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Immunology and Infection

प्रवाह Cytometry द्वारा विश्लेषण के लिए गर्भाशय जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं का अलगाव

Published: October 14, 2021 doi: 10.3791/62670
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,2, 1,2, 1, 1,2
1Department of Obstetrics and Gynaecology, National Institute for Health Research Cambridge Biomedical Research Centre, University of Cambridge School of Clinical Medicine, 2Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge
* These authors contributed equally

Summary

यह गर्भाशय लिम्फोइड कोशिकाओं को गर्भवती और गैर-गर्भवती चूहों दोनों से अलग करने की एक विधि है। इस विधि का उपयोग कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों जैसे कि FACS phenotyping, सेल सॉर्टिंग, कार्यात्मक assays, RNA-seq, और proteomics के लिए किया जा सकता है। यहां प्रोटोकॉल दर्शाता है कि प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा समूह 1 गर्भाशय जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं को फेनोटाइप कैसे किया जाए।

Abstract

यहां वर्णित एक सरल विधि है और फेनोटाइप माउस समूह 1 गर्भाशय जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं (जी 1 यूआईएलसी) को प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा व्यक्तिगत गर्भवती गर्भाशय से अलग और फेनोटाइप किया गया है। प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि कई तुल्यकालिक बांधों को प्राप्त करने के लिए समय संभोग कैसे स्थापित किया जाए, गर्भवती गर्भाशय के यांत्रिक और एंजाइमेटिक पाचन, एकल-सेल निलंबन के दाग, और जी 1 यूआईएलसी को फेनोटाइप और भेदभाव करने के लिए एक एफएसीएस रणनीति। यद्यपि यह विधि अनिवार्य रूप से ऊतक के भीतर सेलुलर वितरण की स्थानिक जानकारी खो देती है, प्रोटोकॉल को यूआईएलसी विषमता, गर्भावस्था को प्रभावित करने वाले मातृ और भ्रूण कारकों, उनके जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल और उनके कार्यों को प्रभावित करने के लिए उनकी प्रतिक्रिया को निर्धारित करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है।

Introduction

यहां वर्णित व्यक्तिगत गर्भवती गर्भाशय से गर्भाशय जन्मजात लिम्फोसाइटों की उच्च उपज प्राप्त करने के लिए एक सरल विधि है। यह विधि प्रोटीन सतह अभिव्यक्ति और गर्भाशय जन्मजात लिम्फोसाइटों की कार्यक्षमता को संरक्षित करती है और यह FACS फेनोटाइपिंग, आरएनएसेक, प्रोटिओमिक्स या कार्यात्मक assays जैसे बाद के अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है। यहां, फोकस फ्लो साइटोमेट्री द्वारा समूह 1 यूआईएलसी के फेनोटाइपिंग पर है।

गर्भाशय तीन परतों से बना होता है: एंडोमेट्रियम, मायोमेट्रियम और पेरिमेट्रियम (चित्रा 1)। एंडोमेट्रियम म्यूकोसा है, जो गर्भाशय के लुमेन को अस्तर करता है। प्रोजेस्टेरोन, कॉर्पस ल्यूटियम द्वारा उत्पादित, एंडोमेट्रियम को डिसिडुआ में परिवर्तित करता है। मायोमेट्रियम चिकनी मांसपेशियों की दो परतों से बना होता है जो गर्भाशय की दीवार बनाते हैं। पेरिमेट्रियम सेरोसा है जो गर्भाशय को लपेटता है और इसे मेसोमेट्रियम नामक व्यापक स्नायुबंधन के माध्यम से पेरिटोनियम से जोड़ता है। गर्भाशय के एक क्रॉस-सेक्शन में, लुमेन के विपरीत भाग को मेसोमेट्रियल पक्ष कहा जाता है, जबकि लुमेन के करीब के हिस्से को एंटी-मेसोमेट्रियल साइड कहा जाता है। विभिन्न प्रकार के मातृ ल्यूकोसाइट्स एंडोमेट्रियम और डिसिडुआ को पॉप्युलेट करते हैं, जिसमें कई प्रकार की कोशिकाएं शामिल हैं, जहां जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं कोशिकाओं के विशाल बहुमत का प्रतिनिधित्व करती हैं। जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाएं (आईएलसी), मैक्रोफेज, डेंड्राइटिक कोशिकाएं (डीसी), साथ ही साथ सीडी 4 + और सीडी 8 + टी लिम्फोसाइट्स, नियामक टी कोशिकाएं (ट्रेग्स), और दुर्लभ बी कोशिकाएं, सभी गर्भावस्था के दौरान गर्भाशय के वातावरण के विनियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती हैं1,2। गर्भाशय में आईएलसी न केवल म्यूकोसा में पाए जाते हैं, बल्कि चूहों में मायोमेट्रियम में भी पाए जाते हैं। आईएलसी के सभी तीन समूहों सहित, गर्भाशय वास्तव में समूह 1 आईएलसी द्वारा सबसे घनी आबादी वाला अंग है। गर्भावस्था के दौरान गर्भाशय के ऊतकों के संरचनात्मक परिवर्तन के साथ, गर्भाशय ल्यूकोसाइट्स की संख्या और अनुपात भी बदल जाता है (समूह 1 यूआईएलसी सबसेट के प्रतिशत में भिन्नताओं के उदाहरण के लिए चित्रा 2 ए देखें)3,4।

जब चूहों को इस पेपर में संदर्भित किया जाता है, तो इनब्रीड प्रयोगशाला चूहों के C57BL / 6 तनाव का मतलब है। आउटब्रीड चूहों (उदाहरण के लिए, एनएमआरआई चूहों) का उपयोग अक्सर प्रजनन अनुसंधान में उनकी उच्च प्रजनन दर के कारण किया जाता है। हालांकि, लगातार परिणाम उत्पन्न करने के लिए इनब्रीड उपभेदों का उपयोग आवश्यक है, और इम्यूनोलॉजिस्ट की पसंदीदा आनुवंशिक पृष्ठभूमि C57BL / 6 है, जिसे B6 के रूप में भी जाना जाता है।

मध्य-गर्भ में बी 6 बांधों में गर्भाशय ल्यूकोसाइट्स का लगभग 30% जी 1 यूआईएलसी हैं, जिन्हें प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा व्यवहार्य CD45 + CD3-CD19-NK1.1 + NKp46 + कोशिकाओं (चित्रा 2B) के रूप में परिभाषित किया गया है: प्रो-एंजियोजेनिक ऊतक-निवासी एनके (TRNK), IFN-g पारंपरिक NK (cNK) का उत्पादन करता है, और uILC14,5। यूएनके कोशिकाओं का प्रतिशत मनुष्यों में भी अधिक है, जो पहली तिमाही में लगभग 70% तक पहुंच गया है। मानव और माउस यूएनके और यूआईएलसी 7, 8 के बीच अंतर की तुलना में अधिक समानताएं हैं। यद्यपि मतभेदों को ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है, लेकिन दो प्रजातियों पर उपलब्ध जानकारी को एकीकृत करना उपयोगी है। जब कोई मनुष्यों और प्रयोगशाला कृन्तकों में यूआईएलसी की जांच से प्राप्त जानकारी को जोड़ता है, तो यह स्पष्ट है कि एनके कोशिकाएं गर्भाशय के जीव विज्ञान के लिए आवश्यक होमोस्टेटिक परिवर्तनों में सहायता करती हैं, जिसमें धमनी अखंडता 9 और सर्पिल धमनी रीमॉडलिंग 10 के रखरखाव के साथ-साथ ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण 11,12 शामिल हैं। वे रोगजनकों के खिलाफ रक्षा में विशिष्ट भूमिका निभाते हैं13,14। चूहों और चूहों में, आरोपण स्थल के चारों ओर decidua भरने के अलावा, एनके कोशिकाएं एक क्षणिक संरचना में बांधों के मायोमेट्रियम की दो मांसपेशियों की परतों के बीच जमा होती हैं, जिसे गर्भावस्था के मेसोमेट्रियल लिम्फोइड एग्रीगेट (एमएलएपी) 15 (चित्रा 1 बी) के रूप में जाना जाता है, जिसे अतीत में मेट्रियल ग्रंथि के रूप में भी जाना जाता है, जिसके कार्य की खोज अभी तक नहीं की गई है।

यहां वर्णित है कि यांत्रिक विभेदन और एंजाइमेटिक पाचन के संयोजन का उपयोग करके गर्भवती चूहों के गर्भाशय से लिम्फोसाइट्स को अलग करने के लिए प्रयोगशाला में उपयोग की जाने वाली विधि का एक विस्तृत प्रोटोकॉल है। जैसा कि पूरे गर्भाशय का उपयोग विधि में किया जाता है, गर्भावस्था के दौरान गर्भाशय से अलग किए गए लिम्फोसाइट्स निर्णायक और मायोमेट्रल कोशिकाओं का मिश्रण हैं। गर्भाशय की दीवार और इसके एमएलएपी से डिसिडुआ का आगे विच्छेदन संभव है, और इसे 16 से पहले वर्णित किया गया है। यहां वर्णित विधि को प्रोटीन सतह अभिव्यक्ति, सेलुलर कार्यक्षमता और व्यवहार्यता को संरक्षित करते हुए गर्भाशय लिम्फोसाइट्स प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया था। परिणाम न्यूनतम अवशिष्ट सेलुलर मलबे के साथ एक एकल सेल निलंबन है और आमतौर पर गर्भवती गर्भाशय के लिए मध्य-गर्भावस्था (10.5 दिन) में 1-5 मिलियन कोशिकाओं से लेकर उपज होती है। इस विधि के अनुप्रयोगों में प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा फेनोटाइपिंग, बाद के ट्रांसक्रिप्टोमिक या प्रोटिओमिक अध्ययनों के लिए सेल सॉर्टिंग, इंट्रासेल्युलर साइटोकाइन उत्पादन, डीग्रेनुलेशन, ELISPOT या साइटोटॉक्सिक एसेस जैसे कार्यात्मक अध्ययन शामिल हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल समूह 1 आईएलसी की पहचान करने पर केंद्रित है, लेकिन अन्य सेल प्रकारों जैसे कि अन्य आईएलसी, टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, डीसी, या एफएसीएस विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी पैनल के मामूली संशोधनों के साथ मैक्रोफेज के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य ऊतकों से कोशिकाओं को अलग करने और पूल किए गए गैर-गर्भवती यूटेरी के लिए भी किया जा सकता है।

Protocol

इस पेपर में वर्णित सभी पशु प्रयोगों को यूके होम ऑफिस द्वारा जारी पीपी 2363781 के तहत पशु (वैज्ञानिक प्रक्रियाएं) अधिनियम 1986 के अनुसार आयोजित किया गया था। नीचे दिए गए प्रोटोकॉल में चूहों के पालन से शुरू होने वाले कई अनुभाग होते हैं और एफएसीएस विश्लेषण के लिए धुंधला होने के साथ परिष्करण होता है। चित्र 3 प्रोटोकॉल के मुख्य चरणों को दर्शाता है। प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सामग्री सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं।

1. जनरल चूहों पशुपालन, संभोग, और विच्छेदन

  1. ली-बूट प्रभाव को ट्रिगर करने के लिए 10-14 दिनों के लिए विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त (एसपीएफ) स्थितियों और समूह-स्थित (आमतौर पर पिंजरे के आकार और जानवरों के वजन के अनुसार 4-6 मादाएं) के तहत 7-14 सप्ताह की मादा चूहों को रखें, जिसके परिणामस्वरूप एस्ट्रस सिंक्रनाइज़ेशन 17 होता है।
  2. एसपीएफ स्थितियों में स्टड पुरुषों को रखें, एकल-रखा गया, और प्रत्येक संभोग (शुक्राणु पुनर्जनन के लिए समय) के बीच कम से कम 48 घंटे के लिए आराम किया। अनुभवी सिद्ध 3-4 महीने पुराने स्टड पुरुषों का उपयोग करना बेहतर है क्योंकि वे आमतौर पर युवाओं की तुलना में अधिक प्रदर्शन करते हैं।
  3. मादाओं के गर्भवती होने की संभावना को बढ़ाने के लिए, संभोग से 3 दिन पहले मादा पिंजरे में एक नर के पिंजरे से गंदे बिस्तर का परिचय दें। यह पुरुष मूत्र फेरोमोन के संपर्क में आने से Whitten effect18 को ट्रिगर करता है, और इसके परिणामस्वरूप सिंक्रनाइज़ एस्ट्रस के साथ-साथ संभोग के लिए बढ़ी हुई ग्रहणशीलता होती है।
  4. दिन 0 (डी 0) पर, दो महिलाओं के प्रति एक स्टड पुरुष का उपयोग करके संभोग के लिए चूहों की स्थापना करें; लगभग 20% -25% की प्लग दर पर विचार करें।
    नोट: संभोग संभवतः रात में होगा क्योंकि चूहे निशाचर जानवर हैं।
  5. संभोग (D0.5) के बाद सुबह में, एक योनि प्लग की उपस्थिति की जांच करें, जो संभोग का संकेतक है (चित्रा 4)। योनि प्लग पुरुष स्खलन का एक समुच्चय है और आमतौर पर संभोग के बाद 8-24 घंटे तक बना रहता है। सुबह जल्दी प्लग की जाँच करें.
  6. एक नए पिंजरे में प्लग मादाओं को समेकित करें और उन्हें चिह्नित करें। आराम करने के लिए पुरुषों को उनके पिंजरों में वापस कर दें।
  7. संभोग के बाद D9.5 या 10.5-पर, ऊतक संग्रह के लिए 1 mL बाँझ HBSS 1x (Mg2+ और Ca2+ के साथ) के साथ 5 mL ट्यूब तैयार करें और उन्हें बर्फ पर रखें।
  8. गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन द्वारा पशु इच्छामृत्यु के लिए आगे बढ़ें, मृत्यु की पुष्टि करने के लिए exsanguination के बाद।
  9. एक बाँझ वातावरण में काम करें यदि डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन को ऐसा करने की आवश्यकता है। इच्छामृत्यु के बाद सीधे, माउस शरीर को 70% इथेनॉल के साथ पोंछें और बाँझ उपकरणों के साथ एक लैमिनर फ्लक्स कैबिनेट के तहत विच्छेदन के लिए आगे बढ़ें।
  10. गर्भवती गर्भाशय को मेसोमेट्रियल वसा (चित्रा 5) से मुक्त विच्छेदित करें और पूरे गर्भाशय को एक तैयार और उचित रूप से लेबल किए गए 5 एमएल ट्यूब में रखें। ट्यूबों को बर्फ पर रखें।

2. यांत्रिक और गर्भाशय के एंजाइमेटिक पाचन

  1. एंजाइमेटिक पाचन समाधान तैयार करने के लिए, बाँझ HBSS 1x के प्रति गर्भाशय 3 mL को DNAse के 30 μg / mL और 0.1 Wünsch इकाई (WU)/ Liberase DH के mL या Liberase TM के 0.52 WU / mL के साथ मिलाएं। समाधान को 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखें।
    नोट:: दोनों Liberase TM और Liberase DH का उपयोग किया जा सकता है। दूसरे पर एक की पसंद को बाद के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त एपिटोप पर उनके संभावित प्रभाव से निर्देशित किया जाना चाहिए।
    सावधानी: यदि lyophilized एंजाइमों का उपयोग कर रहे हैं, हुड के तहत काम करते हैं।
  2. पीबीएस में 5 mM EDTA के 20 mL तैयार करें (कोई Ca2+/Mg2+)। पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर आधा समाधान रखें और दूसरे आधे को बर्फ पर रखें।
  3. एक लैमिनर फ्लक्स कैबिनेट के तहत, धीरे-धीरे एक बाँझ पेट्री डिश में बाँझ उपकरणों के साथ गर्भवती गर्भाशय के आसपास की वसा को हटा दें। ऊतक को सूखने की अनुमति न दें।
  4. भ्रूण को हटाने के लिए बाँझ उपकरणों के साथ प्रत्येक आरोपण स्थल को विच्छेदित करें (सीहॉर्स के आकार की पारभासी संरचना, लंबाई में लगभग 1 मिमी) (चित्रा 6 ए)। भ्रूणों को छोड़ दें।
  5. गर्भाशय को उनके मूल संग्रह 5 एमएल ट्यूब में वापस कर दें और सीधे 5 एमएल ट्यूब और संग्रह माध्यम में कैंची का उपयोग करके ऊतक को कीमा बनाते हैं। प्रक्रियाओं के बीच हर समय बर्फ पर ट्यूब रखें।
  6. 5 एमएल ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में कीमा बनाया हुआ ऊतक युक्त रखें।
  7. प्रत्येक नमूने में गर्म एंजाइमेटिक पाचन मिश्रण के 3 मिलीलीटर जोड़ें ताकि ट्यूब में तरल की कुल मात्रा 4 मिलीलीटर हो (कीमा बनाया हुआ गर्भाशय के साथ संग्रह माध्यम का 1 मिलीलीटर और एंजाइमेटिक पाचन समाधान का 3 एमएल)। एंजाइमेटिक पाचन गतिविधि को बढ़ाने के लिए आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 5 एमएल ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
  8. भंवर 5 एमएल ट्यूबों और एंजाइमों की कार्रवाई को रोकने के लिए उन्हें बर्फ पर जगह. फिर, बाद में, सामग्री को ठीक से लेबल किए गए 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  9. 15 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 5 mL ट्यूबों से सब कुछ फ्लश बर्फ के ठंडे 5 mM EDTA PBS समाधान के 10 mL का उपयोग कर.
  10. 15 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें जिसमें 400 x g पर 10 मिनट के लिए पचे हुए ऊतक होते हैं।
  11. supernatant त्यागें, धीरे गोली झटका, और फिर यह गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) 5 mM EDTA PBS समाधान के 10 mL में resuspend.
  12. 15 mL centrifuge ट्यूबों में नमूनों को 37 °C पर 15 मिनट के लिए आंदोलन के साथ incubate करने के लिए छोड़ दिया पाचन माध्यम को हटाने और सेल clumping को कम करने के लिए.
  13. भंवर 10 s के लिए उच्च पर नमूनों को आगे ऊतक पृथक्करण की सुविधा के लिए.

3. एक एकल सेल निलंबन में गर्भाशय के प्रसंस्करण

  1. एक बाँझ 1 एमएल सिरिंज के प्लंजर का उपयोग करते हुए, एक 70 μm छलनी के माध्यम से पचे हुए ऊतक को ठीक से लेबल और बाँझ 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब पर मजबूर करें ताकि सेल clumps और अविच्छिन्न ऊतक को हटाया जा सके।
  2. सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए कुल 10 मिलीलीटर ठंडे पीबीएस के साथ छलनी को कई बार धोएं।
  3. 50 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को 400 x g पर 10 मिनट के लिए स्पिन करें।
    नोट: विकल्प ए या विकल्प बी का उपयोग करके आगे के चरणों को निष्पादित करें विकल्प ए विकल्प बी की तुलना में कम मलबे और स्ट्रोमल सेल संदूषण के साथ लिम्फोसाइट्स के बेहतर संवर्धन की अनुमति देता है। हालांकि, विकल्प बी कम सेल हानि और नमूनों के बीच सेल उपज की कम परिवर्तनशीलता के कारण एक उच्च प्रतिरक्षा सेल उपज देता है। विकल्प बी तकनीकी रूप से प्रदर्शन करना भी आसान है। इसलिए, वरीयता के आधार पर, विकल्प A या विकल्प B के साथ आगे बढ़ें।
    1. विकल्प A के लिए चरण निम्नानुसार हैं।
      1. लेबल एक बाँझ 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब प्रति नमूना जिसमें 80% (v / v) के 5 एमएल शामिल हैं आइसोटोनिक परकोल पीबीएस में पतला।
      2. स्पिन के बाद, 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब से supernatant को छोड़ दें। पीबीएस में 40% (v / v) आइसोटोनिक Percoll के 8 mL में प्रत्येक गोली को फिर से निलंबित करने के लिए एक पिपेट लड़के का उपयोग करें।
      3. धीमी गति पर एक पिपेट लड़के का उपयोग ध्यान से छर्रे 80% Percoll समाधान पर 40% Percoll समाधान में resuspended overlay करने के लिए। पिपेट धीरे-धीरे और लगातार; 15 मिलीलीटर ट्यूब को 45° के कोण पर रखें (चित्र 6B)।
      4. ओवरले को परेशान किए बिना, कमरे के तापमान (मध्यम त्वरण और न्यूनतम ब्रेक) पर 850 x g पर 20 मिनट के लिए 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
      5. Percoll परतों (चित्रा 6C) को परेशान किए बिना सेंट्रीफ्यूज से ट्यूबों को सावधानीपूर्वक हटा दें।
      6. दो Percoll समाधान के इंटरफ़ेस पर ल्यूकोसाइट्स की अंगूठी को परेशान किए बिना, शीर्ष Percoll परत के लगभग 0.5-1 मिलीलीटर को छोड़कर सभी को त्यागने के लिए एक बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग करें।
      7. परकोल समाधान की न्यूनतम मात्रा (कुल 4-5 एमएल तक) को चूसने की कोशिश करते समय, ध्यान से ल्यूकोसाइट्स की अंगूठी एकत्र करें और कोशिकाओं को एक नए लेबल वाले 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      8. बाँझ RMPI-1640 माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक नमूने को ऊपर उठाएं, जो गर्मी-निष्क्रिय FBS के 10% के साथ पूरक है।
      9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
      10. supernatant को छोड़ दें और RBC lysis के लिए आगे बढ़ें।
    2. विकल्प B के लिए चरण निम्नानुसार हैं।
      1. प्रति नमूना एक बाँझ 15 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब लेबल.
      2. स्पिन के बाद, 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब से supernatant को छोड़ दें। RPMI-1640 माध्यम में 35% (v / v) आइसोटोनिक Percoll के 8 mL के साथ प्रत्येक गोली को फिर से निलंबित करने के लिए एक पिपेट लड़के का उपयोग करें।
      3. नमूनों को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
      4. मध्यम त्वरण और न्यूनतम ब्रेक के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 940 x g पर नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें।
      5. Aspirate supernatant ध्यान से एक aspirator या पिपेट लड़के का उपयोग कर (ट्यूब उलटा द्वारा नहीं).
      6. RPMI-1640 माध्यम के 14 मिलीलीटर में गोली को 10% गर्मी-निष्क्रिय FBS के साथ पूरक किया गया और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
      7. आकांक्षा द्वारा supernatant त्यागें और RBC lysis के लिए आगे बढ़ें।

4.RBC lysis

  1. RBCs lyse करने के लिए, 1x RBC लाइसिंग समाधान के 3 mL में नमूनों को फिर से निलंबित करें और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए नमूनों में पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. 5 मिनट के लिए 400 x g पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें और supernatant को त्याग दें।
  4. PBS के 10 mL जोड़ें और चरण 4.3 दोहराएँ।
  5. RPMI-1640 माध्यम के 1 mL में प्रत्येक गोली को फिर से निलंबित कर दिया गया, जो गर्मी-निष्क्रिय FBS के 10% के साथ पूरक है।
  6. बाँझ 70 μm सेल strainers के माध्यम से नमूनों को पारित करें।
  7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार trypan नीले और एक Neubauer चैंबर का उपयोग कर सेल गिनती प्रदर्शन करें।
  8. पीबीएस या माध्यम के 100 μL में 1-2 मिलियन कोशिकाओं के लिए सेल निलंबन की एकाग्रता को समायोजित करें।

5. पैनल डिजाइन रणनीति और नियंत्रण

नोट: इस पेपर में वर्णित पैनल uILC1, TRNK, और cNK कोशिकाओं के भेदभाव के लिए उपयुक्त है और इसे 5-लेजर BD LSRFortessa पर उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। विभिन्न सेल आबादी का अध्ययन करने और वैकल्पिक फ्लोरोक्रोम का उपयोग करने के लिए मामूली संशोधन किए जा सकते हैं। उपकरण के विन्यास की जांच करने की सिफारिश की जाती है, इष्टतम अलगाव के लिए टिट्रेड एंटीबॉडी का उपयोग करके, निर्माता की चमक सूचकांक से परामर्श करना और NKp46 जैसे कम व्यक्त एंटीजन के लिए सबसे उज्ज्वल रंजक का उपयोग करना, और सामान्य दिशानिर्देशों का पालन करना। यह NKp46 के लिए एक प्रतिदीप्ति माइनस एक (FMO) नियंत्रण शामिल करने की सिफारिश की है.

6. FACS phenotyping के लिए जन्मजात लिम्फोइड सेल धुंधला

  1. एक गोल-नीचे 96-अच्छी तरह से प्लेट में अच्छी तरह से प्रति 1-2 मिलियन कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
  2. 400 x g पर 4 °C पर 3 मिनट के लिए प्लेट स्पिन और एक सिंक में flicking द्वारा supernatant त्याग.
  3. एक बहु चैनल पिपेट का उपयोग कर पीबीएस (प्रोटीन और azide मुक्त) के 100 μL में सेल छर्रों resuspend.
    नोट: सुनिश्चित करें कि PBS में कोई सोडियम azide, कोई Tris, या बाद के चरण के लिए कोई प्रोटीन नहीं है।
  4. चरण 6.2 को दोहराएँ।
  5. PBS (प्रोटीन और azide मुक्त) (1: 1,000) में पतला फिक्सेबल व्यवहार्यता डाई के 50 μL में resuspend कोशिकाओं। अंधेरे में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि PBS में कोई सोडियम azide, कोई Tris, या FBS या BSA जैसे किसी भी प्रोटीन शामिल हैं क्योंकि इसके परिणामस्वरूप मृत कोशिकाओं की धुंधला तीव्रता कम हो सकती है और / या जीवित कोशिकाओं के लिए पृष्ठभूमि धुंधला हो सकती है।
    सावधानी: यदि व्यवहार्यता डाई पाउडर है, तो हुड के नीचे उपयोग करें।
  6. PBS के 150 μL जोड़ें, एक बहु चैनल पिपेट के साथ कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, और फिर चरण 6.2 दोहराएँ।
  7. FACS बफर के 25 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें (PBS 1% BSA या 2% FBS के साथ पूरक) जिसमें Fc रिसेप्टर ब्लॉकिंग अभिकर्मक होता है। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  8. एक सतह एंटीबॉडी कॉकटेल के 25 μL जोड़ें.
    नोट: हमेशा एंटीबॉडी titrate और प्रयोग से पहले एंटीबॉडी पैनल का अनुकूलन.
  9. अंधेरे में 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  10. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए FACS बफर के 150 μL जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण, और फिर चरण 6.2 दोहराएँ।
  11. चरण 6.10 को दोहराएँ।
    नोट:: विकल्प A या विकल्प B का उपयोग कर आगे के चरणों को निष्पादित करें। सतह मार्करों के साथ कक्षों को दाग करने के लिए विकल्प A का उपयोग करें। प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा इंट्रासेल्युलर मार्करों का अध्ययन करने के लिए विकल्प बी का उपयोग करें।
    1. विकल्प A के लिए चरण निम्नानुसार हैं।
      1. 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) प्रति अच्छी तरह से 100 μL में नमूनों को फिर से निलंबित करें और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
        सावधानी: हुड के तहत पीएफए का उपयोग करें। कृपया पीएफए अपशिष्ट / वस्तुओं को छोड़ने के लिए सुरक्षा शीट देखें जो पीएफए (जैसे, पिपेट्स) के संपर्क में सुरक्षित रूप से आए हैं।
      2. चरण 6.2, दो बार दोहराएँ।
        सावधानी: यहां सिंक में फ्लिक करके न छोड़ें क्योंकि इसमें पीएफए होता है। एक पिपेट के साथ एस्पिरेट करें और सुरक्षा शीट के अनुसार अपशिष्ट को छोड़ दें।
      3. पीबीएस के 200 μL में नमूनों को फिर से निलंबित कर दिया।
      4. लेबल FACS ट्यूबों में नमूनों को स्थानांतरित करें और पीबीएस के 100 μL के साथ ऊपर। FACS विश्लेषण के साथ प्रसंस्करण तक ट्यूबों को बर्फ पर या फ्रिज में रखें। 24 घंटे के भीतर एक प्रवाह साइटोमीटर पर नमूने प्राप्त करें।
    2. विकल्प B के लिए चरण निम्नानुसार हैं।
      1. 100 μL निर्धारण / permeabilization समाधान प्रति अच्छी तरह से (पैराफॉर्मेल्डिहाइड युक्त) के नमूनों को फिर से निलंबित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
        सावधानी: हुड के तहत पीएफए का उपयोग करें। कृपया पीएफए अपशिष्ट / वस्तुओं को छोड़ने के लिए सुरक्षा शीट देखें जो पीएफए (जैसे, पिपेट्स) के संपर्क में सुरक्षित रूप से आए हैं।
      2. चरण 6.2 को दोहराएँ।
        सावधानी: यहां सिंक में फ्लिक करके न छोड़ें क्योंकि इसमें पीएफए होता है। एक पिपेट के साथ एस्पिरेट करें और सुरक्षा शीट के अनुसार अपशिष्ट को छोड़ दें।
      3. 1x permeabilization / धोने बफर के 200 μL जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण, और फिर चरण 6.2 दोहराएँ।
      4. चरण 6.11.2.3 दोहराएँ।
      5. इंट्रासेल्युलर स्टेनिंग के लिए एंटीबॉडी मिश्रण युक्त 1x permeabilization / वॉशिंग बफर के 50 μL में निश्चित और permeabilized कोशिकाओं resuspend।
      6. अंधेरे में 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
      7. 1x permeabilization / धोने के समाधान के 200 μL जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण, और फिर चरण 6.2 दोहराएँ।
      8. चरण 6.11.2.7 को दोहराएँ।
      9. पीबीएस के 200 μL में नमूनों को फिर से निलंबित कर दिया।
      10. लेबल FACS ट्यूबों में नमूनों को स्थानांतरित करें और पीबीएस के 100 μL के साथ ऊपर। FACS विश्लेषण के साथ प्रसंस्करण तक ट्यूबों को बर्फ पर या फ्रिज में रखें। 24 घंटे के भीतर एक प्रवाह साइटोमीटर पर नमूने प्राप्त करें।
        नोट:: इस प्रोटोकॉल को करने के बाद, निर्णायक कक्ष निलंबन FACS विश्लेषण के लिए तैयार है। प्रति नमूना के रूप में संभव के रूप में कई घटनाओं को रिकॉर्ड करने की सिफारिश की जाती है; विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए माता-पिता की आबादी की कम से कम 1,000-3,000 घटनाओं को प्राप्त किया जाना चाहिए।

Representative Results

गर्भाशय ल्यूकोसाइट्स के एकल सेल निलंबन को प्राप्त करने के लिए वर्णित विधि के मुख्य चरणों को चित्र 3 में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। चित्रा 2B में प्रदर्शित मूल FACS गेटिंग रणनीति B6 चूहों में g1 ILCs के तीन सबसेट की पहचान के लिए उपयोग की जाती है: uILC1 (CD49a + Eomes-), TRNK (CD49a + Eomes +), और cNK (CD49a-Eomes +) कोशिकाएं। जी 1 आईएलसी के विभिन्न सतह और इंट्रासेल्युलर मार्करों का अध्ययन करने के लिए इन आबादी का आगे का विश्लेषण किया जा सकता है। एक उदाहरण के रूप में, IFN-π और स्व-MHC रिसेप्टर्स की सह-अभिव्यक्ति का मूल्यांकन uILC1, TRNK, और cNK कोशिकाओं में एंटी-NK1.1 एंटीबॉडी (चित्रा 7) के साथ उत्तेजना के बाद किया जा सकता है।

अनुसंधान प्रश्न के आधार पर, प्रोटोकॉल (चित्रा 3) और एंटीबॉडी पैनल दोनों को अनुकूलित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, जी 1 आईएलसी गेटिंग (चित्रा 2 बी और तालिका 1) के लिए एक एफएसीएस पैनल में एंटी-एनके 1.1 और एंटी-एनकेपी 46 एंटीबॉडी दोनों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि रक्त, प्लीहा, या यकृत से प्राप्त जी 1 आईएलसी में गर्भाशय समकक्ष (चित्रा 8) की तुलना में उनकी सतह पर एनकेपी 46 की उच्च अभिव्यक्ति होती है। NK1.1 के लिए सतह धुंधला एक बेहतर अलगाव देता है और गर्भाशय g1 ILCs आसानी से गेटेड किया जा करने के लिए सक्षम बनाता है (चित्रा 8). जबकि NKp46 को सभी माउस उपभेदों द्वारा व्यक्त किया जाता है, एंटी-एनके 1.1 एंटीबॉडी पीके 136 द्वारा मान्यता प्राप्त एनकेआर-पी 1 सी एंटीजन केवल कुछ माउस उपभेदों द्वारा व्यक्त किया जाता है, जिसमें C57BL / 6 (यानी, B6), FVB / N, और NZB शामिल हैं, लेकिन AKR, BALB / c, CBA / J, C3H, DBA / 1, DBA / 2, NOD, SJL, या 129 में नहीं। इसके अलावा, यदि अन्वेषक महत्वपूर्ण एनके सेल रिसेप्टर्स जैसे कि एमएचसी रिसेप्टर्स Ly49 का अध्ययन करने का इरादा रखता है, तो प्रयोगशाला माउस उपभेदों में एलेलिक विविधताओं के बारे में पता होना महत्वपूर्ण है, जो मानव हत्यारा-सेल इम्युनोग्लोबुलिन-जैसे रिसेप्टर्स (केआईआर) की उच्च परिवर्तनशीलता को दोहराते हैं। इसके अलावा, यदि कोशिकाओं को एक कार्यात्मक परख के लिए NK1.1 के साथ उत्तेजित किया जाना है, जैसा कि किम, एस एट अल.20 में वर्णित है, तो एंटी-एनके 1.1 के बजाय एंटी-एनकेपी 46 के साथ कोशिकाओं को दागना वांछनीय हो सकता है, क्योंकि एनकेआर-पी 1 सी एंटीजन को क्रॉसलिंकिंग एंटी-एनके 1.1 द्वारा कब्जा कर लिया जा सकता है या एक रिसेप्टर डाउनरेग्युलेशन उत्तेजना का पालन कर सकता है। या तो रिसेप्टर अधिभोग या डाउनरेगुलेशन उत्तेजित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही एंटीबॉडी के साथ धुंधला होने में बाधा डाल सकता है।

एंजाइमेटिक ऊतक पृथक्करण के साथ एक आम समस्या पाचन माध्यम के लिए उपयोग किए जाने वाले एंजाइमों द्वारा कोशिकाओं पर सतह के एपिटोप का परिवर्तन है। उदाहरण के लिए, MHC CD94: NKG2A रिसेप्टर के लिए धुंधला खराब है यदि Liberase TM का उपयोग किया जाता है। हालांकि, Liberase DH के साथ पाचन 16A11 एंटीबॉडी क्लोन (चित्रा 9) द्वारा NKG2A मान्यता को संरक्षित करता है। किसी के FACS पैनल में सभी एपिटोप पर एंजाइमों के प्रभाव की जांच करने की सिफारिश की जाती है। इस उद्देश्य के लिए, यांत्रिक पृथक्करण द्वारा प्राप्त माउस स्प्लेनोसाइट्स के निलंबन का उपयोग करें (70 μm छलनी के माध्यम से पूरे प्लीहा को पारित करना)। नमूने को तब दो या दो से अधिक भागों में विभाजित किया जाता है, जिसके बाद एंजाइम (ओं) के साथ या बिना माध्यम के साथ इनक्यूबेशन किया जाता है।

जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, रक्त-व्युत्पन्न कोशिकाएं ऊतक विच्छेदित नमूनों में मौजूद होती हैं। यदि आवश्यक हो, तो रक्त संदूषकों को एक इंट्रावैस्कुलर स्टेनिंग विधि का उपयोग करके बाहर रखा जा सकता है जैसा कि मासोपस्ट प्रयोगशाला 21 में विकसित किया गया है। चित्रा 10 दर्शाता है कि गर्भावस्था के दिन 8.5 पर गर्भाशय के ऊतकों के नमूनों में मौजूद जी 1 आईएलसी का लगभग 6.5% रक्त-व्युत्पन्न है। इंट्रावैस्कुलर स्टेनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटी-सीडी 45 एंटीबॉडी को डंप-चैनल के लिए उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोक्रोम के साथ संयुग्मित किया जा सकता है; यह एक अतिरिक्त प्रतिदीप्ति चैनल का उपयोग किए बिना रक्त contaminants बाहर हो जाएगा. सबसे आम समस्याएं और उनके समाधान तालिका 2 में प्रस्तुत किए गए हैं।

Figure 1
चित्रा 1: माउस गर्भाशय का क्रॉस-सेक्शन। (A) माउस गर्भाशय क्रॉस-सेक्शन (गैर-गर्भवती) विभिन्न प्रकार के मातृ ल्यूकोसाइट्स को दर्शाता है जो गर्भाशय को पॉप्युलेट करते हैं। (B) माउस गर्भाशय क्रॉस-सेक्शन (गर्भावस्था का दिन 8.5)। (सी) माउस गर्भाशय क्रॉस-सेक्शन (गर्भावस्था का दिन 13.5)। (घ) ब्लास्टोसिस्ट चरण के बाद से माउस बनाम मानव प्लेसेंटा गठन की तुलना। BioRender.com के साथ बनाई गई छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: गर्भाशय g1 ILC1 की उप-आबादी( A) प्रारंभिक जीवन और गर्भावस्था के दौरान चूहों में गर्भाशय cNK, ILC1, और TRNK का प्रतिशत। डब्ल्यू - सप्ताह, जीडी - गर्भावस्था का दिन। Filipovic से संशोधित ग्राफ, I. et al.4. (बी) प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा गर्भाशय समूह 1 आईएलसी सबसेट का विश्लेषण करने के लिए गेटिंग रणनीति। लिम्फोसाइट्स को गर्भावस्था के दिन 10.5 पर गर्भाशय के ऊतकों से अलग किया गया था। ऊतक पाचन एक पाचन माध्यम का उपयोग करके किया गया था जिसमें लिबेरेस टीएम होता है। कोशिकाओं को प्रकाश को तितर-बितर करने की उनकी क्षमता के आधार पर गेटेड किया गया था। डबल्स को एफएससी-ए बनाम एफएससी-एच प्लॉट का उपयोग करके बाहर रखा गया था, और केवल सीडी 45 + सीडी 3-सीडी 19- व्यवहार्य कोशिकाओं का आगे विश्लेषण किया गया था। CD45+ CD3-CD19- व्यवहार्य कोशिकाओं के भीतर, समूह 1 ILC गेट को NK1.1 + NKp46 + कोशिकाओं के रूप में पहचाना गया था। समूह 1 आईएलसी के भीतर, तीन सबसेट की पहचान की जा सकती है: CD49a-Eomes + पारंपरिक NK कोशिकाएं (cNK), CD49a + Eomes + ऊतक-निवासी एनके कोशिकाएं (TRNK), और CD49a + Eomes- uILC1। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रोटोकॉल के मुख्य चरणों के लिए एक दृश्य मार्गदर्शिका। (1) गर्भवती गर्भाशय को मेसोमेट्रियल वसा से मुक्त विच्छेदन करें। (2) भ्रूण को हटा दें; गर्भाशय को 5 एमएल ट्यूब में वापस करें और ऊतक को कीमा बना दें। एंजाइम पाचन चरण के साथ आगे बढ़ें: प्रत्येक नमूने में गर्म एंजाइमेटिक पाचन मिश्रण के 3 एमएल जोड़ें। आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 5 एमएल ट्यूबों को इनक्यूबेट करें। (3) (i) पाचन के बाद, 5 एमएल ट्यूबों से सब कुछ 15 एमएल ट्यूबों में फ्लश करें, जिसमें 10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा 5 एमएम ईडीटीए पीबीएस समाधान का उपयोग किया जाता है। (ii) 400 x g पर 10 मिनट के लिए पचे हुए ऊतकों वाली 15 मिलीलीटर ट्यूबों को अपकेंद्रित करना। (iii) supernatant त्याग; धीरे से गोली झटका और यह गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) 5 mM EDTA PBS समाधान के 10 mL में resuspend. (iv) 15 मिनट के लिए आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 एमएल ट्यूबों में नमूनों को इनक्यूबेट करें। (4) एक बाँझ 1 एमएल सिरिंज के प्लंजर का उपयोग करके, 70 μm छलनी के माध्यम से पचे हुए ऊतक को ठीक से लेबल किए गए और बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब पर मजबूर करें, और 400 x g पर 10 मिनट के लिए स्पिन करें। (5) स्पिन के बाद, या तो विकल्प ए (यहां आरेखों में दर्शाया गया है) या बी के साथ आगे बढ़ें विकल्प ए: 50 एमएल ट्यूब से supernatant को त्याग दें और, एक पिपेट लड़के का उपयोग करके, पीबीएस में 40% (v / v) आइसोटोनिक परकोल के 8 मिलीलीटर में प्रत्येक गोली को फिर से निलंबित करें। (6) (i) विकल्प ए जारी रखा: धीमी गति पर एक पिपेट लड़के का उपयोग करते हुए, 80% परकोल समाधान के 5 मिलीलीटर पर 40% परकोल समाधान में पुन: निलंबित गोली को सावधानीपूर्वक ओवरले करें। पिपेट धीरे-धीरे और लगातार; 15 मिलीलीटर ट्यूब को 45 डिग्री के कोण पर पकड़ो। (ii) ओवरले को परेशान किए बिना, 15 एमएल ट्यूबों को कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 850 x g पर मध्यम त्वरण और धीमी गति से ब्रेक के साथ सेंट्रीफ्यूज करें। (7) स्पिन के बाद, परकोल समाधान की न्यूनतम मात्रा (कुल 4-5 एमएल तक) को चूसने की कोशिश करते समय, ल्यूकोसाइट्स की अंगूठी को सावधानीपूर्वक इकट्ठा करें। (8) लाल रक्त कोशिका lysis चरणों का प्रदर्शन करें। (9) गणना सेल trypan नीले और एक Neubauer चैंबर का उपयोग कर. (10) एक गोल-नीचे 96-अच्छी तरह से प्लेट में प्रति अच्छी तरह से 1-2 मिलियन कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। (11) व्यवहार्यता डाई और एंटीबॉडी धुंधला के साथ आगे बढ़ें। (12) अंत में, लेबल एफएसीएस ट्यूबों में नमूनों को स्थानांतरित करें। 24 घंटे के भीतर FACS विश्लेषण के साथ प्रसंस्करण तक ट्यूबों को बर्फ पर या फ्रिज में रखें। BioRender.com के साथ बनाई गई छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: योनि प्लग (A) और C57BL/6 महिलाओं में 0.5 दिन के बाद संभोग पर इसकी अनुपस्थिति (A) और इसकी अनुपस्थिति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: एक गर्भवती माउस से गर्भाशय को निकालने के लिए विच्छेदन। (A) बांध को 70% इथेनॉल के साथ शरीर को पोंछने के लिए एक नरम बोर्ड पर सुइयों के साथ पिन किया जाता है। दो ऊर्ध्वाधर चीरों को बनाया जाता है, जैसा कि नीली बिंदीदार रेखाओं द्वारा इंगित किया गया है। (बी) आंतरिक अंगों को उजागर करने के लिए त्वचा को उठाया जाता है। आंतों के छोरों को धीरे से गर्भाशय की कल्पना करने के लिए ऊपर ले जाया जाता है। (सी) गर्भाशय को तीन बिंदुओं पर काटकर नमूना लिया जाता है: अंडाशय के बगल में और गर्भाशय ग्रीवा पर, जैसा कि क्रमशः दो नीली बिंदीदार लाइनों और नीले तीर द्वारा इंगित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: एकल-कोशिका निलंबन की तैयारी। (ए) भ्रूण को उनके आरोपण स्थल से यांत्रिक रूप से हटाना। (बी) परकोल ग्रेडिएंट ओवरले; शीर्ष परत Percoll के 40% में एकल सेल निलंबन और Percoll के नीचे परत 80% शामिल हैं. (C) परकोल ग्रेडिएंट के सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद लिम्फोसाइट रिंग गठन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: समूह 1 आईएलसी के साथ कार्यात्मक परख के प्रतिनिधि FACS विश्लेषण. इंट्रासेल्युलर IFN-π और सतह CD107a समूह 1 ILCs में स्व-MHC (Ly49C, Ly49I, और NKG2A) के लिए NK रिसेप्टर्स को व्यक्त करने का पता लगाना उन लोगों की तुलना में जो प्लेट-बाउंड एंटीबॉडी के साथ NK1.1 को क्रॉसलिंक करने के बाद नहीं करते हैं। कोशिकाओं को गर्भावस्था के दिन 9.5 पर गर्भाशय के ऊतकों से अलग किया गया था। ऊतक पाचन एक पाचन माध्यम का उपयोग करके किया गया था जिसमें लिबेरेस डीएच होता है। सभी चार चतुर्भुजों (कोनों) के कच्चे मूल्यों के साथ-साथ स्वयं और उत्तरदाताओं के लिए रिसेप्टर्स व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के बीच उत्तरदाताओं का सापेक्ष प्रतिशत दिखाया गया है जिनके पास आत्म-रिसेप्टर्स (बोल्ड नंबर) नहीं हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: विरोधी NKp46 और विरोधी NK1.1 एंटीबॉडी के साथ स्प्लेनिक और गर्भाशय लिम्फोसाइट्स धुंधला. (ए) गर्भावस्था के दिन 10.5 में माउस प्लीहा और (बी) गर्भाशय से प्राप्त सेल निलंबन को दो में अलग किया गया था; एक भाग NKp46-APC (लाल) और NK1.1-APC (नीले) के साथ एक दूसरे के साथ दाग दिया गया था। ध्यान दें कि गर्भाशय लिम्फोसाइटों के NKp46 धुंधला NKp46 + और NKp46- कोशिकाओं को स्प्लेनिक लिम्फोसाइट्स के रूप में बड़े करीने से अलग नहीं करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: पाचन माध्यम के साथ इनक्यूबेशन द्वारा NKG2A MFI (एंटीबॉडी क्लोन: 16A11) की कमी। C56BL/6 माउस स्प्लेनोसाइट्स के सेल निलंबन को तीन भागों में विभाजित किया गया था। एक भाग Liberase DH पाचन माध्यम (HBSS जिसमें 0.13 WU / mL Liberase DH और DNAse के 30 μg / mL शामिल हैं) में इनक्यूबेट किया गया था, और एक अन्य भाग को Liberase TM पाचन माध्यम (HBSS जिसमें 0.52 WU / mL Liberase TM और DNAse के 30 μg / mL शामिल हैं) के साथ इनक्यूबेट किया गया था। तीसरे भाग को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए साफ एचबीएसएस के साथ इलाज किया गया था। जी 1 आईएलसी पर एनकेजी 2 ए मार्कर की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया गया था। श्रीवे एन से लिया गया ग्राफ। गर्भावस्था में गर्भाशय एनके-सेल निषेध की भूमिका (थीसिस); पर्यवेक्षक: कोलुची एफ, 2020। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: रक्त-व्युत्पन्न g1 ILCs के बहिष्करण के लिए एंटी-CD45 एंटीबॉडी के साथ इंट्रावाइटल स्टेनिंग। गर्भावस्था के दिन 8.5 पर एक C57BL / 6 बांध माउस को CD45-AF647 के 3 μg के साथ अंतःशिरा इंजेक्शन के 3 मिनट बाद मारा गया था। गर्भाशय, पूरे रक्त और थाइमस को काटा गया था और एफएसीएस विश्लेषण के लिए संसाधित किया गया था। एक्स-अक्ष CD45-AF647 के साथ अंतःशिरा धुंधला से संकेत दिखाता है, और Y-अक्ष इन विट्रो दाग CD45-BUV395 से संकेत प्रदर्शित करता है। उप-जनसंख्या के प्रतिशत चतुर्भुज में दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एंटीबॉडी / डाई क्लोन फ्लोरोक्रोम लेजर
1 (डंप चैनल) ज़ोंबी वायलेट फिक्सेबल व्यवहार्यता डाई बैंगनी
CD19 1D3 BV421
CD3 145-2C11 BV421
2 CD45 30-F11 FITC नीला
3 NK1.1 PK136 BV605 बैंगनी
4 NKp46 29A1.4 APC लाल
5 CD49a Ha31/8 BUV395 पराबैंगनी
6 EOMES Dan11mag पीई हरा

तालिका 1: पारंपरिक 5-लेजर साइटोमीटर के लिए FACS पैनल का एक उदाहरण।

समस्या संभावित कारण सुझाव
सेल रिंग दो percoll समाधानों के इंटरफ़ेस पर दिखाई नहीं दे रहा है Percoll समाधान की खराब layering या नमूना हैंडलिंग के दौरान दो परतों मिश्रण ओवरलेइंग के दौरान 80% percoll कुशन को तोड़ने के लिए अतिरिक्त ध्यान रखें। नमूना हैंडलिंग के दौरान ध्यान दें: percoll इंटरफ़ेस को परेशान न करें
ल्यूकोसाइट्स की कम संख्या (उदाहरण के लिए, गैर-गर्भवती गर्भाशय का उपयोग करते समय) इंटरफ़ेस को तब भी देखा जा सकता है जब इंटरफ़ेस पर सेल संख्या बहुत कम हो। यहां तक कि अगर अंगूठी दिखाई नहीं देती है, तो 40% और 80% percoll समाधानों के बीच तरल एकत्र करें, क्योंकि आगे के प्रसंस्करण के लिए अभी भी पर्याप्त कोशिकाएं हो सकती हैं।
अपूर्ण आरबीसी लाइसिस लाइसिंग बफ़र में कक्षों को ठीक से पुन: निलंबित नहीं किया गया था पिपेट कोशिकाओं को ऊपर और नीचे clumps को तोड़ने के लिए और पूरी तरह से लाइसिंग बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए
लाइसिंग समाधान ठंडा है उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान के लिए लाइसिंग समाधान को संतुलित करें
15min तक लाइसिंग समाधान के साथ इनक्यूबेशन का लंबा समय
RBC lysis चरण दोहराया जा सकता है
कम सेल उपज खराब एंजाइमेटिक पाचन जांचें कि क्या एंजाइम पुराने नहीं हैं और उनके मैनुअल के अनुसार संग्रहीत किए गए हैं
धोने के चरणों के दौरान सेल हानि प्रत्येक धोने के चरण के बाद सेल गोली का निरीक्षण करें: स्पिन के बाद अच्छी तरह से नीचे अपारदर्शी गोली। यू-बॉटम प्लेटों के बजाय वी-बॉटम का उपयोग करना, रोटर सेंट्रीफ्यूज, लंबे समय तक सेंट्रीफ्यूजेशन समय सेल हानि को कम कर सकता है
ऊतक के नमूने में लिम्फोसाइट्स की कम संख्या होती है (उदाहरण के लिए, गैर-गर्भवती गर्भाशय का उपयोग करते समय) विश्लेषण के लिए पर्याप्त घटनाओं को प्राप्त करने के लिए कई गर्भाशय पूल करें। सेल अलगाव के लिए प्रोटोकॉल के विकल्प B का उपयोग करने पर विचार करें
एक ही समूह के चूहों से प्राप्त निरपेक्ष ल्यूकोसाइट संख्याओं की उच्च परिवर्तनशीलता 40% और 80% percoll समाधान के इंटरफ़ेस पर कोशिकाओं का असंगत संग्रह Percoll इंटरफ़ेस पर पूरे सेल अंश को इकट्ठा करने के लिए सुनिश्चित करें। सेल अलगाव के लिए प्रोटोकॉल के विकल्प B का उपयोग करने पर विचार करें
कुछ सेल सतह मार्करों के लिए अपेक्षित लिम्फोसाइट उप-आबादी / मार्करों या असामान्य रूप से कम एमएफआई का पता लगाने में सक्षम नहीं एंजाइमेटिक पाचन कुछ एपिटोप की सतह की अभिव्यक्ति या उनके क्षरण को प्रभावित करता है बदलने से एंजाइमेटिक पाचन का अनुकूलन करें: एंजाइम (जैसे विभिन्न प्रकार के लिबेरेज़ या कोलेजेनेस के लिए) और / या इनक्यूबेशन और / या एंजाइम एकाग्रता की लंबाई
प्रवाह साइटोमीटर में उच्च पृष्ठभूमि शोर सेल मलबे या आरबीसी संदूषण का उच्च अनुपात FSC थ्रेशोल्डिंग पैरामीटर समायोजित करें। सेल अलगाव के लिए प्रोटोकॉल के विकल्प A का उपयोग करने पर विचार करें

तालिका 2: समस्या निवारण मार्गदर्शिका.

Discussion

विधि में इसके बाद चर्चा किए गए कई महत्वपूर्ण चरण शामिल हैं। पहला महत्वपूर्ण कदम कई तुल्यकालिक गर्भधारण प्राप्त करना है क्योंकि गर्भावस्था के माध्यम से ल्यूकोसाइट आबादी की सापेक्ष आवृत्ति में परिवर्तन होता है। एक ही गर्भावधि दिन में कई बांधहोने से या तो एक ही प्रयोगों में जैविक दोहराव या अलग-अलग बांधों से लिम्फोसाइट्स को पूल करने की अनुमति मिलती है ताकि डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक बड़ी संख्या प्राप्त की जा सके। समयबद्ध संभोग शोधकर्ता को 24 घंटे की अवधि के भीतर गर्भाधान को इंगित करने की अनुमति देता है। हालांकि चूहे लगभग 2.5 साल तक जीवित रहते हैं, वे 4-7 सप्ताह से 6-8 महीने की उम्र तक प्रजनन आयु के होंगे। जैसा कि छोटे चूहे आमतौर पर छोटे पिल्लों का उत्पादन करते हैं, मादा चूहों को आमतौर पर तब तक संभोग नहीं किया जाता है जब तक कि वे 6-8 सप्ताह के बीच न हों, और पुरुष चूहे जब तक कि वे 8-10 सप्ताह के बीच न हों। यह देखते हुए कि एस्ट्रस चूहों में लगभग 15 घंटे तक रहता है और हर 4-5 दिनों में होता है, विशिष्ट संभोग दर (योनि प्लग द्वारा प्रकट, चित्रा 4 देखें) लगभग 25% है। इसलिए एस्ट्रस में चूहों का उपयोग करना और किसी दिए गए प्रयोग के लिए आवश्यक संख्या में बांधों को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त संख्या की योजना बनाना महत्वपूर्ण है। एस्ट्रस चक्र चरण योनि स्मीयर cytology22 द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। संभोग से पहले पुरुषों को आराम 48 ज और Whitten effect18 का लाभ उठाकर प्लग दर में सुधार किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, कोई भी गर्भवती घोड़ी सीरम का प्रशासन कर सकता है, जो अंतर्जात कूप-उत्तेजक हार्मोन के प्रभाव की नकल करता है, ओसाइट परिपक्वता को प्रेरित करता है और, 42-50 घंटे बाद, मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन, जो अंतर्जात ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन के प्रभाव की नकल करता है, ओव्यूलेशन को प्रेरित करता है। यह हार्मोनल उपचार एस्ट्रस की आवश्यकता को दरकिनार करता है और लगभग सभी उपचारित महिलाओं को ग्रहणशील बनाता है।

एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम FACS धुंधला की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए है। प्रवाह साइटोमेट्री में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी को हमेशा इष्टतम एकाग्रता पर टिटरेट और उपयोग किया जाना चाहिए, और यह जांचना आवश्यक है कि एंजाइमेटिक पाचन महत्वपूर्ण एंटीजेनिक एपिटोप को बंद नहीं करता है। यह आकलन करने के लिए कि क्या एक एंजाइम एक एपिटोप को बंद कर देगा, एक समानांतर में एक ही नमूने के दो अंशों को दाग सकता है, एक एंजाइमेटिक और दूसरा यांत्रिक पाचन से गुजर रहा है। इसी तरह, विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने के लिए उचित नियंत्रण और एकल दाग का उपयोग महत्वपूर्ण है। दुर्लभ घटनाओं के लिए, मोतियों का उपयोग एकल दाग के नमूने उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। वोल्टेज की स्थापना के लिए मोतियों का उपयोग न करने की सिफारिश की जाती है, बल्कि लिम्फोसाइट्स और अन्य ल्यूकोसाइट्स युक्त कोशिकाओं की आबादी, जैसे कि स्प्लेनोसाइट्स। यदि मोतियों का उपयोग किया जाता है, तो मनका धुंधला होने के लिए एंटीबॉडी को टाइटरेट करना आवश्यक है, इसलिए दाग वाले मोतियों की प्रतिदीप्ति तीव्रता कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति तीव्रता के बराबर होगी। किसी विशेष मार्कर के लिए नकारात्मक कोशिकाओं से सकारात्मक को अलग करने में कठिनाई के मामले में, एक FMO नियंत्रण का उपयोग एक विशिष्ट मार्कर के लिए गेटिंग की सुविधा के लिए भी किया जा सकता है। इंट्रासेल्युलर मार्करों के मामले में, एक आइसोटाइप नियंत्रण का उपयोग किया जाना चाहिए क्योंकि इंट्रासेल्युलर स्टेनिंग के परिणामस्वरूप अवशिष्ट अनबाउंड एंटीबॉडी हो सकते हैं, जो धोने के चरणों के बाद कोशिकाओं के भीतर अभी भी मौजूद हो सकते हैं और इसलिए पृष्ठभूमि सिग्नल को बढ़ाते हैं। FACS विश्लेषण द्वारा फेनोटाइपिंग में सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं को ठीक करने के 24 घंटे के भीतर नमूनों को चलाने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि समय के साथ ऑटोफ्लोरेसेंस काफी बढ़ जाता है और समय के साथ कुछ एंटीबॉडी की प्रतिदीप्ति तीव्रता में गिरावट आ सकती है।

विचार करने के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त एकल-सेल निलंबन का डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग है। कार्यात्मक assays के लिए, बाँझ स्थितियों में काम करना आवश्यक है। इसी तरह, बाद के ओमिक्स अध्ययनों के लिए, बाँझ और RNase, DNase और प्रोटीज-मुक्त में काम करना महत्वपूर्ण है।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल फेनोटाइपिंग समूह 1 आईएलसी पर केंद्रित है, लेकिन एंटीबॉडी पैनल को संशोधित करके अन्य सेल प्रकारों को फेनोटाइप करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह अनुशंसा की जाती है कि एंजाइमेटिक उपचार द्वारा सतह एपिटोप के नुकसान / परिवर्तन का पता लगाने के लिए सभी एंटीबॉडी का पाचन और गैर-पचाए गए सेल निलंबन के खिलाफ परीक्षण किया जाता है। इसी तरह, ऊतक को पचाने और कोशिका उपज बढ़ाने के लिए विभिन्न एंजाइमों का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन महत्वपूर्ण एंटीजेनिक एपिटोप पर इसके प्रभाव का सावधानीपूर्वक अध्ययन किया जाना चाहिए। जबकि NKp46 प्लीहा एनके कोशिकाओं के लिए एक अच्छा मार्कर है और प्रयोगशाला चूहों के सभी उपभेदों में काम करता है, C57BL / 6 चूहों में uNK कोशिकाओं पर NKp46 की अभिव्यक्ति प्लीहा एनके कोशिकाओं की तुलना में काफी कम है। NK1.1 और NKp46 दोनों के लिए एक साथ दाग करना सबसे अच्छा है। यदि कई अंगों की सीधे तुलना की जानी है, तो सभी नमूनों को समान रूप से इलाज करने की सिफारिश की जाती है, भले ही प्लीहा या अस्थि मज्जा जैसे ऊतकों के लिए एंजाइमेटिक पाचन की आवश्यकता न हो। यद्यपि यहां प्रस्तुत विधि गैर-गर्भवती गर्भाशय पर लागू होती है, दो-चरण परकोल ग्रेडिएंट द्वारा लिम्फोसाइट रिंग अलगाव चुनौतीपूर्ण होगा, और अलग-अलग कोशिकाओं की उपज विश्वसनीय एफएसीएस विश्लेषण के लिए बहुत कम हो सकती है और इसलिए व्यक्तिगत, गैर-गर्भवती चूहों के गर्भाशय से अलग कोशिकाओं को एक साथ पूल करने की आवश्यकता होगी23।

डेटा की व्याख्या के लिए विचार करने के लिए प्रोटोकॉल की सीमाएं हैं। जैसा कि यह सभी ऊतकों के लिए मामला है, रक्त से आने वाले परिसंचारी लिम्फोसाइटों को ऊतक-निवासी कोशिकाओं के साथ अलग किया जाएगा। यदि परिसंचारी लिम्फोसाइट्स का बहिष्करण डेटा व्याख्या के लिए आवश्यक है, तो परिसंचारी कोशिकाओं को लेबल करने के लिए इंट्रावाइटल स्टेनिंग किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल की एक दूसरी सीमा यह है कि कुछ कोशिकाएं खो जाएंगी क्योंकि सभी कोशिकाओं को ऊतक से नहीं निकाला जा सकता है। सबसे आम समस्याओं और उनके समस्या निवारण तालिका 2 में प्रस्तुत किए गए हैं।

ऐतिहासिक रूप से, ऊतकों में कोशिकाओं के अध्ययन ने ऊतक वर्गों की हिस्टोलॉजिकल परीक्षा पर भरोसा किया है। सैंड्रा पील की उत्कृष्ट समीक्षा 24 80 के दशक के अंत तक 100 से अधिक वर्षों में किए गए काम को सारांशित करती है। बाद में यूएनके कोशिकाओं के रूप में जानी जाने वाली कोशिकाओं का विवरण वास्तव में लिम्फोसाइट्स की खोज से आधी शताब्दी से अधिक समय पहले प्रकाशित पांडुलिपियों में दिखाई देता है। इसलिए, 1975 में एनके कोशिकाओं की खोज से पहले, और यूएनके कोशिकाओं को मातृ ग्लाइकोजन कोशिकाओं या दानेदार मेट्रियल ग्रंथि कोशिकाओं के रूप में इंगित किया गया है। ऐनी क्रॉयड ने फील्ड 25 में प्रमुख योगदान दिया है और कृपया टीम को विच्छेदन सिखाया है जिसे उसने अनुकूलित किया था3, और वर्तमान में इसका उपयोग किया जाता है। यद्यपि यह यूएनके कोशिकाओं के आकृति विज्ञान और ऊतक स्थान का वर्णन करने में महत्वपूर्ण है, शास्त्रीय हिस्टोलॉजिकल परीक्षा ब्याज की कोशिकाओं पर केवल कुछ मार्करों का पता लगाने तक सीमित है। 2008 में, गर्भाशय लिम्फोसाइट्स पर कई मार्करों का एक साथ पता लगाने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित विधि का वर्णन किया गया था26। यह अनिवार्य रूप से वह विधि है जिसे इस पेपर में वर्णित किया गया है। अधिक हाल की प्रौद्योगिकियों जैसे कि स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स और बड़े पैमाने पर साइटोमेट्री द्वारा इमेजिंग हिस्टोलॉजी और फ्लो-साइटोमेट्री की शक्ति को जोड़ती हैं, जिससे क्रमशः कई जीन या प्रोटीन का एक साथ पता लगाने और सामान्य ऊतक वास्तुकला के संरक्षण दोनों की अनुमति मिलती है।

यहां वर्णित विधि के अनुप्रयोग कई हैं और इसमें FACS phenotyping, कार्यात्मक परख (जैसे ELISPOT, degranulation या cytotoxic assays), सेल सॉर्टिंग, और बाद में ट्रांसक्रिप्टोमिक्स या प्रोटिओमिक्स शामिल हैं। इस विधि के आधार पर विकसित किए जा सकने वाले आगे के अनुप्रयोगों में नकारात्मक कमी द्वारा सेल सॉर्टिंग या संवर्धन के बाद निर्णायक एनके कोशिकाओं की संस्कृति और विस्तार शामिल है। वर्तमान में, माउस यूएनके कोशिकाओं को संस्कृति और विस्तारित करने के लिए कोई प्रोटोकॉल नहीं है और एक विस्तारित अवधि के लिए उनकी व्यवहार्यता और कार्यक्षमता को संरक्षित करता है, मानव एनके कोशिकाओं के समान फैशन में, जिन्हें आईएल -2 या एक संयोजन आईएल -12 और आईएल -15 के अलावा 7-14 दिनों के लिए खेती और विस्तारित किया जा सकता है। माउस uNK कोशिकाओं के लिए इस तरह की एक विधि का अनुकूलन कार्यात्मक assays प्रदर्शन करते समय अधिक लचीलापन प्रदान करेगा और कई स्थितियों के लिए एक उच्च सेल संख्या के साथ परीक्षण किया जा करने की अनुमति देगा। दूसरी ओर, संस्कृति की स्थिति लिम्फोसाइट्स के अद्वितीय फेनोटाइप और संभावित रूप से उनके कार्य को भी संशोधित करने के लिए जानी जाती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है और हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम पिछले और वर्तमान टीम के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने इस विधि को विकसित करने में मदद की है, जिसमें जीन-मार्क डोइसने, नॉर्मन श्रीवे, इवा फिलिपोविक और अनीता क्वाल्स शामिल हैं। इस शोध को वेलकम ट्रस्ट [अनुदान संख्या 200841 / Z / 16 / Z ] और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (MR / P001092 / 1) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। खुली पहुंच के उद्देश्य के लिए, लेखक ने इस सबमिशन से उत्पन्न होने वाले किसी भी लेखक स्वीकृत पांडुलिपि संस्करण के लिए एक सीसी बाय पब्लिक कॉपीराइट लाइसेंस लागू किया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70 µm cell strainers Falcon 352350
BSA Sigma A9647-100G
CD19 antibody BD 562701
CD3 antibody BD 562600
CD45 antibody BioLegend 103108
CD49a antibody BD 740262
DNase I Roche (Sigma) 10104159001
EOMES antibody eBioscience 12-4875-82
Fc block Trustain fcx BioLegend 101320
Fetal Bovine Serum Gibco 10217-106
Fix/Perm buffer (part of BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit) BD 554714
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red Gibco 14025092
Liberase DH Roche (Sigma) 5401089001
Lysis buffer Pharmlyse BD 555899
NK1.1 antibody BioLegend 108739
NKp46  antibody BioLegend 137608
Paraformaldehyde 16% Solution (methanol-free) Agar Scientific AGR1026
PBS 10x Gibco 14030-048
PBS 1x (no Ca2+ or Mg2+) Thermo Scientific 14190144
Percoll VWR international 17-0891-01
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5368-10PAK
Pre-Separation filters Miltenyi 130-095-823
RMPI-1640 medium + GlutaMAX Gibco 61870-010
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo Scientific 15575020
Zombie Violet Fixable Viability dye BioLegend 423113

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References

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प्रवाह Cytometry द्वारा विश्लेषण के लिए गर्भाशय जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं का अलगाव
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Depierreux, D. M., Seshadri, E.,… More

Depierreux, D. M., Seshadri, E., Shmeleva, E. V., Kieckbusch, J., Hawkes, D. A., Colucci, F. Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (176), e62670, doi:10.3791/62670 (2021).

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