Summary
Aquí, presentamos el modelo de lesión de cartílago intraarticular inducida por carga cíclica de la rodilla de rata, generada por 60 compresiones cíclicas sobre 20 N, lo que resulta en daño al cartílago condilar femoral en ratas.
Abstract
La fisiopatología de la osteoartritis primaria (OA) aún no está clara. Sin embargo, una subclasificación específica de OA en grupos de edad relativamente más jóvenes probablemente se correlacione con antecedentes de daño del cartílago articular y avulsión del ligamento. Los modelos animales quirúrgicos de OA de la rodilla juegan un papel importante en la comprensión de la aparición y progresión de la OA postraumática y ayudan en el desarrollo de nuevas terapias para esta enfermedad. Sin embargo, recientemente se han considerado modelos no quirúrgicos para evitar la inflamación traumática que podría afectar la evaluación de la intervención.
En este estudio, se desarrolló un modelo de rata con lesión de cartílago intraarticular inducido por carga compresiva cíclica in vivo , lo que permitió a los investigadores (1) determinar la magnitud, velocidad y duración óptimas de la carga que podrían causar daño focal del cartílago; (2) evaluar los cambios patológicos espaciotemporales postraumáticos en la vitalidad de los condrocitos; y (3) evaluar la expresión histológica de moléculas destructivas o protectoras que están involucradas en los mecanismos de adaptación y reparación contra cargas compresivas articulares. Este informe describe el protocolo experimental para esta nueva lesión de cartílago en un modelo de rata.
Introduction
Tradicionalmente, la transección del ligamento cruzado anterior (LCA) o la desestabilización del menisco medial se ha considerado óptima para investigar la osteoartritis postraumática (PTOA) en animales pequeños. En los últimos años, se han utilizado modelos de compresión cíclica no invasivos para estudiar PTOA. Este modelo fue diseñado originalmente para investigar la respuesta esponjosa del hueso a la carga mecánica1 y luego se modificó como un modelo animal no quirúrgico para los estudios de PTOA 2,3,4,5,6. La razón es colisionar el cartílago articular mediante la aplicación de una fuerza externa periódica, que desencadena una serie de respuestas inflamatorias. Sin embargo, este modelo solo se ha aplicado a ratones, y no se ha discutido la magnitud apropiada de la carga en animales más grandes.
Otro problema con el modelo anterior es que el protocolo de alto volumen incluía demasiados ciclos, lo que causó un engrosamiento excesivo del hueso subcondral, un efecto secundario no deseado, en varias muestras7. Por lo tanto, se desarrolló un nuevo método de compresión cíclica con la magnitud apropiada para animales grandes y un efecto secundario de carga menor8. El objetivo general del presente artículo es describir el protocolo del modelo de compresión cíclica no invasiva en ratas y observar los resultados representativos de la degeneración del cartílago. El protocolo actual ayudaría a los lectores interesados en la aplicación del modelo de compresión cíclica no invasiva en ratas.
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Protocol
El protocolo fue aprobado por el Comité de Investigación Animal de la Universidad de Kioto (número de aprobación: Med kyo 17616).
1. Realizar compresión cíclica in vivo en la rodilla de rata
- Inducir anestesia animal experimental
- Inducir la anestesia en una rata Wistar de 12 semanas de edad (256,8 ± 8,7 g) por inhalación de solución de isoflurano al 5% en la caja de anestesia.
- Inyectar por vía intraperitoneal una mezcla de tres agentes anestésicos9, incluyendo medetomidina, midazolam y butorfanol, a 2 mg/kg del peso corporal de la rata, y afeitar el área alrededor de la articulación de la rodilla derecha. Confirme la anestesia suficiente por falta de reflejo del pedal hasta pellizcar el dedo del pie.
- Monte la rata anestesiada en el dispositivo de fijación.
- Coloque la rata anestesiada acostada sobre su vientre en la placa base (Figura 1), con la rodilla derecha unida a un pequeño trozo de resina con un surco cóncavo. Coloque la extremidad posterior derecha en las posiciones de extensión de cadera, flexión de rodilla y extensión de tobillo, con la rodilla flexionada a aproximadamente 140 °. Acomode el talón de la rata en la ranura en forma de cuña en el accesorio móvil.
- Mueva el dispositivo de fijación al instrumento de ensayo de tensión/tracción (consulte la Tabla de materiales). Después de asegurarse de que no haya contactos con la célula de carga, abra el software de control del instrumento de prueba de tensión/tracción (Tabla de materiales) y haga clic en el botón Calibración . Después de la calibración, fije la parte superior del bastidor a la célula de carga con cuidado. Para mantener la articulación de la rodilla firmemente unida al marco, encienda la perilla giratoria del panel operativo principal móvil lentamente hasta que la precarga alcance los 5 N.
- Cree un método de carga y configure la prueba de compresión.
- En el menú principal, haga clic en Crear un nuevo método | Etiqueta del sistema . Establezca el modo de prueba en Ciclo y Tipo de prueba en Compresión. Haga clic en la etiqueta del sensor y seleccione la pestaña Prueba para comprobar que el límite está dentro de 60 N. Además, seleccione la pestaña Trazo y compruebe que el límite está dentro de los 500 mm.
NOTA: El paso anterior detendrá la operación inmediatamente si hay un gran desplazamiento en el punto de tensión. - En la etiqueta Control de pruebas, seleccione Origen del crecimiento para iniciar el programa principal con 0,3%/escala completa. De las cuatro secciones de un ciclo de carga, ajuste la velocidad de carrera en control en las secciones1ª y3ª a 1 mm/s. Establezca la fuerza de prueba máxima en la2ª sección en 20 N, y la fuerza de prueba mínima en la4ª sección en 5 N. Establezca "la duración de la retención" en 0,5 s para la carga máxima y 10 s para la carga mínima (Figura 2).
NOTA: Como este paso define cada ciclo, asegúrese de que las superficies de las articulaciones estén en contacto entre sí y se muevan a una velocidad razonable y que se mantenga el movimiento. - En la pestaña Precarga en la parte inferior de la página, asegúrese de que Activado esté marcado, que la Velocidad de eliminación de deflexión esté establecida en 100 mm/min y que la fuerza máxima sea de 5 N. En la etiqueta Muestra , establezca el Material como Metal.
NOTA: Esta configuración detallada puede ser específica para cada fabricante. - En el menú principal, en la sección Seleccionar método y prueba, seleccione el método que se acaba de crear y haga clic en Iniciar para comenzar la prueba.
NOTA: La tabla de la parte inferior muestra las medidas reales de la carga máxima y el desplazamiento. - Establezca el número de ciclos en 60.
NOTA: Toda la sesión de carga incluye 60 ciclos, que duran aproximadamente 12 min. En el grupo de control, las ratas se sometieron a una precarga de 5 N durante 12 minutos de precarga en las mismas condiciones.
- En el menú principal, haga clic en Crear un nuevo método | Etiqueta del sistema . Establezca el modo de prueba en Ciclo y Tipo de prueba en Compresión. Haga clic en la etiqueta del sensor y seleccione la pestaña Prueba para comprobar que el límite está dentro de 60 N. Además, seleccione la pestaña Trazo y compruebe que el límite está dentro de los 500 mm.
- Después de la carga, devuelva la rata a su jaula y monitoree hasta la recuperación completa. Mantener un horario de 12-12 h de luz-oscuridad en la jaula con suficiente espacio y comida ad libitum. Después de los períodos experimentales requeridos, sacrificar las ratas con una sobredosis de la mezcla de los tres agentes anestésicos inyectados por vía intraperitoneal o inhalación de dióxido de carbono para su análisis (1 h-8 semanas).
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Representative Results
Se obtuvo un resultado representativo de los cambios a corto plazo (1 h y 12 h) en la viabilidad de los condrocitos en muestras sometidas a carga cíclica de 20 N. Como se muestra en la Figura 3, el número de condrocitos muertos (fluorescencia roja) aumentó a las 12 h después del trauma. Por el contrario, el número de condrocitos vivos (fluorescencia verde) continuó disminuyendo, con algunas muestras que no contienen condrocitos vivos en el área afectada.
La histología mostró que el cartílago articular de las rodillas de rata que sufrieron una carga dinámica de 20 N estaba dañado, y se confirmó una zona focal de lesión en el cóndilo femoral lateral en todas las muestras (Figura 4). Sin embargo, el tamaño de la lesión no aumentó progresivamente durante el período de observación de 8 semanas. El borde que correspondía a la interfaz de la lesión y el cartílago no afectado se pudo observar en el área afectada.
Figura 1: El dispositivo de fijación consiste en una placa base y un aparato de fijación. La placa base (longitud: 27,5 cm, ancho: 13 cm) tiene un surco cóncavo de resina (longitud: 0,8 cm, ancho: 0,4 cm) en el lado posterior para acomodar la articulación flexionada de la rodilla de la rata. El aparato de fijación tiene una ranura en forma de cuña (ancho de ranura: 1,5 cm, profundidad de ranura: 1 cm) que acomoda el talón de la rata, que está anidado en la placa base entre dos barras de metal. La parte superior del aparato de fijación estará en contacto directo con la célula de carga del instrumento de ensayo de tensión/tracción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Perfil de carga para un ciclo de carga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Evaluación espaciotemporal de la viabilidad de los condrocitos en el área de la lesión. Después del sacrificio, la articulación de la rodilla fue diseccionada y separada usando pequeños fórceps y tijeras. Las soluciones de tinciones de calceína AM y EthD-1 se prepararon diluyendo el kit original (Tabla de materiales) a 1:500 y 1:4,000 en 5 mL de PBS, respectivamente. Las muestras se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. Las muestras de control se sumergieron en PBS en las mismas condiciones. Las imágenes de fluorescencia se obtuvieron utilizando un microscopio de fluorescencia (Tabla de materiales) utilizando canales de isotiocianato de fluoresceína (495 nm/519 nm) y yoduro de propidio (535 nm/617 nm). Los condrocitos vitales mostraron fluorescencia verde, mientras que las células muertas fluoresceron rojo. En comparación con los condrocitos en las muestras de control (A), el número de condrocitos muertos en la rodilla de rata cargada aumentó a 1 h (B) y ocupó la mayor parte del área en la región afectada a las 12 h (C). La fluorescencia verde y roja representan las regiones de los condrocitos vivos y muertos, respectivamente. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: calceína AM = calceína acetoxymethyl ester; EthD-1 = ethidium homodimer-1; PBS= solución salina tamponada con fosfato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Tinción representativa de safranina O del cóndilo femoral en la rodilla cargada. Una diapositiva que muestra las secciones sagitales del cóndilo femoral lateral, que se tiñeron con una solución de safranina O/Fast Green y hematoxilina. En comparación con el control, la intensidad de tinción de safranina O en el área afectada disminuyó después de la carga, y se observó un borde claro (flecha) del cartílago superior / calcificado. Barras de escala = 100 μm. Abreviatura: w = semana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Por primera vez, el protocolo actual muestra cómo establecer un modelo de lesión de cartílago inducida por carga en el cóndilo femoral lateral en ratas, similar al modelo de daño intraarticular en roedores más pequeños como el ratón2. Sin embargo, el protocolo de carga en ratones causó la formación severa de osteofitos y lesiones del ligamento cruzado, lo que no fue ideal para evaluar los efectos de la compresión cíclica. El protocolo actual creó una lesión focal del cartílago en ratas con una fuerza de carga mucho menor. La configuración correcta del método de carga es crítica para el protocolo porque solo la magnitud, la velocidad y la duración adecuadas del estrés pueden destruir el cartílago sin dañar el tejido óseo.
Establecer el límite de desplazamiento (paso del protocolo 1.3.1) también es crucial, ya que detiene inmediatamente el instrumento en caso de ruptura del ligamento o si la rata se despierta de la anestesia durante la sesión de carga. La carga máxima óptima y la edad de la rata aún no se han determinado. Sin embargo, en los experimentos preliminares, una carga de más de 50 N resultó en una alta probabilidad de ruptura del LCA en las rodillas de la rata. Además, el modelo actual es difícil de reproducir en ratas más viejas (>36 semanas de edad), posiblemente debido a la rigidez del cartílago a medida que se produce el crecimiento.
Aunque no se determinó el umbral de carga destructiva para ratas más jóvenes, se cree que los estudios futuros deberían mantener la carga máxima por debajo de 20 N para observar cualquier efecto anabólico en el cartílago. El alcance y la localización del área de la lesión fueron relativamente sencillos de establecer, incluso para aquellos nuevos en el campo, según lo estimado por el volumen degenerativo de condrocitos en cada muestra, que potencialmente se centró en la evaluación posterior de la intervención a un área de cartílago relativamente estrecha.
La tinción histológica demostró que el alcance del área de la lesión fue relativamente estable durante el período de observación de 8 semanas. Sin embargo, las puntuaciones de Mankin se deterioraron continuamente, mientras que las puntuaciones de tinción de matriz y distribución celular aumentaron en el área afectada. Además, hubo una desviación de color obvia entre la capa media y el cartílago calcificado, lo que ilustró que solo el cartílago por encima de la marca de marea se vio afectado por la compresión interarticular.
Por el contrario, aparte de la fibrilación leve en muestras raras, la integridad del cartílago permaneció en gran parte intacta durante todo el período de observación, lo que es diferente de los modelos de lesión progresiva de OA10. Por lo tanto, un modelo no quirúrgico puede ser mejor para la evaluación de las lesiones focales inducidas por colisión de la interfaz del cartílago, que son más comunes en las lesiones deportivas. En el futuro, el modelo actual se utilizará para evaluar los efectos de la medicación o la fisioterapia, como la terapia de hipertermia y el ejercicio aeróbico de las articulaciones, sobre el daño traumático del cartílago. Además, el anabolismo de los condrocitos y el catabolismo en respuesta a la estimulación mecánica cíclica también podrían validarse in vivo en animales utilizando este modelo.
El protocolo actual tenía varias limitaciones. Primero, solo se investigaron las lesiones de cartílago en el cóndilo femoral lateral. La lesión en la tibia lateral también debe evaluarse en estudios futuros. En segundo lugar, la parte lesionada del cartílago articular estudiada en el protocolo actual no era la principal región de carga durante la marcha. Debido a la heterogeneidad del cartílago, la rigidez del cartílago intraarticular puede diferir de la parte examinada en el presente estudio. Por lo tanto, estos hallazgos solo pueden usarse como referencia. Finalmente, el modelo no mostró ninguna progresión significativa de la degeneración del cartílago, que es una característica importante del desarrollo de OA. Los estudios adicionales podrían combinar la cirugía invasiva con lesiones precargadas para observar los cambios espaciotemporales.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado en parte por una subvención JSPS KAKENHI (números JP18H03129 y JP18K19739).
Esta investigación también recibió fondos de la Alianza para la Investigación y Capacitación en Rehabilitación Regenerativa (AR3T), que cuenta con el apoyo del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver (NICHD), el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) y el Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería (NIBIB) de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio P2CHD086843. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic Apparatus for Small Animals | SHINANO MFG CO.,LTD. | SN-487-0T | |
| Autograph AG-X | Shimadzu Corp | N.A. | Precision Universal / Tensile Tester |
| Fluoview FV10i microscope | Olympus Corp | N.A. | A fully automated confocal laser-scanning microscope |
| ISOFLURANE Inhalation Solution | Pfizer Japan Inc. | (01)14987114133400 | |
| LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit | Thermo Fisher Scientific Japan Inc | L3224 | A quick and easy two-color assay to determine viability of cells |
| TRAPEZIUM X Software | Shimadzu Corp | N.A. | Data processing software for Autograph AG-X |
References
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