Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Анализ трансформирующего фактора роста ß Семейство расщепляющих продуктов, секретируемых в бластоцеле эмбрионов Xenopus laevis

Published: July 21, 2021 doi: 10.3791/62782
Automatic Translation
1, 2
1Department of Neurobiology, University of Utah, 2Departments of Neurobiology and Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Hematologic Malignancies, University of Utah, School of Medicine

Summary

При преобразовании фактора роста белки-предшественники семейства ß эктопически экспрессируются в эмбрионах Xenopus laevis, они димеризируются, расщепляются и секретируются в бластоцеле, которая начинается на поздней стадии бластулы до ранней стадии гаструлы. Описан способ аспирации продуктов расщепления из полости бластоцелы для иммуноблотбортного анализа.

Abstract

Две ветви суперсемейства Трансформирующего фактора роста ß (Tgfß), представленные лигандами Tgfß/Nodal или Bone morphogenetic protein (Bmp), соответственно, играют важную роль в эмбриональном развитии и гомеостазе взрослых. Члены семейства Tgfß сделаны как неактивные предшественники, которые димеризируются и складываются в эндоплазматическом ритикулуме. Предшественник впоследствии расщепляется на лигандные и продоменные фрагменты. Хотя только димерный лиганд может задействовать рецепторы Tgfß и активировать нисходящую передачу сигналов, растет признание того, что продоменная часть способствует активности лиганда. В этой статье описывается протокол, который может быть использован для идентификации продуктов расщепления, образующихся при активации белков-предшественников Tgfß. РНК, кодирующие предшественники Tgfß, сначала микроинъектируются в эмбрионы X. laevis. На следующий день продукты расщепления собирают из бластоцелы эмбрионов стадии гаструлы и анализируют на вестерн-блоты. Этот протокол может быть выполнен относительно быстро, не требует дорогостоящих реагентов и обеспечивает источник концентрированных продуктов расщепления Tgfß в физиологических условиях.

Introduction

Члены надсемейства Трансформирующего Фактора Роста ß (Tgfß) синтезируются в виде неактивных, димеризованных белков-предшественников. Затем предшественники расщепляются членами семейства пропротеинконвертаз (ПК) либо внутри секреторного пути, либо вне клеток. Это создает активный, дисульфидно-связанный димер лиганда и два продоменных фрагмента1. Хотя уже более 30 лет известно, что продомен предшественников семейства Tgfß необходим для генерации активного лиганда2,понимание того, как продомены способствуют функции лиганда, является неполным.

Хотя понимание процесса протеолитической активации членов семьи Tgfß остается неполным, растет интерес к пониманию того, какие мотивы консенсуса ПК расщепляются in vivo,происходит ли расщепление в определенном субклеточном или внеклеточном компартменте и остается ли продомен ковалентно или нековалентно связанным с расщепленным лигандом3. Несколько исследований показали, что продомен не только направляет сворачивание лиганда перед расщеплением4,5,но также может влиять на стабильность фактора роста и диапазон действия6,7,8,9,управлять образованием гомодимеров или гетеродимеров10,закреплять лиганд во внеклеточном матриксе для поддержания латентности лиганда11,а в некоторых случаях функционировать как лиганд сам по себе для активации гетерологичности сигнализация12. Гетерозиготные точечные мутации в продомене многих членов семейства Tgfß связаны с дефектами глаз, костей, почек, скелета или другими дефектами у людей3. Эти результаты подчеркивают критическую роль продомена в генерации и поддержании активного лиганда и подчеркивают важность выявления и расшифровки роли продуктов расщепления, разработанных во время протеолитического созревания предшественников семейства Tgfß.

Здесь мы описываем подробный протокол для аспирации продуктов расщепления, генерируемых во время созревания предшественников семейства Tgfß из бластоцелы эмбрионов X. laevis, а затем анализируем их на иммуноблотах. Этот протокол может быть использован для определения того, расщепляется ли один или несколько консенсусных мотивов ПК в белке-предшественнике in vivo10,13, идентификацииэндогенных ПК(ов), которые расщепляют каждый мотив13,14,сравнения in vivo образования гомодимеров семейства Tgfß с гетеродимерами10 или анализа того, влияют ли связанные с заболеванием человека точечные мутации в предшественниках Tgfß на их способность образовывать функциональные димерные лиганды.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все описанные процедуры одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета штата Юта. Лягушки размещаются в объекте, одобренном IACUC. Самцов лягушек усыпляют погружением в трицин с последующим обрезанием желудочка сердца. Самки лягушек размещаются в лаборатории максимум на 24 ч после гормональной индукции нереста, чтобы обеспечить сбор яиц, а затем возвращаются в учреждение по уходу.

1. Коллекция X. laevis Testes

  1. Обезболивают половозрелого самца в 0,2% трикаина(табл. 1)в течение 30-40 мин до тех пор, пока животное не перестает реагировать на ущемление когтем.
  2. Используйте тупые щипцы, чтобы оттянуть кожу от стенки тела. Сделайте горизонтальный разрез в коже поперек нижней части живота хирургическими ножницами. Сделайте параллельный разрез в подлежащей стенке тела, а затем третий, перпендикулярный разрез через стенку тела вверх через грудную клетку.
    1. Сложите образовавшиеся лоскутки, найдите желудочек сердца и обрежьте основание, чтобы иссушить и обеспечить смерть.
  3. Вытащите желтые жировые тела из живота тупыми щипцами и распоставьте яички с каждой стороны, лежащие в основе основания жировых тел. Удалите каждое яичко, отрезав его от жировых тел и любых прикрепленных внутренних органов с помощью хирургических ножниц.
  4. Перенесите яички на чашку Петри, содержащую 1x Модифицированный раствор Барта (MBS)(Таблица 1). Промойте и удалите все прилипшие кровеносные сосуды или прикрепленные внутренние органы.
    1. Переложите одно яичечко в 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую буфер яичка(таблица 1)для немедленного использования, а другое храните в конической трубке 10 мл, заполненной буфером яичка для последующего использования. Яички должны храниться при 4 °C, когда они не используются, и будут оставаться жизнеспособными в течение не менее двух недель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фотографии выделения яичек можно найти в ссылке 15.

2. Сбор и оплодотворение яйцеклеток X. laevis

ПРИМЕЧАНИЕ: С лягушками следует обращаться виниловых перчатках или мыть руками до и после обращения с лягушками. Латексные перчатки, лосьоны и остатки моющих средств на руках человека повредят хрупкую кожу лягушек.

  1. Вечером перед нерестом вводят 0,3 мл (1200 МЕ) хорионического гонадотропина человека(таблица 1)в дорсальный лимфатический мешок двух или трех зрелых самок X. laevis с помощью шприца 1 мл, снабженного иглой 26 Г. Используйте новую иглу для каждой инъекции.
  2. После инъекции поместите самок в герметичный контейнер (не герметичный) в биологическом инкубаторе при 18 °C. Нерест обычно начинается на 14-16 ч позже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пластиковые ящики или пластиковые контейнеры с воздушными отверстиями, вырезанными в крышке, хорошо подождут женщин в течение ночи. Убедитесь, что крышка надежно накотана, чтобы лягушки не убегли и не высыхли в инкубаторе.
  3. Держите самку над чашкой Петри 100 мм, содержащей 1 MBS, и нанесите мягкое давление на брюшко лягушки, чтобы изгнать яйца в чашку.
  4. Вырежьте небольшой кусочек яичка (~ 1/5) с помощью лезвия бритвы и переложите его в трубку 1,5 мл, содержащую ~ 500 мкл 1x MBS. Раздавите гранулятом пестиком или гомогенизатором ткани. Храните полученную суспензию сперматозоидов на льду или при 4 °C для последующего оплодотворения в тот же день.
  5. Наклоните чашку Петри 100 мм, чтобы вылить как можно больше из 1 MBS, а оставшуюся часть удалите с помощью пластиковой передаточной пипетки. Нанесите приблизительно 100 мкл суспензии сперматозоидов, добавьте около 1 мл 0,1x MBS и закрутите для смешивания.
    1. Через 5 мин залить блюдо дехлорированной водопроводной водой или 0,1 МБС и постоять 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вода может быть дехлорирована с помощью фильтра или муниципальная водопроводная вода может оставаться непокрытой в течение не менее 24 ч, чтобы позволить хлору рассеиваться в регионах, где в воду добавляется обычный хлор. В районах, где хлорамин добавляется для дезинфекции питьевой воды, вода должна быть обработана коммерчески доступным кондиционером, который может разрушать хлорамин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца собирают в растворе с высоким содержанием соли (1x MBS) для предотвращения образования желейной оболочки, которая обеспечит барьер для оплодотворения. После оплодотворения раствор с низким содержанием соли (дехлорированная вода или 0,1x MBS) позволяет формировать желеобразную оболочку, и яйца будут прилипать друг к другу и блюду. Яйца, которые были оплодотворены, будут вращаться так, что пигментированный полюс животного обращен вверх в течение 30 минут. Если этого не происходит, и яйцеклетки выглядят здоровыми под микроскопом, жизнеспособность сперматозоидов вызывает подозрения и может потребоваться сбор новых яичек.
  6. Раствор вылить, покрыв яйца, и наполнить чашку Петри свежеприготовленным 2% раствором цистеина(таблица 1). Закрутите раствор в посуде в течение 3-5 мин до тех пор, пока желейная оболочка не растворится и яйца больше не прилипнут друг к другу или к блюду.
    1. Наклоните блюдо и аккуратно вылейте раствор цистеина, или снимите пластиковой пипеткой. Заменить на 1x воду пруда Дебура(таблица 1). Закрутите для полоскать и декантировать.
    2. Повторите одну промывку раствором DeBoer, другую с 0,1 МБС и заправляйте блюдо 0,1 МБС. После удаления желейной оболочки яйца становятся более хрупкими и не должны подвергаться воздействию воздушно-жидкой границе раздела.
  7. Переместите оплодотворенные яйцеклетки в биологический инкубатор при температуре 16 °C или оставьте их на скамейке при комнатной температуре. Если оставить при комнатной температуре, то первое расщепление произойдет через 1-1,5 ч после оплодотворения, а последующие расщепления будут происходить примерно каждые 30 мин. Напротив, если эмбрионы инкубируются при 15-16 °C, расщепления будут происходить примерно каждый час, и можно будет ввести большее количество эмбрионов из данной икры.

3. Микроинъекция эмбрионов X. laevis

  1. Нагрейте и потяните стеклянные капилляры до тонкой точки с помощью съемника микропипетки со следующими настройками: Двухступенчатое вытягивание; Тепло 1: 67.4 °C; Температура 2: 62 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки специфичны для съемника микропипетки и стеклянных капилляров, используемых здесь(Таблица материалов).
  2. Под рассекающим микроскопом отрежмите кончик вытянутой иглы близко к концу с помощью щипцов Дюмона No 5. Игла должна быть острой, но не настолько тонкой, чтобы кончик сгибаться при контакте с эмбрионом. На рисунке 1 показан пример надлежащим образом вытянутой иглы, которая не была обрезана для микроинъекции (A) и которая была обрезана (B).
  3. Вставьте иглу в держатель иглы, подключенный к микроинжектору. Прикрепите держатель иглы к микроманипулятору. Поместите 2-4 мкл закрытой синтетической РНК, кодирующей белок-предшественник Tgfß, для анализа на небольшой кусочек парапленки под рассекающим микроскопом.
    1. Используя микроманипулятор, опустите иглу в каплю и используйте функцию заполнения на микроинжекторе, чтобы аспирировать РНК в иглу. Обязательно держите иглу под поверхностью капли и наблюдайте за прогрессом под микроскопом, чтобы избежать аспирации воздуха в иглу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если антитела, распознавляющих продомен и/или лигандный домен прекурсора Tgfß, которые будут анализироваться, недоступны, последовательность, кодировка эпитопной метки (например, V5, myc, Flag), может быть вставлена в кадр в кДНК, которая будет использоваться в качестве шаблона для транскрипции РНК. Биоактивность in vivo помеченного белка следует сравнивать с биоактивностью немаркированного белка, чтобы гарантировать, что эпитоп не препятствует правильному сворачиванию, расщеплению или активности.
  4. Выбросьте каплю раствора РНК в воздух и измерьте размер капли с помощью микрометра, установленного на стадии инъекции или в окуляре микроскопа. Отрегулируйте размер капли примерно до 10 нЛ, используя контроль времени и давления на микроинжекторе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации РНК в диапазоне 5-20 нг/мкл подходят для доставки 50-200 пг РНК в каждый эмбрион. Этого количества РНК обычно достаточно для обнаружения продуктов расщепления в аспиратах из 10-20 эмбрионов. Лучше всего стремиться к самой низкой дозе РНК, которая дает обнаруживаемый сигнал на иммуноблотах. Более высокие количества РНК могут вызывать дефекты гаструляции, которые мешают расширению бластоцелы.
  5. Переместите эмбрионы в инъекционную чашку или лоток, содержащий 5% Фиколла в 0,1x MBS(таблица 1),когда они достигнут 2-4 клеточной стадии. 35-миллиметровая чашка Петри, оснащенная куском нейлоновой сетки на дне, может служить недорогим инъекционным блюдом, которое будет держать эмбрионы обездвиженными. Вставьте иглу вблизи полюса животного и введите 10 нЛ РНК в одну клетку каждого эмбриона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы могут быть легко введены в любое время между одной и 16 клеточными стадиями. Инъекция эмбриона после того, как он раскололся, гарантирует, что яйцеклетка была оплодотворена и что эмбрион здоров. Точное местоположение инъекции не является обязательным. Более подробное описание нереста, культивирования и микроинъекции РНК в эмбрионы X. laevis можно найти в ссылке 15.
  6. Перенесите введенные эмбрионы в 35-миллиметровую чашку Петри, наполненную 5% Ficoll в 0,1x MBS(таблица 1). Поместите небольшие чашки внутрь чашки Петри диаметром 150 мм и свободно накройте крышкой, чтобы предотвратить испарение питательные среды. Культивирование эмбрионов на ночь при 15-16 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Культивирование эмбрионов в Ficoll помогает исцелить место инъекции. Если используются тонкие иглы, достаточно культивирования в 2-3% Фиколла, тогда как 5% Фиколла предпочтительнее, если наблюдается явное повреждение. Содержания эмбрионов в растворе Фиколла в течение 1-2 ч после инъекции достаточно, чтобы помочь заживлению, но ночная инкубация не повреждает эмбрион, если раствор изменен до начала гаструляции.

4. Извлечение бластоцелей и анализ продуктов расщепления Tgfß

  1. На следующее утро после инъекции удалите раствор Фиколла и удалите все мертвые или умирающие эмбрионы. Промыть эмбрионы один или два раза с 0,1x MBS и культивировать эмбрионы в 0,1x MBS на скамейке при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы также могут быть возвращены в биологический инкубатор 16 °C для замедления развития.
  2. Нагрейте и потяните стеклянные капилляры до тонкой точки с помощью съемника микропипетки со следующими настройками: Двухступенчатое вытягивание; Тепло 1: 67.4 °C; Температура 2: 62 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки специфичны для съемника и стеклянного капилляра,используемыхздесь ( Таблица материалов ).
  3. Под рассекающим микроскопом отрежмите кончик вытянутой иглы с помощью щипцов. Чтобы предотвратить засорение, отверстие иглы, используемой для аспирации бластоцеле, должно быть больше, чем в игле, используемой для микроинъекции. Пример хорошей вытянутой и обрезанной иглы, которая будет использоваться для аспирации бластоцелы, показан на рисунке 1С. Вставьте аспирационную иглу в держатель иглы, подключенный к микроинжектору, и прикрепите держатель иглы к микроманипулятору.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный диаметр иглы определяется эмпирически методом проб и ошибок. Иглы с большим диаметром заполняются слишком быстро и повышают вероятность попадания клеточного мусора в иглу. Напротив, иглы очень малого диаметра, вероятно, будут забиты. После того, как соответствующая игла сгенерирована, полезно создать несколько игл, обрезанных в одном и том же положении.
  4. Поместите эмбрионы в инъекционный лоток или чашку, заполненную 0,1x MBS, когда они достигнут ранней и средней стадии гаструлы (стадия 10-11).
  5. Вставьте иглу ниже поверхности эмбриона рядом с полюсом животного. Нажмите кнопку заполнения на микроинжекторе, глядя через рассекающий микроскоп, чтобы следить за иглой и эмбрионом. В течение нескольких секунд уровень прозрачной жидкости в игле повысится, и эмбрион разрушится и станет вогнутым.
    1. Если мутное белое вещество попадает в иглу, отпустите кнопку заполнения и нажмите кнопку инъекции один или несколько раз, чтобы извлечь любое мутное вещество, которое состоит из клеточного мусора, который, вероятно, содержит протеазы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если бластоцел разрушается и обломки клеток попадают в иглу, как только нажимается кнопка заполнения, это указывает на то, что отверстие в игле слишком велико. Если бластоцел не разрушается, но белое вещество сразу же попадает в иглу, это показывает, что игла была вставлена слишком глубоко и касается пола бластоцеле. Выбросите белое вещество и перейдите к следующему эмбриону. Скорость аспирации можно более тщательно контролировать, пульсируя кнопку заполнения, а не нажимая ее непрерывно. Это особенно важно, если отверстие в игле больше оптимального.
  6. Повторяйте шаг 4.5 до тех пор, пока жидкость не будет аспирирована из бластоцелы 10-20 эмбрионов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, аспирированной из 10-20 эмбрионов жидкости бластоцеле достаточно для обнаружения продуктов расщепления на иммуноблотах. Однако это может варьироваться в зависимости от качества антител и должно определяться эмпирически.
  7. Поместите кусочек парафина на инъекционный лоток и пипетку 1 мкл воды без нуклеазы. Погружайте иглу под каплю воды и нажмите кнопку впрыскивания, чтобы рассеять жидкость бластоцеле в воду.
    1. В качестве альтернативы, выталкивайте жидкость непосредственно на парапленку, но в этом случае испускивайте кнопку впрыскивания, а не удерживая ее. Это выталкивает жидкость под более низким давлением, предотвращая ее сплющивание на парапленке, что затрудняет ее вытягивание в пипетку.
  8. Перенесите бластоцелевую жидкость в стерильную микроцентрифужную трубку на льду. Ожидайте собрать примерно 0,3-0,5 мкл бластоцелевой жидкости на эмбрион. Добавьте воду без нуклеазы, чтобы отрегулировать конечный объем до 30 мкл.
  9. Перенесите истощенные жидкостью эмбрионы бластоцела в отдельную трубку на льду. Удалите избыток 0,1x MBS и добавьте 200 мкл охлажденного (4 °C) буфера лисата эмбриона (10 мкл на эмбрион)(таблица 1). Пипетка эмбрионов вверх и вниз 10-20 раз с помощью микропипетки до тех пор, пока они полностью не гомогенизируются и не останется никаких комков.
  10. Центрифугировать гомогенизированные эмбрионы в охлажденной микроцентрифуге при 10 000 х г в течение 10 мин. Удалите 160 мкл супернатанта с помощью пипетки P200 и переложите в новую трубку на льду, стараясь избегать белков белого желтка и другого клеточного мусора в нижней половине трубки.
    1. Повторите микроцентрифугирование один раз и перенесите 128 мкл прозрачного супернатанта в новую трубку на льду. На этом этапе очищенные эмбриональные лизаты и бластоцелевая жидкость могут храниться при -80 °C столько, сколько пожелает.
      ПРИМЕЧАНИЕ: За некоторыми исключениями, белки-предшественники Tgfß не секретируются в бластоцеле и будут обнаружены только в истощенных лизатах эмбриона. Напротив, продукты для расщепления семейства Tgfß в основном видны в жидкости бластоцеле. Полезно собирать и анализировать как лизаты эмбриона, так и жидкость бластоцеле для большинства целей. Как минимум, это обеспечивает позитивный контроль для обеспечения того, чтобы прекурсор был надежно переведен и стабилен. Кроме того, он позволяет сравнивать относительные соотношения продуктов расщепления с предшественниками среди различных диких типов или мутантных белков, выявлять мутации, которые позволяют интактным предшественникам секретироваться в бластоцелевую жидкость (например, мутации в рамках мотива консенсуса ПК, которые позволяют правильно складывать и секрецию без расщепления, и в этом случае неповрежденный предшественник обнаруживается как в эмбрионе, так и в бластоцелевой жидкости) или мутации, которые генерируют неправильно свернутые, не расщепляемые белки (в этом случае предшественник будет обнаружен в лизате эмбриона, но продукты расщепления будут отсутствовать в бластоцеле жидкости).
  11. Дегликозилатные белки, присутствующие в бластоцеле жидкости с PNGase F на данный момент, следуя инструкциям производителя.
    Примечание Нет необходимости дегликозилировать белки-предшественники, присутствующие в лизате эмбриона, поскольку они представляют собой эндоплазматический щетинкулум (ER) - резидентные формы предшественника, в которых отсутствуют сложные N-связанные олигосахариды, удаленные PNGase F. Напротив, продукты расщепления, присутствующие в бластоцелевой жидкости, перемещаются через транс-гольджи-сеть (TGN), где углеводы дополнительно модифицируются и теперь могут быть удалены PNGase F. После дегликозилирования продукты расщепления мигрируют в виде более плотно конденсированной полосы на гелях SDS, что может помочь в визуализации, количественном определении и точной идентификации продуктов расщепления. Это не является строго обязательным, но это может быть полезно, например, если вы пытаетесь различать гомодимеры и гетеродимеры на основе моделей миграции или если продукт расщепления содержит гетерогенные углеводы, которые заставляют его мигрировать в виде широкой нечеткой полосы.
  12. Добавьте 5 мкл восстанавливающего 4-кратного буфера образца(таблица 1)до 15 мкл бластоцеловой жидкости и 15 мкл осветленного лиазата эмбриона. Добавьте 5 мкл нередуцирования 4-кратного буфера образца(таблица 1)к оставшимся 15 мкл бластоцелевой жидкости. Нагреть до 100 °C в течение 5 мин и поместить на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ белков в условиях, невосстанавливающих, необходим для анализа образования расщепленных гомодимерных или гетеродимерных лигандов, но не требуется, если только анализировать участки расщепления или уровни расщепленных белков. За некоторыми исключениями, фрагменты продомена секретируются в виде мономеров. Кроме того, белки-предшественники, присутствующие в лизате эмбриона, в основном являются развернутыми, резидентными мономерами ER. Таким образом, нет необходимости анализировать эти продукты в нередужающих условиях.
  13. Растворяйте белки-предшественники и продукты расщепления путем электрофореза на 15% SDS/полиакриламидных гелях.
  14. Переносите белки из геля на МЕМБРАНУ PVDF с помощью электрофоретического переноса.
  15. Инкубировать мембраны с соответствующими антителами, которые распознают продомен и лигандный домен (или эпитопные метки, вставленные в эти домены), промывать и инкубировать с соответствующими вторичными антителами. Визуализация белков с помощью хемилюминесценции или флуоресцентной визуализации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Цель эксперимента, описанная ниже, состояла в том, чтобы определить, образуют ли Bmp4 и Bmp7 гетеродимеры (димеры, состоящие из одного лиганда Bmp4 и одного лиганда Bmp7), гомодимеры (состоящие из двух Bmp4 или двух лигандов Bmp7) или смесь каждого из них, когда они совместно экспрессируются в X. laevis. Данные, показанные на рисунке 2, извлечены из ранее опубликованного исследования10. Фиг.2А представляет собой схему, показывающую продукты расщепления, генерируемые протеолитическим созреванием гомодимерных предшественников Bmp4 или Bmp7 или гетеродимерных предшественников Bmp4/7. Bmp4 расщепляется на двух участках в продомене для генерации двух фрагментов продомена (темно-зеленого и желтого) и одного димерного фрагмента лиганда (светло-зеленого), который мигрирует при ~26 кДа на гелях SDS-PAGE. Bmp7 расщепляется на одном участке для генерации одного фрагмента продомена (бордовый) и одного димерного фрагмента лиганда (розового), который мигрирует при ~ 35 кДа. Гетеродимерные лиганды мигрируют при ~30 кДа. Серебряный слиток в димерах лигандов представляет собой метку myc-epitope, вставленную в этот домен.

РНК, кодирующие предшественники Bmp4myc или Bmp7myc (200 пг), или обе РНК (по 100 пг каждая), вводили в эмбрионы X. laevis на стадии 2-4 клеток. Эмбрионы культивировали в течение ночи при 16 °C, пока они не достигли ранней стадии гаструлы. В этот момент жидкость аспирировали из бластоцеле 20 эмбрионов в каждой группе и добавляли стерильную воду, чтобы довести объем до 30 мкл. После дегликозилирования каждый образец разбивали на две пробирки. В одну пробирку добавляли уменьшающий буфер пробы, а в другую добавляли нередужающий буфер пробы. Образцы нагревали до 100 °C в течение 5 мин. Затем белки были разделены SDS / PAGE, и иммуноблоты были исследованы антителами, которые распознают метку myc-epitope(рисунок 2B). В условиях редуцирования в лизатах эмбрионов, экспрессирующих только Bmp4 или Bmp7, была обнаружена одна полоса, соответствующая расщепленным мономерам BMP7, экспрессировав только Bmp4 или Bmp7 соответственно(Рисунок 2C,D,нижняя панель, полосы 1, 2). Обе полосы были обнаружены у эмбрионов, совместно экспрессифицировывающих Bmp4 и Bmp7(рисунок 2C,D,нижняя панель, полоса 3). Относительно эквивалентные количества мономеров Bmp4 и Bmp7 присутствовали в каждой из трех групп (нижняя панель, редуцирование). В этом эксперименте, когда белки были разделены в нередукционных условиях, была обнаружена одна зрелая гетеродимерная полоса промежуточной подвижности Bmp4/7 вместе со следовым количеством гомодимера Bmp4 у эмбрионов, совместно экспрессифицированных Bmp4 и Bmp7(рисунок 2C,верхняя панель). Из этих результатов мы делаем вывод, что если эквивалентные уровни белков-предшественников Bmp4 и Bmp7 экспрессируются в эмбрионах Xenopus, они предпочтительно образуют гетеродимеры, а не гомодимеры. В эксперименте, показанном на рисунке 2D,значительно больше белка Bmp7 присутствует относительно Bmp4 (нижняя панель, восстанавливающая). В результате у эмбрионов, экспрессивиющих белки-предшественники Bmp7 и Bmp4, гомодимеры Bmp4 не обнаруживаются, и вместо этого доступный Bmp4 присутствует в виде гетеродимера Bmp4/7, а избыток Bmp7 образует гомодимеры. Хотя этот эксперимент не является оптимальным, поскольку цель состояла в том, чтобы совместно экспрессировать эквивалентное количество предшественника Bmp4 и Bmp7, результаты по-прежнему согласуются с выводом, что Bmp4 и Bmp7 предпочтительно образуют гетеродимеры по сравнению с любым гомодимером при совместной экспрессии.

Figure 1
Рисунок 1. Инъекционные и аспирационные иглы. Показаны фотографии репрезентативных игл, которые были вытянуты, но не обрезаны(A),вытащены и обрезаны для использования в качестве инъекционной иглы(B)или вытянуты и обрезаны для использования в качестве аспирационной иглы(C). Стрелка и наконечник стрелы в(A)указывают точку, в которой стекло было обрезано для создания иглы для инъекции и аспирации соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2. Анализ расщепленных лигандов Bmp, извлеченных из флюида X. laevis blastocele. (A)Продукты расщепления, полученные из гомодимерных или гетеродимерных белков-предшественников Bmp4 и Bmp7, и положение метки эпитопа myc (серебряный слиток) показаны схематично(B)Принципиальная диаграмма, показывающая сроки инъекции и экстракции флюидной жидкости бластоцела. (С-Д) Эмбрионам Xenopus вводили 200 пг РНК Bmp7 или Bmp4 или смешанные вместе РНК Bmp4 и Bmp7 (по 100 пг каждая). На стадии гаструлы из бластоцелы извлекали жидкость из одинакового количества эмбрионов в каждой экспериментальной группе. Белки, присутствующие в бластоцеловой жидкости, были дегликозилированы и разделены SDS-PAGE. Антитела, распознавая метку myc-epitope, использовались для зондирования иммуноблотов. Относительное положение иммунореактивных мономеров и димеров лигандов схематически показано справа от каждого геля. Черная линия в (C) указывает на удаление промежуточной полосы на пятне. Показанные данные извлечены из ранее опубликованного исследования10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Решение Состав
0.2% Трикаин 20 г трикаина, растворенного в деионизированной воде, отрегулируйте рН до 7,4 путем добавления бикарбоната натрия
10 МБС 880 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 25 мМ NaHCO3, 100 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ MgSO4,0,14 мМ Ca(NO3)2,0,41 мМ CaCl2; Отрегулируйте pH 7,5 с NaOH. Запасы 10x MBS могут храниться при температуре 4 °C и разбавляться по мере необходимости.
2% раствор цистеина 2 г цистеина на 100 мл деионизированной воды, с гидроксидом натрия довести рН до 7,8-8,0.  Делайте свежим каждый день.
20x Вода пруда Дебура 100 мМ NaCl, 1,3 мМ KCl, 0,44 мМ CaCl2; Отрегулируйте pH 7,4 с NaHCO3. 20-кратный запас воды в пруду DeBoer можно хранить при температуре 4 °C и разбавлять по мере необходимости.
4x неукращающий буфер выборки 200 мМ Tris pH 6,8, 8% SDS, 0,4% бромфенол синий, 40% глицерин.
4-кратное уменьшение буфера выборки 200 мМ Tris pH 6,8, 8% SDS, 0,4% бромфеноловый синий, 40% глицерин, 14,4 М ß-меркаптоэтанол
5% Фиколл Раствор 25 г Ficoll в 500 мл 0,1x MBS, отрегулируйте рН до 7,5 с гидроксидом натрия.  Хранить при 4 °C.
Буфер лисата эмбриона 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Тритон X-100, 0,1% SDS, 2,5 % NP-40.  Хранить при 4 °C.
Хорионический гонадотропин человека Используя шприц 3 мл, прикрепленный к игле 19 г, вводят 2,5 мл стерильной воды через резиновую пробку флакона хорионического гонадотропина человека (10 000 МЕ). Хранить при 4 °C.
Буфер яичек 10% фетальная бытовая сыворотка, 1% ручка/стрептококк (100U/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина в 1x MBS

Таблица 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Основные преимущества протокола, описанного здесь, заключаются в том, что он может быть выполнен относительно быстро, не требует дорогостоящих реагентов и обеспечивает источник концентрированных продуктов расщепления Tgfß в физиологических условиях. Еще одним преимуществом является то, что он позволяет анализировать белки, помеченные эпитопом, и, таким образом, обходить нехватку коммерчески доступных антител, которые распознают большинство продоменов семейства Tgfß. Хотя также можно проанализировать расщепление помеченных эпитопом белков-предшественников Tgfß в трансфекфицированных культивируемых клетках млекопитающих, есть несколько преимуществ использования X. laevis. Ранние эмбрионы X. laevis экспрессируют всех четырех членов семейства PC, которые являются кандидатами на эндогенные конвертазы Tgfß (Furin, Pcsk5, Pcsk6 и Pcsk7)13,14,16. Некоторые клеточные линии млекопитающих не экспрессируют один или несколько ПК, что требует эктопической экспрессии как белка-предшественника, так и его конвертазы для изучения расщепления17. Более важным соображением является то, что очень высокие уровни белков-предшественников, генерируемых переходным трансфектом трансформированных клеток, могут привести к артефактам, таким как секреция неправильно свернутых продуктов расщепления, что может произойти, если уровни прекурсоров превышают способность к контролю качества в ER18. Это может маскировать влияние вредных мутаций на димеризацию и расщепление предшественников, поскольку неправильно свернутые продукты расщепления появляются в среде, и неправильное сворачивание не будет обнаружено, если активность не будет проана. Напротив, эксперименты с использованием эмбрионов X. laevis легко обнаруживают дефекты сворачивания, что приводит либо к потере предшественника из-за неправильного сложенного белкового ответа в ER, либо к аберрантной миграции продуктов расщепления в условиях невосстановления10,18.

Во время процедуры аспирации бластоцелы важно попытаться извлечь примерно эквивалентное количество бластоцелеобразной жидкости из каждого эмбриона, особенно если, например, целью было сравнить продукты расщепления, полученные из дикого типа и мутантных предшественников. Это неточная наука, но аспирирование примерно равное количество времени от каждого эмбриона помогает нормализовать объем. Кроме того, аспираторная жидкость из большего количества эмбрионов в каждой группе помогает нормализовать любые различия в объеме между отдельными эмбрионами.

Реакции расщепления in vitro представляют собой альтернативную процедуру, которая может быть использована для определения того, расщепляется ли конкретный мотив ПК, присутствующий в белке-предшественнике Tgfß, и для идентификации и/или исключения потенциальных ПК в качестве эндогенных конвертаз для данного субстрата. Существующие протоколы описывают простой анализ, в котором радиомаркированные белки-предшественники генерируются in vitro, с использованием ретикулоцитов кролика, например, или in vivo,с использованием X. laevis oocytes. Затем субстраты инкубируют in vitro с кандидатными рекомбинантными ПК и продуктами расщепления, анализируемыми с помощью электрофореза и ауторадиографии19. Хотя этот протокол обеспечивает быстрый и простой способ определить, является ли белок субстратом ПК, и определить, какие потенциальные участки расщепления используются in vivo,белки-предшественники вряд ли будут адекватно свернуты или димеризированы, и, таким образом, информация о расщеплениях, полученная в результате этих экспериментов, может не отражать ситуацию in vivo.

Одним из недостатков протокола, который мы описываем здесь, является то, что невозможно визуализировать правильно свернутый, димеризованный белок-предшественник в эмбрионах X. laevis. То же самое верно и для других эктопических систем экспрессии, таких как транзиторно трансфекционные клетки млекопитающих, поскольку неочищенный мономерный белок-предшественник накапливается в ER на гораздо более высоких уровнях, чем димеризированные и складчатые предшественники после ER. Димеризованный предшественник быстро расщепляется и секретируется, как только он покидает ER. Если необходимо проанализировать димеризацию и сворачивание белков-предшественников, полезной альтернативной процедурой является изучение незаконного оборота и расщепления радиомаркированных прекурсоров в Ооцитах X. laevis 20. Высокая чувствительность ауторадиографии в сочетании с тем фактом, что белки движутся через секреторную систему медленнее в ооцитах, чем в культивируемых клетках млекопитающих или эмбрионах, позволяет обнаружить димеризированные белки-предшественники в ооцитах и проверить, правильно ли сложены белки и покинули ли они ER, изучив их статус гликозилирования18, 21.

Таким образом, этот протокол обеспечивает быстрый и простой метод анализа продуктов расщепления, генерируемых созреванием белков-предшественников семейства Tgfß.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Мэри Санчес за отличный уход за животными. Исследования авторов поддерживаются грантами Национального института детского здоровья и развития человека Национальных институтов здравоохранения (NIH/NICHD) R01HD067473-08 и R21 HD102668-01 и грантом Национального института диабета и заболеваний пищеварительной системы и почек (NIDDK/NIH) R01DK128068-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ß-mercaptoethanol Fisher AC125470100
Bromophenol Blue Fisher B392-5
Calcium Chloride Fisher C79-500
Calcium Nitrate Fisher C109-500
Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder Fisher 12-141-364
Dumont #5 forceps Fine Science tools 11251-10
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150H
Ficoll 400 Sigma Aldrich F9378-500G
Glass capillary, 1 X 90 mm Narshige G-1
Glycerol Fisher G33-4
HEPES Fisher BP310-500
Human chorionic gonadotropin Sigma Aldrich CG10-10VL
Injection Syringe, 1 mL Fisher 8881501368
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
Magnesium Sulfate Fisher M63-500
Needle, 26 G Fisher 305111
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140148
Picoliter Microinjector Warner Instruments PLI-100A
Pipette Puller Narashige PC-100
Potassium Chloride Fisher P217-500
PVDF Membrane Sigma Aldrich IPVH00010
Sodium Bicarbonate Fisher S233-500
Sodium Chloride Fisher S271-10
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-500
Sodium Hydroxide Fisher S318-500
Tricaine-S Pentair TRS5
Tris Fisher BP152-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands. Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).
  2. Gray, A. M., Mason, A. J. Requirement for activin A and transforming growth factor--beta 1 pro-regions in homodimer assembly. Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).
  3. Constam, D. B. Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing. Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).
  4. Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. Structure and activation of pro-activin A. Nature Communications. 7, 12052 (2016).
  5. Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1. Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).
  6. Cui, Y., et al. The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor. Genes & Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).
  7. Goldman, D. C., et al. Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity. Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).
  8. Le Good, J. A., et al. Nodal stability determines signaling range. Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).
  9. Tilak, A., et al. Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice. Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).
  10. Neugebauer, J. M., et al. The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).
  11. Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).
  12. Zhou, F., et al. GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth. Cell Reports. 33, 108332 (2020).
  13. Nelsen, S. M., Christian, J. L. Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7. Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).
  14. Birsoy, B., et al. XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development. Development. 132 (3), 591-602 (2005).
  15. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).
  16. Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. Proprotein convertase genes in Xenopus development. Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).
  17. Constam, D. B., Robertson, E. J. Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases. Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).
  18. Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).
  19. Sopory, S., Christian, J. L. Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. Whitman, M. A., Whitman, S. , CRC Press LLC. 38-55 (2006).
  20. Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).
  21. Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4. Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).

Tags

Биология развития выпуск 173
Анализ трансформирующего фактора роста ß Семейство расщепляющих продуктов, секретируемых в бластоцеле эмбрионов <em>Xenopus laevis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, H. S., Christian, J. L.… More

Kim, H. S., Christian, J. L. Analysis of Transforming Growth Factor ß Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos. J. Vis. Exp. (173), e62782, doi:10.3791/62782 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter