Summary
ここでは、幼虫期 4C.エレガン スから活性核抽出物を単離し、 インビトロ 系で転写活性を可視化するための詳細なプロトコルについて説明する。
Abstract
カエノハブディティス・エレガンスは、1963年に導入されて以来、生物研究にとって重要なモデルシステムとなっています。しかし、C.エレガンスは、インビトロ転写やDNA複製などの核抽出物を用いた生物学的反応の生化学的研究に十分に利用されていない。生化学的研究でC.エレガンスを使用するための重要なハードルは、核抽出物の活性を犠牲にすることなく、線虫の厚い外側のキューティクルを破壊することです。ドオンス均質化や超音波処理など、キューティクルを壊すためにいくつかの方法が使用されますが、タンパク質の不安定性につながることがよくあります。インビトロ反応のために、活性核タンパク質を幼虫または成人C.エレガンスから単離するための確立されたプロトコルはありません。ここで、プロトコルは、バルチホモジナイザーを用いた幼虫ステージ4 C.エレガンスの均質化について詳細に説明する。バルチホモジナイザーは、圧力を使用して、その過程でキューティクルを壊す狭い隙間からゆっくりと動物を強制します。バルチホモジナイザーの均一な設計および精密な機械化は実験間の動物の一貫した粉砕を可能にする。バルチホモジナイザーから得られたホモジネートを分画すると、C.エレガンスの転写活性をアッセリングするインビトロ法で使用できる機能的に活性な核抽出物を得る。
Introduction
小さくて自由に生きている線虫カ エノハブディティスエレガンス は、幅広い生物学的問題に取り組むシンプルでありながら強力なモデル生物です。1963年の導入以来、線虫は神経生物学、代謝、老化、発達、免疫、遺伝学1の質問に答えるのに非常に貴重なされています。理想的なモデル生物となる動物の多くの特徴のいくつかは、短い生成時間、RNA干渉の有効性、透明な身体、およびその細胞系統と神経系の両方の完成した地図を含む。
線虫の科学への貢献は膨大ですが、真核転写システムを解明するために十分に利用されておらず、酵母、フルーツフライ、哺乳類細胞培養からの核抽出物を用いた研究から得られたメカニズムに関する理解のほとんどが得ています。研究者が機能性核抽出物を抽出するのを妨げる最大のハードルは、線虫のタフな外キューティクルです。この外骨格は、架橋されたコラーゲン、キューティクリン、糖タンパク質、および脂質を含み、幼虫期から化学的または機械的な力を介したタンパク質抽出に耐性を持つC.エレガンスを作る3。C.エレガンス核抽出物を用いたインビトロ転写システムは、かつて開発されたが、システムの限られた範囲のために広く採用されておらず、抽出物を調製するためのDounceホモジナイザーの使用は、タンパク質不安定性につながる可能性がある4,5。
C.エレガンスを破るためにDounceホモジナイザーを利用した核抽出分離のための以前のプロトコルとは異なり、このプロトコルはバルチホモジナイザーを使用しています。Balchホモジナイザーは2つの主要なコンポーネントから成っている:タングステンカーバイドボールと一方の端から別の端に退屈チャネルを持つステンレス鋼のブロック。バルチホモジナイザーはタングステンカーバイドボールを積み込み、粉砕室を密封するために両側にキャップされます。シリンジは、粉砕室につながる2つの垂直ポートに積み込むことができます。材料が一方の注射器からもう一方のシリンジに粉砕室を通って渡されると、注射器からの圧力は、ボールとチャンバーの壁との間の狭い隙間を通って材料を強制します。この遅く、一定の圧力は、それが容易に狭いギャップを通過することができる一貫したサイズに達するまで材料を壊す。一定でありながら穏やかな圧力を介して狭い隙間を通ってC.エレガンスを強制すると、動物が開き、周囲の緩衝液に内容物が放出されます。ボールサイズの切り替えにより、ギャップがさらに引き締まり、新たに放出された細胞が破壊され、核がバッファに解放されます。遠心分離の複数のインスタンスは、細胞の破片の残りの部分から核を分離し、きれいな核抽出物の収集を可能にする。バルチホモジナイザーは、いくつかの理由からDounceホモジナイザーよりも好ましい:システムは、一度の試みで活性タンパク質の大量を抽出することが可能になり、動物の多数を処理することができます。ボールとスチールブロックの精密な加工は、複数のサンプル間で一貫した研削を可能にします。重い鋼ブロックはヒートシンクとして機能し、均一に研削室から熱を引き出し、変性を防ぎます。
単離後、核抽出物の転写活性は、生化学的実験で使用される前に検証する必要があります。従来、転写活性は、新たに合成されたRNAを追跡および可視化するために、放射性標識ヌクレオチドを用いて測定した。しかし、放射性標識は使用時および処分時に注意を要するため、負担が大きくなる可能性があります。技術の進歩により、研究者は定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)7などの技術を用いて、より有害でない、または面倒な方法を使用して、少量のRNA量を測定することができます。ここで、プロトコルは、幼虫期4(L4) C.エレガンス から活性核抽出物を単離し、 インビトロ 系における転写活性を可視化する方法を説明する。
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Protocol
1. メディアの準備
- メーカーの指示に従って、無菌リソジニーブロス(LB)寒天プレートと液体培地を準備します。
- LB寒天板上のスリーク エシェリヒア大腸菌 (大腸菌)株OP50。一晩で37°Cで細菌ストリークをインキュベートします。
- 大腸菌OP50ストリークプレートはインキュベーション後4°Cで保管してください。大腸菌OP50プレートは、水分損失を防ぐためにパラフィルムで包んだ場合、2週間4°Cで安全に保管することができます。
- 表1のレシピを使用して、ネマトード成長培地(NGM)の2 Lを準備します。
注: ナイスタチンはオプションです。ナイスタチンは、カビ、および他の真菌汚染がNGMプレート上で増殖するのを防ぐのに役立ちます。大きな150のmmの直径の版は、大 腸菌 OP50を注ぎ、播種するために蓋を取り除くときに真菌胞子を捕まえる可能性が高い。ナイスタチンは、10,000単位/mLのベンダーから滅菌溶液にあらかじめ混合して購入することも、滅菌粉末として購入して滅菌水と混合することができます。ナイスタチンはオートクレーブすることも、効果的に殺菌してフィルターすることもできません。無菌技術への注意は、実験室でナイスタチンの溶液を混合しながら重要です.オートクレーブ 1 M CaCl2、1 M KPO4 pH 6.0、1M MgSO4 121 °Cで15分間95%エタノールに溶解した後、0.22 μmフィルターを通してコレステロールを殺菌します。 - 試薬を培地に加えた後、NGMを401mmペトリ皿に注ぎます。各150ミリメートルの皿は、充填するために50 mLを必要とします。NGMプレートを室温で一晩冷まします。
- 前のストリークプレートから大 腸菌 OP50と無菌LBの25 mLを含む2つの50 mL円錐管を接種します。200rpmで維持された振る振るインキュベーターで37°Cで24時間培養します。
注:一貫性を保つには、ストリークプレートから同じ単一コロニーで両方のチューブを接種します。これが困難であることが判明した場合は、50 mL円錐形チューブに単一コロニーを有する無菌LBの5 mLを接種し、NGMプレートを調製する前日に200rpmで維持された振盪インキュベーターで37°Cで16時間培養する。新鮮な液体培養物を4°Cで2日間保存します。25 μLの液体培養液で25mLの2本の液を接種し、上記と同じ条件でインキュベートします。 - 新鮮な 大腸菌 OP50液培養の1mLで新鮮なNGMプレートをシードし、プレートの表面を均等に広げ、プレートの大部分を覆う大きな細菌の芝生を作り出し、端から端に細菌を広げないように注意します。 大腸菌 OP50は、室温で72-96時間、または目に見えて厚い芝生が現れるまで成長させます。
注:24時間後、水分損失を減らし、プレートの寿命を延ばすために、新しく播種したNGMプレートを覆われた容器に移動します。
2. 動物の準備と漂白剤の同期
- 5十分に供給された野生型のグラビッド大人 C.エレガンス を、 大腸菌 OP50を播種した10個の新鮮なNGMプレートのそれぞれに移し、合計50匹の動物を飼育します。
- 動物が卵を産むことを許可します。彼らはグラビド大人の段階に達するまで、子孫は20°Cで成長してみましょう。
- M9バッファー(表2)の15 mLを使用して、10枚のメンテナンスプレートから新しい十分に供給された野生タイプのグラビッドな大人を収集し、動物をラベル付き15 mL円錐形チューブに移します。
- チューブの底にすべての動物をペレットに3分間1,000 x g で動物を遠心分離します。
- 15 mL円錐形チューブにラベルを付けた別の15 mLで、漂白剤の同期のために2 mLの漂白剤を5 mLの1 N NaOHと混合します。完全に混合する溶液を渦。
注:効果的な準備ができている同じ日に漂白剤+NaOH溶液を使用してください。 - 10 mLの滅菌ピペットを使用して遠心動物から上清をそっと取り除きます。動物の破壊を改善するために、できるだけ多くのM9バッファーを除去しよう。
- 動物ペレットに漂白剤+NaOH溶液の500 μLを加え、4分間タイマーを開始します。
- 手で、またはロッカーを使用して、穏やかに動物のペレットを完全に壊すためにチューブを揺らし、動物が漂白剤+NaOH溶液で自由に動くようにします。4分間チューブを揺らし続けます。
注:必要な漂白剤+NaOH溶液の量は、同期する動物ペレットのサイズによって異なる場合があります。動物や漂白剤+NaOH溶液の様々な量を事前にこの技術を最適化します。 - 4分後、解剖顕微鏡で破壊効率を確認します。グラビッド成虫の大半が壊れ、卵を含む内部の内容物が放出されることを確認してください。
- 動物が開いて分割されていない場合は、短時間で最高速度でチューブをボルテックスし、顕微鏡の下でもう一度確認してください。
注:卵は漂白剤+NaOH溶液に耐性がありますが、不浸透ではありません。卵は、必要以上に漂白剤+NaOH溶液にさらしてはならない。動物の破壊ステップ中にあまりにも長い失速は、子孫の発達上の問題につながる可能性があります。 - 壊れた動物の溶液にM9バッファーの10 mLを加えます。
- 卵と残りを1,000xgで3分間遠心します。
- 上清をピペット離れて、チューブの底にすべての卵を含む新しいペレットに触れないようにしてください。
- M9バッファーと遠心分離機を1,000 x gで3分間追加 します。
- 手順 2.13-2.14 をさらに 2 回繰り返して、漂白剤 + NaOH 溶液が残らないようにします。
- 3回目のM9緩衝液洗浄後、上清を取り出し、S基底バッファーの10mLを加える(表2)。
- チューブを反転させて底部のペレットを壊し、卵をバッファーに均等に吊り下げます。
- チューブをロッカーに置き、卵が孵化して幼虫ステージ1(L1)逮捕に達できるように、20°Cで22時間チューブをそっと揺らします。
- 22時間後、1000xgで3分間同期したL1動物を含むチューブを遠心分離 する。
- ピペットをチューブに約1mLのバッファーを残して上清を捨てます。
- マイクロピペットを用いて、動物ペレットを邪魔して、残りの緩衝液中にL1動物の均質な懸濁液を作る。
- L1動物の均質懸濁液の単一の液滴を 、大腸菌 OP50を播種したラベル150mmNGMプレートに移します。
- 解剖顕微鏡を用いて、1滴当たりのL1動物数を視覚的にカウントすることで、ドロップ当たりの動物密度を計算します。 大腸菌 OP50の完全に成長した芝生と150のmm NGMプレートは、グラヴィッド大人の段階に到達するためにL1ステージの最大500匹の動物をサポートすることができます。
- L1動物を大 腸菌 OP50で6つの150mm NGMプレートに移します。プレートを過負荷にしないようにしてください。
注:動物がL1とgravid成体の間の発達に十分な食料を持っているかどうかが不明な場合は、各プレートに動物を少なくし、より多くのプレートを使用してください。 - 彼らはグラビド成虫の段階に到達し、卵を産み始めるまで、動物は20°Cで72時間成長することができます。
- 同期した、よく供給された野生型の大人の動物に漂白剤の同期の第二ラウンドを実行します。
- シンクロナイズしたL1動物を、1皿あたり約1,000匹の大 腸菌 OP50で播種した10個の150mm NGMプレートに置きます。
- 新しい同期L1動物がL4段階に達するまで20°Cで48時間成長させます。
注:目標は、L4動物の約700〜800 μLペレットを得る。動物が多すぎると、バルチホモジナイザーの使用が困難になる可能性があります。これは、ホモジナイザーを操作しながら筋肉の緊張を引き起こす可能性があり、圧力の増加による注射器からの漏出の可能性があります。
3. バルチホモジナイザー調製
- 表 3 および表 4 に記載されているように、低張バッファーと高張バッファーの両方を準備します。
注:低張性および高張性の緩衝液は、事前に調製し、4°Cで安全に保管することができます。 - 70%エタノールで粉砕室をあふれさせることによってバルチホモジナイザーをきれいにし、その後、余分なエタノールを除去するために脱イオン水でチャンバーを洗い流す。
注:苛性剤を使用してバルチホモジナイザーを洗浄しないでください。エタノールと脱イオン水で徹底的に洗い流すだけでは十分です。 - 7.9820 mm (18 μm の隙間) タングステンカーバイドボールを粉砕チャンバーに挿入します。
- バルチホモジナイザーのバレルの両端をキャップし、付属のつまみねじでキャップを固定します。
- サンプルあたり5 mLの「完全な低張性緩衝液」を調製:1 M DTT(最終濃度:1mM DTT)5 μLと100μLの100xプロテアーゼ阻害剤、シングルユースカクテル(最終濃度:2x)を加えます。氷の上に緩衝液を保管してください。
- サンプルあたり5 mLの「完全な高トニックバッファー」を調製:1 M DTT(最終濃度:1 mM DTT)の5 μLと100xプロテアーゼ阻害剤の100 μL、1回使用カクテル(最終濃度:2x)を加えます。氷の上に緩衝液を保管してください。
注: 準備の同じ日に完全な低張と高張バッファーを使用します。後で使用するために保存しないでください。1 M DTT を -20 °C で単独使用のアリコートとして保管してください。 プロテアーゼ阻害剤のシングルユースカクテルを4°Cで保存してください。 - 滅菌2 mLシリンジに1 mLの「完全な低張性緩衝液」を充填し、バルチホモジナイザーの粉砕室を静かに洗い流します。チャンバーに約500 μLの「完全な低張バッファー」を残します。
- 洗い流したホモジナイザーを氷の上に保管し、30分間冷まします。
注:ホモジナイザーは、動物を粉砕する前に氷冷でなければなりません。研削プロセスは、摩擦による熱を発生させ、核タンパク質を変性させることができます。金属ホモジナイザーが氷冷であることを確認して、これを防ぎます。周囲の氷からの水がホモジナイザーに入らないようにしてください。ホモジナイザーに穴を差し込み、意図しない液体が粉砕チャンバーに入るのを妨げるために2つの無菌シリンジを使用してください。
4. 動物の収集
注: クイック リファレンス ガイドが用意されており、動物の収集、破壊、分画の主な手順を示します(図 1)。
- M9バッファーを持つ十分に供給されたL4動物を15 mL円錐管に集め、動物を1000 x g で遠心分離して3分間収集します。上清を取り除き、上清がはっきりするまで動物ペレットを洗浄し続けます。
- 4°C低張性緩衝液の3mLと遠心分離機を1000 x g で3分間洗浄します。
注:4°C低張度バッファーでの最終洗浄中に、動物はチューブの側面にくっつくことがあります。これは正常であり、上清の除去中に動物の小さな損失をもたらす可能性があります。 - 低張バッファーを取り除き、動物ペレットに「完全な低血圧バッファー」の 1 mL を追加します。動物の懸濁液を新しい2 mLの滅菌シリンジに移します。
注:マイクロピペットを使用して動物を注射器に移す間、無菌0.1%Tween20溶液を軽くピペットチップでピペットチップの内側にコーティングし、ピペットチップの壁に付着して失われた動物の数を減らします。
5. 分数
- 氷の上で、7.9820 mmボールを積んだバルチホモジナイザーの粉砕室を通して動物を優しく押し込み、新しい滅菌注射器に動物を穏やかに押し込んで動物を均質化します。30完全なサイクルのために粉砕室を通して動物を押し繰り返します。
注: 「完全なサイクル」は、シリンジのプランジャの完全な上下運動として定義されます。
この研削ステップは7.9820 mmの球(18 μmの球軸受け)を使用する。 - 30サイクル後、バルチホモジナイザーからできるだけ多くの動物懸濁液を取り出し、シリンジを保管し、1.7 mLマイクロチューブでチップダウンします。
- 7.9820 mmのボールを研削チャンバーから取り出し、脱イオン水で洗浄します。乾いて、ラベル付きのチューブにボールを戻します。
- 7.9880 mm (12 μm の隙間) のボールを粉砕チャンバーに挿入し、ホモジナイザーを再シールします。
- 氷冷の「完全な低張性緩衝液」の1 mLで再び粉砕室を洗い流す。
- 25完全なサイクルのための懸濁液を粉砕。
- 25サイクル後、バルチホモジナイザーから動物の懸濁液を取り除き、懸濁液を清潔な1.7 mLマイクロチューブに移し、氷の上に保管します。
注:70%エタノールと脱イオン水でバルチホモジナイザーを分解し、洗浄してください。7.9880 mmのボールを適切なチューブに戻してください。 - 動物体やデブリを500xgで遠心し 、 4°Cで5分間ペレット。
- 上清のピペット40 μLを「入力分数」とラベル付けされたチューブにし、氷の上に保存します。
注:後で塗りつぶさないように、アルコール防止ペンですべてのラベルを書いてください。 - 残りの上清を新しい1.7 mLチューブに移し、チューブの底部のペレットに触れないように気を配り、ペレットを捨てます。
- 遠心分離剤は、4,000xgで核をペレットにし、4°Cで5分間ペレットする。
- 上清を移し、ペレット核を乱さないよう気をつけ、新しい1.7mLチューブにし、チューブを「細胞質画分」とラベル付けします。
注:遠心分離17,000 x gで、4 °Cの30分間、残りの不溶性物質を除去し、ウェスタンブロット(特に核タンパク質)の陰性対照として使用します。 - 核ペレットを500 μLの「完全な低張バッファー」で洗浄し、ペレットを新しい1.7 mLチューブに移します。懸濁したペレットを4,000xg 、 4°Cで5分間遠心する。
- 上清を捨て、500 μLの新鮮な「完全な低血圧バッファー」を核ペレットに加え、懸濁液を新しい1.7 mLチューブに移します。4,000 x g でサンプルを再び遠心分離 し、 4 °Cで 5 分間処理します。
- 上清を取り除き、ペレットを「完全な高トニックバッファー」の40 μLに溶かします。新しい核懸濁液を新しい1.7 mLチューブに移し、チューブに「核分率」とラベルを付け、氷の上に保管します。
- 蛍光定量キットを用いて3つの画分のタンパク質濃度を決定します。
注:この方法で得られる核タンパク質の量は、1~2 μg/μLの範囲です。 - 核分画を核タンパク質6μgを含む単回使用チューブにアリクォートし、ドライアイスとエタノール浴で凍結する。さらに使用するまで-80°Cで保管してください。
6. 転写アッセイ
- 電源を入れ、ヒートブロックを30°Cに予熱します。
- ヌルシア抽出インビトロ転写システムから次の項目を取り除きます:50 mM MgCl2、核エキス1x転写バッファー、100 mM rATP、100 mM rCTP、100 mM rGTP、100 mM rUTP、CMVプロモーターポジティブコントロールテンプレート。氷の上で解凍します。
注: 高忠実度ポリメラーゼを使用してポジティブコントロールDNAテンプレートを増幅し、正規化された単独使用アリコートとして保存します。 - 10 mMの作業ソリューションを準備する前に、解凍したrNTPを混合して遠心分離します。
注: 各 rATP、rCTP、rGTP、および rUTP の 2 μL を H2O の 12 μL に加え、各 rNTP の 10 mM を達成します。この構成は、必要に応じてスケールアップできます。 - アリコートrNTP混合物を標識した単使用チューブにし、将来の使用のために-20°Cで保存する。
- 「Mastermix」とラベル付けされた新鮮な1.5 mLチューブで、表5に記載されているように反応ごとに試薬を追加します。
- 各反応チューブにマスターミックスの14 μLを移す
- 1x転写バッファーの11 μLマイナス(核エキスの5 μgの体積)を各反応管に加えます。
- 各反応管に核エキス5μgを加えます。
- 反応チューブを軽くタップして内容物を混合し、混合後にチューブをパルス遠心分離して、チューブの壁に反応材料が貼り付けないようにします。
- 30°Cで30分間インキュベートします。
- RNA抽出キットによって提供されるRLTバッファーの400 μLを加えることによって、反応を直ちに停止します。
注: この時点で、停止しても安全です。サンプルはRNA抽出キットでさらにクリーンアップするまで-80°Cで保存することができます。
7. RNAのクリーンアップ
- RNA抽出キットに用意されているRNaseフリーDNaseセットを使用してDNase Iストック溶液を調製します。凍結乾燥したDNase Iを550μLのRNaseフリー水で溶解します。溶液を軽く混ぜます。渦を出さないで下ろしてください。アリコートDNase I溶液を10 μLの単回使用チューブにし、アリコートを-20°Cで保存します。
- 分子グレードのエタノールとRNaseフリー水を使用して70%および80%エタノールを調製します。
- サンプルと試薬をRNaseフリーのワークスペースに移動してから、クリーンアップを開始します。
- 各サンプルに400μLの70%エタノールを加え、ピペットを軽く混ぜ合わせます。
- サンプル400μLを2mLのコレクションチューブを用いた標識されたRNA抽出スピンカラムに移し、サンプルを30sの8,500 x g で遠心分離します。フロースルーを破棄します。
- 残りのサンプルでステップ 7.5 を繰り返し、流れを破棄します。
- 各カラムに350 μLのRW1バッファ(RNA抽出キット)を加えます。30 s の場合は 8,500 x g で列を遠心分離します。フロースルーを破棄します。
- 70 μL の RDD バッファー (RNA 抽出キット) を DNase I ストック溶液の 1 つの 10 μL アリコートに加え、穏やかに混合します。渦を出さないで下ろしてください。
- DNase Iインキュベーションミックス(80 μL)をスピンカラム膜に直接追加します。カラムを室温で15分間インキュベートします。
注:DNase I溶液を膜に追加してください。ソリューションの一部を柱壁または O リングに失わないようにします。 - 15分後、350 μLのRW1バッファをカラムに追加します。8,500 x gで30 sの遠心分離機 。 フロースルーを破棄します。
- 新しい2 mLコレクションチューブにコラムを配置します。500 μL の RPE バッファー(RNA 抽出キット)をスピンカラムに追加します。膜を洗浄するために 30s の8,500 x gでカラムを遠心する。フロースルーを破棄します。
- 各カラムに80%エタノールの500 μLを加え、30 sの場合は8,500 x g で遠心分離します。フロースルーを破棄します。
- 新しい2 mLコレクションチューブにコラムを配置します。柱の蓋を開いたままにして、5分間17,900 x g で柱を遠心します。フロースルーを破棄します。
- 柱をラベル付きの 1.7 mL チューブに配置します。スピンカラム膜の中心に17μLのRNaseフリー水を直接加えます。カラムは室温で1分間休ませます。17,900 x g で 1 分間の遠心分離機。
- カラムを捨て、精製したRNAサンプルで1.7mLチューブを保管します。
8. DNAの消化
- 37°Cと65°Cで2つのヒートブロックを予熱します。
- 各サンプルに2μLの10倍反応バッファーを加えます。
- 各サンプルに1μL(1MBU)のDNaseを加えます。
- ピペットを10 μLに設定し、新しい溶液を上下にピペットして穏やかに混ぜます。渦を出さないで下ろしてください。
- RNAサンプルを37°Cで30分間インキュベートし、残りのDNAを消化します。
- 65 °Cでヒートブロック上のサンプルを10分間インキュベートしてDNaseを不活性化します。
注:このステップで停止し、後で逆転写を行うために-80°CでRNAを保存しても安全です。
9. 逆転写
- サーモサイクラーをプログラムする場合は、インキュベーションの前にさらに1時間、37°Cのステップを加えてサーモサイクラーを予熱します。サンプルを準備しながら「予熱ステップ」でプログラムを実行し、サーモサイクラーを37°Cに達させます。 逆転写用サンプルが準備できたら、37°Cの予熱ステップをスキップし、実際のインキュベーションステップに進みます(表6)。サーモサイクラーにスキップ機能がない場合は、インキュベーションの前に1分37°Cのステップを追加します。サーモサイクラーが適切な温度まで加熱してから、システムを一時停止し、準備したサンプルを追加します。
- RNaseフリーH2Oで転写リバースプライマーの10μMの作業溶液を調製し、氷の上に保管します。
- 氷上で融解、逆転写キットからの10x緩衝液、dNTPミックス(各dNTP)、RNase阻害剤、および逆転写酵素。
- 表7に記載されている構成成分をクリーンな0.2 mL PCRチューブに加えて、マスターミックス(反応ごと)を準備します。
- マスターミックスのアリコート18 μLを、各サンプルに対して新しい0.2 mL PCRチューブに取り込みます。
- 各サンプルに対してDNase処理RNAを2μLずつ、それぞれの標識チューブに加えます。
- 予熱サーモサイクラーで37°Cで1時間インキュベートします。
- 逆転写後に保存するために-20°Cにサンプルを移動するか、次のステップに直接進みます。
注: このステップで停止しても安全です。後で使用するために-20°CでcDNAを保存してください。
10. 特定の製品増幅
- 氷上で解凍:cDNA、10 μM転写前方および10 μM転写リバースプライマー、およびPCR 2xプレミックスA。
注: PCR 2x プレミックス A を小さなボリュームにアリクォートして、解凍時間を短縮します。 - 表8に記載されている構成成分をクリーンな0.2 mL PCRチューブに加えて、マスターミックス(反応ごと)を作成します。
- アリコート 24 μL のマスターミックスを各サンプルに対してクリーンラベル 0.2 mL PCR チューブにします。
- 各サンプルのcDNAを1μLずつ各チューブに加えます。
- 表9に記載されているプログラム条件を使用して、サーモサイクラーにサンプルをインキュベートする
- インキュベーション後、PCR製品を4°Cまたは-20°Cで保管し、長期保存します。
11. ゲル分析
- 1x TAEバッファーを使用して、アガロースの2%w/vと1xゲル染色を含むゲルを調製します。
- PCR 製品を 50 V および 300 mA で 1 時間、または明確なバンド分離が発生するまで実行します。
- ゲルイメージャーにプリロードされた自動露光プログラムを使用してゲルを画像化します。
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Representative Results
概説されたステップに従って機能的核抽出物 (図1)を得る必要があり、粉砕または洗浄ステップの偏差は、不十分な活動または低い収率につながる可能性があります。機能的 C.エレガンス 核抽出物が得られた場合、先に説明した インビトロ アッセイに添加した場合に、DNAテンプレート上のCMVプロモーターの下流の領域を転写する。得られたRNA転写物は、従来の方法を用いて核タンパク質およびDNA鋳型から精製することができる。テンプレートDNAがなければ、逆転写およびその後のPCR産物は、核抽出物によって転写されたRNAの結果に過ぎない。PCR産物はアガロースゲル上で可視化することができ、DNAバンドの強度は核タンパク質およびRNA単離の品質を示し得る。弱いバンド強度は、熱または緩衝液調製不良のいずれかによって核抽出物の不活性化によって引き起こされる可能性がある。過度に強いバンド強度は、RNAの精製不良または不適切なDNase消化によるDNA汚染の結果である可能性があります。一貫した成功した核分離は、同様の強度のバンドを生成し、転写対照とPCR陰性制御の両方に目に見えるPCR産物を持たせる必要はありません(図2)。
図 1.核抽出分離の概要。 フローチャートは、 C.エレガンスから核抽出物を分離するための主要なステップを概説しています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2. C.エレガンス 核抽出物は、その活性を保持します。 ゲル画像は、CMVプロモーターDNAテンプレートを用いた C.エレガンス L4幼虫核抽出物の転写産物を示す。活性核タンパク質の単離に成功すると、レーン1および2に見られるように、 インビトロ 転写後に132 bp PCR産物が生じる。分離が失敗すると、弱いバンドが発生するか、レーン 3 と同様の PCR 産物が存在しなくなる。この PCR 増幅による転写活性の視覚化は、核抽出分離の品質を評価する簡単な方法です。陽性PCRコントロールは、PCR反応にCMVプロモーターDNAテンプレートを添加することによって生成され、陰性制御はテンプレートDNAを欠いている。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 線虫成長メディアプレート | |
| 寒天 | 20.4 g |
| 塩化ナトリウム | 2.8 g |
| バクトペプトン | 2.3グラム |
| dH2O | 975 mL |
| オートクレーブ 121 °C で 30 分間 | |
| 次の項目を追加する前に、メディアを50°Cまで冷却します。 | |
| 1 M CaCl2 (滅菌) | 1 mL |
| 1 M MgSO4 (滅菌) | 1 mL |
| 10,000ユニット/mLナイスタチン(滅菌) | 3 mL |
| 5 mg/mL コレステロール 95% エタノール (フィルター滅菌) | 1 mL |
| 1M KPO4 pH 6.0 (滅菌) | 25 mL |
表 1.
| M9 バッファ | |
| KH2PO4 | 3 g |
| ナ2HPO4 | 6 g |
| ナクル | 5 g |
| dH2O | 1,000 mL |
| 121°Cでオートクレーブ15分間 | |
| 1 M MgSO4 (滅菌) | 1 mL (オートクレーブ後に追加) |
| S基底バッファー | |
| KH2PO4 | 6 g |
| K2HPO4 | 1 g |
| ナクル | 5.85グラム |
| dH2O | 1,000 mL |
| 121°Cでオートクレーブ15分間 | |
| コレステロール 5 mg/mL (滅菌) | 1 mL (オートクレーブ後に追加) |
表 2.
| 低張性バッファー | ||
| ストックソリューション | 容積 | 最終濃度 |
| 1 M ヘペス コー pH 7.6 | 7.5 mL | 15mM |
| 1 M KCl | 5.0 mL | 10mM |
| 1 M MgCl2 | 2.5 mL | 5 mM |
| 0.5 M EDTA | 0.1 mL | 0.1 mM |
| 1 M スクロース | 175 mL | 350 mM |
| dH2O | 309.9 mL | |
| フィルター滅菌 | ||
表 3.
| ハイパートニックバッファー | ||
| ストックソリューション | 容積 | 最終濃度 |
| 1 M ヘペス コー pH 7.6 | 7.5 mL | 15mM |
| 1 M KCl | 200 mL | 400 mM |
| 1 M MgCl2 | 2.5 mL | 5 mM |
| 0.5 M EDTA | 0.1 mL | 0.1 mM |
| 10% トゥイーン 20 | 5 mL | 0.10% |
| 50%グリセロール | 100 mL | 10% |
| dH2O | 184.9 mL | |
| フィルター滅菌 | ||
表 4.
| MgCl2,50 mM | 1.5 μL |
| rNTP ミックス、各 10 mM | 1.0 μL |
| テンプレートDNA、25 ng/μL | 4.0 μL |
| RNaseフリーH2O | 7.5 μL |
表 5.
| 歩 | 一時 | 時間 | サイクル番号 |
| 予熱 | 37°C | 60分 | 1x |
| 逆転写 | 37°C | 60分 | 1x |
| 持つ | 10°C | 1x |
表 6.
| 10x逆転写バッファー | 2.0 μL |
| dNTP ミックス (各 dNTP の 5 mM) | 2.0 μL |
| 転写リバースプライマー(10 μM) | 2.0 μL |
| RNase阻害剤 | 1.0 μL |
| センシスクリプト逆転写酵素 | 1.0 μL |
| RNaseフリーH2O | 10.0 μL |
表 7.
| RNaseフリーH2O | 6.25 μL |
| 転写フォワードプライマー(10 μM) | 2.5 μL |
| 転写リバースプライマー(10 μM) | 2.5 μL |
| PCR 2X プレミックス A | 12.5 μL |
| PCR酵素ミックス | 0.25 μL |
表 8.
| 歩 | 一時 | 時間 | サイクル番号 |
| 初期変性 | 92°C | 60 s | 1x |
| 変性 | 92°C | 30 s | |
| アニール | 59°C | 30 s | 35倍 |
| 延長 | 72°C | 30 s | |
| 持つ | 10°C | 1x |
表 9.
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Discussion
C.エレガンス は、その低コストのメンテナンスと遺伝子操作の容易さのために真核生物転写システムを研究する魅力的なモデル生物です。ここでは、L4 C. エレガンス からの機能的に活性な核抽出物を一貫して分離するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは転写活性の可視化に焦点を当てたが、転写後に産生されたcDNAをRT-qPCRを用いて定量化し、転写活性の測定をより正確に得ることができる8。核タンパク質を C.エレガンス から分離するこの方法は、真核転写機構の研究を拡大するのに役立ちます。 C.エレガンス は皿や酵母のコロニーの細胞の培養ではなく、むしろ自由ローミング動物であるため、核抽出物を分離して研究することは、転写機械が時間の経過とともに、または様々な環境でどのように変化する可能性があるかについてのより明確な洞察を与える可能性があります。これにより、研究者は C.エレガンス の低コストと回復力を利用することができます。 C.エレガンスは、他の モデル生物や細胞培養物とは異なり、細菌または酵母の汚染が出現すると、はるかに寛容である。 C.エレガンス の集団は確立されたプロトコルを使用して汚染を容易に洗浄することができ、汚染が発生したときに時間と労力を節約する9。全体として、生化学的アッセイに C.エレガンス からの核抽出物を使用することは、ベンダーから核抽出物を購入したり、寛容性の低いモデル生物を扱うのと比較して、より手頃な価格で柔軟な選択肢になる可能性があります。
このプロトコルは比較的単純ですが、核抽出物の分離を成功させるためには、特別な注意が必要な重要なステップが残っています。完全な低張性および高張性バッファーの調製中に、2 つの溶液が明確にラベル付けされ、分離することが重要です。分離中の任意の時点でバッファーが切り替えられると、核タンパク質の不活性化や核タンパク質からの細胞質タンパク質の分画不良につながる可能性があります。また、単離された核タンパク質は、必要に応じて、水やその他の溶液ではなく、高張性緩衝液中で希釈する必要があります。高塩濃度は、タンパク質の活性を維持するのに役立ち、低張性溶液は、この活性を殺すことができます10。
このプロトコルの研削部分の間に発生する可能性があるもう一つの課題は、タングステンボールの表面に付着した破片から来ています。球は、粉砕サイクルごとに洗浄し、乾燥させるべきであるが述べられているが、材料は、ボールの滑らかな表面に付着します。この材料は、通常、ボールの周囲の周りに錆色のリングとして表示され、ボールと研削室の壁との間のギャップをブロックするのに十分な厚さです。この閉塞は、グラインダーを通して動物を押し込むのがますます困難になり、最終的には筋肉の損傷や注射器の破裂につながる可能性がある。タングステンボールが変色し始めた場合は、5分間お湯に浸し、新しい精練パッドで表面をきれいにします。酸性または基本的な洗浄液の使用は避けてください。優しく研磨した後、タングステンボールは元の輝きに戻る必要があり、サンプルを粉砕することが顕著に容易になります。
このプロトコルは、 C.エレガンスから核抽出物全体を分離するように設計されています。他のモデル生物での使用についてはテストされていません。他の生物からの核抽出物は異なる緩衝液を必要とし、CMVプロモーターは他の非哺乳類サンプルの転写を駆動するのに十分でない場合がある。この方法を用いて採取した核抽出物は、組織や細胞特異的でもなく、また、細胞に特異的ではない。この方法を用いて測定された転写活性は、動物全体を組織間の微妙な変化を隠す可能性がある。
このプロトコルの将来の用途は、DNA損傷後の C.エレガンス のDNA修復または複製機械を測定する可能性があります。分離過程で採取した細胞質画分を利用して、可溶性タンパク質の量を測定し、これらのタンパク質の活性を測定転写と同様の方法で定量することができる。
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Disclosures
著者らは開示する競合する利益を持っていません。
Acknowledgments
この作業は、NIH MIRA助成金(J.S.にR35GM124678)によって支えられていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables and reagents | |||
| 0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear | Genesee Scientific | 24-706 | |
| 0.2 mL Individual PCR tubes | Genesee Scientific | 24-153G | |
| 1.7 mL sterile microtubes | Genesee Scientific | 24-282S | |
| 100% absolute molecular grade ethanol | Fisher Scientific | BP2818 | |
| 100% ethanol, Koptec | Decon Labs | V1001 | |
| 10 mL serological pipet | VWR international | 89130-898 | |
| 150 mm petri plates | Tritech Research | T3325 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Genesee Scientific | 28-103 | |
| 20 mL plastic syringes | Fisher Scientific | 14955460 | |
| 2 mL Norm-Ject syringes | Henke-Sass Wolf GmbH | 4020 | |
| 500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus | Millipore Sigma | SCGPU10RE | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| 50 mL serological pipet | VWR international | 89130-902 | |
| 5 mL serological pipet | VWR international | 89130-896 | |
| Agar, Criterion | VWR International | C7432 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Alcohol proof marker | VWR International | 52877-310 | |
| Bacto peptone | VWR International | 90000-264 | |
| Caenorhabditis elegans | CGC | N2 | |
| Calcium dichloride | Millipore Sigma | C4901 | |
| Cholesterol | Millipore Sigma | C8667 | |
| Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’ | |||
| Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’ | |||
| Deionized water | |||
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| DNA gel stain, SYBR safe | Invitrogen | S33102 | |
| DNA ladder mix, O’gene ruler | Fisher Scientific | SM1173 | |
| DNA Loading Dye, 6x TriTrack | Fisher Scientific | FERR1161 | |
| DNase, Baseline-ZERO | Lucigen | DB0715K | |
| Dry ice | |||
| Escherichia coli OP50 strain | CGC | OP50 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38 | |
| Glycerol | Millipore Sigma | G6279 | |
| HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe | Promega | E3110 | |
| Hepes Solution, 1 M Gibco | Millipore Sigma | 15630080 | |
| Hydrochloric acid 37% | Millipore Sigma | P0662 | |
| Hypochlorite bleach | Clorox | ||
| LB Broth | Millipore Sigma | L3022 | |
| Magnesium dichloride | Millipore Sigma | M8266 | |
| Magnesium Sulfate | Millipore Sigma | M7506 | |
| Medium weigh dishes | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| microscope slides, Vista vision | VWR International | 16004-368 | |
| molecular grade water, Hypure | Hyclone Laboratories | SH30538 | |
| Nystatin | Millipore Sigma | N1638 | |
| PCR system, FailSafe with premix A | Lucigen | FS99100 | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P39111 | |
| Potassium phosphate dibasic | Millipore Sigma | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P0662 | |
| Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| protein assay kit, Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33211 | |
| reverse transcription kit, Sensiscript | Qiagen | 205211 | |
| RNA extraction kit RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| RNase Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sodium Chloride | VWR International | BDH9286-12KG | |
| Sodium hydroxide | Millipore Sigma | 1-09137 | |
| Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane | VWR international | 28145-501 | |
| Sucrose | VWR International | 200-334-9 | |
| transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’ | |||
| transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’ | |||
| Tris-Base | Fisher Scientific | BP152 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 | |
| Equipment | |||
| -20 °C incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| 20 °C incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| 37 °C incubator | Forma Scientific | ||
| 4 °C refrigerator | ThermoFisher Scientific | ||
| -80 °C freezer | Eppendorf | ||
| Autoclave | Sanyo | ||
| Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer | Isobiotec | ||
| Benchtop Vortexer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Centrifuge, Eppendorf 5418 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Centrifuge, VWR Clinical 50 | VWR International | 82013-800 | |
| Dissection microscope, Leica M80 | Leica Microsystems | ||
| Fluorometer, Qubit 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Gel imaging system, iBright FL1500 | ThermoFisher Scientific | A44241 | |
| Gel system | ThermoFisher Scientific | ||
| Heat block | VWR International | 12621-048 | |
| Microcentrifuges, Eppendorf 5424 | Eppendorf | 22620401 | |
| PIPETBOY acu 2 | Integra | 155017 | |
| Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014382 | |
| Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014388 | |
| Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014391 | |
| Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014392 | |
| Rocking platform | VWR International | ||
| Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro | Eppendorf | 950030010 |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Blackwell, T. K., Walker, A. K.
- Page, A. P., Johnstone, I. L.
- Lichtsteiner, S., Tjian, R. Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).
- Lichtsteiner, S., Tjian, R. Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts. EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).
- Shan, G., et al. Isotope-labeled immunoassays without radiation waste. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).
- Voss, C., et al. A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity. BMC Molecular Biology. 15, 7 (2014).
- Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system. BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).
- Stiernagle, T.
- Zbacnik, T. J., et al.
