Summary
Wanneer Transforming Growth Factor ß familie voorloper eiwitten ectopisch tot expressie komen in Xenopus laevis embryo's, worden ze gedimeriseerd, worden ze gesplitst en worden ze uitgescheiden in de blastocoele, die begint bij de late blastula tot vroege gastrula stadium. We beschrijven een methode voor het opzuigen van splitsingsproducten uit de blastocoeleholte voor immunoblotanalyse.
Abstract
De twee armen van de Transforming Growth Factor ß (Tgfß) superfamilie, vertegenwoordigd door respectievelijk Tgfß/Nodal of Bone morphogenetic protein (Bmp) liganden, spelen een essentiële rol in de embryonale ontwikkeling en volwassen homeostase. Leden van de Tgfß-familie worden gemaakt als inactieve voorlopers die dimeriseren en vouwen in het endoplasmatisch reticulum. De voorloper wordt vervolgens gesplitst in ligand- en prodomeinfragmenten. Hoewel alleen het dimerische ligand Tgfß-receptoren kan activeren en stroomafwaartse signalering kan activeren, is er een groeiende erkenning dat het prodomeingedeelte bijdraagt aan ligandactiviteit. In dit artikel wordt een protocol beschreven dat kan worden gebruikt om splitsingsproducten te identificeren die worden gegenereerd tijdens de activering van Tgfß-precursoreiwitten. RNA dat codeert voor Tgfß-voorlopers wordt eerst micro-geïnjecteerd in X. laevis-embryo's. De volgende dag worden splitsingsproducten verzameld uit de blastocoele van gastrula-stadiumembryo's en geanalyseerd op Western blots. Dit protocol kan relatief snel worden voltooid, vereist geen dure reagentia en biedt een bron van geconcentreerde Tgfß-splitsingsproducten onder fysiologische omstandigheden.
Introduction
Leden van de Transforming Growth Factor ß (Tgfß) superfamilie worden gesynthetiseerd als inactieve, gedimde voorlopereiwitten. De voorlopers worden vervolgens gesplitst door leden van de proproteïne convertase (PC) familie, hetzij binnen de secretoire route of buiten cellen. Hierdoor ontstaat een actief, disulfide-gebonden liganddimeer en twee prodomeinfragmenten1. Hoewel het al meer dan 30 jaar bekend is dat het prodomein van voorlopers van de Tgfß-familie nodig is om een actief ligand2te genereren, is het begrip van hoe prodomeinen bijdragen aan de ligandfunctie onvolledig.
Hoewel het begrip van het proces van proteolytische activering van Tgfß-familieleden onvolledig blijft, is er een toenemende belangstelling voor het begrijpen welke PC-consensusmotieven in vivoworden gesplitst, of de splitsing plaatsvindt in een specifiek subcellulair of extracellulair compartiment, en of het prodomein covalent of niet-covalent geassocieerd blijft met het gekloofde ligand3. Verschillende studies hebben aangetoond dathet prodomein niet alleen ligandvouwing vóór splitsing4, 5,maar ook de stabiliteit van de groeifactor en het actiebereik6,7,8, 9kan beïnvloeden, de vorming van homodimeren of heterodimeren10kan stimuleren, het ligand in de extracellulaire matrix kan verankeren om ligandlatentie11te behouden en in sommige gevallen als een ligand op zichzelf te functioneren om heterologe te activeren signalering12. Heterozygote puntmutaties binnen het prodomein van veel leden van de Tgfß-familie zijn geassocieerd met oog-, bot-, nier-, skelet- of andere defecten bij mensen3. Deze bevindingen benadrukken de cruciale rol van het prodomein bij het genereren en onderhouden van een actief ligand en benadrukken het belang van het identificeren en ontcijferen van de rol van splitsingsproducten die zijn ontwikkeld tijdens proteolytische rijping van Tgfß-familieprecursoren.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het opzuigen van splitsingsproducten die worden gegenereerd tijdens de rijping van Tgfß-familieprecursoren uit de blastocoele van X. laevis-embryo's en analyseren ze vervolgens op immunoblots. Dit protocol kan worden gebruikt om te bepalen of een of meer PC-consensusmotieven in een voorlopereiwit in vivo10,13worden gesplitst, de endogene PC('s) identificeren die elk motief splitsen13,14,in vivo vorming van Tgfß-familiehomodimeren versus heterodimeren10 vergelijken of analyseren of menselijke ziekte-geassocieerde puntmutaties in Tgfß-precursoren hun vermogen om functionele dimerische liganden te vormen beïnvloeden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschreven procedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Utah. Kikkers worden gehuisvest in een IACUC-goedgekeurde faciliteit. Mannelijke kikkers worden geëuthanaseerd door onderdompeling in tricaïne na het knippen van de ventrikel van het hart. Vrouwelijke kikkers worden maximaal 24 uur in het laboratorium gehuisvest na hormonale inductie van paaien om het verzamelen van eieren mogelijk te maken en vervolgens teruggebracht naar de zorginstelling.
1. Verzameling van X. laevis Testes
- Anesthetiseer een geslachtsrijpe man in 0,2% Tricaine (tabel 1) gedurende 30-40 minuten totdat het dier niet reageert op klauwknijpen.
- Gebruik een stompe tang om de huid weg te trekken van de lichaamswand. Maak een horizontale incisie in de huid over de onderbuik met behulp van een chirurgische schaar. Maak een parallelle incisie in de onderliggende lichaamswand en vervolgens een derde, loodrechte incisie door de lichaamswand omhoog door de ribbenkast.
- Vouw de resulterende flappen terug, lokaliseer de ventrikel van het hart en klem de basis vast om te exsanguineren en de dood te garanderen.
- Trek de gele vetlichamen uit de buik met een stompe tang en lokaliseer de teelballen aan elke kant, onderliggend aan de basis van de vetlichamen. Verwijder elke testis door deze weg te knippen van de vetlichamen en eventuele aangehechte ingewanden met behulp van een chirurgische schaar.
- Breng de teelballen over in een petrischaaltje met 1x Modified Barth's Solution (MBS) (tabel 1). Spoel en verwijder eventuele aanhechte bloedvaten of aangehechte ingewanden.
- Breng de ene testis over in een petrischaaltje van 35 mm met testisbuffer(tabel 1) voor onmiddellijk gebruik en bewaar de andere in een conische buis van 10 ml gevuld met testisbuffer voor later gebruik. Testis moet bij niet-gebruik bij 4 °C worden bewaard en zal ten minste twee weken levensvatbaar blijven.
OPMERKING: Foto's van de isolatie van de teelballen zijn te vinden in referentie 15.
- Breng de ene testis over in een petrischaaltje van 35 mm met testisbuffer(tabel 1) voor onmiddellijk gebruik en bewaar de andere in een conische buis van 10 ml gevuld met testisbuffer voor later gebruik. Testis moet bij niet-gebruik bij 4 °C worden bewaard en zal ten minste twee weken levensvatbaar blijven.
2. Verzameling en bevruchting van X. laevis-eieren
OPMERKING: Kikkers moeten worden behandeld met vinyl handschoenen of handen worden gewassen voor en na het hanteren van de kikkers. Latex handschoenen, lotions en wasmiddelresten op mensenhanden zullen de kwetsbare huid van de kikkers beschadigen.
- Injecteer de avond voor het paaien 0,3 ml (1200 IE) humaan choriongonadotrofine(tabel 1)in de dorsale lymfezak van twee of drie volwassen X. laevis-vrouwtjes met behulp van een spuit van 1 ml met een naald van 26 G. Gebruik voor elke injectie een nieuwe naald.
- Plaats de vrouwtjes na injectie in een afgesloten container (niet luchtdicht) in een biologische incubator van 18 °C. Paaien begint over het algemeen 14-16 uur later.
OPMERKING: Plastic laden of plastic containers met luchtgaten die in het deksel zijn gesneden, werken goed om vrouwtjes 's nachts vast te houden. Zorg ervoor dat het deksel goed zit om te voorkomen dat kikkers ontsnappen en uitverdoven in de couveuse. - Houd het vrouwtje boven een petrischaaltje van 100 mm met 1x MBS en oefen zachte druk uit op de buik van de kikker om eieren in de schaal te drijven.
- Snijd een klein stukje van de testis (~1/5) met een scheermesje en breng het over in een buis van 1,5 ml met ~500 μL 1x MBS. Plet met een pellet stamper of weefselhomogenisator. Bewaar de resulterende spermasuspensie op ijs of bij 4 °C voor volgende bevruchting op dezelfde dag.
- Kantel de petrischaal van 100 mm om zoveel mogelijk van de 1x MBS af te gieten en verwijder de rest met een plastic transferpipet. Breng ongeveer 100 μL spermasuspensie aan, voeg ongeveer 1 ml 0,1x MBS toe en draai om te mengen.
- Overspoel de schaal na 5 minuten met gedechloreerd leidingwater of 0,1x MBS en laat 30 minuten staan.
OPMERKING: Water kan worden gedechloreerd met behulp van een filter of gemeentelijk leidingwater kan ten minste 24 uur onbedekt worden gelaten om het chloor te laten verdwijnen in gebieden waar conventioneel chloor aan het water wordt toegevoegd. In gebieden waar chlooramine wordt toegevoegd om drinkwater te desinfecteren, moet het water in plaats daarvan worden behandeld met een in de handel verkrijgbare conditioner die chlooramine kan afbreken.
OPMERKING: Eieren worden verzameld in een zoutrijke oplossing (1x MBS) om de vorming van een geleilaag te voorkomen, die een barrière zou vormen voor bevruchting. Na de bevruchting zorgt de zoutarme oplossing (gedechloreerd water of 0,1x MBS) voor de vorming van een geleilaag en zullen de eieren zich aan elkaar en het gerecht hechten. Eieren die bevrucht zijn, zullen zodanig draaien dat de gepigmenteerde dierenpool binnen 30 minuten naar boven gericht is. Als dit niet gebeurt en de eieren er gezond uitzien onder de microscoop, is de levensvatbaarheid van het sperma verdacht en kan het nodig zijn om nieuwe teelballen te oogsten.
- Overspoel de schaal na 5 minuten met gedechloreerd leidingwater of 0,1x MBS en laat 30 minuten staan.
- Giet de oplossing die de eieren bedekt af en vul de petrischaal met vers bereide 2% cysteïne-oplossing(tabel 1). Draai de oplossing in de schaal gedurende 3-5 minuten totdat de geleilaag is opgelost en de eieren niet langer aan elkaar of het gerecht blijven plakken.
- Kantel de schaal en giet voorzichtig de cysteïne-oplossing af of verwijder met een plastic pipet. Vervangen door 1x DeBoer's vijverwater (Tabel 1). Draai om af te spoelen en te decanteren.
- Herhaal één wasbeurt met de oplossing van DeBoer, één met 0,1x MBS, en vul de schaal opnieuw met 0,1x MBS. Na het verwijderen van de geleilaag worden de eieren kwetsbaarder en mogen ze niet worden blootgesteld aan het lucht-vloeistofinterface.
- Verplaats de bevruchte eieren naar een biologische broedmachine van 16 °C of laat ze op kamertemperatuur op de bank liggen. Indien achtergelaten bij kamertemperatuur, zal de eerste splitsing 1-1,5 uur na de bevruchting plaatsvinden en zullen de daaropvolgende splitsingen ongeveer elke 30 minuten plaatsvinden. Als embryo's daarentegen worden geïncubeerd bij 15-16 ° C, zullen splitsingen ongeveer elk uur optreden en zal het mogelijk zijn om een groter aantal embryo's uit een bepaalde spawn te injecteren.
3. Micro-injectie van X. laevis Embryo's
- Verwarm en trek glazen haarvaten tot een fijn punt met behulp van een micropipette puller met de volgende instellingen: Two-step pull; Warmte 1: 67,4 °C; Warmte 2: 62 °C.
OPMERKING: Deze instellingen zijn specifiek voor de micropipettetrekker en glazen haarvaten die hier worden gebruikt(Tabel met materialen). - Knip onder een ontleedmicroscoop de punt van een getrokken naald dicht bij het uiteinde af met behulp van dumont # 5-tang. De naald moet scherp zijn, maar niet zo dun dat de punt buigt wanneer deze in contact komt met het embryo. Figuur 1 toont een voorbeeld van een correct getrokken naald die niet is geknipt voor micro-injectie (A) en een naald die is geknipt (B).
- Steek de naald in een naaldhouder die is aangesloten op een micro-injector. Bevestig de naaldhouder aan een micromanipulator. Plaats 2-4 μL afgetopt synthetisch RNA dat codeert voor het Tgfß-voorlopereiwit dat moet worden geanalyseerd op een klein stukje parafilm onder een ontleedmicroscoop.
- Laat met behulp van de micromanipulator de naald in de druppel zakken en gebruik de vulfunctie op de micro-injector om RNA in de naald te zuigen. Zorg ervoor dat u de naald onder het oppervlak van de druppel houdt en bekijk de voortgang onder de microscoop om te voorkomen dat er lucht in de naald wordt gespirateerd.
OPMERKING: Als antilichamen die het prodomein en/of liganddomein van de te analyseren Tgfß-voorloper herkennen niet beschikbaar zijn, kan sequentiecodering van een epitooptag (bijv. V5, myc, Flag) in-frame in het cDNA worden ingevoegd dat zal worden gebruikt als een sjabloon voor RNA-transcriptie. De in vivo bioactiviteit van het gelabelde eiwit moet worden vergeleken met die van niet-gecodeerd eiwit om ervoor te zorgen dat het epitoop niet interfereert met de juiste vouwing, splitsing of activiteit.
- Laat met behulp van de micromanipulator de naald in de druppel zakken en gebruik de vulfunctie op de micro-injector om RNA in de naald te zuigen. Zorg ervoor dat u de naald onder het oppervlak van de druppel houdt en bekijk de voortgang onder de microscoop om te voorkomen dat er lucht in de naald wordt gespirateerd.
- Werp een druppel van de RNA-oplossing in de lucht en meet de druppelgrootte met behulp van een micrometer die op de injectietrap of in het oculair van de microscoop is gemonteerd. Pas de druppelgrootte aan tot ongeveer 10 nL met behulp van de tijd- en drukregelaars op de micro-injector.
OPMERKING: RNA-concentraties in het bereik van 5-20 ng / μL zijn geschikt om 50-200 pg RNA in elk embryo af te geven. Deze hoeveelheid RNA is over het algemeen voldoende om splitsingsproducten in aspiraten van 10-20 embryo's te detecteren. Het is het beste om te streven naar de laagste dosis RNA die een detecteerbaar signaal geeft op immunoblots. Hogere hoeveelheden RNA kunnen gastrulatiedefecten veroorzaken, die de uitzetting van de blastocoele verstoren. - Verplaats embryo's naar een injectieschaal of -tray met 5% Ficoll in 0,1x MBS(tabel 1)wanneer ze het 2-4 celstadium bereiken. Een petrischaaltje van 35 mm met een stuk nylon gaas in de bodem kan dienen als een goedkope injectieschaal die de embryo's geïmmobiliseerd houdt. Steek de naald in de buurt van de dierpool en injecteer 10 nL RNA in één cel van elk embryo.
OPMERKING: Embryo's kunnen gemakkelijk worden geïnjecteerd op elk moment tussen de één en 16 celstadia. Het injecteren van het embryo nadat het is gekloofd zorgt ervoor dat de eicel is bevrucht en dat het embryo gezond is. De exacte locatie van de injectie is niet essentieel. Een meer gedetailleerde beschrijving van het paaien, de kweek en de micro-injectie van RNA's in X. laevis-embryo's is te vinden in referentie 15. - Breng de geïnjecteerde embryo's over in een petrischaaltje van 35 mm gevuld met 5% Ficoll in 0,1x MBS(tabel 1). Plaats de kleine schaaltjes in een petrischaaltje van 150 mm en dek losjes af met een deksel om te voorkomen dat de kweekmedia verdampen. Kweek de embryo's 's nachts bij 15-16 °C.
OPMERKING: Het kweken van embryo's in Ficoll helpt de injectieplaats te genezen. Als fijne naalden worden gebruikt, is het kweken in 2-3% Ficoll voldoende, terwijl 5% Ficoll de voorkeur heeft als er duidelijke schade wordt waargenomen. Het houden van de embryo's in Ficoll-oplossing gedurende 1-2 uur na injectie is voldoende om de genezing te bevorderen, maar incubatie 's nachts beschadigt het embryo niet zolang de oplossing wordt veranderd vóór het begin van de gastrulatie.
4. Blastocoele-extractie en analyse van Tgfß-splitsingsproducten
- Verwijder de volgende ochtend na de injectie de Ficoll-oplossing en verwijder eventuele dode of stervende embryo's. Spoel de embryo's een of twee keer af met 0,1x MBS en kweek de embryo's in 0,1x MBS op de bank bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Embryo's kunnen ook worden teruggebracht naar de biologische incubator van 16 °C om de ontwikkeling te vertragen. - Verwarm en trek glazen haarvaten tot een fijn punt met behulp van een micropipette puller met de volgende instellingen: Two step pull; Warmte 1: 67,4 °C; Warmte 2: 62 °C.
OPMERKING: Deze instellingen zijn specifiek voor de trekker en het glazen capillair dat hier wordt gebruikt(Tabel met materialen). - Knip onder een ontleedmicroscoop de punt van een getrokken naald af met een tang. Om verstopping te voorkomen, moet de opening van een naald die wordt gebruikt voor blastocoele-aspiratie groter zijn dan die in een naald die wordt gebruikt voor micro-inductie. Een voorbeeld van een goed getrokken en geknipte naald voor blastocoele-aspiratie is weergegeven in figuur 1C. Steek de aspiratienaald in de naaldhouder die is aangesloten op een micro-injector en bevestig de naaldhouder aan een micromanipulator.
OPMERKING: De optimale naalddiameter wordt empirisch bepaald met vallen en opstaan. Naalden met een grote diameter vullen zich te snel en maken het waarschijnlijker dat cellulair vuil de naald binnendringt. Naalden met een zeer kleine diameter daarentegen zullen waarschijnlijk verstopt raken. Zodra een geschikte naald is gegenereerd, is het handig om meerdere naalden te genereren die op dezelfde positie zijn geknipt. - Plaats embryo's in een injectiebak of schaal gevuld met 0,1x MBS wanneer ze het vroege tot het midden-gastrulastadium bereiken (stadium 10-11).
- Steek de naald onder het oppervlak van het embryo in de buurt van de dierenpool. Druk op de vulknop op de micro-injector terwijl u door de ontleedmicroscoop kijkt om de naald en het embryo in de gaten te houden. Na een paar seconden zal het niveau van heldere vloeistof in de naald stijgen en zal het embryo instorten en hol worden.
- Als troebele witte stof de naald binnendringt, laat dan de vulknop los en pulseer de injectieknop een of meer keren om troebele materie uit te werpen, die bestaat uit cellulair puin dat waarschijnlijk proteasen bevat.
OPMERKING: Als de blastocoele instort en celresten de naald binnendringen zodra de vulknop wordt ingedrukt, geeft dit aan dat de opening in de naald te groot is. Als de blastocoele niet instort, maar witte stof onmiddellijk in de naald komt, toont dit aan dat de naald te diep is ingebracht en de blastocoele-vloer raakt. Werp de witte stof uit en ga naar het volgende embryo. De aspiratiesnelheid kan zorgvuldiger worden geregeld door de vulknop te pulseren in plaats van deze continu in te drukken. Dit is vooral belangrijk als de opening in de naald groter is dan optimaal.
- Als troebele witte stof de naald binnendringt, laat dan de vulknop los en pulseer de injectieknop een of meer keren om troebele materie uit te werpen, die bestaat uit cellulair puin dat waarschijnlijk proteasen bevat.
- Herhaal stap 4.5 totdat de vloeistof is aangezogen uit de blastocoele van 10-20 embryo's.
OPMERKING: Over het algemeen is blastocoelevloeistof aangezogen uit 10-20 embryo's voldoende om splitsingsproducten op immunoblots te detecteren. Dit kan echter variëren afhankelijk van de kwaliteit van het antilichaam en moet empirisch worden bepaald. - Leg een stuk paraffine op de injectiebak en pipetteer er 1 μL nucleasevrij water op. Dompel de naald onder de druppel water en druk op de injectieknop om de blastocoelevloeistof in het water te verdrijven.
- U kunt de vloeistof ook rechtstreeks op de parafilm uitwerpen, maar in dit geval de injectieknop pulseren in plaats van deze ingedrukt te houden. Dit verdrijft de vloeistof onder lagere druk, waardoor deze niet kan worden afgevlakt op de parafilm, waardoor het moeilijk is om in een pipet op te trekken.
- Breng de blastocoelevloeistof over in een steriele microcentrifugebuis op ijs. Verwacht ongeveer 0,3-0,5 μL blastocoele vloeistof per embryo te oogsten. Voeg nucleasevrij water toe om het uiteindelijke volume aan te passen aan 30 μL.
- Breng de blastocoele vloeistof-uitgeputte embryo's over in een aparte buis op ijs. Verwijder overtollige 0,1x MBS en voeg 200 μL gekoelde (4 °C) embryolysaatbuffer (10 μL per embryo) toe (tabel 1). Pipetteer de embryo's 10-20 keer op en neer met behulp van een micropipette totdat ze volledig gehomogeniseerd zijn en er geen klonten overblijven.
- Centrifugeer de gehomogeniseerde embryo's in een gekoelde microcentrifuge bij 10.000 x g gedurende 10 minuten. Verwijder 160 μL van het supernatant met behulp van een P200-pipet en breng over naar een nieuwe buis op ijs, waarbij u voorzichtig bent om de witte dooiereiwitten en ander cellulair vuil in de onderste helft van de buis te vermijden.
- Herhaal de microcentrifugatie eenmaal en breng 128 μL van het heldere supernatant over naar een nieuwe buis op ijs. Op dit punt kunnen geruimde embryolysaten en blastocoele-vloeistof zo lang als gewenst bij -80 °C worden bewaard.
OPMERKING: Op enkele uitzonderingen na worden Tgfß-voorlopereiwitten niet uitgescheiden in de blastocoele en worden ze alleen gedetecteerd in de uitgeputte embryolysaten. Daarentegen worden de decolletéproducten van de Tgfß-familie voornamelijk gezien in de blastocoele-vloeistof. Het is nuttig om zowel de embryolysaten als de blastocoele-vloeistof voor de meeste doeleinden te oogsten en te analyseren. Dit biedt minimaal een positieve controle om ervoor te zorgen dat de precursor robuust vertaald en stabiel was. Bovendien kan men relatieve verhoudingen van splitsingsproducten vergelijken met precursoren tussen verschillende wildtype- of mutante eiwitten, om mutaties te identificeren die het mogelijk maken intacte precursoren uit te scheiden in blastocoele-vloeistof (bijv. Mutaties binnen het PC-consensusmotief die een goede vouwing en secretie mogelijk maken zonder splitsing, in welk geval de intacte precursor wordt gedetecteerd in zowel het embryo als de blastocoele-vloeistof) of mutaties die verkeerd gevouwen genereren, niet-splijtbare eiwitten (in welk geval de precursor zal worden gedetecteerd in het embryolysaat, maar splitsingsproducten zullen afwezig zijn in de blastocoele-vloeistof).
- Herhaal de microcentrifugatie eenmaal en breng 128 μL van het heldere supernatant over naar een nieuwe buis op ijs. Op dit punt kunnen geruimde embryolysaten en blastocoele-vloeistof zo lang als gewenst bij -80 °C worden bewaard.
- Deglycosylaateiwitten die op dit punt aanwezig zijn in blastocoelevloeistof met PNGase F door de instructies van de fabrikant te volgen.
OPMERKING Het is niet nodig om precursoreiwitten die aanwezig zijn in het embryolysaat te deglycosyleren, omdat deze endoplasmatisch reticulum (ER) vertegenwoordigen - residente vormen van de precursor die de complexe N-gebonden oligosacchariden missen die door PNGase F zijn verwijderd. Daarentegen hebben splitsingsproducten die aanwezig zijn in blastocoele-vloeistof zich door het trans-Golgi-netwerk (TGN) verplaatst, waar koolhydraten verder worden gemodificeerd en nu kunnen worden verwijderd door PNGase F. Na deglycosylatie migreren splitsingsproducten als een nauwer gecondenseerde band op SDS-gels, wat kan helpen bij het visualiseren, kwantificeren en nauwkeurig identificeren van splitsingsproducten. Dit is niet strikt vereist, maar het kan bijvoorbeeld nuttig zijn als u probeert onderscheid te maken tussen homodimeren en heterodimeren op basis van migratiepatronen of als een splitsingsproduct heterogene koolhydraten bevat die ervoor zorgen dat het als een brede pluizige band migreert. - Voeg 5 μL reductie van 4x monsterbuffer(tabel 1) toe aan 15 μL blastocoele-vloeistof en 15 μL geklaard embryolysaat. Voeg 5 μL niet-reducerende 4x monsterbuffer(tabel 1)toe aan de resterende 15 μL blastocoelevloeistof. Verwarm gedurende 5 min tot 100 °C en leg op ijs.
OPMERKING: Het analyseren van eiwitten onder niet-reducerende omstandigheden is essentieel om de vorming van gekloofde homodimere of heterodimere liganden te analyseren, maar is niet nodig als alleen splitsingsplaatsen of niveaus van gesplitste eiwitten worden geanalyseerd. Op enkele uitzonderingen na worden prodomeinfragmenten uitgescheiden als monomeren. Bovendien zijn voorlopereiwitten die aanwezig zijn in het embryolysaat voornamelijk ontvouwde, ER-residente monomeren. Het is dus niet nodig om deze producten te analyseren onder niet-reducerende omstandigheden. - Los precursoreiwitten en splitsingsproducten op door elektroforese op 15% SDS/polyacrylamide-gels.
- Breng eiwitten uit de gel over op een PVDF-membraan met behulp van elektroforetische overdracht.
- Incubeer membranen met geschikte antilichamen die het prodomein en het liganddomein herkennen (of epitooptags die in die domeinen zijn ingebracht), wassen en incuberen met de juiste secundaire antilichamen. Visualiseer eiwitten met chemiluminescentie of fluorescerende beeldvorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van het experiment dat hieronder wordt beschreven, was om te bepalen of Bmp4 en Bmp7 heterodimeren vormen (dimeren bestaande uit één Bmp4-ligand en één Bmp7-ligand), homodimeren (samengesteld uit twee Bmp4- of twee Bmp7-liganden), of een mengsel van elk wanneer ze samen worden uitgedrukt in X. laevis. De gegevens in figuur 2 zijn afkomstig uit een eerder gepubliceerde studie10. Figuur 2A is een schema van splitsingsproducten die worden gegenereerd door proteolytische rijping van Bmp4 of Bmp7 homodimere precursoren of Bmp4/7 heterodimere precursoren. Bmp4 wordt gesplitst op twee locaties binnen het prodomein om twee prodomeinfragmenten (donkergroen en geel) en één dimerisch ligandfragment (lichtgroen) te genereren dat migreert bij ~ 26 kDa op SDS-PAGE-gels. Bmp7 wordt op een enkele locatie gesplitst om één prodomeinfragment (kastanjebruin) en één dimerisch ligandfragment (roze) te genereren dat migreert bij ~35 kDa. Heterodimere liganden migreren bij ~30 kDa. De zilveren staaf in de liganddimeer vertegenwoordigt een myc-epitoop-tag die in dit domein is ingevoegd.
RNA dat codeert voor Bmp4myc of Bmp7myc voorlopers (200 pg), of beide RNA's (100 pg van elk) werden geïnjecteerd in X. laevis embryo's in het 2-4 celstadium. De embryo's werden 's nachts gekweekt bij 16 °C totdat ze het vroege gastrulastadium bereikten. Op dit punt werd vloeistof aangezogen uit de blastocele van 20 embryo's in elke groep en steriel water werd toegevoegd om het volume op een totaal van 30 μL te brengen. Na deglycosylatie werd elk monster in twee buizen gesplitst. Aan de ene buis werd een reducerende monsterbuffer toegevoegd en aan de andere werd een niet-reducerende monsterbuffer toegevoegd. De monsters werden gedurende 5 minuten verwarmd tot 100 °C. Eiwitten werden vervolgens gescheiden door SDS / PAGE en immunoblots werden onderzocht met antilichamen die de myc-epitooptag herkennen(figuur 2B). Onder reducerende omstandigheden werden een enkele band gedetecteerd die overeenkomt met gekloofde Bmp4-monomeren en een langzamer migrerende band die overeenkomt met gekloofde BMP7-monomeren in lysaten van embryo's die respectievelijk alleen Bmp4 of Bmp7 tot expressie brengen(figuur 2C, D, onderste paneel, rijstroken 1, 2). Beide banden werden gedetecteerd in embryo's die Bmp4 en Bmp7 co-expressien(figuur 2C,D,onderste paneel, baan 3). Relatief gelijkwaardige hoeveelheden Bmp4- en Bmp7-monomeren waren aanwezig in elk van de drie groepen (onderste paneel, reductie). In dit experiment, toen eiwitten werden gescheiden onder niet-reducerende omstandigheden, werd een enkele volwassen Bmp4 /7 heterodimeerband van intermediaire mobiliteit gedetecteerd, samen met een sporenhoeveelheid Bmp4-homodimeer in embryo's die Bmp4 en Bmp7 co-expressien(figuur 2C,bovenste paneel). Uit deze resultaten concluderen we dat als equivalente niveaus van Bmp4- en Bmp7-voorlopereiwitten tot expressie worden gebracht in Xenopus-embryo's, ze bij voorkeur heterodimeren vormen in plaats van homodimeren. In het experiment in figuur 2Dis significant meer Bmp7-eiwit aanwezig ten opzichte van Bmp4 (onderste paneel, verminderen). Als gevolg hiervan worden in embryo's die zowel Bmp7- als Bmp4-voorlopereiwitten tot expressie brengen, Bmp4-homodimeren niet gedetecteerd en in plaats daarvan is de beschikbare Bmp4 aanwezig als een Bmp4/7-heterodimeer en vormt de overtollige Bmp7 homodimeren. Hoewel dit experiment niet optimaal is, omdat het doel was om de equivalente hoeveelheid Bmp4- en Bmp7-precursor samen uit te drukken, zijn de resultaten nog steeds consistent met de conclusie dat Bmp4 en Bmp7 bij voorkeur heterodimeren vormen boven beide homodimeren wanneer ze co-uitgedrukt worden.
Figuur 1. Injectie en aspiratienaalden. Foto's van representatieve naalden die zijn getrokken maar niet geknipt (A) getrokken en geknipt voor gebruik als injectienaald (B) of getrokken en geknipt voor gebruik als aspiratienaald (C) worden getoond. De pijl en pijlpunt in (A) geven het punt aan waarop het glas werd geknipt om een naald te genereren voor respectievelijk injectie en aspiratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Analyse van gespleten Bmp-liganden geëxtraheerd uit X. laevis blastocele vloeistof. (A) Splitsingsproducten gegenereerd uit Bmp4 en Bmp7 homodimere of heterodimere precursoreiwitten en de positie van myc epitoop tag (zilverbalk) wordt schematisch weergegeven (B) Schematisch diagram met de timing van injectie en blastocoele vloeistofextractie. (C-D) Xenopus-embryo's werden geïnjecteerd met 200 pg Bmp7- of Bmp4-RNA, of met Bmp4- en Bmp7-RNA gemengd (elk 100 pg). In het gastrulastadium werd vloeistof geëxtraheerd uit de blastocoele van hetzelfde aantal embryo's in elke experimentele groep. Eiwitten aanwezig in de blastocoele vloeistof werden gedeglycosyleerd en gescheiden door SDS-PAGE. Antilichamen die de myc-epitoop tag herkenden, werden gebruikt om immunoblots te onderzoeken. De relatieve positie van immunoreactieve ligandmonomeren en dimeren wordt schematisch rechts van elke gel weergegeven. Zwarte lijn in (C) geeft het verwijderen van een tussenliggende rijstrook op de vlek aan. De getoonde gegevens zijn geëxtraheerd uit een eerder gepubliceerde studie10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Oplossing | Compositie |
| 0,2% Tricaïne | 20 g Tricaine opgelost in gedeioniseerd water, stel de pH in op 7,4 door toevoeging van natriumbicarbonaat |
| 10x MBS | 880 mM NaCl, 10 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 100 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgSO4,0,14 mM Ca(NO3)2,0,41 mM CaCl2; Stel in op pH 7,5 met NaOH. De 10x MBS-voorraad kan worden bewaard bij 4 °C en indien nodig worden verdund. |
| 2% cysteïne oplossing | 2 g cysteïne per 100 ml gedeioniseerd water, stel de pH in op 7,8-8,0 met natriumhydroxide. Maak elke dag vers. |
| 20x DeBoer's vijverwater | 100 mM NaCl, 1,3 mM KCl, 0,44 mM CaCl2; Stel in op pH 7,4 met NaHCO3. 20x voorraad vijverwater van DeBoer kan worden opgeslagen bij 4 °C en indien nodig worden verdund. |
| 4x niet-reducerende monsterbuffer | 200 mM Tris pH 6,8, 8% SDS, 0,4% broomfenolblauw, 40% glycerol. |
| 4x minder monsterbuffer | 200 mM Tris pH 6,8, 8% SDS, 0,4% broomfenolblauw, 40% glycerol, 14,4 M ß-mercaptoethanol |
| 5% Ficoll-oplossing | 25 g Ficoll in 500 ml 0,1x MBS, stel de pH in op 7,5 met natriumhydroxide. Bewaren bij 4 °C. |
| Embryo lysaat buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 2,5% NP-40. Bewaren bij 4 °C. |
| Humaan choriongonadotrofine | Injecteer met behulp van een spuit van 3 ml die is bevestigd aan een naald van 19 G 2,5 ml steriel water door de rubberen stop van een injectieflacon met humaan choriongonadotrofine (10.000 IE). Bewaren bij 4 °C . |
| Testis buffer | 10% foetaal runderserum, 1% pen/streptokokken (100U/ml penicilline, 100 mg/ml streptomycine in 1x MBS |
Tabel 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De belangrijkste voordelen van het hier beschreven protocol zijn dat het relatief snel kan worden voltooid, geen dure reagentia vereist en een bron van geconcentreerde Tgfß-splitsingsproducten biedt onder fysiologische omstandigheden. Een ander voordeel is dat het iemand in staat stelt om epitoop-gelabelde eiwitten te analyseren en zo het tekort aan commercieel beschikbare antilichamen te omzeilen die de meeste Tgfß-familie prodomein herkennen. Hoewel het ook mogelijk is om de splitsing van epitoop-gelabelde Tgfß-voorlopereiwitten in getransfecteerde gekweekte zoogdiercellen te analyseren, zijn er verschillende voordelen aan het gebruik van X. laevis. Vroege X. laevis-embryo's drukken alle vier de leden van de PC-familie uit die in aanmerking komen voor endogene Tgfß-convertasen (Furin, Pcsk5, Pcsk6 en Pcsk7)13,14,16. Sommige cellijnen van zoogdieren drukken niet een of meer PC's uit, waardoor de ectopische expressie van zowel het voorlopereiwit als het convertase ervan nodig is om de splitsing te onderzoeken17. Een belangrijkere overweging is dat zeer hoge niveaus van precursoreiwitten gegenereerd door voorbijgaande transfect van getransformeerde cellen kunnen leiden tot artefacten, zoals de secretie van verkeerd gevouwen splitsingsproducten, die kunnen optreden als de precursorniveaus de capaciteit voor kwaliteitscontrole in de ERoverschrijden 18. Dit kan het effect van schadelijke mutaties op voorloperdimmerdimeerisatie en splitsing maskeren, omdat de verkeerd gevouwen splitsingsproducten in de media verschijnen en verkeerd vouwen niet zou worden gedetecteerd tenzij de activiteit wordt getest. Daarentegen detecteren experimenten met X. laevis-embryo's gemakkelijk defecten in het vouwen, wat leidt tot verlies van precursor als gevolg van de verkeerd gevouwen eiwitrespons in het ER of afwijkende migratie van splitsingsproducten onder niet-reducerende omstandigheden10,18.
Tijdens de blastocoele-aspiratieprocedure is het van essentieel belang om te proberen een ongeveer gelijkwaardige hoeveelheid blastocoele-vloeistof uit elk embryo te extraheren, vooral als het doel bijvoorbeeld was om splitsingsproducten te vergelijken die zijn gegenereerd uit wilde en gemuteerde precursoren. Dit is een onnauwkeurige wetenschap, maar het aspirateren voor een ongeveer gelijke hoeveelheid tijd van elk embryo helpt om het volume te normaliseren. Bovendien helpt het aspirateren van vloeistof uit een groter aantal embryo's in elke groep om eventuele verschillen in volume tussen individuele embryo's te normaliseren.
In vitro splitsingsreacties zijn een alternatieve procedure die kan worden gebruikt om te bepalen of een bepaald PC-motief in een Tgfß-precursoreiwit wordt gesplitst en om potentiële pc's als endogene convertasen voor een bepaald substraat te identificeren en/of uit te sluiten. Bestaande protocollen beschrijven een eenvoudige test waarin radioactief gelabelde precursoreiwitten in vitro worden gegenereerd, bijvoorbeeld met behulp van konijnenreticulocyten, of in vivo, met behulp van X. laevis-eicellen. Substraten worden vervolgens in vitro geïncubeerd met kandidaat-recombinante pc's en splitsingsproducten geanalyseerd door elektroforese en autoradiografie19. Hoewel dit protocol een snelle en gemakkelijke manier biedt om te bepalen of een eiwit een PC-substraat is en om te identificeren welke potentiële splitsingsplaatsen in vivoworden gebruikt, is het onwaarschijnlijk dat de voorlopereiwitten voldoende gevouwen of gedimd zijn en dus splitsingsinformatie verkregen uit deze experimenten mogelijk niet de in vivo situatie weerspiegelt.
Een tekortkoming van het protocol dat we hier beschrijven, is dat het onmogelijk is om goed gevouwen, gedimd voorlopereiwit in X. laevis-embryo's te visualiseren. Hetzelfde geldt voor andere ectopische expressiesystemen, zoals tijdelijk getransfecteerde zoogdiercellen, omdat ongereinigd monomere voorlopereiwit zich in het ER op veel hogere niveaus ophoopt dan post-ER gedimde en gevouwen voorlopers. De gedimde voorloper wordt snel gesplitst en uitgescheiden zodra deze de ER verlaat. Als het essentieel is om dimerisatie en vouwing van precursoreiwitten te analyseren, is een nuttige alternatieve procedure om de handel in en splitsing van radioactief gelabelde precursoren in X. laevis-eicellen te onderzoeken20. De hoge gevoeligheid van autoradiografie, in combinatie met het feit dat eiwitten langzamer door het secretoire systeem bewegen in eicellen dan in gekweekte zoogdiercellen of embryo's, stelt men in staat om gedimde voorlopereiwitten in eicellen te detecteren en te testen of de eiwitten goed zijn gevouwen en de ER hebben verlaten door hun glycosylatiestatus te onderzoeken18, 21.
Samenvattend biedt dit protocol een snelle en eenvoudige methode om splitsingsproducten te analyseren die worden gegenereerd door de rijping van voorlopereiwitten uit de Tgfß-familie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Mary Sanchez voor de uitstekende verzorging van dieren. Het onderzoek van de auteurs wordt ondersteund door het National Institute of Child Health and Human Development van de National Institutes of Health (NIH / NICHD) subsidies R01HD067473-08 en R21 HD102668-01 en door het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK / NIH) subsidie R01DK128068-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ß-mercaptoethanol | Fisher | AC125470100 | |
| Bromophenol Blue | Fisher | B392-5 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C79-500 | |
| Calcium Nitrate | Fisher | C109-500 | |
| Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder | Fisher | 12-141-364 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science tools | 11251-10 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378-500G | |
| Glass capillary, 1 X 90 mm | Narshige | G-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-4 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma Aldrich | CG10-10VL | |
| Injection Syringe, 1 mL | Fisher | 8881501368 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Needle, 26 G | Fisher | 305111 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140148 | |
| Picoliter Microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Pipette Puller | Narashige | PC-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| PVDF Membrane | Sigma Aldrich | IPVH00010 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S271-10 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher | S318-500 | |
| Tricaine-S | Pentair | TRS5 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 |
References
- Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands. Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).
- Gray, A. M., Mason, A. J. Requirement for activin A and transforming growth factor--beta 1 pro-regions in homodimer assembly. Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).
- Constam, D. B. Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing. Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).
- Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M.
- Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1. Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).
- Cui, Y., et al. The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor. Genes & Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).
- Goldman, D. C., et al. Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity. Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).
- Le Good, J. A., et al. Nodal stability determines signaling range. Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).
- Tilak, A., et al. Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice. Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).
- Neugebauer, J. M., et al. The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).
- Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).
- Zhou, F., et al. GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth. Cell Reports. 33, 108332 (2020).
- Nelsen, S. M., Christian, J. L. Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7. Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).
- Birsoy, B., et al. XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development. Development. 132 (3), 591-602 (2005).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).
- Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L.
- Constam, D. B., Robertson, E. J. Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases. Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).
- Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).
- Sopory, S., Christian, J. L. Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. Whitman, M. A., Whitman, S. , CRC Press LLC. 38-55 (2006).
- Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).
- Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4. Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).
