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Cancer Research

Glutamatergic न्यूरॉन्स और बाल चिकित्सा उच्च ग्रेड ग्लियोमा कोशिकाओं की सह-संस्कृति माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में विद्युत इंटरैक्शन का आकलन करने के लिए

Published: November 17, 2021 doi: 10.3791/62748
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 1, 1, 1,3, 1, 1,4
1Team Tumoral signaling and therapeutic targets, UMR CNRS 7021 - Laboratory of Bioimaging and Pathologies, 2NETRI, 3Centre de Ressources Biologiques, Pathology department, University Hospital of Strasbourg, 4Pediatric Oncohematology unit, University Hospital of Strasbourg

Summary

हाल के कार्यों में उच्च-ग्रेड बाल चिकित्सा ग्लियोमा (पीएचजीजी) कोशिकाओं और उनके पारस्परिक इंटरैक्शन पर न्यूरोनल प्रभाव को उजागर किया गया है। वर्तमान काम एक इन विट्रो मॉडल सह-culturing pHGG कोशिकाओं और glutametergic न्यूरॉन्स के विकास से पता चलता है और उन interactivities नकल करने के लिए उनके electrophysiological बातचीत दर्ज की।

Abstract

बाल चिकित्सा उच्च ग्रेड ग्लियोमास (पीएचजीजी) बचपन और किशोर मस्तिष्क कैंसर का प्रतिनिधित्व करते हैं जो तेजी से निराशाजनक रोग का निदान करते हैं। चूंकि वर्तमान उपचारों के प्रतिरोध को दूर करने और इलाज का एक नया तरीका खोजने की आवश्यकता है, इसलिए नई दवाओं और चिकित्सीय प्रक्रियाओं का परीक्षण करने के लिए इन विट्रो सेटिंग में जितना संभव हो सके बीमारी को मॉडलिंग करना अत्यधिक मांग है। ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन हाइपरएक्साइटबिलिटी सहित उनकी मौलिक पैथोबायोलॉजिकल प्रक्रियाओं का अध्ययन करना, पर्यावरणीय मस्तिष्क और पीएचजीजी कोशिकाओं के बीच बातचीत को समझने में एक वास्तविक अग्रिम होगा। इसलिए, न्यूरॉन्स / पीएचजीजी सेल इंटरैक्शन को फिर से बनाने के लिए, यह काम एक कार्यात्मक इन विट्रो मॉडल के विकास को दर्शाता है जो मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम (एचआईपीएस) -व्युत्पन्न कॉर्टिकल ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स पीएचजीजी कोशिकाओं को कंपार्टमेंटलाइज्ड माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में और उनके इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल संशोधनों को रिकॉर्ड करने की प्रक्रिया है। पहला कदम मानव ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स को अलग करना और चिह्नित करना था। दूसरे, कोशिकाओं को पीएचजीजी व्युत्पन्न सेल लाइनों के साथ माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में सुसंस्कृत किया गया था। मस्तिष्क माइक्रोएन्वायरमेंट और न्यूरोनल गतिविधि को तब इन सूक्ष्म-पर्यावरणीय न्यूरॉन्स पर पीएचजी कोशिकाओं के विद्युत प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए इस मॉडल में शामिल किया गया था। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग को इन माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के लिए मल्टीइलेक्ट्रोड सरणियों (एमईए) का उपयोग करके शारीरिक स्थितियों की नकल करने और पूरे तंत्रिका नेटवर्क की विद्युत गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए युग्मित किया जाता है। ट्यूमर कोशिकाओं की उपस्थिति में न्यूरॉन उत्तेजना में एक महत्वपूर्ण वृद्धि को रेखांकित किया गया था।

Introduction

बाल चिकित्सा उच्च ग्रेड gliomas (pHGG) रोगी की उम्र, ट्यूमर शारीरिक स्थान और विस्तार, और आणविक ड्राइवरों 1 के आधार पर एक विस्तारित जीनोटाइपिक और फेनोटाइपिक विविधता प्रदर्शित करते हैं। वे आक्रामक मस्तिष्क ट्यूमर हैं जो वर्तमान में उपलब्ध उपचार विकल्पों के साथ खराब रूप से नियंत्रित होते हैं और बच्चों और किशोरों में मस्तिष्क कैंसर से संबंधित मृत्यु का प्रमुख कारण हैं2। इसलिए, 80% से अधिक रोगी अपने निदान के बाद 2 साल के भीतर पुनरावृत्ति कर रहे हैं, और उनका औसत अस्तित्व 9-15 महीने है, जो मस्तिष्क के स्थानों और ड्राइवर उत्परिवर्तन पर निर्भर करता है। उपचारात्मक उपचार की अनुपस्थिति प्रयोगशाला अनुसंधान के लिए प्राथमिक आग्रह है और नए अभिनव चिकित्सीय दृष्टिकोणों की तत्काल आवश्यकता पर प्रकाश डालती है। इस उद्देश्य के लिए, रोगी-व्युत्पन्न सेल लाइनों (पीडीसीएल) को दो-आयामी (2 डी) लाइनों और / या तीन-आयामी (3 डी) न्यूरोस्फीयर में पीएचजीजी विविधता 3 प्रदान करने की उम्मीद के साथ विकसित किया गया था। फिर भी, उन रोगी-व्युत्पन्न इन विट्रो सेल संस्कृतियों में सभी मस्तिष्क चर स्थितियों की नकल नहीं करते हैं। ये मॉडल आमतौर पर पीएचजीजी में वर्णित मैक्रोस्कोपिक और माइक्रोस्कोपिक न्यूरो-शारीरिक वातावरण पर विचार नहीं करते हैं।

आमतौर पर, छोटे बच्चों में पीएचजीजी मुख्य रूप से पोंटिन और थैलेमिक क्षेत्रों में विकसित हो रहा है, जबकि किशोर और युवा वयस्क के एचजीजी कॉर्टिकल क्षेत्रों में ध्यान केंद्रित करते हैं, विशेष रूप से फ्रंटोटेम्पोरल लोब 1 में। बाल चिकित्सा उम्र भर में इन स्थान-विशिष्टताओं में विभिन्न वातावरण शामिल होते हैं जो ग्लियोमाजेनेसिस और ट्यूमर कोशिकाओं और विशिष्ट न्यूरोनल गतिविधि 4,5,6 के बीच एक अंतर्निहित नेटवर्क के लिए अग्रणी होते हैं। यद्यपि तंत्र की अभी भी पहचान नहीं की गई है, पीएचजीजी मुख्य रूप से एस्ट्रोग्लियल और ओलिगोडेंड्रोग्लियल वंशों के भेदभाव प्रक्षेपवक्र के साथ तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं से विकसित होता है। जबकि इन ग्लियाल वंशों की भूमिका लंबे समय से न्यूरॉन्स के लिए सरल संरचनात्मक समर्थन तक सीमित है, अब यह स्पष्ट रूप से स्थापित हो गया है कि वे पूरी तरह से तंत्रिका सर्किट में एकीकृत होते हैं और मस्तिष्क के संरचनात्मक क्षेत्रों को पुनर्गठित करने और न्यूरोनल सर्किटरी 4,7,8 को फिर से तैयार करने में सक्षम जटिल द्वि-दिशात्मक ग्लियाल-न्यूरोनल इंटरैक्शन प्रदर्शित करते हैं। . इसके अलावा, सबूतों के बढ़ते टुकड़े इंगित करते हैं कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) मस्तिष्क कैंसर की दीक्षा और प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हाल के कार्यों ने न्यूरोनल गतिविधि पर ध्यान केंद्रित किया, जो स्रावित विकास कारकों और प्रत्यक्ष इलेक्ट्रोकेमिकल सिनैप्टिक संचार 6,9 के माध्यम से ग्लियाल दुर्दमताओं के विकास और माइटोसिस को चलाने के लिए प्रतीत होता है। पारस्परिक रूप से, उच्च ग्रेड ग्लियोमा कोशिकाएं एक बढ़ती हुई ग्लूटामेटर्जिक न्यूरोनल गतिविधि के साथ न्यूरोनल फ़ंक्शन को प्रभावित करती हैं और सर्किट के संचालन को संशोधित करती हैं जिसमें वे संरचनात्मक और विद्युत रूप से एकीकृत होते हैं। इसलिए, न्यूरॉन कार्रवाई को नियंत्रित करने वाले रोगी-व्युत्पन्न मॉडल और उपन्यास तंत्रिका विज्ञान उपकरणों का उपयोग करने वाले अध्ययनों ने ग्लियोमा स्थान, विकास और प्रगति पर न्यूरोनल गतिविधि के सर्किट-विशिष्ट प्रभाव का प्रदर्शन किया। ग्लियोमास में शामिल इन न्यूरोनल अनुमानों में से अधिकांश ग्लूटामेटर्जिक हैं और ग्लूटामेट स्राव के माध्यम से संवाद करते हैं। विशिष्ट ग्लूटामेटर्जिक बायोमार्कर जैसे कि mGluR2 या vGlut1/2 आमतौर पर वर्णित हैं6।

दिलचस्प बात यह है कि उनके आणविक विषमता के बावजूद, बाल चिकित्सा और वयस्क उच्च-ग्रेड ग्लियोमास ग्लूटामेटर्जिक न्यूरोनल गतिविधि और न्यूरोलिगिन -3 या बीडीएनएफ (मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक) जैसे अन्य स्रावित कारकों के लिए एक विशिष्ट प्रोलिफेरेटिव प्रतिक्रिया दिखाते हैं 4,6,10,11,12,13 . कॉर्टिकल क्षेत्रों में, बाल चिकित्सा और वयस्क एचजीजी एक बढ़े हुए ग्लूटामेट स्राव के माध्यम से न्यूरोनल हाइपरएक्साइटबिलिटी को प्रेरित कर सकते हैं और गैबा इंटरन्यूरॉन्स को बाधित कर सकते हैं जिससे मिर्गी नेटवर्क गतिविधि 14,15 से जुड़े ग्लियोमास होते हैं। इसके शीर्ष पर, तंत्रिका सर्किट को विशिष्ट न्यूरोलॉजिकल कार्यों को धक्का देने वाले ग्लियोमास द्वारा फिर से तैयार किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, भाषा, और अतिरिक्त संगठित न्यूरोनल गतिविधि 9 की मांग कर सकता है।

इस तर्क के आधार पर, ग्लियोमा कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के बीच द्विदिश संचार की समझ को आगे बढ़ाने के लिए पूरी तरह से स्पष्ट किया जाना चाहिए और इन विट्रो पीएचजीजी दृष्टिकोण के शुरुआती चरणों के साथ एकीकृत किया जाना चाहिए। इस तरह के अभिनव मॉडलिंग दवा परीक्षण के दौरान न्यूरोनल विद्युत गतिविधि प्रभाव को समझने और मापने और मस्तिष्क सर्किटरी में पीएचजीजी प्रतिक्रिया की उम्मीद करने में महत्वपूर्ण है। न्यूरोसाइंस उपकरणों में हाल के विकास, जैसे कि माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण और पीएचजीजी अनुसंधान कार्य, नए मॉडलिंग दृष्टिकोण विकसित करने के लिए बिस्तर हैं और अब इन विट्रो पीएचजीजी मॉडल 3,16,17,18,19 में मस्तिष्क माइक्रोएन्वायरमेंट को एकीकृत करने में सक्षम हैं। मल्टीइलेक्ट्रोड सरणियों (एमईए) का उपयोग करके इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के साथ युग्मित, माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस20,21,22 पूरे तंत्रिका नेटवर्क की विद्युत गतिविधि को रिकॉर्ड करते हुए शारीरिक स्थितियों की नकल करने और कई स्थितियों के तहत नेटवर्क कनेक्टिविटी पैरामीटर निकालने की संभावना प्रदान करते हैं। यह डिवाइस 23,24 पहले एमईए पर सीधे एक कक्ष में कोशिकाओं के सटीक जमाव की अनुमति देता है। यह तकनीक एमईए पर सेल सीडिंग घनत्व और समरूपता के नियंत्रण और मीडिया एक्सचेंज के ठीक नियंत्रण को सक्षम बनाती है, जो सीधे उपकरणों में मानव तंत्रिका पूर्वज भेदभाव के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। इसके अलावा, वर्तमान निक्षेपण कक्ष को अलग-अलग समय बिंदुओं पर कई कोशिकाओं के साथ बीज दिया जा सकता है।

इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य एक कार्यात्मक इन विट्रो मॉडल को विकसित करना है, जो मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम (एचआईपीएस) -व्युत्पन्न कॉर्टिकल ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स और पीएचजीजी-व्युत्पन्न कोशिकाओं को माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में विकसित करता है और दोनों सेल आबादी के बीच विद्युत इंटरैक्शन का मूल्यांकन करने के लिए उनकी विद्युत गतिविधि को रिकॉर्ड करता है। सबसे पहले, एचआईपीएस-व्युत्पन्न कॉर्टिकल ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स को प्राप्त किया गया था और संस्कृति के विभिन्न चरणों में माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में विशेषता थी [दिन 4 (डी 4), एचआईपीएस कोशिकाओं के रूप में, और दिन 21 (डी 21) और दिन 23 (डी 23), ग्लूटामेटर्जिक परिपक्व न्यूरॉन्स के रूप में। सह-संस्कृति के दूसरे चरण के लिए, दो pHGG मॉडल का उपयोग किया गया था: एक रोगी ट्यूमर (BT35)3 से शुरू की गई pHGG कोशिकाओं का व्यावसायीकरण किया गया था, जिसमें H3.3 K27M ड्राइवर उत्परिवर्तन था। अंत में, हमने PHGG सेल सीडिंग से पहले D21 पर ग्लूटामेटर्जिक कोशिकाओं की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग का प्रदर्शन किया और एक ही माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में सह-संस्कृति के 48 ज के बाद D23। ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स और पीएचजीजी कोशिकाओं के बीच बातचीत को रिकॉर्ड की गई इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गतिविधि में महत्वपूर्ण वृद्धि की विशेषता थी।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल के लिए, मानव सामग्री के उपयोग से संबंधित मान्यता संख्या डीसी -2020-4203 है।

1. Microfluidic डिवाइस निर्माण, तैयारी और उपचार

  1. पारंपरिक फोटोलिथोग्राफी तकनीकों का उपयोग करके SU-8 मोल्ड्स का निर्माण करें18.
    नोट: इस उद्देश्य के लिए, दो फोटोलिथोग्राफी मास्क को सिलिकॉन वेफर सब्सट्रेट पर फोटोरेसिस्ट संरचनाओं की दो परतों और एक पतली एसयू -8 2005 फोटोरेसिस्ट परत (3.2 μm उच्च और 6 ± 1 μm चौड़ा) का निर्माण करने के लिए डिज़ाइन किया गया है जो SU-8 2100 (200 μm उच्च, 1 मिमी चौड़ा) में बनाए गए मुख्य चैनलों के पैटर्निंग के तहत असममित माइक्रोग्रूव्स को परिभाषित करता है। और 13 मिमी लंबा) ( पूरक चित्रा S1 देखें)।
  2. 1 मिनट के लिए एक प्लाज्मा क्लीनर (5.00e-1 torr, उच्च रेडियो आवृत्ति (आरएफ) स्तर) का उपयोग करके वेफर को सक्रिय करें और 30 मिनट के लिए एक डेसिकेटर में एक एल्यूमीनियम फ़ोल्डर में 1 मिलीलीटर (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane का उपयोग करके इसे सिलानिज़ करें।
  3. Polydimethylsiloxane (PDMS) का 10: 1 अनुपात तैयार करें, उत्प्रेरक के साथ प्रीपॉलिमर को मिलाएं, फंसे हुए बुलबुले को हटाने के लिए इसे एक वैक्यूम डेसिकेटर में पास करें, और 40 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में ठीक होने से पहले इसे धीरे-धीरे मोल्ड पर डालें।
  4. मोल्ड को छीलने से पहले वांछित आकार पर एक रेजर का उपयोग करके इसे काट लें। 3 मिमी चौड़े छेद प्राप्त करने के लिए इनलेट और आउटलेट ज़ोन को पंच करें, पीडीएमएस को साफ करें, और चिपकने वाले टेप का उपयोग करके इसकी रक्षा करें।
    नोट: अंतिम PDMS डिवाइस की मोटाई लगभग 5 मिमी है।
  5. प्लाज्मा क्लीनर (5.00e-1 torr, 1 मिनट के दौरान उच्च आरएफ स्तर) का उपयोग करके डिवाइस का इलाज करें, इसे पॉलीस्टीरीन पेट्री डिश के साथ इकट्ठा करें, और 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के तहत वैक्यूम को उजागर करें।
  6. 70% इथेनॉल के साथ उपयोग से पहले माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के इनलेट को एक पिपेट के साथ भरें और इसे पिपेटिंग आकांक्षा द्वारा खाली करें।
  7. इनलेट जलाशयों Dulbecco फॉस्फेट Buffered खारा (डी-PBS) जोड़कर माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को धोलें और लगातार तीन बार आकांक्षा pipetting द्वारा इसे खाली।
  8. 0.05 मिलीग्राम / एमएल पॉली-डी-लाइसिन का उपयोग करके डिवाइस को कोट करें और इसे इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में रखें। 24 घंटे के बाद, इनलेट जलाशय में न्यूरोबेसल माध्यम को जोड़कर डिवाइस को कुल्ला करें और लगातार तीन बार आकांक्षा को पिपेट करके इसे खाली करें।
  9. सेल संस्कृति माध्यम के साथ माइक्रोफ्लुइडिक चिप को भरें और इसे कमरे के तापमान पर रहने दें जब तक कि अधिकतम 2 घंटे के लिए उपयोग न किया जाए।

2. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में सेल की तैयारी और सीडिंग

  1. मानव hiPS-व्युत्पन्न cortical glutametergic न्यूरॉन्स की संस्कृति, सीडिंग, और immunofluorescent लक्षण वर्णन
    नोट: व्यावसायीकृत hiPS-व्युत्पन्न cortical glutametergic न्यूरॉन्स के साथ प्रयोगों को पूरा करें (चित्र 1A). मानव-व्युत्पन्न सामग्रियों को संरक्षित करें और उन्हें अनुमोदन के साथ और कानून के दिशानिर्देशों के तहत संभालें।
    1. सीडिंग से पहले पिपेट आकांक्षा द्वारा माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के इनलेट और आउटलेट जलाशयों को खाली करें, जिससे केवल डिवाइस के चैनलों को माध्यम से भरा जा सके।
    2. दिन 0 (डी0) पर हाइपीएस कोशिकाओं को 6.5 x 106 hiPS कोशिकाओं / एमएल निलंबन (उदाहरण के लिए, 900 सेल / एमएम 2 एकाग्रता) के 10 μL को माध्यम के साथ रखकर बीज दें, जिसकी संरचना तालिका 1 में दी गई है, और डिवाइस को 15 मिनट के लिए हुड (कमरे के तापमान पर) के नीचे रहने दें ताकि कोशिकाओं को संलग्न करने की अनुमति मिल सके।
    3. 15 मिनट के बाद, इनलेट और आउटलेट जलाशयों दोनों को D4 संस्कृति माध्यम के 50 μL के साथ भरें, जिनकी पूरी संरचना तालिका 1 में दी गई है, और डिवाइस को इनक्यूबेटर (37 °C, 5% CO2) में स्थानांतरित करें।
    4. एक नियंत्रित वातावरण (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) के तहत और एक विशिष्ट सेल संस्कृति माध्यम के साथ 23 दिनों (चित्रा 1 ए (1), माइक्रोस्कोपी) के लिए ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन भेदभाव बनाए रखें, जिसकी संरचना तालिका 1 में वर्णित है। अगले चरण 5 में विस्तृत के रूप में नियमित रूप से माध्यम को बदलें। बस नीचे और चित्रा 1B के रूप में चरणों का पालन करें.
    5. तालिका 1 संरचना के बाद हर 3 से 4 दिनों में माध्यम को बदलें। D4 तक सीडिंग माध्यम का उपयोग करें, D7 तक D4 माध्यम, D11 तक D7 माध्यम, और संस्कृति के शेष समय के लिए D11 माध्यम।
    6. सेल व्यवहार्यता का आकलन करने और सेल गिनती की अनुमति देने के लिए एक मानक चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके D4, D21 और D23 पर माइक्रोस्कोपिक चित्र लें।
    7. लक्षण वर्णन के लिए, मध्यम आकांक्षा के बाद कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) में विभेदित ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स को ठीक करें और इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के लिए प्रोटोकॉल का पालन करें।
    8. फॉस्फेट-बफ़र्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं और उन्हें 0.1% ट्राइटन-एक्स के साथ 10 मिनट के लिए permeabilize करें, इसके बाद 3% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के साथ 30 मिनट। प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें और डिवाइस को 4 डिग्री सेल्सियस पर रातभर इनक्यूबेट करें।
    9. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार कुल्ला करें और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए संबंधित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ आगे इनक्यूबेट करें।
      नोट: अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले इम्युनोफ्लोरोसेंट एंटीबॉडी को तालिका 2 में सूचीबद्ध किया गया है।
    10. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार कुल्ला और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए DAPI (4', 6-diamino-2-phenylindole) के साथ काउंटरस्टेन।
    11. एक CMOS (पूरक धातु-ऑक्साइड-अर्धचालक) कैमरे के साथ फिट एक उल्टे epifluorescence माइक्रोस्कोप के साथ छवियों को प्राप्त करें और उचित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण करें।
    12. DAPI दाग छवियों को खोलें और सॉफ़्टवेयर में थ्रेशोल्डिंग रूटीन के साथ binarize। ऐसा करने के लिए, छवि > समायोजित > थ्रेशोल्ड पर क्लिक करें, और पृष्ठभूमि से नाभिक को अलग करने के लिए उपयुक्त पैरामीटर सेट करें। फिर, समग्र नाभिक को विभाजित करने के लिए वाटरशेड > लागू करें > प्रक्रिया पर क्लिक करें।
    13. उसके बाद, बाइनरी छवियों की व्याख्या करने के लिए कणों का विश्लेषण करें जन्मजात सॉफ़्टवेयर के कार्य का उपयोग करें। ऐसा करने के लिए, विश्लेषण पर क्लिक करें और फिर कणों का विश्लेषण करें और इसके बाद उपयुक्त पैरामीटर सेट करें: आकार और परिपत्रता फ़िल्टर (7 μm से छोटी, 20 μm से बड़ी, या 0.1 μm से छोटी परिपत्रता के साथ विश्लेषण वस्तुओं से बाहर)।
    14. सही धुंधला मान्य करने के लिए संवाददाता immunofluorescent चित्रों के लिए DAPI विश्लेषण से प्राप्त समोच्च छवियों को मर्ज करें।
    15. अंत में, विभिन्न बायोमाकर्स के लिए संबंधित डेटा (वस्तुओं की संख्या, माध्य क्षेत्र, कवरेज का % आदि) को सहेजें और उचित परिमाणीकरण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके D4 और / या D21 पर अभिव्यक्ति को मापें।
  2. व्यावसायिक pHGG लाइन, UW479, और रोगी व्युत्पन्न सेल लाइन, BT353 की सेल संस्कृति
    1. DMEM / F-12 GlutaMAX में दोनों सेल लाइनों को एक सेल संस्कृति फ्लास्क में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक संस्कृति। चित्र 1C में प्रस्तुत के रूप में प्रत्येक सेल लाइन के 80% संगम के लिए प्रतीक्षा करें।
    2. प्रयोगों के दौरान normoxic स्थितियों में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक नियंत्रित वातावरण के तहत इन pHGG कोशिकाओं को बनाए रखें।

3. सह संस्कृति प्रोटोकॉल

  1. UW479 और BT35 सेल लाइनों के लिए सीडिंग दिन और एकाग्रता को समायोजित करें ताकि 80% confluent कोशिकाओं तक पहुंच सकें, जब सह-संस्कृति शुरू होनी चाहिए, ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स के लिए संस्कृति के 21 दिनों के अनुरूप।
  2. Trypsinize UW479 और BT35 कोशिकाओं और उन्हें प्रत्येक समर्पित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में glutametergic न्यूरॉन्स के शीर्ष पर बीज (प्रत्येक सेल प्रकार के लिए 900 सेल / mm2 के लक्ष्य घनत्व के साथ) परिपक्व ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स युक्त माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में pHGG कोशिकाओं को सीडिंग से पहले।
  3. ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन डी 11 और तालिका 1 में विस्तृत आगे के माध्यम के साथ एक नियंत्रित वातावरण (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) के तहत 2 दिनों के लिए सह-संस्कृतियों को बनाए रखें।
  4. उनकी व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किए गए सूक्ष्म चित्रों का उपयोग करके pHGG कोशिकाओं की गणना करें। कक्षों के प्रतिशत की गणना करें.
    नोट:: निम्न सूत्र का उपयोग करें: 100 - ((D23 पर कक्षों की संख्या / D21 पर कक्षों की संख्या) x 100).

4. Electrophysiological रिकॉर्डिंग

  1. एक वाणिज्यिक प्रणाली और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर के साथ electrophysiological रिकॉर्डिंग प्रदर्शन।
    नोट: प्रयोगों को एक एमईए के साथ किया गया था जिसमें 30 μm व्यास के इलेक्ट्रोड शामिल थे जो 100 μm से अलग थे।
  2. pHGG कोशिकाओं के सीडिंग से पहले D21 पर ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स पर पहली इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग करें। विभेदित ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स को नियंत्रण के रूप में उपयोग करें और उन्हें सह-संस्कृति के समानांतर अकेले संस्कृति दें। दोनों स्थितियों के लिए एक दूसरी रिकॉर्डिंग करें जैसा कि अगले चरण क्रमांकित 3 में वर्णित है।
  3. D23 (सह-संस्कृति के 2 दिनों के बाद) पर एक दूसरी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग करें।

5. Electrophysiological डेटा प्रसंस्करण

  1. एक दूसरे क्रम बैंड-पास Butterworth फिल्टर के साथ कच्चे डेटा फ़िल्टर (100 हर्ट्ज और 2500 हर्ट्ज की passband आवृत्तियों के साथ).
  2. स्पाइक डिटेक्शन के लिए, प्रत्येक इलेक्ट्रोड के लिए 10 मिनट की रिकॉर्डिंग पर सिग्नल के रूट माध्य वर्ग की गणना करें और इस रूट माध्य के वर्ग मान के आठ गुना के अनुरूप एक आयाम थ्रेशोल्ड सेट करें।
  3. एक PTSD (परिशुद्धता समय स्पाइक डिटेक्शन 25) एल्गोरिथ्म लागू करें, एक कार्रवाई क्षमता के लिए 2 एमएस की अधिकतम अवधि पर विचार करते हुए।
  4. एक सक्रिय इलेक्ट्रोड के रूप में विचार करें, प्रत्येक इलेक्ट्रोड कम से कम 5 स्पाइक्स / मिनट का पता लगाता है। परख जारी रखें यदि रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के कम से कम 10% सक्रिय हैं.
  5. प्रत्येक सक्रिय इलेक्ट्रोड की औसत फायरिंग दर की गणना करने के लिए रिकॉर्डिंग की समय-अवधि से पता लगाए गए स्पाइक्स की संख्या को विभाजित करें। प्रत्येक स्वतंत्र प्रयोग के लिए एक औसत माध्य फायरिंग दर की गणना करें। आखिरकार, शर्त (±SEM) द्वारा एक औसत की गणना करें और इसे रिकॉर्डिंग के दिन एक फ़ंक्शन के रूप में व्यक्त करें।
  6. समय के एक समारोह के रूप में प्रत्येक सक्रिय इलेक्ट्रोड के लिए पता लगाई गई घटनाओं का प्रतिनिधित्व करने वाले प्रत्येक प्रयोग के लिए एक रास्टर प्लॉट की गणना करें। फिर, सभी सक्रिय इलेक्ट्रोड की अस्थायी सरणी-व्यापी फायरिंग दरों (या तात्कालिक फायरिंग दरों) की गणना करें, जिससे तंत्रिका नेटवर्क गतिविधि की synchronicity की निगरानी की जा सके।
  7. अंत में, परिमाणीकरण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके बार ग्राफ उत्पन्न करें और Kruskal Wallis परीक्षणों का उपयोग करके तुलना करें।

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Representative Results

ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स और ग्लियोमा कोशिकाओं के बीच विद्युत बातचीत का अध्ययन करने से पहले, एचआईपीएस-व्युत्पन्न कॉर्टिकल ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स को माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों (चित्रा 1 ए) में उन्हें खेती करने की व्यवहार्यता को मान्य करने की विशेषता थी। उनके लक्षण वर्णन का मूल्यांकन नेस्टिन, सोक्स 2, mGlurR2 (मेटाबोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर्स 2) और vGLUT1 इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग करके किया गया था, जिसे चित्रा 1 ए (2-7) में दर्शाया गया था। जैसा कि नेस्टिन एक मध्यवर्ती फिलामेंट प्रोटीन है जो तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं के अस्तित्व, नवीकरण और माइटोजेन-प्रेरित प्रसार के लिए आवश्यक है, इस प्रकार इसे विकास के दौरान अविभाजित सीएनएस कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। Sox2 SRY-जैसे HMG-बॉक्स जीन (SOX) प्रतिलेखन कारक परिवार का एक सदस्य है जो भ्रूण के विकास के विनियमन में शामिल है, और यह मुख्य रूप से सीएनएस में तंत्रिका उपकला की अपरिपक्व और अविभाजित कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। mGluR2 व्यापक रूप से कॉर्टेक्स और हिप्पोकैम्पस में उच्च अभिव्यक्ति के साथ, मस्तिष्क भर में वितरित किया जाता है। आमतौर पर, यह प्रीसिनेप्टिक कोशिकाओं को उनकी न्यूरोनल उत्तेजना और सिनैप्टिक ट्रांसमिशन (जैसे, ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स) के साथ परिभाषित करता है। vGLUT1 का उपयोग ग्लूटामेटर्जिक बायोमार्कर के रूप में भी किया जाता है। इसलिए, चित्रा 1 D4 और D21 में नेस्टिन और Sox2 अभिव्यक्तियों के साथ ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स पर ध्यान केंद्रित करती है ताकि संस्कृति की स्थिति में उनके प्रगतिशील भेदभाव को मान्य किया जा सके (चित्रा 1A (2-4)। नेस्टिन पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत D4 पर 5.4 ± 0.4% से घटकर D21 में 0.69 ± 0.3% हो गया (पी < 0.01, चित्रा 1A5)। इसी तरह, ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स की विभेदित स्थिति की पुष्टि करते हुए, Sox2 सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत D4 पर 12.2 ± 2.1% से घटकर D21 पर 5.5 ± 1.7% हो गया (पी < 0.05, चित्रा 1A6 देखें)। MGluR2 की अभिव्यक्ति D21 (डेटा नहीं दिखाया गया है) पर ग्लूटामेटर्जिक कोशिकाओं के 45.4 ± 4.7% में पाया गया था, और D21 पर ग्लूटामेटर्जिक भेदभाव के दौरान एक बड़ा vGLUT1 immunostaining देखा गया था। इन परिणामों से पता चला कि तंत्रिका पूर्वजों का अनुपात कम रहा और माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में 21-दिवसीय संस्कृति के बाद अधिकांश कोशिकाओं को अच्छी तरह से विभेदित किया गया। चित्रा 1B में, मल्टीस्टेप सह-संस्कृतियों और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग का एक सामान्य प्रोटोकॉल D21 पर माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में UW479 या BT35 सेल सीडिंग का वर्णन करता है। उन सेल लाइनों (चित्रा 1 सी) को पहले से ही वर्णित किया गया था और हमारे द्वारा किए गए पिछले अवलोकनों के बराबर हैं3,19। अंत में, दो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग प्राप्त की गई थीं: एक सह-कृषि से पहले डी 21 पर और दूसरा पीएचजीजी सेल लाइन सीडिंग के 48 घंटे के बाद डी 23 में।

सह-संस्कृतियों के दौरान BT35, UW479, और ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स की गतिशीलता और व्यवहार्यता को समझने और उनका पालन करने के लिए, सूक्ष्म मूल्यांकन नियमित रूप से D21 से D23 तक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग अवधि के दौरान किए गए थे और चित्र 2 में प्रस्तुत किए गए हैं। माइक्रोस्कोपिक छवियों ने माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों (चित्रा 2 ए) में ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स के एक प्रगतिशील विस्तार और विशेष वितरण का खुलासा किया। ग्लूटामेटर्जिक कोशिकाएं सह-संस्कृति में एक समान तरीके से उत्तरोत्तर कुछ समुच्चय बनाती हैं और जब डी 23 (नियंत्रण प्रयोग) तक अकेले सुसंस्कृत होती हैं। चित्रा 2B, C में, BT35 और UW479 को जोड़ते समय, यह देखा गया कि D21 में ग्लियोमा कोशिकाओं के सीडिंग के तुरंत बाद मौजूद फ्लोटिंग कोशिकाएं धीरे-धीरे D23 तक गायब हो गईं और डिवाइस में अनुयायी pHGG कोशिकाएं बन गईं। यह UW479 लाइन के लिए विशेष रूप से उल्लेखनीय था।

इसके अलावा, डी 23 (डेटा नहीं दिखाया गया है) पर सभी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के बाद फ्लोटिंग कोशिकाओं में कोई वृद्धि नहीं हुई थी। फिर भी, चित्रा 2 डी में व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत का अनुमान क्रमशः BT35 और UW479 के लिए 83.02% और 85.16% था। दोनों लाइन viability तुलनीय थे और इस तथ्य को रेखांकित किया कि रोगी-व्युत्पन्न सेल लाइनों का उचित रूप से उपयोग किया जा सकता है। एमईए और सेल जोड़तोड़ के लिए युग्मित माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों की तकनीकी तैयारी उनकी आसंजन क्षमताओं को नहीं बदलती है। यह सेल मृत्यु को प्रेरित करने या उनके सूक्ष्म पहलुओं को संशोधित करने के लिए प्रतीत नहीं होता है। BT35 और UW479 कोशिकाएं डिवाइस में ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स के सटीक स्थानों को मैप करने लगती हैं, जो उत्तेजक न्यूरॉन्स के लिए निकटता से पलायन करती हैं।

चित्रा 3 एक उदाहरण के रूप में वर्णन करता है UW479 / glutametergic न्यूरॉन सह-संस्कृतियों चित्रा 3A में रिकॉर्डिंग समय के साथ उनके स्पाइक का पता लगाने और चित्रा 3 बी में D23 पर इसके रास्टर प्लॉट के साथ, pHGG कोशिकाओं को जोड़ते समय बढ़ी हुई विद्युत गतिविधि दिखा रहा है। चित्रा 3 सी BT35 / glutametergic न्यूरॉन सह-संस्कृतियों में अस्थायी सरणी-व्यापक फायरिंग दर प्रस्तुत करता है। नियंत्रण प्रयोग (ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स की संस्कृति) और पीएचजीजी कोशिकाओं के साथ ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स की सह-संस्कृतियों के बीच के अंतर डी 23 विद्युत गतिविधि को रिकॉर्ड करते समय महत्वपूर्ण हैं, जैसा कि चित्रा 3 डी में दिखाया गया है, जो न्यूरॉन उत्तेजना पर पीएचजीजी के प्रभाव को इंगित करता है।

घटक बीजारोपण माध्यम D4 माध्यम D7 माध्यम D11 और आगे का माध्यम
DMEM/F-12 मध्यम 0.5x 0.25x 0.125x Ø
न्यूरोबेसल माध्यम 0.5x 0.25x 0.125x Ø
BrainPhys मध्यम Ø 0.5x 0.75x 1x
SM1 पूरक 1x 1x 1x 1x
N2 पूरक-A 1x 1x 1x 1x
Ala-Gln (GlutaMax) 0.5 mM 0.5 mM 0.5 mM 0.5 mM
BDNF 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL
GDNF 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL
TGF-π1 1 ng/mL 1 ng/mL 1 ng/mL 1 ng/mL
Geltrex 30 μg/mL Ø Ø Ø
सीडिंग सप्लीमेंट 1x Ø Ø Ø
दिन 4 पूरक Ø 1x Ø Ø

तालिका 1: hiPS-व्युत्पन्न glutametergic न्यूरॉन्स के लिए संस्कृति मीडिया संरचना।

एंटीबॉडी स्टॉक सांद्रता कार्यशील तनुकरण
नेस्टिन 0.5 mg/mL 1:500
(1 μg/mL)
Sox2 1 mg/mL 1:500
(2 μg/mL)
mGluR2 0.2 mg/mL 1:50
(4 μg/mL)
vGlut1 0.25 mg/mL 1:50
(5 μg/mL)
गधा विरोधी खरगोश IgG एच एंड एल (AF 647) 2 mg/mL 1:1000 से 1:2000
(1 से 2 μg/mL)
गधा विरोधी माउस IgG एच एंड एल (AF 555) 2 mg/mL 1:1000
(2 μg/mL)

तालिका 2: immunofluorescent एंटीबॉडी की सूची।

Figure 1
चित्रा 1: ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स और उच्च ग्रेड बाल चिकित्सा ग्लियोमा (pHGG) लाइनों के सेल लक्षण वर्णन और सह-संस्कृति प्रोटोकॉल। (ए) ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स की पूर्वशर्त माइक्रोस्कोपिक और इम्युनोफ्लोरोसेंट लक्षण वर्णन। (1) ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स के दिन 21 (D21) और दिन 23 (D23) पर माइक्रोस्कोपिक चित्र। (2) हरे रंग में नेस्टिन लेबलिंग और D4 (ऊपरी पंक्ति) और D21 (नीचे की पंक्ति) पर नीले रंग में DAPI लेबलिंग। (3) हरे रंग में Sox2 लेबलिंग और D4 (ऊपरी पंक्ति) और D21 (नीचे पंक्ति) पर नीले रंग में DAPI लेबलिंग. (4) MGluR2 हरे रंग में लेबलिंग और D21 पर नीले रंग में DAPI लेबलिंग. (5 और 6) नेस्टिन और सॉक्स 2 लेबलिंग के बीच सांख्यिकीय तुलना संस्कृति के डी 4 और डी 21 पर, सेल भेदभाव का प्रदर्शन करती है। (7) vGlut1 हरे रंग में धुंधला और D21 पर नारंगी में DAPI. (बी) इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए सामान्य प्रोटोकॉल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए जब उपकरणों पर ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स और ग्लियोमा कोशिकाओं को सह-संवर्धित किया जाता है। (C) BT35 और UW479 सेल लाइनों के पूर्वशर्त सूक्ष्म पहलू। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ग्लूटामेटर्जिक और ग्लियोमा कोशिकाओं की सूक्ष्म छवियां माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में सुसंस्कृत मल्टीइलेक्ट्रोड सरणियों (एमईए) के लिए युग्मित हैं। ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स को 21 दिन (डी 21) तक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में अकेले विभेदित और सुसंस्कृत किया जाता है। (ए) इस प्रयोगात्मक नियंत्रण के लिए, केवल माध्यम को डी 21 पर ग्लूटामेटर्जिक कोशिकाओं में जोड़ा गया था, जबकि या तो बीटी 35 (बी) या यूडब्ल्यू 479 (सी) सेल लाइनों को उनकी संबंधित स्थितियों में जोड़ा गया था। D22 और D23 पर छवियों को प्रत्येक स्थिति के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्ड से पहले किया गया था। सभी छवियों को एक शास्त्रीय चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। (डी) D23 पर BT35 और UW479 के लिए ट्यूमर सेल व्यवहार्यता का अनुमान छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ एक स्वचालित गणना का उपयोग करके लगाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: Electrophysiological रिकॉर्डिंग. (ए) UW479 / glutametergic न्यूरॉन सह संस्कृतियों में रिकॉर्डिंग समय के साथ स्पाइक का पता लगाने. (बी) D23 पर परिकलित रास्टर प्लॉट का एक उदाहरण UW479 / glutamatergic न्यूरॉन सह-संस्कृतियों में समय के एक समारोह के रूप में प्रत्येक सक्रिय इलेक्ट्रोड के लिए पता लगाई गई घटनाओं का प्रतिनिधित्व करता है। (सी) बीटी 35 / ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन सह-संस्कृतियों में विद्युत गतिविधि को रिकॉर्ड करने वाले सभी सक्रिय इलेक्ट्रोड की टेम्पोरल सरणी-वाइड फायरिंग दर (या तात्कालिक फायरिंग-दर) जो तंत्रिका नेटवर्क गतिविधि की synchronicity की निगरानी करने की अनुमति देती है। (डी) नियंत्रण की स्थिति में माध्य फायरिंग दर के बार चार्ट (उदाहरण के लिए, ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स की संस्कृति) और जब ट्यूमरल UW479 सेल लाइन (हरे रंग में) और BT35 सेल लाइन (लाल रंग में) जोड़ते हैं। डेटा को SEM ± माध्य के रूप में दिखाया गया है( * p < 0.05). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा S1: SU-8 molds के 3D (3-आयामी) प्रतिनिधित्व. (ए) ऑटोकैड सॉफ्टवेयर के साथ एसयू -8 मोल्ड्स का निर्माण और चित्रांकन। (बी) फोटोरेसिस्ट संरचनाओं की दो परतों और 3 मिमी चौड़ाई के चार छेदों के साथ एसयू-मोल्ड्स की तस्वीर। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

यह काम मानव हाइप्स-व्युत्पन्न कॉर्टिकल ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स और माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं के बीच बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए एक सटीक कार्यात्मक इन विट्रो मॉडल का वर्णन करता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में से एक ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स में हाइप्स भेदभाव था, जिसकी पुष्टि नेस्टिन और सॉक्स 2 इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग की कमी और mGluR2 और vGLUT1 धुंधला की एक साथ उपस्थिति से की गई थी। फिर भी, कुछ तंत्रिका पूर्वज बने रहे क्योंकि ग्लूटामेटर्जिक कोशिकाओं के केवल आधे ने mGluR2 व्यक्त किया, जिसका अर्थ है एक विषम न्यूरॉन सेल आबादी। कुल मिलाकर, ये परिणाम इस बात पर जोर देते हैं कि विशेष देखभाल को ऐसे उपकरणों में ग्लूटामेटर्जिक सेल विकास के लिए समर्पित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, पीएचजीजी कोशिकाओं की उपस्थिति में न्यूरॉन्स के विद्युत व्यवहार का अध्ययन करने वाला अगला कदम स्पाइक का पता लगाने और व्याख्या को अनुकूलित करने के लिए डेटा प्रसंस्करण स्थापित करने के लिए अपेक्षाकृत श्रम-गहन था। फिर भी, जैसा कि उम्मीद की गई है और हाल ही में प्रकाशित अन्य कार्यों में वर्णित है4,5,6,9,10, पीएचजीजी और ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स की उपस्थिति उन न्यूरॉन्स की उत्तेजक विशेषता की पुष्टि करने वाली विद्युत गतिविधि को बढ़ाती है।

इस मॉडलिंग की प्रमुख सीमा एमईए पर न्यूरॉन्स का विषम वितरण हो सकता है जो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग को प्रभावित कर सकता है। इसके लिए माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में उच्च घनत्व वाली संस्कृति के रखरखाव की आवश्यकता होगी। डिवाइस पर एक द्वितीयक सेल प्रकार को सीडिंग करने के लिए, शुरू में 48 घंटे के लिए तेजी से प्रसार और माइग्रेशन को बनाए रखना महत्वपूर्ण है और न्यूरॉन्स के लिए रिकॉर्डिंग के लिए 48 एच तकनीक में एक सजातीय वितरण प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। एक अन्य सीमा नेत्रहीन रूप से ऐसे उपकरणों में विभिन्न प्रकार की सेल आबादी को अलग कर रही है, लेकिन फ्लोरोसेंट नैनोकणों का उपयोग करके नए दृष्टिकोण दोनों सेल प्रकारों का पालन करने में मदद कर सकते हैं26। अंत में, इस माइक्रोफ्लुइडिक दृष्टिकोण का प्रदर्शन केवल दो प्रकार की पीएचजीजी लाइनों में किया गया था और इसे विभिन्न आणविक ड्राइवरों वाले अधिक रोगी-व्युत्पन्न सेल लाइनों तक बढ़ाया जाना चाहिए। पूरक मूल्यांकन इस उत्तेजक प्रभाव को समझने के लिए किया जा सकता है जब उन कोशिकाओं को सह-संवर्धित किया जाता है। फिर भी, यह एक H3.3 K27M ड्राइवर उत्परिवर्तन, जैसे BT35 line3 में असर pHGG कोशिकाओं के साथ संभव है।

इस काम में विकसित समग्र विधि विद्युत प्रभाव का पता लगाने के लिए नए दृष्टिकोणों में से एक है। इसने माइक्रोफ्लुइडिक संस्कृति स्थितियों में हाइप्स-व्युत्पन्न ग्लूटामेटर्जिक न्यूरॉन्स और पीएचजीजी ट्यूमरल सेल लाइनों के बीच बातचीत को ट्रांसड्यूस करने के लिए तंत्रिका नेटवर्क विश्लेषण की क्षमता दिखाई है। यह विधि कई अनुप्रयोगों के लिए सहायक है, विशेष रूप से कार्यात्मक और यांत्रिक अध्ययनों के लिए और औषधीय एजेंटों के प्रभावों का विश्लेषण करने के लिए जो पीएचजीजी सेल माइग्रेशन और न्यूरॉन्स के साथ बातचीत को अवरुद्ध कर सकते हैं। यह माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के उपयोग पर जोर देता है, लेकिन विशेष रूप से जब प्रयोग इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गतिविधि को रिकॉर्ड कर सकते हैं और इसे एमईए में जोड़ा जा सकता है।

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Disclosures

AB, MG, JR, LM, ML, JV, DD NETRI द्वारा नियोजित हैं, FL NETRI में मुख्य प्रौद्योगिकी अधिकारी है, और TH NETRI में मुख्य वैज्ञानिक अधिकारी है। अन्य लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम Satt Conectus कार्यक्रम, Fondation de l'Université de Strasbourg, «J'ai demandé la lune», «Une roulade pour Charline», «LifePink», «Frank,Rayon de Soleil» और «Semeurs d'Etoile» संघों से अनुदान द्वारा समर्थित था। हम इस शोध में उनके योगदान और उनके समर्थन के लिए एचजीजी से प्रभावित बच्चों और परिवारों को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
256MEA100/30iR-ITO-w/o MCS 256MEA100/30iR-ITO-w/o
40 µm probe for Scepter counter  Dutscher 53750
60 µm probe for Scepter counter  Dutscher 51999
Accutase Sigma A6964
Ala -Gln (GlutaMAX) Sigma G8541
Axel Observer 7 Microscope Zeiss 431007-9904-000
Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® Dutscher 353109
Class II Biological Safety Cabinet Thermo Scientific HERASafe type KS12
Colibri 7 LED Zeiss 4230529710-000
Cortical Glutamatergic Neurons BrainXell BX-0300
DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX Gibco 31331-028
DMEM/F12 Medium Sigma D8437
DPBS 1X Dutscher L0615-500
EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 Nunc 156499
Foetal Bovine Serum (FBS) Dutscher 500105
GDNF Peprotech 450-10
Geltrex Life Technologies A1413201
Human BDNF Peprotech 450-02
Incubator Memmert IC0150med
MCS InterFace Boarder MCS 181205-MEA2100-11240
MEA2100 MCS 181205-MEA2100-11240
Micropipette P10 Sartorius LH-729020
Micropipette P100 Sartorius LH-729050
Micropipette P1000 Sartorius LH-729070
Micropipette P200 Sartorius LH-729060
Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock Dutscher 33290
MultiChannel Experimenter MCS -
N2 Supplement-A StemCell 7152
Neurobasal Medium Life Technologies 21103049
Neurocult SM1 neuronal supplement StemCell 5711
Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack  Dutscher 030570ACL
Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack  Dutscher 032260CL
Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack Dutscher 134760CL
Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine Dutscher X0557-100
Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity Drummond 4000202/4038202
Pipette for cell culture 10 mL Falcon®  Dutscher 357551
Pipette for cell culture 5 mL Falcon®  Dutscher 357543
Plaque chauffante (CultureTemp) Belart 370151000
Poly-D-Lysine Sigma P6407
Primovert microscope Zeiss 415510-1100-000
Scepter (Handheld Automated Cell Counter) Millipore PHCC00000
TGF-β1 Peprotech 100-21C
Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon®  Dutscher 352096
Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon®  Dutscher 352070

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References

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Glutamatergic न्यूरॉन्स और बाल चिकित्सा उच्च ग्रेड ग्लियोमा कोशिकाओं की सह-संस्कृति माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में विद्युत इंटरैक्शन का आकलन करने के लिए
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Fuchs, Q., Batut, A., Gleyzes, M.,… More

Fuchs, Q., Batut, A., Gleyzes, M., Rontard, J., Miny, L., Libralato, M., Vieira, J., Debis, D., Larramendy, F., Honegger, T., Messe, M., Pierrevelcin, M., Lhermitte, B., Dontenwill, M., Entz-Werlé, N. Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions. J. Vis. Exp. (177), e62748, doi:10.3791/62748 (2021).

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