).
- Ko, F. C., et al. In vivo cyclic compression causes cartilage degeneration and subchondral bone changes in mouse tibiae. Arthritis and Rheumatism. 65 (6), 1569-1578 (2013).
- Ji, X., et al. Effects of in vivo cyclic compressive loading on the distribution of local Col2 and superficial lubricin in rat knee cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 39 (3), 543-552 (2021).
- Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).
- Iijima, H., et al. Destabilization of the medial meniscus leads to subchondral bone defects and site-specific cartilage degeneration in an experimental rat model. Osteoarthritis Cartilage. 22 (7), 1036-1043 (2014).
