Summary
L'apprendimento e la memoria sono metriche potenti nello studio dei deficit cognitivi dello sviluppo, dipendenti dalla malattia o indotti dall'ambiente. La maggior parte delle valutazioni cognitive richiede attrezzature specializzate e lunghi impegni di tempo. Tuttavia, il test shuttle box è uno strumento di apprendimento associativo che utilizza una scatola di gel convenzionale per una valutazione rapida e affidabile della cognizione del pesce zebra adulto.
Abstract
I deficit cognitivi, tra cui l'apprendimento e la memoria compromessi, sono un sintomo primario di varie malattie neurodegenerative legate allo sviluppo e all'età e lesioni cerebrali traumatiche (TBI). I pesci zebra sono un importante modello di neuroscienze grazie alla loro trasparenza durante lo sviluppo e alle robuste capacità rigenerative dopo il neurotrauma. Mentre esistono vari test cognitivi nel pesce zebra, la maggior parte delle valutazioni cognitive che sono rapide esaminano l'apprendimento non associativo. Allo stesso tempo, i test di apprendimento associativo spesso richiedono più giorni o settimane. Qui, descriviamo un test di apprendimento associativo rapido che utilizza uno stimolo avverso (scossa elettrica) e richiede un tempo di preparazione minimo. Il test della scatola navetta, presentato qui, è semplice, ideale per gli investigatori alle prime armi e richiede attrezzature minime. Dimostriamo che, dopo TBI, questo shuttle box test valuta in modo riproducibile il deficit cognitivo e il recupero dal pesce zebra giovane a quello vecchio. Inoltre, il test è adattabile per esaminare la memoria immediata o ritardata. Dimostriamo che sia un singolo TBI che ripetuti eventi TBI influenzano negativamente l'apprendimento e la memoria immediata, ma non la memoria ritardata. Pertanto, concludiamo che il test shuttle box traccia in modo riproducibile la progressione e il recupero del deterioramento cognitivo.
Introduction
L'apprendimento e la memoria sono abitualmente usati come metriche del deterioramento cognitivo, che si verifica a causa dell'invecchiamento, delle malattie neurodegenerative o delle lesioni. Le lesioni cerebrali traumatiche (TBI) sono la lesione più comune che si traduce in deficit cognitivi. I TBI sono di crescente preoccupazione a causa della loro associazione con diversi disturbi neurodegenerativi, come la demenza frontotemporale e il morbo di Parkinson1,2. Inoltre, l'aumento delle aggregazioni di beta-amiloide osservato in alcuni pazienti con TBI suggerisce che potrebbe anche essere associato allo sviluppo della malattia di Alzheimer3,4. I TBI sono spesso il risultato di traumi da forza contundente e coprono una gamma di gravità5, con lievi lesioni cerebrali (miTBI) che sono le più comuni. Tuttavia, i miTBI sono spesso non segnalati e diagnosticati erroneamente perché provocano lievi disturbi cognitivi solo per un breve periodo e gli individui feriti di solito guariscono completamente6. Al contrario, gli eventi ripetuti di miTBI sono stati una preoccupazione crescente perché è altamente prevalente negli adulti giovani e di mezza età, può accumularsi nel tempo7, può compromettere lo sviluppo cognitivo ed esacerbare le malattie neurodegenerative1,2,3,4,5, simile agli individui che sperimentano un TBI8moderato o grave .
Zebrafish (Danio rerio) è un modello utile per esplorare una varietà di argomenti nelle neuroscienze, tra cui la capacità di rigenerare i neuroni persi o danneggiati in tutto il sistema nervoso centrale9,10,11,12,13. La rigenerazione neurale è stata dimostrata anche nel telencefalo, che contiene l'archipallio nella regione dorsale-interna. Questa regione neuroanatomica è analoga all'ippocampo ed è probabilmente necessaria per la cognizione nei pesci e per la memoria a breve termine negli esseri umani14,15,16. Inoltre, il comportamento del pesce zebra è stato ampiamente caratterizzato e catalogato17. L'apprendimento è stato studiato attraverso varie tecniche, tra cui l'assuefazione alla risposta di startle18,che può rappresentare una forma rapida di apprendimento non associativo se eseguito in blocchi brevi e con attenzione al tempo di decadimento rapido19. Test più complessi di apprendimento associativo, come T-box, plus-labirinti e discriminazione visiva20,21 sono usati, ma spesso richiedono tempo, richiedono giorni o settimane di preparazione e si basano su secche o rinforzi positivi. Qui, descriviamo un paradigma rapido per valutare sia l'apprendimento associativo che la memoria immediata o ritardata. Questo test shuttle box utilizza uno stimolo avversivo e un condizionamento di rinforzo negativo per valutare i deficit cognitivi e il recupero dopo TBI a forza smussata. Dimostriamo che il pesce zebra adulto di controllo non danneggiato (8-24 mesi) impara in modo riproducibile a evitare la luce rossa entro 20 prove (<20 minuti dalla valutazione) nella scatola della navetta, con un alto grado di coerenza tra gli osservatori. Inoltre, utilizzando la shuttle box dimostriamo che le capacità di apprendimento e memoria tra adulti (8-24 mesi) sono coerenti e sono utili per l'analisi cognitiva con compromissioni significative tra diverse gravità tbi o TBI ripetuti. Inoltre, questo metodo potrebbe essere rapidamente impiegato come metrica per tracciare una vasta gamma di progressioni della malattia o l'efficacia degli interventi farmacologici che influiscono sul mantenimento o sul recupero della cognizione nel pesce zebra adulto.
Qui, forniamo una panoramica didattica di una rapida valutazione cognitiva che può esaminare sia l'apprendimento associativo complesso (sezione 1) che la memoria in termini di memoria immediata e ritardata. Questo paradigma fornisce una valutazione della memoria a breve e lungo termine di un compito cognitivo associativo appreso (sezione 2).
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Protocol
I pesci zebra sono stati allevati e mantenuti nella struttura di Notre Dame Zebrafish nel Freimann Life Sciences Center. I metodi descritti in questo manoscritto sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Notre Dame (numero di garanzia del benessere degli animali A3093-01).
1. Paradigma di apprendimento shuttle box (Figura 1A)
NOTA: Il paradigma di apprendimento fornisce una rapida valutazione della cognizione per quanto riguarda l'apprendimento associativo.
- Preparare la scatola navetta modificando una scatola di gel da 30,5 x 19 x 7,5 cm con un pezzo di plexiglass di grado acquario da 5 x 19 cm aggiunto su ciascun lato con un angolo di 45 °. Crea una linea che segna il punto intermedio del serbatoio per valutare quando i pesci hanno attraversato il centro del serbatoio (Figura 1B).
- Aggiungere 800 ml di acqua di sistema alla scatola della navetta. Fai quest'acqua sciogliendo 60 mg di Instant Ocean in 1 L di acqua RO deionizzata. Riempire l'acqua al centro del serbatoio ad una profondità di 5 cm.
NOTA: Sostituire con acqua dolce di sistema a 28 °C ogni ora o dopo aver testato 3 pesci. - Posizionare 2-3 pesci in un serbatoio contenente acqua di sistema, situato in una stanza buia dove verrà eseguito il test della scatola della navetta.
- Nella stanza buia, posizionare 1 pesce al centro della scatola della navetta, fissare il coperchio e collegare gli elettrodi a un alimentatore.
NOTA: La stanza dovrebbe rimanere il più buia possibile durante l'acclimatazione e il test.
- Nella stanza buia, posizionare 1 pesce al centro della scatola della navetta, fissare il coperchio e collegare gli elettrodi a un alimentatore.
- Acclimatare il pesce nella scatola della navetta per 15 minuti.
NOTA: lo sperimentatore deve rimanere nella stanza durante il periodo di acclimatazione o tornare tranquillamente nella sala di prova con ampio tempo prima del test per consentire ai pesci di adattarsi alla presenza dello sperimentatore. L'acclimatazione di successo può essere considerata quando il pesce esplora liberamente il serbatoio.- Se il pesce non riesce ad esplorare, continua l'acclimatazione per altri 15 minuti. Se il pesce non riesce ancora ad acclimatarsi alla scatola della navetta, rimuovere il pesce. Non usare questo pesce per i test.
- Lucidare manualmente una torcia a lente rossa da 800 lumen a ~ 2 cm dalla parete della scatola di gel sul lato occupato dal pesce, dopo l'acclimatazione.
NOTA: non iniziare una prova se il pesce è appoggiato accanto al filo di platino contro il muro vicino alle estremità profonde della scatola della navetta. - Brillare lo stimolo luminoso direttamente sul pesce e seguire manualmente qualsiasi movimento laterale del pesce con la luce per garantire una visualizzazione continua dello stimolo (Figura 1C). Continuare a fornire lo stimolo luminoso fino a quando non viene soddisfatta una delle seguenti condizioni.
- Considera il percorso di successo se il pesce attraversa il punto a metà del serbatoio entro i 15 s di esposizione alla luce. Una volta che il pesce attraversa il punto intermedio, interrompere immediatamente lo stimolo luminoso (Figura 1D).
- Considera il sentiero come fallito se il pesce non attraversa il punto a metà della scatola in 15 s. In questo caso, utilizzare un alimentatore per elettroforesi per applicare uno stimolo d'urto negativo (20 mV:1 A) alternando 2 s di On, 2 s di Off per un periodo di 15 s (massimo di 4 shock), o fino a quando il pesce non supera il punto intermedio della scatola, a quel punto terminare sia la luce che lo stimolo negativo.
- Lasciare riposare il pesce per 30 s e ripetere i passaggi 1.5-1.6.2. Tenere un registro dettagliato dell'ordine delle prove riuscite (1.6.1) e delle prove fallite (1.6.2).
NOTA: Qui, abbiamo definito l'apprendimento come il completamento di 5 prove consecutive di successo. Una volta che l'apprendimento è stato dimostrato, il pesce dovrebbe essere rimosso dalla scatola della navetta e umanamente eutanasia.
2. Paradigma della memoria (Figura 1A)
NOTA: Questo paradigma fornisce una valutazione della memoria a breve e lungo termine di un compito cognitivo associativo appreso.
- Periodo di formazione
- Aggiungere 800 ml di acqua di sistema alla scatola della navetta. Fai quest'acqua sciogliendo 60 mg di Instant Ocean in 1 L di acqua RO deionizzata. Riempire l'acqua al centro del serbatoio ad una profondità di 5 cm.
NOTA: l'acqua deve essere sostituita con acqua dolce di sistema a 28 °C ogni ora o dopo aver testato 3 pesci. - Posizionare 2-3 pesci in un serbatoio di tenuta che contiene acqua di sistema, situato in una stanza buia dove verrà eseguito il test della scatola della navetta.
- Nella stanza buia, posizionare 1 pesce al centro della scatola della navetta, fissare il coperchio e collegare gli elettrodi a un alimentatore.
NOTA: La stanza dovrebbe rimanere il più buia possibile durante l'acclimatazione e il test. - Acclimatare il pesce nella scatola della navetta per 15 min.
NOTA: lo sperimentatore deve rimanere nella stanza durante il periodo di acclimatazione o tornare alla sala di prova in silenzio con ampio tempo prima del test per consentire ai pesci di adattarsi alla presenza dello sperimentatore. Determinare l'acclimatazione di successo quando il pesce sta esplorando liberamente il serbatoio. - Se il pesce non riesce ad esplorare, continua l'acclimatazione per altri 15 minuti. Se il pesce non riesce ancora ad acclimatarsi alla scatola della navetta, rimuovere il pesce e non utilizzarlo per i test.
- Dopo l'acclimatazione riuscita, fai brillare manualmente una torcia rossa da 800 lumen a ~ 2 cm dalla parete laterale della scatola di gel, sul lato della scatola della navetta occupata dal pesce.
- Fai brillare lo stimolo luminoso direttamente sul pesce e segui qualsiasi movimento laterale del pesce con la luce per garantire una visualizzazione continua dello stimolo da parte del pesce.
- Mentre la luce splende sul pesce, applicare contemporaneamente lo stimolo d'urto avverso (20 mV: 1 A) alternando 2 s On, 2 s Off per 15 s (massimo di 4 shock), o fino a quando il pesce non passa il punto a metà strada della scatola. Una volta raggiunto questo obiettivo, terminare sia la luce che lo stimolo avverso.
NOTA: lasciare riposare il pesce per 30 s, quindi ripetere il passaggio 2.1.6-2.1.8 per 25 iterazioni (Figura 1A).
- Aggiungere 800 ml di acqua di sistema alla scatola della navetta. Fai quest'acqua sciogliendo 60 mg di Instant Ocean in 1 L di acqua RO deionizzata. Riempire l'acqua al centro del serbatoio ad una profondità di 5 cm.
- Test iniziali
- Lasciare 15 minuti di riposo al pesce dopo il periodo di allenamento. Non rimuoverli dalla scatola della navetta. Testare la conservazione iniziale della memoria registrando ogni prova come rigorosamente passata/fallita, immediatamente dopo questo periodo di riposo.
- Applicare solo lo stimolo luminoso per un massimo di 15 s e registrare le risposte come segue.
- Considera la prova di successo se il pesce attraversa il punto a metà della navetta entro 15 s dopo aver avviato lo stimolo luminoso. Interrompere immediatamente lo stimolo luminoso quando il pesce attraversa il punto intermedio.
- Considera la prova come fallita se il pesce non attraversa il punto a metà della scatola della navetta 15 s dopo aver avviato lo stimolo luminoso. Interrompere lo stimolo luminoso dopo 15 s.
NOTA: durante il test iniziale, uno stimolo avverso non viene applicato a seguito di un tentativo fallito.
- Ripetere il passaggio 2.2.2, con un periodo di riposo di 30 s tra le prove, e registrare le prove di successo (2.2.2.1) e le prove fallite (2.2.2.2) in 25 prove. Questo valore servirà come riferimento individuale per ogni pesce.
- Memoria immediata
- Indurre lesioni immediatamente dopo il periodo di prova iniziale dal paradigma di danno preferito (ad esempio, un trauma da forza contundente utilizzando la caduta di peso Marmarou modificata). Pesce domestico individualmente per una facile identificazione. Registrare i loro valori di test iniziali e restituire i pesci alla struttura per animali.
NOTA: I pesci sono stati feriti da TBI a forza smussata come precedentemente descritto22. - Raccogliere 2-3 pesci non danneggiati o TBI 4 ore dopo il test iniziale e/o 4 ore dopo l'infortunio (o nel periodo di tempo sperimentale in questione) dalla struttura animale. Tenere tutti i pesci nella stanza buia in vasche individuali contenenti acqua di sistema.
- Posizionare il pesce al centro della scatola della navetta (preparato con acqua di sistema come descritto in 1.1), un pesce alla volta e fissare il coperchio. Collegare l'alimentatore e lasciare che il pesce si acclimati per 15 minuti.
- Dopo l'acclimatazione, valutare la memoria immediata (rigorosamente passare / fallire) applicando solo lo stimolo luminoso per un massimo di 15 s e registrare le risposte come segue.
- Considera la prova di successo se il pesce attraversa il punto a metà della scatola entro il periodo di prova di 15 s. Terminare lo stimolo luminoso dopo aver attraversato il punto intermedio.
- Considera la prova come fallita se il pesce non attraversa il punto a metà della scatola entro 15 s dall'avvio dello stimolo luminoso. Terminare lo stimolo luminoso dopo che il periodo di 15 s è finito.
NOTA: durante questo test post-infortunio, lo stimolo avverso allo shock non viene applicato a seguito di un tentativo fallito.
- Ripetere il passaggio 2.3.4, con un periodo di riposo di 30 s tra le prove, e registrare il numero di prove riuscite (2.3.4.1) e prove fallite (2.3.4.2) in 25 prove.
- Calcola la differenza percentuale nelle prove di successo post-infortunio al periodo di test iniziale usando l'equazione:
- Indurre lesioni immediatamente dopo il periodo di prova iniziale dal paradigma di danno preferito (ad esempio, un trauma da forza contundente utilizzando la caduta di peso Marmarou modificata). Pesce domestico individualmente per una facile identificazione. Registrare i loro valori di test iniziali e restituire i pesci alla struttura per animali.
- Memoria ritardata
- Restituire i pesci, alloggiati individualmente per una facile identificazione e registrazione dei loro valori di test iniziali, all'impianto per animali immediatamente dopo il periodo di prova iniziale.
- Consentire ai pesci 4 giorni (o il periodo di tempo sperimentale in questione) tra il test iniziale e il test di lesioni e / o memoria ritardata.
- Indurre lesioni dal paradigma di danno preferito (come la caduta di peso marmarou modificata per indurre un trauma da forza contundente). Ospitare il pesce individualmente per una facile identificazione dei valori iniziali dei test e restituire il pesce alla struttura animale.
NOTA: I pesci sono stati feriti da TBI a forza smussata come precedentemente descritto22. - Raccogliere 2-3 pesci non danneggiati o TBI 4 ore dopo il test iniziale e/o 4 ore dopo l'infortunio (o nel periodo di tempo sperimentale in questione) dalla struttura animale.
- Tenere tutti i pesci nella stanza buia in singole vasche contenenti acqua di sistema e posizionarne una alla volta al centro della scatola della navetta (preparata con acqua di sistema come descritto al punto 1.1), fissare il coperchio, collegare l'alimentatore e consentire ai pesci di acclimatarsi per 15 minuti.
- Dopo l'acclimatazione, valutare la memoria immediata (rigorosamente passare /fallire) applicando solo lo stimolo luminoso per un massimo di 15 s e registrare le seguenti risposte:
- Considera il percorso di successo se il pesce attraversa il punto a metà della scatola entro il periodo di prova di 15 s. Terminare lo stimolo luminoso dopo aver attraversato il punto intermedio.
- Considera il sentiero come fallito se il pesce non attraversa il punto a metà della scatola entro 15 s dall'inizio dello stimolo luminoso, termina lo stimolo luminoso.
NOTA: durante questo test post-infortunio, uno stimolo avverso allo shock non viene applicato a seguito di un tentativo fallito.
- Ripetere il passaggio 2.4.6, con un periodo di riposo di 30 s tra le prove, e registrare il numero di prove di successo (2.4.6.1) e prove fallite (2.4.6.2) in 25 prove.
- Calcola la differenza percentuale nelle prove di successo post-infortunio al periodo di test iniziale con l'equazione:
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Representative Results
Il paradigma di apprendimento, delineato nel protocollo e schematico (Figura 1), fornisce una rapida valutazione della cognizione rispetto all'apprendimento associativo. Inoltre, questo paradigma ha un alto livello di rigore, definendo l'apprendimento come una visualizzazione ripetuta e coerente di 5 studi positivi consecutivi. Questo paradigma è applicabile anche a una serie di età e lesioni. I pesci non danneggiati a 8 mesi (giovane adulto), 18 mesi (adulto di mezza età) e 24 mesi (adulto anziano) hanno richiesto un numero simile di prove per imparare il comportamento di evitare la luce rossa (Undamaged 8 m: 15,28 ± 4,92 prove, 18 m: 17,66 ± 5,5 prove, 24 m: 16,2 ± 4,79 prove, 8 m vs 18 m p = 0,92, 8 m vs 24 m p = 0,98, 18 m vs. 24 m p=0,97, Figura 2A). Abbiamo anche utilizzato un modello di lesione cerebrale traumatica da forza contundente grave (sTBI)22 e abbiamo osservato che i pesci di età diverse richiedevano un numero simile di prove per padroneggiare il test in 1-5 giorni dopo l'infortunio (dpi; 8 m vs 18 m, p = 0,09, 8 m vs 24 m, p = 0,96, 18 m vs 24 m, p = 0,12, Figura 2A). Al giorno 1 successivo a sTBI, i pesci di tutte le età (8, 18 e 24 m) hanno richiesto un numero simile di prove per apprendere il comportamento (8 m: 73,3 ± 9,45 prove, 18 m: 79,33 ± 6,35 prove, 24 m: 68,25 ± 6,65 prove, 8 m contro 18 m p = 0,71, 8 m contro 24 m p = 0,76, 18 m vs 24 m p = 0,28, Figura 2A) ed erano tutti significativamente maggiori dei controlli non danneggiati (p<0.01). Collettivamente, questi dati dimostrano che la scatola navetta può essere utilizzata per esaminare i deficit cognitivi indotti da lesioni in tutte le fasce di età e suggeriscono che il pesce zebra adulto può recuperare cognitivamente dopo una lesione da forza contundente.
Poiché gli eventi miTBI ripetuti possono compromettere sempre più la funzione cognitiva, abbiamo utilizzato il test shuttle box come metrica per tracciare la progressione dose-dipendente utilizzando TBI ripetitivo. Abbiamo utilizzato questo test per valutare l'apprendimento a seguito di una lesione da forza contundente miTBI22 che viene ripetuta quotidianamente per i diversi periodi di tempo. Come osservato in precedenza, i pesci non danneggiati hanno rapidamente padroneggiato la shuttle-box ottenendo 5 prove positive consecutive in 16,4 ± 3,5 prove (Figura 2B). Un giorno dopo un singolo miTBI, i pesci mostrano un aumento significativo del numero di studi per apprendere il comportamento (40,25 ± 12,65 prove, p<0,05, Figura 2B). Questo deficit è aumentato dopo 2 eventi miTBI (48 ± 14,9 studi) ed è stato ulteriormente elevato dopo 3 lesioni miTBI (56,63 ± 12,75 studi, Figura 2B). Inoltre, abbiamo osservato un aumento significativo del deterioramento cognitivo tra i pesci miTBI che hanno ricevuto una lesione singolare e 3 lesioni (p<0,05).
Abbiamo anche esaminato come la memoria è stata influenzata a seguito di ripetuti eventi miTBI utilizzando il protocollo per paradigmi di memoria immediata e ritardata (Figura 1A). Ai pesci naïve non danneggiati è stato dato un periodo di addestramento e un periodo di test iniziale, dopo di che una parte del pesce è stata ferita per la memoria immediata e altri sono stati restituiti alla struttura di pesca per 4 giorni per accedere alla memoria ritardata (Figura 2C). I pesci non danneggiati mostrano un leggero aumento della differenza percentuale degli studi di successo sia nella memoria immediata (6,22% ± 4,7%) che nella memoria ritardata (6,13% ± 5,57%) rispetto al periodo di test iniziale. Abbiamo quindi esaminato l'effetto di più eventi TBI a forza smussata sulla memoria. Deficit significativi sono stati osservati a seguito di miTBI nella memoria immediata, ma non nella memoria ritardata. A seguito di un singolo miTBI, i pesci hanno mostrato significativi deficit di memoria immediati (-26,77% ± 8,93%) rispetto ai pesci non danneggiati (p<0,0001, Figura 2C). Questa tendenza è proseguita con ripetuti infortuni con deficit in aumento a seguito sia di 2x miTBI (-37,42% ± 10,01%) che di 3x miTBI (-39,71% ± 11,39%). Inoltre, abbiamo osservato un simile effetto-dose tra pesci trattati con un singolo (1x) miTBI e 3x miTBI (p<0.05, Figura 2C). Questi dati suggeriscono che l'apprendimento e la memoria sono ridotti nei pesci miTBI con il crescente numero di lesioni, aumentando significativamente il deficit e il test shuttle box e i protocolli sopra descritti sono abbastanza sensibili da rilevare queste differenze.
Figura 1: Il test shuttle box. (A)Panoramica didattica dei paradigmi di apprendimento e memoria per la valutazione cognitiva. (B) Schema di una grande scatola di gel di DNA convertita per il test della scatola navetta. (C,D) Rappresentazione grafica dell'applicazione degli stimoli durante le prove. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: I pesci zebra mostrano deficit cognitivi a seguito di TBI a forza smussata. (A) Dopo sTBI, i pesci zebra a 8, 18 e 24 mesi di età mostrano deficit di apprendimento che non sono significativamente diversi tra i gruppi di età. Aumenti significativi del numero di prove per apprendere il paradigma della scatola navetta rispetto ai controlli abbinati all'età sono stati osservati a 1 dpi tornando a livelli non danneggiati di 4-5 dpi. (B,C) I pesci miTBI ripetuti hanno mostrato deficit di apprendimento (B) e di memoria (C) in modo dose-dipendente. La media ± SEM è tracciata in A e B, mentre la media ± deviazione standard è tracciata in C. Ogni punto dati su tutti e tre i grafici rappresenta un singolo pesce zebra adulto. Le analisi statistiche sono state eseguite con un ANOVA unizionale o bidirezionale seguito da un test post-hoc Tukey. # p<0.05, ## p<0.01. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il deterioramento cognitivo può avere un impatto significativo e negativo sulla qualità della vita. A causa della maggiore visibilità e del verificarsi di commozioni cerebrali e lesioni cerebrali traumatiche in tutta la popolazione, è importante capire come causano il deterioramento cognitivo e come il danno può essere ridotto al minimo o invertito. Per questi motivi, gli organismi modello che possono essere testati per il declino cognitivo svolgono un ruolo fondamentale in questi studi. I roditori sono stati a lungo il modello primario per studiare il neurocomportamento e la cognizione, tuttavia, il pesce zebra è emerso come un modello utile con numerosi comportamenti distinti per indagare una serie di deficit cognitivi di sviluppo, legati all'età e acquisiti17,20,23,24,25,26. Vari metodi per valutare la cognizione sono stati utilizzati dall'apprendimento unidimensionale sotto forma di assuefazione, all'apprendimento complesso e alla memoria spaziale, al riconoscimento di nuovi oggetti e posizioni e al processo decisionale18,19,20,21,27,28. Tuttavia, questi test cognitivi sono limitati a testare la cognizione non associativa o richiedono una configurazione complessa, investimenti finanziari in attrezzature o un ampio impegno di tempo prima che i test possano essere eseguiti. Al contrario, la scatola navetta e i paradigmi di apprendimento e memoria qui descritti utilizzano un complesso test di apprendimento associativo che è conveniente, rapidamente valutato e facilmente impiegato da un investigatore alle prime armi. Ancora più importante, coerentemente con gli altri test cognitivi, il nostro test dimostra che i pesci non danneggiati imparano rapidamente il compito associativo e possono memoriare il compito giorni dopo senza allenamento intermittente29.
L'adattabilità del test fornisce strade per indagare vari punti temporali di apprendimento e memoria come metrica della progressione della malattia o interventi meccanicistici. Ci sono due caratteristiche principali del test. Innanzitutto, il metodo è semplice. Il test viene rapidamente impostato e ha punti finali chiari e distinti rispetto agli studi riusciti e falliti, rendendolo accessibile a una serie di investigatori. Abbiamo scoperto che, a causa della semplicità di questo test, è necessaria pochissima risoluzione dei problemi per utilizzare correttamente la scatola della navetta. In secondo luogo, il test è estremamente rapido rispetto ad altri esami cognitivi, il che fornisce flessibilità o la capacità di esaminare rapidamente un gran numero di pesci in un solo giorno. Il tempo per valutare l'apprendimento è di almeno 19,75 minuti (Figura 1), con il pesce che richiede 15 minuti per acclimatarsi alla scatola della navetta (determinata dall'esplorazione della vasca), seguita da una singola prova fallita (15 s stimolo alla luce, 15 s stimolo di avversione, 30 s tra le prove) e 5 prove positive immediate e consecutive (<15 s stimolo luminoso). In pratica, abbiamo osservato che i pesci non danneggiati richiedono 6-30 prove (19,75 min-43,75 min), mentre in casi estremi (a seguito di un grave trauma da forza contundente), i deficit più gravi possono richiedere 100 prove (113,75 min). Anche gli studi sulla memoria vengono eseguiti rapidamente. Seguendo lo schema del protocollo, il tempo minimo necessario per l'acclimatazione, l'allenamento e il test iniziale è di 67,5 minuti (15 minuti di acclimatazione, 25 iterazioni di luce e shock per 15 s, 30 s di riposo tra le prove e ripetizione per i test iniziali senza gli stimoli avversi). Mentre il nuovo test della memoria immediata o ritardata richiede solo 33,75 minuti (15 minuti di acclimatazione, 25 iterazioni di solo stimolo luminoso per 15 s e 30 s di riposo tra le prove), indipendentemente da lesioni, trattamento o deficit cognitivo.
Quando si valuta il neurocomportauto, vari paradigmi utilizzano stimoli positivi o avversi. Gli stimoli positivi sotto forma di cibo o interazione sociale, spesso usati nei classici labirinti di T-box, possono aiutare in una forte risposta di un compito appreso. Tuttavia, i saggi che utilizzano l'associazione positiva lo fanno a scapito del tempo. Al contrario, mentre il condizionamento in risposta a uno stimolo avverso fornisce una rapida associazione e una forte risposta comportamentale, è a scapito dello stimolo avverso. I pesci non danneggiati spesso imparano rapidamente il test della scatola della navetta e sono quindi sottoposti a un numero minimo di shock e, di conseguenza, sembrano non avere eventi avversi. Tuttavia, i pesci neurologicamente compromessi (TBI), con gravi deficit cognitivi, richiedono un numero significativo di prove e scosse elettriche. Questi shock multipli sono stati osservati per provocare occasionalmente convulsioni tonico-cloniche. Qualsiasi pesce che sperimenti un attacco tonico-clonico mentre si trova all'interno della scatola della navetta dovrebbe essere immediatamente rimosso ed eticamente eutanasizzato. Tutte le prove per il pesce eutanasizzato, fino all'evento convulsivo, dovrebbero essere escluse in qualsiasi analisi statistica. Inoltre, vale la pena notare che una scossa elettrica a un soggetto neurologicamente danneggiato potrebbe imporre differenze non intenzionali tra i pesci danneggiati che sono e non sono derivanti dalla scatola della navetta. Per questo motivo, suggeriamo che tutti i pesci sottoposti a valutazione neurocomportamentosa non dovrebbero essere utilizzati per nessun'altra metrica quantitativa (biomarcatore sierico, IHC, ecc.). È anche importante capire che questo metodo di apprendimento si basa su uno stimolo visivo e non è appropriato per danni che possono compromettere i circuiti visivi, in quanto confonderà i risultati.
I nostri risultati dimostrano che dopo il TBI a forza smussata, i pesci zebra mostrano un rapido deficit cognitivo che si traduce in un aumento delle prove per padroneggiare un compito associativo nel test della scatola dello shuttle. Deficit immediati simili si vedono nei modelli di roditori di TBI, tuttavia questi deficit possono diminuire, spesso persistono e rimangono significativi30. Al contrario, il pesce zebra mostra un recupero cognitivo entro 7 giorni dall'infortunio. La capacità rigenerativa del pesce zebra adulto è ben documentata9,10,11,12,13,14,15,con nicchie neurogeniche note nelle zone ventricolari/subventricolari del telencefalo31,32. Il recupero cognitivo osservato nel nostro test dopo TBI fornisce informazioni sugli esami necessari per identificare se queste nicchie neurogeniche sono stimolate e svolgono un ruolo nel recupero tissutale e cognitivo.
In conclusione, la navetta fornisce una rapida valutazione della cognizione per quanto riguarda l'apprendimento associativo e la memoria. Il test utilizza attrezzature minime e conventuali ed è tecnicamente semplice. Applicazioni future potrebbero essere utilizzate per valutare interventi genetici e farmacologici a pesci neurologicamente insultati per quanto riguarda la neuroprotezione e altri paradigmi di lesione o modelli neurodegenerativi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio Hyde per le loro discussioni ponderate e i tecnici del Freimann Life Sciences Center per la cura e l'allevamento dei pesci zebra. Questo lavoro è stato sostenuto dal Center for Zebrafish Research presso l'Università di Notre Dame, dal Center for Stem Cells and Regenerative Medicine presso l'Università di Notre Dame e da sovvenzioni del National Eye Institute del NIH R01-EY018417 (DRH), del National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (JTH), LTC Neil Hyland Fellowship di Notre Dame (JTH), Sentinels of Freedom Fellowship (JTH) e Pat Tillman Scholarship (JTH). Figura 1 realizzata con BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flashlight | Ultrafire | 9145 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Large DNA Gel Box | Fisher Scientific | FB-SB-1316 | Shuttle Box |
| Power Supply | Fisher Scientific | FB-105 |
References
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