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Biochemistry

रिबोसोम प्रोटीन संश्लेषण का एकल अणु फ्लोरेसेंस एनर्जी ट्रांसफर अध्ययन

Published: July 6, 2021 doi: 10.3791/62664
Automatic Translation
1
1Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

Summary

एकल अणु फ्लोरेसेंस ऊर्जा हस्तांतरण एक विधि है जो रिबोसोमल प्रोटीन संश्लेषण के दौरान ट्रान की गतिशीलता को ट्रैक करती है। व्यक्तिगत राइबोसोम्स को ट्रैक करके, अउमेन्तर आबादी की पहचान की जाती है, जो तंत्र पर प्रकाश डाला जाता है। इस विधि का उपयोग सामान्य रूप से जैविक अनुरूप परिवर्तनों को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है ताकि कई अन्य जटिल बायोसिस्टम में गतिशील-कार्य संबंधों को प्रकट किया जा सके। एकल अणु विधियां गैर-दर-दर सीमित चरणों और कम आबादी वाले प्रमुख मध्यवर्ती का निरीक्षण कर सकती हैं, जो औसत प्रभाव के कारण पारंपरिक पहनावा विधियों द्वारा सुलभ नहीं हैं।

Abstract

राइबोसोम एक बड़ा राइबोन्यूलोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स है जो एमआरएनए टेम्पलेट्स के साथ प्रोटीन को प्रोसेसिक रूप से असेंबल करता है। राइबोसोम का व्यास ए-, पी-और ई-साइटों पर बड़े टीआरएनए सब्सट्रेट्स को समायोजित करने के लिए लगभग 20 एनएम है। नतीजतन, राइबोसोम गतिशीलता स्वाभाविक रूप से जल्दी से चरणबद्ध रूप से डी-चरणबद्ध होती है। एकल अणु विधि प्रत्येक राइबोसोम का अलग से पता लगा सकती है और असंगत आबादी को अलग कर सकती है, जो बहु-घटक प्रणालियों के जटिल तंत्र को प्रकट करने के लिए आवश्यक है। हम राइबोसोमल प्रोटीन L27 और tRNAs के बीच राइबोसोम गतिशीलता की जांच करने के लिए निकॉन Ti2 उल्टे माइक्रोस्कोप पर आधारित एक smFRET विधि के विवरण की रिपोर्ट करते हैं । L27 अपनी अनूठी Cys ५३ स्थिति पर लेबल और एक राइबोसोम है कि L27 कमी इंजीनियर है में पुनर्गठन किया है । TRNA अपने कोहनी क्षेत्र में लेबल है । चूंकि ट्रानई विस्तार चक्र के दौरान राइबोसोम के अंदर विभिन्न स्थानों पर जाती है, जैसे कि पूर्व और बाद के स्थानांतरण, FRET क्षमता और गतिशीलता अंतर प्रदर्शित करते हैं, जिन्होंने कई उप-आबादी का सुझाव दिया है। ये उपआबादी कलाकारों की टुकड़ी के तरीकों से पता लगाने योग्य नहीं हैं। टीआईआरएफ आधारित एसएमएफईटी माइक्रोस्कोप एक मैनुअल या मोटराइज्ड उल्टे माइक्रोस्कोप पर बनाया गया है, जिसमें घर में बने लेजर रोशनी होती है । राइबोसोम नमूनों को अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा शुद्ध किया जाता है, जो घर में निर्मित बहु-चैनल नमूना सेल में लोड होता है और फिर एक इवांसेंट लेजर क्षेत्र के माध्यम से प्रकाशित होता है। प्रतिबिंब लेजर स्पॉट सही ध्यान का प्रतिक्रिया नियंत्रण प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। फ्लोरेसेंस सिग्नल एक मोटराइज्ड फिल्टर-बुर्ज से अलग होते हैं और दो डिजिटल सीएमओएस कैमरों द्वारा एकत्र किए जाते हैं। तीव्रता एनआईएस-तत्व सॉफ्टवेयर के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं ।

Introduction

राइबोसोम एक बड़े (50S) और एक छोटे (30S) सबयूनिट का ø 20 एनएम बड़ा राइबोन्यूक्लिकोप्रोटीन परिसर है। यह एमआरएनए टेम्पलेट के साथ लंबे पेप्टाइड्स को प्रक्रियात्मक रूप से और सहकारी रूप से इकट्ठा करता है। राइबोसोम 30S प्रोटीन संश्लेषण शुरू करने के लिएfMet-tRNA fMet और mRNA से बांधता है, और 50S तब 70 के दशक दीक्षा परिसर बनाने में शामिल होता है। टीआरएनए ए-साइट (अमीनोएसिल-टीआरएनए बाइंडिंग साइट) पर राइबोसोम में अमीनो एसिड लाते हैं, जबकि लम्बी पेप्टिडिल श्रृंखला पी-साइट (पेप्टिडिल-टीआरएनए बाध्यकारी साइट) पर आयोजित की जाती है। पूर्व-स्थानांतरण परिसर में, पेप्टिडाइल चेन को एक अमीनो एसिड के साथ ए-साइट पर टीआरएनए में स्थानांतरित कर दिया जाता है। इस बीच, पी साइट tRNA deacylated है । फिर, ए-, पी-ट्रान्सए पोस्ट-ट्रांसलोकेशन कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए पी-, ई-साइट्स पर जाते हैं, जिसमें ई-साइट ट्रानओन एग्जिट साइट का प्रतिनिधित्व करता है । इस राज्य में, पेप्टिडिल-ट्रान वापस पी-साइट पर जाता है। विस्तार चक्र पूर्व और बाद के अनुरूपता के बीच जारी है, जबकि राइबोसोम एमआरएनए पर ट्रांसलॉकेट करता है, एक समय में एक कोडन1। राइबोसोम इस प्रक्रिया को कुशल और सटीक बनाने के लिए विभिन्न कार्यात्मक स्थलों का अत्यधिक समन्वय है, जैसे इंटर-सब-सबयूनिट रैचेटिंग2,ट्रान्स हाइब्रिडाइजेशन में उतार-चढ़ाव3,जीटीपीई एक्टिवेशन4,एल1 डंठल खोलने-समापन5,आदि। नतीजतन, राइबोसोम जल्दी से डी-फेज करते हैं क्योंकि हर अणु अपनी गति से चलता है। पारंपरिक तरीके केवल स्पष्ट औसत मापदंडों को कम कर सकते हैं, लेकिन कम आबादी वाली या अल्पकालिक प्रजातियों को औसत प्रभाव6में नकाबपोश किया जाएगा। एकल अणु विधि व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक राइबोसोम का पता लगाकर इस सीमा को तोड़ सकती है, फिर सांख्यिकीय पुनर्निर्माण7के माध्यम से विभिन्न प्रजातियों की पहचान कर सकती है। राइबोसोम गतिशीलता की जांच के लिए विभिन्न लेबलिंग साइटों को लागू किया गया है, जैसे कि ट्रान-ट्रान8,ईएफ-जी-एल119,एल1-ट्रान10आदि के बीच बातचीत। इसके अलावा, बड़ी और छोटी उपइकाओं को लेबल करके, क्रमशः, इंटर-सब-सबयूनिट रैचेटेड काइनेटिक्स और कारकों के साथ समन्वय11,12मनाया जाता है। इस बीच, smFRET विधि अन्य केंद्रीय जैविक प्रक्रियाओं में व्यापक अनुप्रयोगों है, और बहु रंग FRET तरीकों13उभर रहे हैं ।

पहले एक उपन्यास राइबोसोम एफर्ट जोड़ी14,15विकसित की गई थी । रिकॉम्बिनेंट राइबोसोमल प्रोटीन एल27 को व्यक्त किया गया है, शुद्ध किया गया है, और लेबल किया गया है, और राइबोसोम में वापस शामिल किया गया है। इस प्रोटीन ने एक करीबी दूरी पर टीआरएनए के साथ बातचीत की और स्थानांतरण के बाद परिसर में पी-साइट टीआरएनए को स्थिर करने में मदद की। जब ट्रान ए-से पी-साइट पर चले जाते हैं, तो इस प्रोटीन और ट्रान के बीच की दूरी को छोटा कर दिया जाता है, जिसे smFRET सिग्नल द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है। सांख्यिकीय विधियों और म्यूटेनेसिस का उपयोग करके कई राइबोसोम उप-आबादी की पहचान की गई है, और पूर्व में इन आबादी के सहज आदान-प्रदान के बाद नहीं, लेकिन बाद के स्थानांतरण परिसर से पता चलता है कि राइबोसोम एमआरएनए पर जाने से पहले अधिक लचीला है, और16, 17,18को डिकोडिंग केदौरानअधिक कठोर है। ये विविधताएं राइबोसोम फ़ंक्शन के लिए आवश्यक हैं। यहां, प्रोटोकॉल राइबोसोम/tRNA-लेबलिंग, राइबोसोम में उनके निगमन, smFRET नमूना तैयारी, और डेटा अधिग्रहण/विश्लेषण19के विवरण का वर्णन करता है ।

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Protocol

1. FRET का पता लगाने के लिए लेबल राइबोसोम और tRNA की तैयारी

  1. मानक प्रोटोकॉल 20,21 के अनुसार ई कोलाई स्ट्रेन IW312 सेL27के बिना राइबोसोम को अलग करें। ई. कोलाई तनाव MRE600 से नियमित राइबोसोम निकालें।
  2. सी-टर्मिनल अपने टैग के साथ एल27 के आरपीएमए जीन को पीईटी-21b (+) प्लाज्मिड में क्लोन करें, जिसे BL21 (DE3) pLysS कोशिकाओं15में बदल और व्यक्त किया जाता है। प्रोटीन को प्रीपैक्ड सेफारोज कॉलम के माध्यम से शुद्ध करें।
  3. L27 की लेबलिंग
    1. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर टीसीईपी (ट्रिस-2-कार्बोक्सीथिल-फॉस्फिन) के 2-10 गुना अतिरिक्त के साथ 100 माइक्रोन में शुद्ध L27 के 20-100 माइक्रोन को इनक्यूबेट करें। बफर ने नैप-5 कॉलम का उपयोग करके समाधान को पीबीएस बफर (10 एमएमएनए 2एचपीओ4,1.8 एमएम केएच2पीओ4,2.7 mM KCl; 0.137 M NaCl में एक्सचेंज किया। समाधान में DMSO में 10 गुना अतिरिक्त Cy5-malimide मोनो प्रतिक्रियाशील डाई जोड़ें और 2 घंटे के लिए अंधेरे में आरटी पर इनक्यूबेट ।
    2. अतिरिक्त डाई को हटाने के लिए झपकी-5 कॉलम पर ऊपर उल्लिखित लेबल प्रोटीन समाधान (500 माइक्रोल) लोड करें। सुनिश्चित करें कि प्रोटीन पहले रंग बैंड में elutes, दूसरे बैंड में मुफ्त डाई elute के बाद, क्रमशः । टैम10 बफर (20 एमएम ट्राइस-एचसीएल(पीएच 7.5), 10 एमएम एमजी (ओएसी)2, 30एमएम एनएच4सीएल, 70 एमएम केसीएल, 0.5 एमएम ईडीटीए, और 7 एमएम बीएमई (2-मर्केटोएन्थेन) के 1 एमएल में एल्युट किए गए प्रोटीन को कलेक्ट करें।
  4. L27 के साथ राइबोसोम का पुनर्गठन करें। लेबल वाले एल27 प्रोटीन को टैम10 बफर में आईडब्ल्यू312 राइबोसोम की बराबर मात्रा के साथ मिलाएं और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। ट्यूब के तल पर एक नीले रंग का गोली बनाने के लिए राइबोसोम बनाने के लिए राइबोसोम की अनुमति देने के लिए सुक्रोज कुशन अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन (100,000 x ग्राम,रातोंरात) द्वारा मुफ्त प्रोटीन निकालें।
  5. पहले प्रकाशित रिपोर्ट22के अनुसार TRNAपीएचई लेबल । सबसे पहले, टीआरएनए (1 मिलील पानी में10 ए 260) को 1 घंटे के लिए 0 डिग्री सेल्सियस पर एनएबीएच4 (100 mm स्टॉक, ड्रॉपवाइज जोड़ते हुए) के 100 μL के साथ इनक्यूबेट करें। 3 एम केएसी (पीएच5.0) और इथेनॉल की 2.5x मात्रा की 1/10 मात्रा जोड़कर तीन बार इथेनॉल वर्षा के माध्यम से एनएएनएबी 4 से ट्रान्स को मुक्त करें। 0.1 एम सोडियम फोरमेट (पीएच 3.7) के न्यूनतम मात्रा (~ 20 माइक्रोन) में Cy3-NHS डाई समाधान (1 मिलीग्राम में 1 मिलीग्राम DMSO) के 1 माइक्रोन के साथ कम tRNA को इनक्यूबेट करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के 2 घंटे के बाद, एक छोटे से G25 Sephadex कॉलम के माध्यम से unreacted डाई से tRNA अलग है, और फिर दो बार इथेनॉल वर्षा के माध्यम से मुक्त डाई को हटा दें ।

2. राइबोसोम कॉम्प्लेक्स की तैयारी

  1. मानकविधियोंका उपयोग करके IF1, IF2, IF3, EF-G, EF-Tu, EF-Ts, और tRNA संश्लेषण के अपने टैग किए गए प्रोटीन को व्यक्त और शुद्ध करें।
  2. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर टैम10 बफर में निम्नलिखित सामग्री जोड़कर दीक्षा मिश्रण तैयार करें: लेबल वाले राइबोसोम का 1 माइक्रोन; 1.5 μM IF1, IF2, और IF3 के प्रत्येक; 2 माइक्रोनम बायोटिनेलेटेड म् आरएनए (पहले दो अमीनो एसिड के लिए एमएफ कोडिंग); 4 μM का आरोप लगाया fMet-tRNAfMet; और 1 एमएमएल जीटीपी।
  3. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर टैम10 बफर में निम्नलिखित सामग्री को मिलाकर ईएफ-Tu_G मिश्रण तैयार करें: 4 माइक्रोन ईएफ-टू, 0.4 माइक्रोन ईएफ-टीएस, 2 माइक्रोएम ईएफ-जी, 4 एमएम जीटीपी, 4 एम एम पीपीएल, और पाइरुवेट किनेज़ का 0.02 मिलीग्राम/
  4. ईएफ-Tu_NoG मिश्रण को ईएफ-जी के बिना चरण 2.3 के समान तैयार करें।
  5. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नाभिक मुक्त पानी में निम्नलिखित अवयवों को मिलाकर पीएचई मिश्रण तैयार करें: 100 mM Tris (पीएच 7.5), 20 mM MgAc2, 1 एमएमएम ईडीटीए, 4 एमएमएम एटीपी, 7 एमएम बीएमई, 2 एमएम फेनिलाइन-विशिष्ट संश्लेषण, लेबल वाले टीआरएनएपीएचईके 2 A260/mL, और 50 माइक्रोनएम फेनिलैनिन।
  6. पूर्व-स्थानांतरण परिसर (पूर्व) को 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर Tu_NoG 1:2:2 के अनुपात में 1:2:2 के अनुपात में मिलाकर तैयार करें। इनक्यूबेशन के बाद, 1.1 एम सुक्रोज कुशन अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा 100,000 x ग्रामपर रात भर पूर्व को शुद्ध करें।
  7. 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर, 1:2:2 के अनुपात में दीक्षा, ईएफ-Tu_WG और पीएचई को मिलाकर स्थानांतरण के बाद परिसर (पोस्ट) तैयार करें। इनक्यूबेशन के बाद, 1.1 एम सुक्रोज कुशन अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा पोस्ट को 100,000 x ग्रामपर रात भर शुद्ध करें।

3. सैंपल स्लाइड की तैयारी

  1. माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड (75 मिमी x 25 मिमी) को साफ करें जिसमें छह जोड़े छेद (व्यास में 1 मिमी) होते हैं। प्रत्येक जोड़ी नमूना कक्ष का एक इनलेट-आउटलेट बनाती है। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक इनलेट-आउटलेट छेद के बीच की दूरी 13 मिमी है और दो चैनलों के बीच केंद्र-से-केंद्र की दूरी 6 मिमी है। एक गिलास क्रूसिबल में छह स्लाइड रखें।
  2. एसीटोन के साथ क्रूसिबल भरें और उन्हें 5 मिनट के लिए सोनीकेट करें। एसीटोन को डिसेंट करें और स्लाइड्स को अल्ट्रापुरे पानी से तीन बार खंगालें। क्रूसिबल को फिर से पानी और 10 एम कोह के 1 एमएल से भरें। 20 मिनट के लिए सोनिकेट ।
  3. स्लाइड्स में तीन बार अल्ट्रापुरे पानी से कुल्ला। इथेनॉल के साथ फिर से क्रूसिबल भरें और 5 मिनट के लिए सोनिकेट करें। सॉल्वेंट को पूरी तरह से डिकेंट करें। स्लाइड्स में देखिए धूम हुड में सूखी।
  4. माइक्रोस्कोप ग्लास कवरस्लिप (#1.5 मोटाई, 24 x 40 मिमी) को साफ करें। चरण 3.1-3.3 में वर्णित सफाई चरणों को करें।
  5. 3 घंटे के लिए 300 डिग्री सेल्सियस पर साफ स्लाइड और कवरलिप बेक करें। इन्हें ठंडा करने के लिए रात भर भट्ठी में रखें।
  6. अमीनोसिलेन के साथ कवरस्लिप को कोट करें। क्रूसिबल युक्त कवर्लिप्स में, मेथनॉल मिश्रण (मेथनॉल के 100 एमएल, 5 एमएल पानी, 0.5 एमएल एचएएसी और 1 एमएल अमीनोसिलेन) में डालें। 10 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में क्रूसिबल गर्म करें, इसे 10 मिनट के लिए सोनिकेट करें, और फिर पानी के स्नान में क्रूसिबल को एक और 10 मिनट के लिए गर्म करें। मेथनॉल मिश्रण को डिकेंट करें, साफ पानी के तीन क्रूसिबल में कवरस्लिप को अच्छी तरह से कुल्ला करें। एक सुई के माध्यम से एक सूखी नाइट्रोजन धारा के साथ सतहों शुद्ध।
  7. एक लैमिनार क्लीन हुड में बायोटिन-खूंटी के साथ कवरस्लिप को कोट करें।
    1. खूंटी को घोल बनाने के लिए 100 एमएम एनएएचसीओ 3 सॉल्यूशन के 200 माइक्रोन में 98 मिलीग्राम खूंटी और2-3 मिलीग्राम बायोटिन-खूंटी का इस्तेमाल करें।
    2. एक सतह पर एक कवरस्लिप फ्लैट बिछाएं। ध्यान से शीर्ष किनारे पर खूंटी समाधान के 60 μL ड्रॉप। फिर, इसके ऊपर एक और कवरलिप बिछाएं, जिससे केशिका प्रभाव दो कवरस्लिप के बीच समाधान फैला। सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले नहीं बनते हैं।
    3. कवर्लिप्स के दो और जोड़े के लिए चरण 3.7.2 दोहराएं। बायोटिन के साथ कवरस्लिप के छह टुकड़े कोट करें। यदि अधिक कवरस्लिप की आवश्यकता है, तो अधिक खूंटी समाधान बनाने के लिए तदनुसार खूंटी और बायोटिन खूंटी की मात्रा को समायोजित करें।
    4. इन कवरस्लिप को पानी से भरे खाली टिप-बॉक्स में स्टोर करें और अंधेरे में 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. 3 घंटे के बाद, कवर्लिप्स को अलग करें, लगातार तीन क्रूसिबल में पानी से कुल्ला करें और सूखी नाइट्रोजन धारा के साथ शुद्ध करें। एक सिरेमिक रैक पर लेपित कवर्लिप्स रखें। सतह को कोटिंग से चिह्नित करें।
  8. 19नमूना कक्षों को इकट्ठा करें ।
    1. कांच स्लाइड पर छेद के माध्यम से तेज पिपेट सुझाव खींचो जब तक वे तंग फिट । तेज सिरों को तब तक कुरेदें जब तक कि यह कांच की सतह पर पूरी तरह से सपाट न हो जाए। नमूना लोड िंग के लिए लगभग 5 मिमी होने के लिए टिप के दूसरे छोर को काटें।
    2. उस पर चैनल पैटर्न (25 x 40 मिमी) के साथ एक डबल-सामना टेप काटें।
    3. फ्लैट की ओर ग्लास स्लाइड पर डबल-मुखी टेप चिपकाएं।
    4. लेपित कवरलिप को डबल-मुखी टेप पर चिपकाएं। इस पर प्रेस करने के लिए नमूना कक्ष की एक तंग सील बनाने के लिए। सुनिश्चित करें कि लेपित पक्ष अंदर की ओर का सामना कर रहा है।

4. एकल अणु FRET इमेजिंग

  1. कंप्यूटर चालू करें।
  2. माइक्रोस्कोप स्विच चालू करें।
  3. लेजर कंट्रोल इंटरफेस शुरू करें और लेजर चालू करें। लेजर को गर्म करने के लिए लेजर कंट्रोल बॉक्स पर सक्षम बटन पुश करें।
  4. कैमरों को चालू करें।
  5. माइक्रोस्कोप से जुड़े सॉफ्टवेयर प्रोग्राम शुरू करें। ऊपरी शटर पर क्लिक करें और दीपक परक्लिक करें ।
  6. टैम10_WT बफर को टैम 10 बफर के 1 एमएल में 5% ट्वीन-20 के10 माइक्रोन जोड़कर तैयार करें।
  7. एक छोटी माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 3 मिलीग्राम ग्लूकोज ऑक्सीडेस का वजन करके डिऑक्सी सॉल्यूशन तैयार करें। कैटालेज़ के 45 माइक्रोन जोड़ें। भंवर धीरे ठोस भंग करने के लिए। 1 मिनट के लिए एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज में 20,000 x ग्राम पर स्पिन करें। सुपरनिटेस्ट ले लो।
  8. पानी में 30 फीसद ग्लूकोज घोल और डीएमएसओ में 200 एमएम ट्रोलॉक्स सॉल्यूशन तैयार करें।
  9. नाभिक मुक्त पानी में स्ट्रेप्टाविडिन समाधान का 0.5 मिलीग्राम/एमएल तैयार करें।
  10. TIRF उद्देश्य के लिए इमेजिंग तेल की एक बूंद जोड़ें।
  11. उद्देश्य पर नमूना कक्षों रखो।
  12. स्ट्रेप्टाविडिन समाधान के 10 माइक्रोन के साथ चैंबर भरें। 1 मिनट के लिए रुको।
  13. TAM10_WT बफर के 30 एमएल के साथ चैंबर धोएं और एक मुड़ा हुआ फिल्टर पेपर के साथ रन-थ्री समाधान एकत्र करें। 1 मिनट के लिए रुको।
  14. टैम10 _WT बफर के साथ 10-50 एनएम एकाग्रता के लिए राइबोसोम कॉम्प्लेक्स (पूर्व या पोस्ट) को पतला करें।
  15. चैनल में राइबोसोम नमूने के 20 माइक्रोन लोड करें। 2 मिनट के लिए रुको।
  16. इमेजिंग बफर (टैम 10 बफर के50 माइक्रोन प्लस 0.5 माइक्रोन प्रत्येक डिऑक्सी, ग्लूकोज और ट्रॉलॉक्स समाधान) बनाएं। बफर को अच्छी तरह मिला लें।
  17. इमेजिंग बफर के 30 माइक्रोल के साथ चैंबर फ्लश।
  18. 100 एमएस/फ्रेम, 16 बिट्स, 4 x 4 बिनिंग प्राप्त करने के लिए कैमरा सेट करें।
  19. ऊपरी शटर पर क्लिक करें और दीपक बंद।
  20. कैमरा अधिग्रहण शुरू करें। दो व्यक्तिगत कैमरों और ओवरले का प्रतिनिधित्व करने वाली तीन खिड़कियों में छवियों को फैलाएं।
  21. ऑटो फोकसपर क्लिक करें । सबसे अच्छा ध्यान खोजने के लिए ठीक धुन ।
  22. एक विधि पर क्लिक करें। फ़ील्ड पॉइंट्स, फाइल स्टोरेज और लूप नंबर सेट करें।
  23. रनपर क्लिक करें ।
    नोट: एक नई खिड़की वास्तविक समय इमेजिंग के साथ प्रकट होता है । समय श्रृंखला और देखने के क्षेत्र श्रृंखला की प्रगति खिड़की के शीर्ष पर दिखाया गया है ।
  24. एक बार छवि अधिग्रहण पूरा हो जाने के बाद, पॉपअप विंडो बंद करें।
  25. एनडी फाइल (अधिग्रहीत फाइल) खोलें।
  26. आरओआई/सिंपल आरओआई एडिटरपर क्लिक करें । विकल्प सर्कलचुनें ।
  27. छवि पर आरओआई का चयन करें। पूरा होने पर फिनिश पर क्लिक करें।
  28. डेटा को प्लॉट के रूप में या स्प्रेडशीट के रूप में दिखाने के लिए मापन/समय माप पर क्लिक करें ।
  29. निर्यात टैब खोलें। निर्यात मापदंड निर्धारित करें।
  30. तीव्रता को बचाने के लिए निर्यात पर क्लिक करें।

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Representative Results

SMFRET में टीआरएनए यातायात की मध्य स्थिति में राइबोसोम लेबल था, जो टीआरएनए ट्रांसलोकेशन को ए-टू-से पी-साइट(चित्रा 1)15में अलग करता था। L27 लेबलिंग अवशेषों से ए-या पी-साइट tRNA की दूरी क्रमशः 52 या 61 Å है, जो 0.47 और 0.65 की FRET दक्षता के अनुरूप है। छवि संग्रह के बाद, दाता और स्वीकारकर्ता चैनलों से फ्लोरेसेंस तीव्रता को वापस लाया गया और समय चूक(चित्र 1)के रूप में प्लॉट किया गया। FRET दक्षता की गणना उस सूत्र द्वारा की गई थी जो मैंस्वीकारकर्ताहूं /(मैंस्वीकारकर्ता+आईडोनर)। एक घर का बना कार्यक्रम दाता/स्वीकारकर्ता के एकल कदम विरंजन का पता लगाया और शोर से FRET की गणना से बचने के लिए ब्लीचिंग अंक से पहले डेटा फिट । दाता ब्लीचिंग के बाद, दोनों निशान बेसलाइन से संपर्क किया क्योंकि कोई उत्तेजन सीधे स्वीकारकर्ता(चित्रा 2A)पर हो सकता है । स्वीकारकर्ता ब्लीचिंग के बाद, दाता तीव्रता बढ़ गई क्योंकि कम प्रतिक्रिया रास्ते उत्तेजन ऊर्जा(आंकड़े 2B, सी)को नष्ट करते हैं।

यह पाया गया कि व्यक्तिगत राइबोसोम अलग-अलग उतार-चढ़ाव प्रदर्शित करते हैं, जैसे कि चित्र 2में दिखाए गए उदाहरणों में। ये उतार-चढ़ाव ट्रान्सॅ की लड़खड़ाती गति के कारण होते हैं, जो एल2717, 18में दूरी के उतार-चढ़ाव का कारणबनताहै। चित्र 2में, बिंदीदार रेखाएं मूल डेटा हैं, और ठोस लाइनें कार्यक्रम से फिट डेटा हैं। लगे हुए निशान कच्चे डाटा रीडिंग को नहीं बदलते बल्कि ब्लीचिंग के बाद समय-चूक के निशान को काटते हैं। नीले निशान गणना FRET क्षमता हैं। आरटी में 5 मिनट इनक्यूबेशन के बाद सटीक एक ही राइबोसोम्स पर नज़र रखने से, यह पाया गया कि एक प्रकार की गतिशीलता दूसरे23पर स्विच कर सकती है। क्योंकि आसपास के राइबोसोम द्वारा तय ट्रानई गति पर ये संकेत रिपोर्ट करते हैं, इसी तरह की FRET क्षमता को विभिन्न राइबोसोम उपजनसंख्या में बांटा गया था।

चित्रा 3 पूर्व परिसर में बहुत विविध उपआबादी से पता चलता है। उतार-चढ़ाव वाली प्रजातियों में लगभग 70% (640/951) और 30% (311/951) गैर-उतार-चढ़ाव वाली प्रजातियां हैं। इन दोनों श्रेणियों को आगे महीन उपआबादी में बांटा जा सकता है । दूसरी ओर, चित्रा 4 विपरीत गतिशीलता वितरण दिखाता है। पोस्ट में, 65% उप-आबादी गैर-उतार-चढ़ाव वाली होती है, और उनमें से अधिकांश ने उच्च FRET दक्षता का प्रदर्शन किया। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि राइबोसोम पोस्ट राज्य की तुलना में पूर्व राज्य में अधिक लचीला है, जो एक क्रायो-ईएम अध्ययन की पुष्टि करता है जो निष्कर्ष निकाला है कि पी-साइट पर पेप्टिडिल श्रृंखला पोस्ट राज्य में राइबोसोम गतिशीलता को लॉक करती है। हालांकि, पूर्व राज्य में, पेप्टिडिल श्रृंखला को ए-साइट पर स्थानांतरित कर दिया जाता है, राइबोसोम को अनलॉक करता है और5को बढ़ावा देता है। परिणामों ने अधिक शारीरिक परिस्थितियों में संरचना अध्ययन निष्कर्ष का समर्थन किया। अनलॉक राज्य 30S और 50S के बीच शाफ़्टिंग गति के साथ सहसंबद्ध है, और बंद राज्य संयुक्त राष्ट्र-शाफ़्ट अनुरूपता के साथ सहसंबद्ध है।

उप-जनसंख्या छंटाई विधि एंटीबायोटिक वायोमाइसिन द्वारा अवरोध पर राइबोसोम संरचना का पता चलता है,जैसा कि चित्र 514में दिखाया गया है। समग्र FRET दक्षता हिस्टोग्राम 0.47 पर एक प्रमुख चोटी दिखाता है, क्लासिक राज्य, छंटाई के बिना। इस राज्य में, राइबोसोम बंद और अन-शाफ़्ट किया जाता है। हालांकि, उपआबादी छंटाई से पता चला है कि 60% आबादी अनलॉक प्री कॉम्प्लेक्स के रूप में उतार-चढ़ाव कर रही है। इसलिए, वायोमाइसिन ने राइबोसोम को शाफ़्टेड अवस्था में फंसा दिया है। इस अध्ययन के परिणामों ने प्रकाशन (2010) के समय एक्स-रे संरचना परिणाम का खंडन किया लेकिन हाल ही में एक अन्य संरचना अध्ययन (2020) द्वारा समर्थित थे।

Figure 1
चित्रा 1:राइबोसोम और tRNA पर Cy3/Cy5 की लेबलिंग स्थिति । एल27 के लेबलिंग अवशेषों के बीच की दूरी ए-और पी-साइट ट्रानई को दिखाया गया है (लाल और नीले सितारे क्रमशः Cy5 और Cy3 के अनुमानित लेबलिंग स्थानों को दिखाते हैं)। CY3/Cy5 FRET जोड़ी से फ्लोरेसेंस तीव्रता का एक प्रतिनिधि समय-चूक ट्रेस दिखाया गया है । एक कार्यक्रम दाता/स्वीकारकर्ता निशान पर ब्लीचिंग अंक का पता लगाता है और उस बिंदु से पहले ट्रेस truncates । इस आंकड़े को Altuntop, एम एट अल15से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:ठेठ राइबोसोम निशान उनकी विभिन्न गतिशीलता द्वारा वर्गीकृत किया गया। (क)एक गैर-उतार-चढ़ाव वाले राइबोसोम ट्रेस। (ख)एक उतार-चढ़ाव राइबोसोम ट्रेस जो केवल नमूने FRET मूल्यों से कम ०.६ । (ग)एक उतार-चढ़ाव राइबोसोम ट्रेस जो नमूनों कावी मूल्य 0.6 से अधिक है। किंवदंतियों को साजिश में दिखाया गया है। दाता और स्वीकारकर्ता की फ्लोरेसेंस तीव्रता क्रमशः हरे और मजेंटा हैं। FRET मूल्यों की गणना के रूप में मैंस्वीकारकर्ता/(मैंस्वीकारकर्ता+ मैंदाता)और नीले रंग में अलग से साजिश रची । मूल डेटा बिंदीदार लाइनों में प्रदर्शित होते हैं, और ब्लीचिंग पॉइंट्स को ठोस लाइनों में प्रदर्शित करने से पहले डेटा काट दिया जाता है। इस आंकड़े को Altuntop, एम एट अल15से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:पूर्व-परिसर के एफिसेंट दक्षता हिस्टोग्राम। शीर्ष स्तरीय भूखंड कुल राइबोसोम्स के FRET हिस्टोग्राम दिखाते हैं। दूसरे स्तर के भूखंडों में उतार-चढ़ाव (एफ) और गैर-उतार-चढ़ाव (एनएफ) समूहों में अलग किए गए राइबोसोम्स के FRET हिस्टोग्राम दिखाई देते हैं। तीसरे स्तर के भूखंड राइबोसोम्स के FRET हिस्टोग्राम को आगे उतार-चढ़ाव के समूहों में अलग करते हैं जो 0.6 के FRET मूल्य से ऊपर या नीचे थे। इसी तरह के मापदंड एनएफ राइबोसोम्स पर लागू किए गए थे ताकि उन्हें 0.6 (एनएफ-कम, एनएफ-उच्च) के नीचे या उससे ऊपर स्थिर FRET राज्यों में अलग किया जा सके। चौथे स्तर के भूखंड प्रत्येक उपआबादी के लिए प्रतिनिधि निशान प्रदर्शित करते हैं। इस आंकड़े को Altuntop, एम एट अल15से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:पोस्ट-कॉम्प्लेक्स के एफिल्ट दक्षता हिस्टोग्राम। व्यवस्था और समूह निर्धारण चित्र 3के समान हैं । चित्रा 3के विपरीत, एनएफ-उच्च आबादी बहुमत है। इस आंकड़े को Altuntop, एम एट अल15से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:100 माइक्रोन viomycin की उपस्थिति में पूर्व परिसर के हिस्टोग्राम। व्यवस्था और समूह निर्धारण चित्र 3के समान हैं । इस आंकड़े को Ly, C. T. et al.14से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

SMFRET पृष्ठभूमि संकेतों के प्रति संवेदनशील है। सबसे पहले, 0.05% ट्वीन के साथ नमूना कक्ष को कोट करना आवश्यक है और फिर सतह पर राइबोसोम के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को अवरुद्ध करने के लिए राइबोसोम समाधान के साथ समवर्ती रूप से जोड़ा जाना आवश्यक है। स्वीकारकर्ता Cy5 उत्सर्जन से फ्लोरेसेंस देखने के लिए, ऑक्सीजन मेहतर कॉकटेल (डिऑक्सी, ग्लूकोज, और ट्रॉलॉक्स समाधान) आवश्यक है। इस समाधान के बिना, उपयोगी जानकारी प्राप्त करने के लिए स्वीकारकर्ता चैनल में ब्लीचिंग बहुत तेज होती है। राइबोसोम प्रयोगों के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम, विशेष रूप से, कांच की सतह पर खूंटी कोटिंग है। राइबोसोम गतिविधि सतह के वातावरण के प्रति संवेदनशील है; इसलिए, प्रतिकूल सतह प्रभावों को ढालने के लिए लंबे ब्रशिंग पॉलिमर आवश्यक हैं।

अगर सैंपल स्टेज फोकस से बहुत दूर है तो ऑटो फोकसिंग सिस्टम काम नहीं करेगा। यदि ऐसा होता है, तो ऑटो-फोकस बंद करें और परावर्तित लेजर स्पॉट को देखते हुए वस्तुनिष्ठ स्थिति को मैन्युअल रूप से समायोजित करें। यह एक घर का एक लाभ है कुल आंतरिक प्रतिबिंब रोशनी का निर्माण क्योंकि लेजर स्पॉट दिखाई दे रहा है । जब उद्देश्य ध्यान के पास है, घटना और परिलक्षित लेजर धब्बे साथ-साथ होना चाहिए, और वस्तुनिष्ठ स्थिति के समायोजन के साथ प्रतिबिंबित स्थान चलता है । जब ये दोनों स्पॉट करीब आएंगे तो ऑटो फोकस फिर से काम करेगा।

SMFRET की एक सीमा बहुत कम एकाग्रता रेंज है। केवल 50 एनएम तक फ्लोरोसेंटली लेबल वाले सब्सट्रेट्स को पृष्ठभूमि शोर को बाधित किए बिना लोड किया जा सकता है। यद्यपि सतह से बंधे नमूनों को एक ही अणु पर लंबे समय तक अधिग्रहण की आवश्यकता हो सकती है, समय-संकल्प एमएस रेंज तक सीमित है, जबकि प्रसार आधारित कॉन्फोकल एसएमएफईटी μs रेंज24की गतिशीलता तक पहुंच सकता है। FRET विधि की एक और सीमा FRET दक्षता से दूरी की सटीक गणना है। अलग-अलग डाई लिंकर्स और वातावरण के कारण, फोर्स्टर की दूरी लैब से प्रयोगशाला तक भिन्न होती है। इसलिए, पूर्ण दूरी की तुलना समस्याग्रस्त हो सकती है25. यद्यपि एफआरटी दक्षता परिवर्तन से स्थानांतरण तंत्र का पता चलता है, लेकिन एमआरएनए26, 27पर राइबोसोम के सटीक कवरेज को मापने के लिए एक अधिक प्रत्यक्ष रणनीति विकसित की गई थी।

फिर भी, एक प्रयोगात्मक सेटिंग के भीतर असंगत आबादी को अलग करने के लिए सापेक्ष संदर्भों के रूप में FRET मूल्यों का उपयोग करना एक शक्तिशाली तरीका है जो एक समय में तंत्र और गतिशीलता एक अणु को प्रकट करता है, जो पारंपरिक तरीकों के साथ सुलभ नहीं है। इसके अलावा, बहु-रंग FRET और ऑप्टिकल ट्रैप के साथ FRET का संयोजन भविष्य28में अधिक आर्केस्ट्रा राइबोसोम गतिशीलता प्रकट करेगा। ये विकास अभूतपूर्व संवेदनशीलता (Å दूरी का विस्थापन) और नए मापदंडों (जैसे पिको-न्यूटन परिमाण की ताकतों) प्रदान कर रहे हैं जो मौजूदा तरीकों के साथ प्राप्त नहीं किए जा सकते हैं28।

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Disclosures

वाई वांग ने हितों का कोई टकराव नहीं होने की घोषणा की ।

Acknowledgments

यह काम अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (R01GM1111452) और वेल्च फाउंडेशन (ई-1721) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aminosilane Laysanbio MPEG-SIL-5000
Biotin-PEG Laysanbio Biotin-PEG-SVA-5000
BL21(DE3)pLysS cells Novagen 71403
Catalase millipore sigma C3515
CS150FNX Micro Ultracentrifuge nuaire
Cy3/C5-maleimide ApexBio A8138/A8140
ECLIPSE Ti2 inverted microscope Nikon
EdgeGARD Laminar Flow Hood Baker
Glucose oxidase millipore sigma G2133
Histrap HP column (Prepacked sepharose column) Cytiva 17524701
Microscope cover slip VWR 48393-230
Microscope glass slides VWR 470235-792
ORCA-Flash4.0 V3 camera Hamamatsu
PEG (5,000) Laysanbio MPEG-SVA-5000
pET-21b (+) plasmid Novagen 69741
Sonicator VWR CPX-952-518R
TCEP Apexbio B6055
Trolox millipore sigma 238813

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References

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बायोकेमिस्ट्री अंक 173
रिबोसोम प्रोटीन संश्लेषण का एकल अणु फ्लोरेसेंस एनर्जी ट्रांसफर अध्ययन
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Wang, Y. Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis. J. Vis. Exp. (173), e62664, doi:10.3791/62664 (2021).

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