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Biology

Recolección de tejidos y extracción de ARN de la articulación de la rodilla osteoartrítica humana

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62718
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Bone and Joint Center, Henry Ford Health System, 2Department of Orthopedic Surgery, Henry Ford Health System, 3Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University

Summary

Los tejidos primarios obtenidos de pacientes después de la artroplastia total de rodilla proporcionan un modelo experimental para la investigación de la osteoartritis con la máxima traducibilidad clínica. Este protocolo describe cómo identificar, procesar y aislar el ARN de siete tejidos únicos de la rodilla para apoyar la investigación mecanicista en la osteoartritis humana.

Abstract

La osteoartritis (OA) es una enfermedad articular crónica y degenerativa que afecta con mayor frecuencia a la rodilla. Como actualmente no hay cura, la artroplastia total de rodilla (ATC) es una intervención quirúrgica común. Los experimentos con tejidos primarios de OA humana obtenidos de TKA proporcionan la capacidad de investigar los mecanismos de la enfermedad ex vivo. Si bien anteriormente se pensaba que la OA afectaba principalmente al cartílago, ahora se sabe que afecta a múltiples tejidos de la articulación. Este protocolo describe la selección del paciente, el procesamiento de muestras, la homogeneización de tejidos, la extracción de ARN y el control de calidad (basado en la pureza, integridad y rendimiento del ARN) de cada uno de los siete tejidos únicos para apoyar la investigación del mecanismo de la enfermedad en la articulación de la rodilla. Con consentimiento informado, se obtuvieron muestras de pacientes sometidos a ATC para OA. Los tejidos se diseccionaron, lavaron y almacenaron dentro de las 4 h posteriores a la cirugía mediante congelación instantánea para la fijación de ARN o formalina para histología. Los tejidos recolectados incluyeron cartílago articular, hueso subcondral, menisco, almohadilla de grasa infrapatelar, ligamento cruzado anterior, sinovial y músculo oblicuo vasto medialis. Se probaron protocolos de extracción de ARN para cada tipo de tejido. La modificación más significativa involucró el método de desintegración utilizado para tejidos duros de células bajas, de matriz alta (considerados como cartílago, hueso y menisco) versus tejidos blandos de células relativamente altas, de matriz baja (considerados como almohadilla de grasa, ligamento, sinovial y músculo). Se encontró que la pulverización era apropiada para los tejidos duros, y la homogeneización era apropiada para los tejidos blandos. Se observó una proclividad de algunos sujetos a producir valores de número de integridad de ARN (RIN) más altos que otros sujetos consistentemente en múltiples tejidos, lo que sugiere que factores subyacentes como la gravedad de la enfermedad pueden afectar la calidad del ARN. La capacidad de aislar ARN de alta calidad de tejidos primarios de OA humana proporciona un modelo fisiológicamente relevante para experimentos sofisticados de expresión génica, incluida la secuenciación, que pueden conducir a conocimientos clínicos que se traducen más fácilmente a los pacientes.

Introduction

La rodilla es la articulación sinovial más grande del cuerpo humano, que comprende la articulación tibiofemoral entre la tibia y el fémur y la articulación patelofemoral entre la rótula y el fémur1. Los huesos de la rodilla están revestidos con cartílago articular y soportados por varios tejidos conectivos, incluidos meniscos, grasa, ligamentos y músculos, y una membrana sinovial encapsula toda la articulación para crear una cavidad llena de líquido sinovial1,2,3 (Figura 1). Una rodilla sana funciona como una articulación de bisagra móvil que permite un movimiento sin fricción en el plano frontal1,3. En condiciones patológicas, el movimiento puede volverse restringido y doloroso. La enfermedad degenerativa de la articulación de la rodilla más común es la osteoartritis (OA)4. Se sabe que una variedad de factores de riesgo predisponen al desarrollo de OA, incluida la edad avanzada, la obesidad, el sexo femenino, el trauma articular y la genética, entre otros5,6. Actualmente se estima que hay 14 millones de personas en los Estados Unidos con OA de rodilla sintomática, con la prevalencia aumentando debido al aumento de la edad de la población y las tasas de obesidad7,8. Inicialmente considerada como una enfermedad del cartílago, la OA ahora se entiende como una enfermedad de toda la articulación9. Los cambios patológicos comúnmente observados en la OA incluyen erosión del cartílago articular, formación de osteofitos, engrosamiento óseo subcondral e inflamación de la membrana sinovial9,10. Dado que no existe una cura conocida para la OA, los tratamientos se centran principalmente en el manejo de los síntomas (por ejemplo, dolor)11,12, y una vez que la OA ha progresado a la etapa final, la cirugía de reemplazo articular a menudo está indicada13.

Las cirugías de reemplazo articular pueden ser reemplazos parciales o totales de rodilla, con artroplastia total de rodilla (TKA) que incluye el reemplazo de toda la articulación tibiofemoral y la articulación patelofemoral. A partir de 2020, aproximadamente 1 millón de TKAs se realizan en los EE.UU. cada año14. Durante la TKA, un cirujano ortopédico resecta la parte superior de la meseta tibial y los cóndilos femorales inferiores(Figura 2A,2B)para ser equipado con implantes protésicos. A veces malinterpretado por los pacientes, en un TKA, solo se resejan 8-10 mm del extremo de cada hueso, que posteriormente se tapa o resurge, con metal. Un revestimiento de polietileno interpuesto forma la superficie del rodamiento (es decir, el acolchado) entre los dos implantes metálicos. Además, varios componentes de tejidos blandos de la articulación se extirpan total o parcialmente para lograr un equilibrio articular adecuado. Entre estos tejidos se encuentran los meniscos medial y lateral(Figura 2C),almohadilla de grasa infrapatelar(Figura 2D),ligamento cruzado anterior (LCA; Figura 2E),sinovial(Figura 2F),y músculo oblicuo vasto medialis (VMO; Figura 2G) 15. Aunque los TKAs son generalmente exitosos para el tratamiento de la OA, alrededor del 20% de los pacientes reportan recurrencia del dolor después de la cirugía16. Junto con el alto costo y la relativa invasividad del procedimiento, estas limitaciones apuntan a la necesidad de más investigación para identificar tratamientos alternativos para mitigar la progresión de la OA.

Para explorar los mecanismos de la enfermedad en la OA que pueden presentar nuevas vías para la intervención terapéutica, se pueden utilizar sistemas experimentales, incluidas células, explantes de tejidos y modelos animales. Las células se cultivan típicamente en monocapa y se derivan de tejidos humanos o animales primarios (por ejemplo, condrocitos aislados del cartílago) o células inmortalizadas (por ejemplo, ATDC517 y CHON-00118). Si bien las células pueden ser útiles para manipular variables experimentales en un entorno de cultivo controlado, no capturan las condiciones de la articulación natural que se sabe que afectan los fenotipos celulares19. Para recapitular mejor la compleja cascada de comunicación química, mecánica y de célula a célula subyacente a la OA, se encuentra una alternativa en muestras primarias de tejido humano o animal, ya sea que se utilicen frescas o cultivadas ex vivo como explantes, para preservar la estructura del tejido y el microambiente celular20. Para estudiar la articulación in vivo,también son útiles los modelos animales pequeños (por ejemplo,ratón 21)y grandes (por ejemplo, caballo22)para OA (por ejemplo, a través de inducción quirúrgica, alteración genética o envejecimiento). Sin embargo, la traducción de estos modelos a la enfermedad humana puede estar limitada por diferencias anatómicas, fisiológicas y metabólicas, entre otras23. Teniendo en cuenta las ventajas y desventajas de los sistemas experimentales, las fortalezas clave de ser específico de la especie y mantener el nicho extracelular ofrecido por los tejidos primarios de OA humana maximizan el potencial de traducción de los hallazgos de la investigación.

Los tejidos primarios de OA humana se pueden obtener fácilmente después de la TKA, lo que hace que la alta frecuencia de TKA sea un recurso valioso para la investigación. Entre las posibles aplicaciones experimentales se encuentran la expresión génica y los análisis histológicos. Para darse cuenta del potencial de los tejidos primarios de OA humana para estos enfoques de investigación y otros, se describen las siguientes consideraciones clave. En primer lugar, el uso de muestras de pacientes está sujeto a regulación ética, y los protocolos deben cumplir con las aprobaciones de la Junta de Revisión Institucional (IRB)24. En segundo lugar, la heterogeneidad inherente de los tejidos primarios enfermos humanos y la influencia de variables como la edad y el sexo, entre otras, crean la necesidad de una cuidadosa selección del paciente (es decir, la aplicación de criterios de elegibilidad) y la interpretación de los datos. En tercer lugar, las propiedades biológicas únicas de diferentes tejidos en la articulación (por ejemplo, baja celularidad del cartílago y el menisco25)pueden presentar desafíos durante los experimentos (por ejemplo, aislar alta calidad y cantidad de ARN). Este informe aborda estas consideraciones y presenta un protocolo para la selección de pacientes, el procesamiento de muestras, la homogeneización de tejidos, la extracción de ARN y el control de calidad (es decir, la evaluación de la pureza e integridad del ARN; Figura 3) fomentar el uso de tejidos primarios de OA humana en la comunidad investigadora.

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Protocol

Este protocolo de estudio fue aprobado y siguió las pautas institucionales establecidas por la Junta de Revisión Institucional del Sistema de Salud Henry Ford (IRB # 13995).

1. Selección de pacientes

  1. Identifique a los pacientes de entre los programados para someterse a TKA con un cirujano ortopédico.
  2. Seleccionar a los pacientes en función de los criterios de elegibilidad definidos por el protocolo del estudio. Ejemplos de criterios de inclusión incluyen tener 18 años de edad o más y tener un diagnóstico confirmado de osteoartritis de rodilla. Los ejemplos de criterios de exclusión incluyen someterse a un reemplazo parcial de rodilla o tener un diagnóstico confirmado de artritis reumatoide.
  3. Póngase en contacto con los pacientes para obtener el consentimiento informado antes de la cirugía.

2. Procesamiento de muestras (para ARN)

NOTA: Realice todo el procesamiento de tejidos en un gabinete de bioseguridad de clase II y siga técnicas estériles. Siempre use epp apropiado (guantes de nitrilo, bata de laboratorio, gafas de seguridad) al procesar muestras humanas. Varios fragmentos de hueso se producen durante la TKA, una gran cantidad de hueso / cartílago estará potencialmente disponible para la disección. Debido a la progresión de la enfermedad, la degeneración del cartílago articular puede ser más grave en algunas porciones óseas, lo que se puede tener en cuenta en el diseño experimental. Solo los tejidos que exigen electrocauterización para la resección tienen daño térmico en el borde, y se realiza un esfuerzo quirúrgico concertado para obtener la mayoría de los tejidos con un bisturí para minimizar el daño. Los tejidos resecados deben mantenerse hidratados en todo momento con PBS estéril.

  1. Desinfecte todas las superficies y equipos de trabajo con etanol al 70%, descontaminante RNasa, agua tratada con DEPC y, nuevamente, con etanol al 70%. Limpie el líquido residual con pañuelos limpios y sin pelusa. Las torzas, los cortadores de huesos y los bisturíes se colocan en autoclave o se empapan en etanol al 70% durante al menos 10 minutos antes de su uso. Mantenga el equipo sumergido en etanol al 70% cuando no esté en uso inmediato.
  2. Pre-etiquetar al menos tres crioviales con el nombre de la muestra no identificado y el número de alícuota para cada tejido (por ejemplo, cartílago TKA-1 1).
    1. Identifique cada tipo de tejido de la muestra en función de las diferencias de tamaño, forma, color y textura como se muestra y describe en la Figura 2. Identificar el cartílago(Flecha Figura 2A), hueso(Flecha Figura 2B), menisco(Figura 2C),almohadilla grasa infrapatelar(Figura 2D),ligamento cruzado anterior(Figura 2E),sinovial(Figura 2F),y el músculo oblicuo vasto medialis(Figura 2G).
  3. Aislar el cartílago articular.
    1. Seleccione una porción ósea con una degradación mínima del cartílago.
    2. Usando un bisturí No.10, corte la profundidad del cartílago en la medida de lo posible para diseccionar todo el grosor de la capa de cartílago.
      NOTA: Un bisturí No.10 solo penetrará en el cartílago, no en el hueso.
    3. Usando todo el grosor del cartílago, diseccione tres cubos de 5 mm.
  4. Aislar el hueso subcondral.
    1. Use la misma sección ósea de la que se recolectó el cartílago.
    2. Usando un bisturí No.10, raspe el cartílago restante y los tejidos residuales de la superficie ósea.
    3. Sostenga la porción de hueso que se cortará con fórceps y use los cortadores de hueso para cortar tres cubos de 5 mm.
  5. Aislar el menisco.
    1. Identifique una porción relativamente no dañada del menisco medial o lateral.
    2. Usando un bisturí No.10 y fórceps, disecciona tres cubos de 5 mm.
  6. Aísle la almohadilla de grasa infrapatelar.
    1. Usando un bisturí No.10 y fórceps, corte la porción amarilla del tejido en tres porciones de igual tamaño y homogéneas (~ 500 mg cada una).
  7. Aislar el ligamento cruzado anterior (LCA).
    1. Usando un bisturí No.10 y fórceps, disecciona tres cubos de 5 mm.
  8. Aislar la membrana sinovial.
    1. Usando un bisturí No.10 y forrórceps, aísle la porción celular rosa de la membrana tanto como sea posible raspando el tejido graso.
    2. Diseccionar tres porciones de igual tamaño y homogéneas (~200 mg cada una).
  9. Aislar el músculo oblicuo vasto medialis (VMO).
    1. Usando un bisturí No.10 y forrórceps, elimine cualquier tejido graso de la muestra, dejando solo el tejido muscular rojo.
    2. Diseccionar tres cubos de 5 mm.
      NOTA: El tamaño inicial del tejido limita el tamaño de las porciones.
  10. Enjuague las porciones de tejido con PBS estéril para eliminar cualquier residuo o desecho.
  11. Para realizar la histología, fije cada porción de tejido como se describe en la Parte 3.
  12. Para realizar la extracción de ARN, corte cada una de las tres porciones de tejido en trozos más pequeños (cubos de ~ 1-2   mm).
    1. Transfiera las piezas más pequeñas a un criovial de 2 ml, asegure las tapas herméticamente, congele rápidamente sumergiéndose en nitrógeno líquido durante 30 s, y luego transfiera a un congelador de -80 ° C para su almacenamiento a largo plazo (hasta 4 meses probado en el protocolo actual). Repita esto para todas las alícuotas de todos los tejidos.
    2. Continúe con la homogeneización de tejidos como se describe en la Parte 4.

3. Procesamiento de muestras (para histología)

PRECAUCIÓN: La formalina es un producto químico peligroso, solo se usa en una campana de humos químicos.

  1. Llene los tubos cónicos preeticalados de 15 ml con solución de formalina al 10%.
  2. Con bórceps, transfiera la sección de tejido a los tubos llenos de formalina.
  3. Fije los tejidos en formalina durante 1 semana a temperatura ambiente mientras agita / agita si es posible.
  4. Después de 1 semana, deseche la formalina en la eliminación adecuada de desechos químicos, enjuague los tejidos con PBS y luego transfiera a un tubo cónico fresco de 15 ml que contenga etanol al 70% para su almacenamiento a largo plazo a 4 ° C hasta que las muestras se incrusten para la sección.
    NOTA: Solo para huesos/cartílagos, realice la descalcificación de la siguiente manera.
  5. Después de 1 semana, deseche la formalina en la eliminación adecuada de desechos químicos y enjuague los tejidos con PBS.
  6. Transfiera el tejido a un tubo cónico de 50 ml con 45 ml de solución de EDTA al 10% (pH 7.4).
  7. Si no es posible agitar/agitar, invierta los tubos 10-15 veces al día.
  8. Deseche y reemplace la solución de EDTA una vez a la semana.
    1. Dos veces por semana, pruebe la textura con un instrumento (es decir, espátula) o un dedo enguantado para confirmar la descalcificación observando la deformación cuando se aplica presión. El tiempo requerido para descalcificar el tejido óseo variará entre muestras de 4 a 6 semanas.
  9. Una vez descalcificado, enjuague el tejido con PBS y transfiéralo a un tubo cónico fresco de 15 ml que contenga 70% de etanol para su almacenamiento a largo plazo a 4 ° C hasta que las muestras se incrusten para la sección.

4. Homogeneización tisular

PRECAUCIÓN: El protocolo utiliza el químico peligroso fenol. El trabajo con fenol debe realizarse en una campana de humos químicos.

NOTA: Limpie a fondo todos los equipos y superficies que se utilizarán con etanol al 70% (remoje durante un mínimo de 10 minutos), seguido de descontaminante RNasa (remoje durante un mínimo de 10 minutos), enjuague con agua tratada con DEPC, limpie con una toalla de papel limpia y sin pelusa, y luego vuelva a pulverizar o remojar con etanol al 70%.

  1. Homogeneización de tejidos duros (cartílago articular, hueso subcondral, menisco)
    1. Antes de la homogeneización, enfríe el mortero, el mortero y la espátula con nitrógeno líquido. Estos deben mantenerse lo más fríos posible para evitar el deshielo de la muestra.
    2. Procese las muestras una a la vez, manteniendo las otras muestras a -80 °C hasta que se utilicen.
    3. Transfiera la muestra de tejido al mortero utilizando una espátula refrigerada; vierta nitrógeno líquido adicional sobre el tejido y deje que se evapore. Aplasta el tejido con el mortero. Agregue repetidamente más nitrógeno líquido a la muestra de tejido, deje que se evapore y luego continúe moliendo con el mortero para hacer un polvo fino.
    4. Después de pulverizar el tejido tanto como sea posible, transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml preenfriado.
      1. Pre-enfriar los tubos sumergiéndolos en nitrógeno líquido durante 30 s antes de la transferencia de tejido.
    5. Agregue 1 ml de la solución de ácido-guanidinio-fenol a cada tubo y manténgalo en hielo.
    6. Repita los pasos 4.1.3-4.1.5 para cada muestra de tejido duro.
    7. Después de cada tejido, limpie el mortero, el mortero y la espátula con etanol al 70%, descontaminante RNasa, agua tratada con DEPC y un remojo adicional en etanol al 70%. Limpie cualquier líquido residual con un pañuelo limpio y sin pelusa.
    8. Incubar las muestras en hielo durante 20 minutos adicionales.
  2. Homogeneización de tejidos blandos (almohadilla de grasa infrapatular, LCA, sinovial, VMO)
    1. Desinfecte el homogeneizador haciendo correr tubos de etanol al 70%, descontaminante RNasa, agua tratada con DEPC y un lavado adicional de etanol al 70%, cada uno durante 30 s. Limpie cualquier líquido residual con un pañuelo limpio y sin pelusa. Repita esto entre cada muestra.
    2. Pre-etiqueta 5 ml de tubos de fondo redondos para cada muestra. Agregue 1 ml de la solución de ácido-guanidinio-fenol a cada tubo.
      1. Trabaje en una muestra a la vez, manteniendo otras muestras para ser procesadas a -80 °C hasta su uso.
    3. Transfiera el tejido a un tubo de 5 ml preetitiqueta con ácido-guanidinio-fenol.
    4. Homogeneizar los tejidos en pulsos de 30 s, manteniéndose en hielo durante y entre pulsos. Repetir hasta que el tejido se disuelva visualmente o durante un máximo de cinco pulsos de 30 s.
      NOTA: Algunos tejidos fibrosos (es decir, músculo) pueden no homogeneizarse completamente.
    5. Incubar el tejido disuelto en hielo y pasar a la siguiente muestra.
      1. Limpie el homogeneizador como se describe en el paso 4.2.1. Asegúrese de que los trozos de tejido no permanezcan en los dientes de la sonda; retirar con pórceps estériles si es necesario.
    6. Después de la homogeneización de todas las muestras, incubar en hielo en ácido-guanidinio-fenol durante 20 minutos adicionales.
    7. Transfiera las muestras de los tubos de fondo redondos a los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml preetitiqueados y preenfriados.

5. Extracción de ARN de los tejidos

PRECAUCIÓN: Este protocolo utiliza productos químicos peligrosos como fenol, cloroformo e isopropanol. Realiza todo el trabajo en una campana extractora de humos químicos.

NOTA: El equipo y los reactivos están reservados solo para el trabajo de ARN y deben ser de grado químico adecuado para aplicaciones moleculares (es decir, estériles, libres de nucleasas). Este protocolo sucede a los protocolos de homogeneización de tejidos de las partes 4.1 y 4.2. Limpie a fondo todos los equipos y superficies que se utilizarán con etanol al 70% (remojo durante un mínimo de 10 min), seguido de descontaminante RNasa (remojo durante un mínimo de 10 min). Enjuague con agua tratada con DEPC, limpie el líquido residual con una toalla de papel limpia y sin pelusa, y luego vuelva a pulverizar o remojar con etanol al 70%.

  1. Centrifugar los tubos de la microcentrífuga a 10000 x g durante 10 min a 4 °C para peletizar los escombros.
  2. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 ml.
    NOTA: Para los tejidos grasos, una capa lipídica a veces estará presente en la parte superior. Evite transferir esto perforando la capa en el lado del tubo con una punta de pipeta.
  3. Añadir 200 μL de cloroformo por 1 ml de la solución de ácido-guanidinio-fenol a cada muestra. Agite los tubos vigorosamente a mano durante 30 s para mezclar. Luego, incubar en hielo durante 2 min.
  4. Muestras de centrífugas a 10000 x g durante 12 min a 4 °C.
    NOTA: Después de la centrifugación, se habrán formado tres capas: una fase acuosa que contiene ARN, una interfase de ADN blanco y una fase de proteína rosa en la parte inferior.
  5. Transfiera ~ 500 μL de la fase acuosa superior a un tubo de microcentrífuga fresco de 1.5 ml.
    NOTA: No altere la interfase y las fracciones de proteínas. Almacene estas fases a -80 °C para futuros aislamientos de ADN o proteínas.
  6. Agregue un volumen igual de solución de ácido-guanidinio-fenol a la fase acuosa transferida, mezcle invirtiendo el tubo 8-10 veces. Incubar el tubo en hielo durante 20 min.
  7. Añadir 200 μL de cloroformo por 1 ml de la solución de ácido-guanidinio-fenol a cada muestra. Agitar vigorosamente a mano durante 30 s para mezclar y luego incubar en hielo durante 2 min.
  8. Muestras de centrífugas a 10000 x g durante 12 min a 4 °C.
  9. Transfiera <500 μL de la fase acuosa a un tubo de microcentrífuga fresco, con cuidado de no contaminar la muestra con las otras fases.
    PRECAUCIÓN: Deseche las fases restantes con los métodos apropiados de eliminación de materiales peligrosos.
  10. Añadir un volumen igual (como fase acuosa) de 100% de isopropanol a cada muestra. Mezclar invirtiendo el tubo 8-10 veces. Incubar en hielo durante 5 min.
    1. Agregue 1 μL de coprecipitante de glucógeno a cada muestra para ayudar a localizar el pellet de ARN después de la centrifugación.
  11. Centrifugar las muestras a 12000 x g durante 25 min a 4 °C.
  12. Ubique el gránulo en el tubo (si usa coprecipitant, aparecerá azul). Vierta con cuidado el sobrenadante.
  13. Lave el pellet agregando 1 ml de etanol helado al 75% a cada muestra, vórtice para desalojar el pellet del fondo del tubo.
    NOTA: Prepare etanol al 75% utilizando etanol puro de grado molecular y agua libre de nucleasas.
  14. Centrifugadora a 7000 x g durante 5 min a 4 °C. Vierta con cuidado el sobrenadante.
  15. Repita los pasos 5.13 y 5.14 dos veces más.
  16. Giro rápido (<2000 x g durante 5 s) para llevar cualquier líquido residual al fondo del tubo. Use una pipeta P20 para eliminar cualquier etanol residual de la parte inferior de los tubos.
    1. Evite tocar el pellet de ARN con una punta de pipeta. Cambiar consejos entre muestras.
  17. Con las tapas de los tubos abiertas, seque al aire las muestras a temperatura ambiente durante 10 min.
    NOTA: El pellet puede volverse translúcido a medida que se seca. Asegurarse de que todo el etanol residual se haya evaporado mejorará la pureza del ARN.
  18. Agregue 25 μL de agua libre de nucleasa a cada tubo para disolver el pellet.
  19. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
  20. Pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar el ARN.
  21. Alícuota de 5 μL de la muestra en un tubo fresco para el análisis de control de calidad (Parte 6). Almacene los 20 μL restantes a -80 °C para los ensayos de expresión génica.

6. Control de calidad

  1. Determine la concentración y pureza del ARN utilizando un espectrofotómetro de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  2. Determine la integridad del ARN utilizando un dispositivo de electroforesis de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    NOTA: Diluya el ARN para que esté dentro del rango de los límites de detección del chip.

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Representative Results

Siete tejidos únicos de la articulación de la rodilla humana están disponibles para su recolección de pacientes sometidos a ATC para OA(Figura 1). En este protocolo, cada uno de estos tejidos fue identificado y procesado dentro de las 4 h de la extirpación quirúrgica (Figura 2). Siguiendo los pasos descritos en la Figura 3,las porciones de cada tejido se fijaron en formalina para la evaluación histológica(Figura 4),mientras que otras porciones se congelaron para el aislamiento de ARN. Separando los tejidos duros de los tejidos blandos por método de desintegración (pulverización versus homogeneización, respectivamente), se extrajo ARN de alta integridad y pureza de cada tipo de tejido, con resultados representativos mostrados en la Tabla 1 (Columnas de alta calidad). En particular, algunos sujetos produjeron ARN de menor calidad en múltiples tejidos(Tabla 1,Columnas de baja calidad), lo que sugiere que, a pesar de un método optimizado, los factores externos (por ejemplo, la gravedad de la enfermedad) pueden estar afectando la calidad del ARN en todos los tipos de tejidos.

Figure 1
Figura 1: Esquema de la articulación de la rodilla humana que muestra una sección transversal lateral. Cada uno de los siete tejidos etiquetados se recolecta durante la TKA y se utiliza con fines de investigación como se describe en este protocolo. VMO = músculo oblicuo vasto medialis. Imagen accedida y modificada desde OpenStax College bajo una licencia creative commons26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imágenes brutas representativas para cada uno de los siete tejidos obtenidos de pacientes sometidos a TKA. (A) Corte del hueso femoral anterior con flecha apuntando al cartílago articular a recoger. El cartílago se identifica por una capa blanquecina que se encuentra en la superficie del hueso. (B) Corte de hueso femoral anterior con flecha apuntando al hueso subcondral a recoger. C)Menisco. Evite la recolección de secciones quemadas causadas por electrocauterización durante la TKA. (D) Almohadilla de grasa infrapapelar (de color amarillo). (E) Ligamento cruzado anterior (tejido blanco, fibroso, esponjoso). (F) Sinovial. Un lado aparecerá de color claro y fibroso, a menudo conteniendo tejido graso, mientras que el lado opuesto aparecerá rosado y menos fibroso. El lado rosado de la membrana contiene el revestimiento sinovial. (G) Músculo oblicuo vastus medialis (rojo). Esto a menudo puede ser la porción de tejido más pequeña y puede contener algo de tejido graso. Barra de escala = 2 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Descripción general de los pasos tomados para recolectar tejidos primarios de OA humana para histología y ARN. Este protocolo describe la selección de pacientes, el procesamiento de muestras para histología y ARN, la homogeneización de tejidos para tejidos duros y tejidos blandos, la extracción de ARN y el control de calidad para siete tejidos primarios de OA de rodilla humana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Secciones histológicas para cada uno de los siete tejidos obtenidos de pacientes sometidos a TKA. Las secciones teñidas de hematoxilina y eosina se muestran con un aumento de 6x en los paneles A-F con un recuadro magnificado a 40x en los paneles A'-F' y A". (A, A') Cartílago articular; (A, A") hueso subcondral; (B, B ') menisco; (C, C ') almohadilla de grasa infrapatular; (D, D ') ligamento cruzado anterior; (E, E') sinovial; (F, F ') músculo oblicuo vasto medialis. Barras de escala = 400 μm para A-F y 50 μm para A'-F' y A". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tejido N RIN [ARN] (ng/μL) en 25 μL A260:A280 A260:A230
Alta calidad Baja calidad Alta calidad Baja calidad Alta calidad Baja calidad Alta calidad Baja calidad Alta calidad Baja calidad
"Tejidos duros"
Cartílago articular 10 4 7,0 ± 0,8 1.3 ± 1.2 135
(36-243)		 46
(26-78)		 1,80 ± 0,09 1,47 ± 0,34 1,40 ± 0,36 0,45 ± 0,26
Hueso subcondral 10 4 7,8 ± 0,6 3.6 ± 1.1 514
(181-1586)		 342
(122-769)		 1,96 ± 0,05 1,90 ± 0,17 1,72 ± 0,27 1,12 ± 0,62
Menisco 10 4 7,5 ± 0,6 2,4 ± 0,3 242
(38-1629)		 95
(60-318)		 1,91 ± 0,05 1,71 ± 0,15 1,41 ± 0,47 0,77 ± 0,59
"Tejidos blandos"
Almohadilla de grasa infrapapelante 10 3 8,5 ± 0,6 6.1 ± 1.4 1905
(668-5100)		 1151
(381-2306)		 1,99 ± 0,01 2,02 ± 0,03 2,09 ± 0,17 1,47 ± 0,71
Ligamento cruzado anterior 8 3 7,4 ± 0,4 5.2 ± 1.9 1836
(613-8456)		 727
(97-1479)		 1,97 ± 0,03 1,91 ± 0,18 1,88 ± 0,20 1,35 ± 0,70
Sinovial 9 3 8,5 ± 0,6 6.2 ± 3.1 2239
(401-4100)		 1897
(902-3366)		 1,99 ± 0,04 2.00 ± 0.03 2,05 ± 0,11 1,91 ± 0,20
Vastus Medialis Oblicuo 9 3 8,5 ± 0,6 8,4 ± 0,7 1002
(377-1715)		 1097
(308-2138)		 1,96 ± 0,03 1,99 ± 0,03 1,82 ± 0,11 1,62 ± 0,27

Tabla 1. Calidad y cantidad de ARN aislado de tejidos de OA recolectados de pacientes con ATC. RIN = Número de integridad de ARN. Los datos presentados como media ± desviación estándar para RIN, A260:A280 y A260:A230 relaciones, y media (rango) para los valores de concentración de ARN. Las muestras de alta calidad consisten en pacientes de los cuales todos los tipos de tejido produjeron ARN con RIN > 6 (n = 8-10). Las muestras de baja calidad consisten en pacientes de los cuales múltiples tipos de tejido produjeron ARN con RIN < 6 (n = 3-4).

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Discussion

El protocolo presentado ha demostrado ser exitoso para la recolección de siete tejidos primarios de OA humana para la extracción de ARN(Tabla 1)y el procesamiento histológico(Figura 4). Antes de recolectar muestras de pacientes, es necesario establecer un protocolo aprobado por el IRB, idealmente en colaboración con un cirujano o equipo quirúrgico. La aplicación de un protocolo estandarizado para la recolección de muestras (por ejemplo, la resección desde ubicaciones in situ consistentes) es esencial para maximizar la reproducibilidad experimental. Las muestras de tejido deben transportarse al laboratorio en recipientes estériles y procesarse dentro de las 4 h posteriores a la cirugía para evitar la degradación. Durante la disección y el procesamiento de tejidos, todos los tejidos se mantienen hidratados en PBS estériles y se enjuagan en PBS frescos y estériles para eliminar posibles contaminantes superficiales como biofluidos y otros desechos no deseados antes de ser congelados para la extracción de ARN o fijados con formalina para histología. Una aplicación útil del análisis histológico es la confirmación de los tipos de tejido y la gravedad de la enfermedad, ya que estos pueden distinguirse por número de células, distribución y morfología, entre otros factores observables por tinciones estándar como la hematoxilina y la eosina(Figura 4).

Los tejidos primarios de OA humana pueden presentar desafíos para extraer ARN de cantidad y calidad suficientes, según lo definido por la pureza y laintegridad 27. La cantidad de ARN es una función de la celularidad general del tejido, y en la articulación de la rodilla, hay tejidos de células bajas y de matriz alta, como el cartílago, el hueso y el menisco, y tejidos relativamente altos y de matriz baja, como la almohadilla de grasa, el LCA, la membrana sinovial y la VMO. Por ejemplo, tanto el cartílago hialino articular como el fibrocartílago meniscal28 se caracterizan por una baja celularidad, con la matriz extracelular que contiene cantidades variables de colágenos, proteoglicanos y otras glicoproteínas28,29. Tener menos células resulta en menos ARN por volumen de tejido (reduciendo la cantidad) y tener más proteínas resulta en co-purificación con ARN (reduciendo la pureza)25,30. La pureza del ARN se puede determinar mediante espectrofotometría donde A260:A280 y A260:A230 valores de <1.5 reflejan la presencia de contaminantes orgánicos (por ejemplo, proteínas) y los valores de ~ 2.0 reflejan ARN puro31. La integridad del ARN refleja el nivel de degradación, ya sea causada por condiciones experimentales (es decir, fuerzas de cizallamiento) o por digestión enzimática (por ejemplo, nucleasas), y a menudo se determina mediante análisis electroforético. Un número de integridad de ARN (RIN) de 1 refleja el ARN degradado y un RIN de 10 refleja el ARN intacto31,32. Para la secuenciación de ARN, a menudo se recomienda un RIN mínimo de 733,34,35. Los datos presentados en la Tabla 1 revelan que estos umbrales A260:A280, A260:A230y RIN se cumplieron en todos los tejidos de las muestras de pacientes en el grupo de ARN de alta calidad en comparación con las muestras de pacientes en el grupo de ARN de baja calidad, excepto algunos A260:A230 valores, que pueden reflejar la contaminación proteica del ARN en los tejidos de células bajas y matriz alta. Si bien hay muchos factores que podrían estar contribuyendo a la calidad del ARN aislado de una muestra de paciente determinada, entre ellos puede estar el nivel de gravedad de la enfermedad. La naturaleza enferma de los tejidos de OA sugiere que los procesos degradativos están ocurriendo a través de mayores niveles de enzimas que pueden digerir los tejidos, pero también el ARN, reduciendo así la calidad.

Este protocolo para la extracción de ARN tiene como objetivo maximizar la cantidad y calidad de ARN de los tejidos primarios de OA humana. El paso más crítico se refería a si los tejidos se desintegraban al ser pulverizados u homogeneizados, y se encontró que esto se correlacionaba con la celularidad del tejido y la composición de la matriz. Inicialmente, los siete tejidos se sometieron al mismo protocolo en el que los tejidos se pulverizaron primero con mortero y mortero utilizando nitrógeno líquido, luego se transfirieron a una solución de ácido-guanidinio-fenol y se homogeneizaron aún más utilizando un homogeneizador de tejido de mano. Este método produjo un rendimiento de ARN favorable, pureza e integridad para la almohadilla de grasa, el LCA, la membrana sinovial y la VMO (tejidos blandos colectivos; también, células relativamente altas, matriz baja), pero resultados desfavorables para el cartílago, el hueso y el menisco (tejidos colectivamente duros; también, células bajas, matriz alta). Sobre la base de estas observaciones, los siete tejidos se dividieron en dos grupos para un mayor refinamiento del protocolo. Se observó que la homogeneización adicional tuvo un efecto mínimo en la desintegración adicional de los tejidos duros después de que habían sido pulverizados en un polvo fino. Por el contrario, la disociación de los tejidos blandos se logró con éxito con homogeneización sola y no requirió pulverización. Por lo tanto, se eliminó la homogeneización de los tejidos duros y la pulverización de los tejidos blandos. Esto fue beneficioso para minimizar las fuerzas de cizallamiento, el tiempo de procesamiento y la fluctuación de la temperatura, todo lo cual puede mejorar la integridad del ARN. Se realizaron dos rondas de separación de fase fenol/cloroformo para los siete tejidos, ya que se ha informado que esto mejora la pureza del ARN sin reducir el rendimiento31.

Una limitación potencial de este protocolo es el efecto por lotes que puede surgir de la separación de los tejidos en dos grupos si el diseño experimental requiere la comparación entre todos los tejidos. El uso de métodos de pulverización versus homogeneización puede alterar las condiciones técnicas (por ejemplo, el tiempo de procesamiento) y ambientales (por ejemplo, las fluctuaciones de temperatura) que pueden introducir variabilidad36. Una segunda limitación es la posible inconsistencia en la identificación, disección y orientación (para la seccionamiento histológico) de los tejidos dentro y entre los sujetos. Una tercera limitación es nuestra incapacidad para confirmar las posibles correlaciones entre la gravedad de la enfermedad del paciente y la calidad del ARN en el informe actual. Una cuarta limitación es la falta de disponibilidad de tejidos de control sanos para la comparación. Aunque las muestras de control pueden estar disponibles de cadáveres, estos son menos fácilmente disponibles que los tejidos de OA de TKA. Una estrategia experimental para eludir esto es utilizar a cada sujeto como su propio control, ya sea haciendo comparaciones entre tejidos o dentro de tejidos comparando el tratamiento con el control o lesionados a áreas preservadas. Finalmente, el uso de explantes de tejido para la extracción de ARN no permite el análisis de la expresión génica de los tipos de células individuales que comprenden los tejidos (por ejemplo, fibroblastos sinoviales versus macrófagos sinoviales37).

A pesar de las limitaciones observadas, los tejidos primarios de OA humana son un recurso valioso para la investigación, ofreciendo ventajas sobre otros sistemas experimentales para OA, incluida la preservación del nicho celular23. Sin embargo, los tejidos humanos primarios de OA pueden estar subutilizados en la investigación debido a desafíos logísticos o técnicos. Este protocolo describe la selección de pacientes, el procesamiento de muestras, la homogeneización de tejidos, la extracción de ARN y el control de calidad para apoyar el uso de las muestras obtenidas de TKA. Después del procesamiento de muestras, se pueden seguir varios enfoques experimentales, incluida la expresión génica y la histología, entre otros. Lo más relevante para el campo ómico en rápida evolución es la capacidad de aislar cantidades suficientes de ARN de alta calidad para aplicaciones como la secuenciación de ARN38,39. Los perfiles moleculares se pueden comparar dentro y a través de tejidos de sujetos con fenotipos específicos de la enfermedad (por ejemplo, en función de la edad, el sexo y otros factores de riesgo de OA). Los conocimientos adquiridos pueden informar nuevas vías terapéuticas que se pueden traducir más fácilmente a la población de pacientes con OA.

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Disclosures

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Acknowledgments

Los autores agradecen a los participantes del estudio que hicieron posible esta investigación y dedican este informe a los nuevos científicos en el campo de la osteoartritis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 05 402 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% Formalin Cardinal Health C4320-101 Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific ICN19400290 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific BP2818500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific AC327272500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent Alcohol Cardinal Health C4305 Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishes Thermo Scientific 12-556-003 Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 14 959 53A Sterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded) Fisher Scientific 10 500 26 Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubes Corning 352052 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 12 565 271 Sterile, nuclease-free.
Bioanalyzer Agilent G2939BA For RNA integrity measurement.
Biosafety Cabinet General lab equipment
Bone Cutters Fisher Scientific 08 990 Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume Hood General lab equipment
Disposable Scalpels (No.10) Thermo Scientific 3120032 Sterile, nuclease-free.
EDTA Life Technologies 15-576-028 10% solution with dH2O.
Forceps Any vendor Sterilized with 70% EtOH.
Glycoblue Coprecipitant Fisher Scientific AM9516 Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Liquid Nitrogen Any vendor
Liquid Nitrogen Dewar General lab equipment
Mortar and Pestle Any vendor Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000 For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated water Fisher Scientific Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile) Gibco 20 012 050 Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips Any vendor Sterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kit Qiagen 217204
Refrigerated Centrifuge 5810R Eppendorf 22625101
RNAlater Thermo Scientific 50 197 8158 Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZap Fisher Scientific
7002
Spatula (semimicro size) Any vendor Reserved for RNA work only.
Tissue homogenizer Pro Scientific 01-01200 Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol Reagent Fisher Scientific 15 596 026 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.

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Biología Número 173
Recolección de tejidos y extracción de ARN de la articulación de la rodilla osteoartrítica humana
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Wilson, T., Kaur, N., Davis, J.,… More

Wilson, T., Kaur, N., Davis, J., Ali, S. A. Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint. J. Vis. Exp. (173), e62718, doi:10.3791/62718 (2021).

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