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Biology

Confocal माइक्रोस्कोप इमेजिंग विश्लेषण के माध्यम से बाह्य कोशिकीय पुटिका अपटेक परख

Published: February 14, 2022 doi: 10.3791/62836
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,3, 2,4, 1, 2,4, 1
1The Brady Urological Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, School of Life Sciences, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST), 3Department of Urology, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 4Center for Soft and Living Matter, Institute for Basic Science (IBS)
* These authors contributed equally

Summary

बाह्यकोशिकीय पुटिकाएं (ईवी) सेलुलर जीव विज्ञान और अंतरकोशिकीय संचार में योगदान करती हैं। कोशिकाओं द्वारा ईवी एस अपटेक की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए व्यावहारिक assays की आवश्यकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल एक नैनो निस्पंदन आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस द्वारा ईवी अलगाव के बाद, confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से तीन आयामी प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग करके ईवी अपटेक परख का प्रस्ताव करता है।

Abstract

कोशिकाओं के बाह्य कोशिकीय पुटिका (ईवी) अपटेक की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए व्यावहारिक assays की आवश्यकता है। ईवी अपटेक विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में अंतरकोशिकीय संचार में एक भूमिका निभाता है; कैंसर जीव विज्ञान, तंत्रिका विज्ञान, और दवा वितरण। साहित्य में कई ईवी अपटेक एसेस की सूचना दी गई है; हालांकि, व्यावहारिक, विस्तृत प्रयोगात्मक पद्धति की कमी है। ईवी अपटेक का मूल्यांकन कोशिकाओं के भीतर उनके स्थान का पता लगाने के लिए ईवी को फ्लोरोसेंटली लेबल करके किया जा सकता है। कोशिकाओं में आंतरिक ईवी और कोशिकाओं पर सतही ईवी के बीच अंतर करना मुश्किल है, फिर भी महत्वपूर्ण है, ईवी अपटेक को सही ढंग से निर्धारित करने के लिए। इसलिए, एक परख है कि कुशलतासे तीन आयामी (3 डी) प्रतिदीप्ति confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से EV uptake quantifies इस काम में प्रस्तावित है. फ्लोरोसेंटली लेबल वाले ईवी को नैनो-निस्पंदन-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग करके तैयार किया गया था, जिसे 3 डी कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की गई थी, और फिर उन्नत छवि-प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के माध्यम से विश्लेषण किया गया था। प्रोटोकॉल एक सेलुलर स्तर पर ईवी का विश्लेषण करने के लिए एक मजबूत पद्धति और कुशल विश्लेषण के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण प्रदान करता है।

Introduction

बाह्य कोशिकीय पुटिकाएं (ईवी) नैनो-आकार, लिपिड झिल्ली-बाध्य कण हैं जिन्हें उनके आकारों द्वारा वर्गीकृत किया जाता है: एक्टोसोम (100-500 एनएम) और एक्सोसोम (50-150 एनएम)1। ईवी में विभिन्न बायोमोलेक्यूल्स होते हैं, जैसे प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड और लिपिड। ये बायोमोलेक्यूल्स कार्गो के रूप में encapsulated होने से पहले कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं और EVs1,2,3 के माध्यम से बाह्य कोशिकीय अंतरिक्ष में जारी किए जाते हैं।

उनके कार्गो की विविधता के कारण, ईवी एस को अंतरकोशिकीय संचार में सक्रिय भूमिका निभाने के लिए माना जाता है। कोशिकाओं द्वारा ईवी की रिहाई और उत्थान कोशिकाओं के बीच बायोमोलेक्यूल्स के हस्तांतरण की अनुमति देता है4,5। एक सेल के लिए ईवी कार्गो की शुरूआत प्राप्तकर्ता सेल के कार्यों और होमोस्टैटिक स्टेट 4,5,6 को बदल सकती है। ईवी को कई मार्गों के माध्यम से आंतरिक किया जाता है; हालांकि, सटीक तंत्र को सटीक रूप से प्रदर्शित नहीं किया गया है।

ईवी अपटेक एसेस के बहुमत, जैसे कि आनुवंशिक टैगिंग, फ्लोरोसेंटली लेबल व्यक्तिगत ईवी 7। परिणामी संकेत को माइक्रोप्लेट फोटोमीटर, फ्लो साइटोमेट्री, या माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा जा सकता है, जिसमें प्रत्येक तकनीक की पर्याप्त सीमाएं होती हैं। माइक्रोप्लेट फोटोमीटर, फ्लो साइटोमेट्री, या मानक दो-आयामी (2 डी) माइक्रोस्कोपी आंतरिक और सतही रूप से संलग्न ईवी 8, 9 के बीच अंतर नहीं कर सकती है। इसके अतिरिक्त, इन तकनीकों में से प्रत्येक के लिए आवश्यक नमूना तैयारी EV uptake मूल्यांकन के लिए अतिरिक्त मुद्दों को पेश कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, ईवी अपटेक विश्लेषण से पहले ट्रिप्सिन के साथ चिपके हुए कोशिकाओं को उठाने से सेल की सतह 10,11 पर कुछ सतही रूप से संलग्न ईवी को क्लीव किया जा सकता है। ट्रिप्सिन सेल सतह के साथ भी बातचीत कर सकता है, सेल और ईवी फेनोटाइप को प्रभावित कर सकता है। इसके अतिरिक्त, ट्रिप्सिन सतही ईवी को पूरी तरह से अलग नहीं कर सकता है, अलग-थलग आबादी को तिरछा कर सकता है।

फ्लोरोसेंट रंगों के साथ ईवी को सटीक रूप से लेबल करने के लिए, अवशिष्ट डाई 7 को हटाने के लिए अतिरिक्त धोने के चरणों की आवश्यकता होती है। स्वीकृत अलगाव तकनीकें भी जमावट के कारण झूठे-सकारात्मक संकेतों में योगदान कर सकती हैं जो ईवी अलगाव के दौरान होती हैं। उदाहरण के लिए, सीरियल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (यूसी) का उपयोग व्यापक रूप से ईवी को अलग करने और स्थिर डाई को हटाने के लिए किया जाता है। हालांकि, यूसी ईवी को सह-अवक्षेपित कर सकता है, और अवशिष्ट डाई एक गलत-सकारात्मक संकेत 12,13 का कारण बन सकता है। अन्य नैनो-निस्पंदन विधियों, जैसे स्तंभ-आधारित निस्पंदन, का उपयोग गैर-स्थिर डाई हटाने के लिए भी व्यापक रूप से किया जाता है। ईवी और स्तंभ मैट्रिक्स के भीतर बातचीत करने वाले डाई की जटिल प्रकृति जटिल इनपुट 14,15,16 द्वारा परिवर्तित किए जा रहे स्तंभ के आणविक कट-ऑफ के कारण अवशिष्ट डाई के अधूरे हटाने का कारण बन सकती है।

वर्तमान प्रोटोकॉल एक नैनो-निस्पंदन-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का प्रस्ताव करता है जो फ्लोरोसेंटली लेबल वाले अलग-अलग ईवी को अलग करने और धोने के लिए है। नैनो-निस्पंदन-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस द्रव-सहायता प्राप्त पृथक्करण प्रौद्योगिकी (फास्ट) 17,18 के माध्यम से कुशल निस्पंदन प्रदान कर सकता है। फास्ट फिल्टर भर में दबाव ड्रॉप को कम करता है, इस प्रकार ईवी और रंजक के बीच संभावित एकत्रीकरण को कम करता है। कुशलतासे अवशिष्ट डाई को हटाने से, फ्लोरोसेंटली लेबल ईवी की गुणवत्ता और परख की विशिष्टता को बढ़ाना संभव है।

Confocal माइक्रोस्कोपी सेल की सतह पर आंतरिक और सतही रूप से संलग्न ईवी के बीच अंतर कर सकती है और व्यापक रूप से एक स्पैटिओटेम्पोरल रिज़ॉल्यूशन 19,20,21,22,23,24,25 में ईवी अपटेक के सेलुलर तंत्र की जांच कर सकती है। उदाहरण के लिए, सुंग एट अल ने अपने विकसित लाइव-सेल रिपोर्टर का उपयोग करके एक्सोसोम जीवनचक्र के विज़ुअलाइज़ेशन का वर्णन किया। आंतरिक ईवी के स्थान का पता लगाया गया था और तीन आयाम (3 डी) और पोस्ट-इमेज प्रोसेसिंग टूल20 में एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। हालांकि छोटे ईवी (40-200 एनएम) का आकार ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप की रिज़ॉल्यूशन सीमा से नीचे है, फ्लोरोसेंटली लेबल वाले ईवी को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया जा सकता है क्योंकि फोटोडिटेक्टर बढ़ाया प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का पता लगा सकता है। इसलिए, एक सेल के भीतर फ्लोरोसेंटली लेबल वाले ईवी के उपकोशिकीय स्थानीयकरण को ईवी और आसपास के सेलुलर ऑर्गेनेल की कई जेड-स्टैक्ड छवियों को प्राप्त करके ठीक से निर्धारित किया जा सकता है।

इसके अतिरिक्त, 3 डी पुनर्निर्माण और पोस्ट-डेटा प्रोसेसिंग आंतरिक, सतही और मुक्त-फ्लोटिंग ईवी की स्थिति में आगे अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा पेश किए गए टाइम-लैप्स लाइव-सेल इमेजिंग के साथ संयोजन के रूप में इन प्रक्रियाओं का उपयोग करके, ईवी अपटेक के स्तर का सटीक मूल्यांकन किया जा सकता है, और ईवी अपटेक का वास्तविक समय ट्रैकिंग भी संभव है। इसके अलावा, ईवी तस्करी विश्लेषण ऑर्गेनेल के साथ ईवी के सह-स्थानीयकरण का आकलन करके कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके किया जा सकता है, यह निर्धारित करने के लिए पहला कदम है कि आंतरिक ईवी इंट्रासेल्युलर फ़ंक्शन में कैसे शामिल हैं। यह प्रोटोकॉल नैनो-निस्पंदन-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस 17,26, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और पोस्ट-इमेज विश्लेषण का उपयोग करके एक ईवी अपटेक परख करने के लिए पद्धति का वर्णन करता है।

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Protocol

1. ईवी अलगाव और पर चिप इम्यूनो फ्लोरोसेंट ईवी लेबलिंग

  1. सेल कल्चर मीडिया (सीसीएम) का संग्रह और ईवी अलगाव के लिए सीसीएम का पूर्व-प्रसंस्करण
    1. बीज PC3 कोशिकाओं पर 30% confluency एक 75 सेमी 2 सेल संस्कृति फ्लास्क में. मानक मीडिया और सेल-लाइन-विशिष्ट पूरक में नियंत्रण कोशिकाओं को 90% confluency (~ 48 h) तक बढ़ने की अनुमति दें।
      नोट: ईवी युक्त घटकों को सेलुलर अपटेक (यानी, भ्रूण गोजातीय सीरम) को प्रभावित करने से रोकने के लिए, एक्सोसोम-समाप्त मीडिया और सप्लीमेंट्स का उपयोग करें।
    2. CCM की कटाई करें।
    3. कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए 1000 x g पर सीसीएम को सेंट्रीफ्यूज करें ताकि किसी भी असंबद्ध कोशिकाओं और मीडिया के साथ काटे गए बड़े मलबे को गोली मार सकें। supernatant एक नई शंक्वाकार ट्यूब के लिए स्थानांतरण.
    4. नई ट्यूब में, 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 10,000 x g पर supernatant को सेंट्रीफ्यूज करें ताकि छोटे मलबे और मीडिया में शेष एपोप्टोटिक निकायों को गोली मार सकें। कुछ बड़े ईवी छर्रे होंगे। supernatant एक नई ट्यूब के लिए स्थानांतरण.
    5. एक 0.45 μm हाइड्रोफिलिक Polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली सिरिंज फिल्टर के माध्यम से supernatant फ़िल्टर।
      नोट:: यदि तुरंत EV अलगाव के लिए CCM संसाधित नहीं है, तो पूर्व संसाधित CCM -80 °C पर संग्रहीत करें जब तक कि अलगाव नहीं किया जाता है। यदि जमे हुए हैं, तो फ्रीज-पिघलने वाले चक्रों को एक तक सीमित करें।
  2. एक नैनो निस्पंदन आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग कर सीसीएम से ईवी अलगाव
    1. यदि जमे हुए, पूरी तरह से सीसीएम और भंवर को चरण 1.2.2 से पहले 30 सेकंड के लिए पिघलाएं।
    2. नैनो-निस्पंदन-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के नमूना कक्ष में पूर्व-संसाधित सीसीएम (चरण 1.1) के 1 एमएल इंजेक्ट करें (सामग्री की तालिका देखें)17,26।
      नोट:: नैनो-निस्पंदन-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस 17,26 के लिए मानक ऑपरेटिंग प्रक्रिया का पालन करें।
    3. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को संचालित करने के लिए बेंच-टॉप कताई मशीन ( सामग्री की तालिका देखें) में 10 मिनट के लिए 3000 आरपीएम पर स्पिन करें।
      नोट:: CCM प्रारंभिक रन के बाद नमूना कक्ष पर रहता है, तो सभी CCM नमूना कक्ष से खाली हो गया है जब तक कि अतिरिक्त spins निष्पादित करें।
    4. pipetting द्वारा अपशिष्ट कक्ष से तरल पदार्थ निकालें और चरण 1.2.1, 1.2.2, और 1.2.3 दो बार दोहराएँ।
      नोट: कुल में, सीसीएम के 3 एमएल ईवी अलगाव के लिए संसाधित किया जाएगा।
    5. अलग-थलग ईवी को धोने के लिए नमूना कक्ष में 1 एमएल फॉस्फेट-बफ़र्ड सलाइन (पीबीएस) इंजेक्ट करें। चरण 1.2.3 में उल्लिखित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के संचालन के लिए बेंच-टॉप कताई मशीन में स्पिन करें। डिवाइस की झिल्ली पर शुद्ध ईवी का पता लगाएं।
      नोट: नैनो-निस्पंदन आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस से अलग किए गए ईवी की गुणवत्ता की पुष्टि की गई थी और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम), स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एसईएम), नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए), संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी, एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसोर्बेंट परख और वास्तविक समय पीसीआर द्वारा पारंपरिक यूसी विधि की तुलना की गई थी पिछले शोध 17,26 में।
  3. नैनो-निस्पंदन आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग करके ईवी की इम्युनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग (चित्रा 1)
    1. परख के उद्देश्य के अनुसार एक ईवी-विशिष्ट एंटीबॉडी का चयन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: कुछ एंटीबॉडी ईवी-अपटेक मार्गों (यानी, एंडोसाइटोसिस) के लिए विशिष्ट लिगैंड बाइंडिंग साइटों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं।
    2. ईवी-विशिष्ट एंटीबॉडी के 1 μg / mL को अलग-थलग ईवी के 100 μL युक्त डिवाइस के क्षालन छेद में इंजेक्ट करें।
    3. नमूने भर में एंटीबॉडी के समान वितरण को सुनिश्चित करने के लिए एक प्लेट शेकर पर आरटी पर अंधेरे में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. क्षालन छेद के लिए एक चिपकने वाला टेप संलग्न करें। किसी भी अवशिष्ट एंटीबॉडी को धोने के लिए नमूना कक्ष में 1 एमएल पीबीएस इंजेक्ट करें।
    5. नमूना कक्ष खाली है जब तक 3000 rpm पर डिवाइस स्पिन। पाइपेटिंग द्वारा अपशिष्ट कक्ष से किसी भी तरल पदार्थ को हटा दें। नमूना कक्ष में 1 एमएल पीबीएस इंजेक्ट करें।
      नोट: फ्लोरोसेंटली लेबल ईवी झिल्ली कक्ष में स्थित होगा।
    6. झिल्ली कक्ष से एम्बर ट्यूब तक फ्लोरोसेंटली लेबल किए गए ईवी (चित्रा 2) को पिपेट करें। उपयोग तक प्रकाश से ब्लॉक करें।

2. ईवी-अपटेक परख के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल ईवी के साथ कोशिकाओं की इनक्यूबेशन

  1. सेल-संस्कृति संगत व्यंजनों पर लक्ष्य सेल सीडिंग और संस्कृति।
    1. बीज 1 x 104 PC3 कोशिकाओं को माइक्रोस्लाइड 8-अच्छी तरह से प्लेट (प्रत्येक अच्छी तरह से 9.4 x 10.7 मिमी) में 0.2 मिलीलीटर मीडिया या 4 x 104 पीसी 3 कोशिकाओं के साथ 35 मिमी डिश में 1 एमएल मीडिया के साथ 35 मिमी डिश में। कोशिकाओं को एक सेल-संस्कृति संगत पकवान में प्लेट करें जिसमें एक पतली कवरस्लिप (मोटाई: 0.18 मिमी) शामिल है।
      नोट: पतली coverslip प्रकाश के प्रतिकूल प्रकीर्णन को कम करता है।
    2. कोशिकाओं को इष्टतम सेल-संस्कृति स्थितियों (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 एकाग्रता, 90% आर्द्रता) में रात भर पालन करने की अनुमति दें।
    3. एक्सोसोम-समाप्त मीडिया (चरण 1.1.1 में वर्णित) के साथ दो बार पालन की गई कोशिकाओं को धोएं।
  2. फ्लोरोसेंटली लेबल ईवी के साथ सेल इनक्यूबेशन।
    1. नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए, पूरक चित्रा 1) द्वारा फ्लोरोसेंटली लेबल किए गए ईवी (चरण 1.3.5) की एकाग्रता को मापें। सुसंस्कृत कोशिकाओं (चरण 2.1.2.) में जोड़े जाने के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल किए गए ईवी की इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करें।
    2. चरण 2.2.1 में मापी गई वांछित एकाग्रता से मेल खाने के लिए एक्सोसोम-समाप्त मीडिया के साथ फ्लोरोसेंटली लेबल किए गए ईवी को पतला करें। (यानी, एक्सोसोम-समाप्त मीडिया के 200 μL में 7.80 x 109 EVs (NTA मान में)।
    3. पतला EVs (चरण 2.2.2) 2.1.2 पर तैयार किए गए लक्ष्य कक्षों में जोड़ें। प्रयोगात्मक समय के लिए इनक्यूबेट करें (यानी, 4, 8, या 12 घंटे)।
    4. किसी भी गैर-आंतरिक ईवी को हटाने के लिए एक्सोसोम-मुक्त मीडिया के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं।
      नोट:: वैकल्पिक: कक्षों को धोने के बाद ठीक किया जा सकता है।
    5. सीएमटीएमआर ((5-(और-6)-((4-क्लोरोमिथाइल)बेंजोयल)एमिनो) टेट्रामेथिलरोडामाइन) के 1 μg /mL के साथ पालन की गई कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म को लेबल करें ( सामग्री की तालिका देखें) और इष्टतम सेल-संस्कृति स्थितियों (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 एकाग्रता, 90% आर्द्रता) में इनक्यूबेट करें।
      नोट: सेल क्षेत्र रंजक लेबल ईवी से अलग से fluoresce चाहिए स्थानिक स्थान (internalized या सतही) EV uptake परख के दौरान spiked EVs के निर्धारित करने में सहायता करने के लिए.
    6. अवशिष्ट डाई को हटाने के लिए एक्सोसोम-समाप्त मीडिया के साथ लेबल की गई कोशिकाओं को दो बार धोएं। लाइव-सेल कॉन्फोकल इमेजिंग की तैयारी में कोशिकाओं में ताजा एक्सोसोम-समाप्त मीडिया जोड़ें।

3. Confocal माइक्रोस्कोपी

  1. लाइव-सेल इमेजिंग करने के लिए, इष्टतम सेल-संस्कृति स्थितियों (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 एकाग्रता, 90% आर्द्रता) को बनाए रखने के लिए एक ऑन-स्टेज इनक्यूबेटर का उपयोग करें।
  2. तैयार कोशिकाओं को ऑन-स्टेज इनक्यूबेटर में रखें।
  3. नियंत्रण नमूनों के आधार पर इमेजिंग पैरामीटर सेट करें.
    नोट: सुझाए गए नियंत्रण नमूनों में शामिल हैं: फ्लोरोसेंटली लेबल वाले ईवी केवल, फ्लोरोसेंटली लेबल वाली कोशिकाएं, बिना लेबल वाले ईवी, और अनलेबल कोशिकाएं।
  4. लक्ष्य कोशिकाओं की गहराई और 3 डी confocal छवियों को प्राप्त करने के लिए z-दिशा में स्टैकिंग आकार की सीमा निर्धारित करें।
    नोट:: एक Z-स्टैक की मोटाई 1 μm है। confocal 3D छवि अधिग्रहण 2 मिनट 34 s तक चला (प्रत्येक Z-विमान छवि अधिग्रहण लगभग 8 s; बीस Z-स्टैक छवियों की कुल) ले लिया।
  5. सेल-विशिष्ट डाई (यानी, लाल) और ईवी-विशिष्ट डाई (यानी, हरे) दोनों की एकाधिक जेड-स्टैक्ड छवियों के लिए छवि अधिग्रहण सेट करें एक साथ (चित्रा 3 और चित्रा 4 ए)।

4. छवि प्रसंस्करण

  1. कच्चे z-स्टैक्ड confocal छवियों का विश्लेषण करने और कोशिकाओं द्वारा EV अपटेक निर्धारित करने के लिए स्वचालित छवि-प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. कोशिकाओं और ईवी-विशिष्ट रंजक के फ्लोरोसेंट सिग्नल के लिए थ्रेशोल्डिंग पैरामीटर सेट करें। कोशिकाओं की आभासी सतहों का निर्माण करें (चित्र4A, B).
    1. कक्षों की वर्चुअल सतहों को बनाने के लिए, नई सतहें जोड़ें बटन क्लिक करें.
    2. सॉफ़्टवेयर द्वारा प्रदान किए गए एल्गोरिथ्म का उपयोग करने के लिए "एल्गोरिथ्म सेटिंग्स" के रूप में सबसे छोटी दूरी की गणना का चयन करें, फिर अगला: स्रोत चैनल क्लिक करें.
    3. इस प्रयोग में "स्रोत चैनल" के रूप में चैनल 2 - CMTMR का चयन करें।
    4. चिकनी का चयन करें और सतह चिकनाई के लिए "सतहों का विस्तार" में उपयुक्त मान डाल दिया।
      नोट: 0.57 μm इस प्रयोग में के बाद से 1 पिक्सेल कच्चे इमेजिंग डेटा में 0.57 μm का प्रतिनिधित्व करता है।
    5. "थ्रेशोल्डिंग" के रूप में निरपेक्ष तीव्रता का चयन करें।
    6. प्रदान किए गए एल्गोरिथ्म द्वारा फ्लोरोसेंट छवि को स्वचालित रूप से थ्रेशोल्ड करने के लिए, थ्रेशोल्ड (निरपेक्ष तीव्रता) क्लिक करें: मान स्वचालित रूप से सेट हो जाता है.
    7. "स्प्लिट टचिंग ऑब्जेक्ट्स (रीजन ग्रोइंग)" के रूप में सक्षम करें का चयन करें और इस प्रयोग में अनुमानित सेल आकार के मान को "बीज अंक व्यास" में रखें, 10.0 μm। उसके बाद अगलाक्लिक करें: फ़िल्टर बीज बिंदु।
    8. वर्चुअल सेल सतहों को कॉन्फ़िगर करने के लिए, + जोड़ें बटन पर क्लिक करें, फिर "फ़िल्टर प्रकार" के रूप में गुणवत्ता का चयन करें. एक दृश्य निरीक्षण द्वारा कम सीमा के लिए उपयुक्त मान (इस प्रयोग में 210) और ऊपरी सीमा के लिए अधिकतम मान (1485) थ्रेशोल्ड करें, फिर समाप्त करें बटन क्लिक करें।
      नोट: एक दृश्य निरीक्षण का अर्थ है कि एक शोधकर्ता एक कच्चे फ्लोरोसेंट छवि से सेलुलर क्षेत्र भेदभाव कर सकते हैं।
    9. इसके बाद, ईवी के आभासी डॉट्स बनाने के लिए, नए स्पॉट जोड़ें बटन पर क्लिक करें।
    10. "एल्गोरिथ्म सेटिंग्स " के रूप में विभिन्न स्पॉट आकार (क्षेत्र बढ़ते) और सबसे छोटी दूरी की गणना का चयन करें, फिर अगला: स्रोत चैनल क्लिक करें.
    11. इस प्रयोग में "स्रोत चैनल" के रूप में चैनल 1 - एलेक्सा फ्लोर 488 का चयन करें।
    12. स्पॉट डिटेक्शन के लिए "अनुमानित XY व्यास" में उपयुक्त मान रखें, इस प्रयोग में 1 μm । उसके बाद, अगलाक्लिक करें: फ़िल्टर स्पॉट।
    13. वर्चुअल EV डॉट्स को कॉन्फ़िगर करने के लिए, + जोड़ें बटन पर क्लिक करें, "फ़िल्टर प्रकार" के रूप में गुणवत्ता का चयन करें, और इस प्रयोग में 100 , दृश्य निरीक्षण द्वारा "लोअर थ्रेशोल्ड" सेट करें। उसके बाद, अगला: स्पॉट क्षेत्र प्रकार बटन क्लिक करें।
    14. "स्पॉट क्षेत्र प्रकार" के रूप में निरपेक्ष तीव्रता का चयन करें, फिर अगला: स्पॉट क्षेत्र क्लिक करें.
    15. दहलीज के लिए, EV डॉट्स का क्षेत्र, एक दृश्य निरीक्षण द्वारा "क्षेत्र थ्रेशोल्ड" में उपयुक्त मान डाल दिया, इस प्रयोग में "क्षेत्र थ्रेशोल्ड" के रूप में 100 ।
      नोट: एक दृश्य निरीक्षण का मतलब है कि एक शोधकर्ता एक कच्चे फ्लोरोसेंट छवि से ईवी क्षेत्र में भेदभाव कर सकता है।
    16. "से व्यास" के रूप में क्षेत्र वॉल्यूम का चयन करें, फिर समाप्त करें क्लिक करें.
  3. चरण 4.2 (चित्रा 4C, i-iv) पर निर्मित सतह के अंदर समूहीकृत धब्बों को विभाजित करने के लिए सॉफ़्टवेयर के प्रदान किए गए एल्गोरिदम का उपयोग करें।
    1. निर्मित स्पॉट पर क्लिक करें, फिर फ़िल्टर में जाएँ.
    2. क्लिक करें + जोड़ें बटन, तो सतहों की सतहों के लिए सबसे छोटी दूरी का चयन करें = सतह 1 फ़िल्टर प्रकार के रूप में, फिर नए स्पॉट बटन पर डुप्लिकेट चयन क्लिक करें। निम्न सीमा के लिए निम्नतम थ्रेशोल्ड (-7.0) और ऊपरी सीमा के लिए उपयुक्त मान (-0.5).
      नोट:: स्पॉट की अनुमानित त्रिज्या के साथ ऊपरी सीमा सेट करें। इस प्रयोग में, स्पॉट्स का अनुमानित व्यास, यानी, ईवी डॉट्स, चरण 4.2.11 में 1 μm पर सेट किया गया था; इस प्रकार, ऊपरी सीमा 0.5 हो सकती है।
  4. कोशिकाओं के अंदर ईवी की स्वचालित गिनती
    नोट:: सॉफ़्टवेयर स्वचालित रूप से कक्षों के अंदर EVs की संख्या की गणना करेगा, जो लक्ष्य कक्षों द्वारा आंतरिक की गई संख्या को इंगित करता है.
    1. निर्मित स्पॉट 1 चयन पर क्लिक करें [सतहों की सबसे छोटी दूरी सतहों की सतहों = -7.00 और -0.500 के बीच सतह1]
    2. आँकड़े पर जाएँ, और "स्पॉट की कुल संख्या" से मान निर्यात करें
      नोट:: सॉफ़्टवेयर के प्रदान किए गए एल्गोरिदम स्वचालित रूप से कक्षों की संख्या और मात्रा की गणना करेंगे।
  5. उपर्युक्त परिकलित मानों के आधार पर प्रति इनक्यूबेशन अवधि में EV अपटेक की उपज ज्ञात कीजिये (चित्र5).
    1. कक्षों की संख्या प्राप्त करने के लिए, निर्मित सतह1 पर क्लिक करें, फिर सांख्यिकी पर जाएँ, और समग्र से "सतहों की कुल संख्या" का मान निर्यात करें.
    2. विस्तृत से वॉल्यूम निर्यात करने के लिए सांख्यिकी में विस्तृत पर जाएँ।

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Representative Results

एक नैनो-निस्पंदन-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग करते हुए, ईवी को पीसी 3 सीसीएम से अलग किया गया था और फ्लोरोफोर-संयुग्मित ईवी-विशिष्ट (सीडी 63) एंटीबॉडी (चित्रा 1) के साथ लेबल किया गया था। लेबल किए गए ईवी को सफलतापूर्वक 3 डी कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2) द्वारा विज़ुअलाइज़ किया गया था। लेबल किए गए ईवी को एक्सोसोम-समाप्त मीडिया में कई घंटों के लिए कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेट किया गया था। इनक्यूबेशन बाद, कोशिकाओं को एक्सोसोम समाप्त मीडिया के साथ धोया गया था। शेष ईवी को इनक्यूबेशन के दौरान कोशिकाओं को आंतरिक या पालन किया गया था। कक्ष क्षेत्र लेबल किया गया था. आंतरिक ईवी को puncta19,20,24,27 और एक व्यक्तिगत EV (चित्रा 3 और चित्रा 4A) के रूप में देखा गया था। इन छवियों के बाद प्रसंस्करण कोशिकाओं में ईवी आंतरिककरण के विज़ुअलाइज़ेशन और परिमाणीकरण की अनुमति देता है (चित्रा 4)। संयोजन में कदम सटीक ईवी अपटेक परख कुशलतासे प्रदर्शन की अनुमति देते हैं। चित्रा 5 ईवी अपटेक परख के प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है. परख इंगित करता है कि ईवी अपटेक का स्तर इनक्यूबेशन अवधि की लंबाई पर निर्भर करता है। प्रक्रिया गैर-आंतरिकीकृत ईवी (चित्रा 4 सी) के व्यवस्थित बहिष्करण के लिए अनुमति देती है ताकि ठीक से mea + सुनिश्चित किया जा सके कि आंतरिक ईवी की संख्या। आंतरिक ईवी डॉट्स के आकार वितरण की गणना की गई थी (चित्रा 6)। इसके अलावा, आंतरिक ईवी की संख्या को विशिष्ट सेल के लिए ईवी अपटेक की वास्तविक दर निर्धारित करने के लिए प्राप्तकर्ता कोशिकाओं की मात्रा में सामान्यीकृत किया जा सकता है। सामान्यीकरण विषम सेल आकार के लिए खाता है और सेलुलर सतह क्षेत्र के बारे में आंतरिक ईवी की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है। सेलुलर सतह क्षेत्र को इनक्यूबेशन के दौरान ईवी-स्पाइक्ड, एक्सोसोम-समाप्त संस्कृति मीडिया के संपर्क में सेल क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: ईवी अलगाव और एक नैनो-निस्पंदन-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग करके ऑन-चिप लेबलिंग का योजनाबद्ध चित्रण। (ए) सीसीएम से ईवी अलगाव। (बी) ईवी की ऑन-चिप इम्युनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग। (c) अनबाउंड एंटीबॉडी को हटाना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: फ्लोरोसेंटली लेबल ईवी की इमेजिंग। फ्लोरोसेंटली लेबल (एंटी-सीडी 63-एलेक्सा फ्लोर 488) ईवी को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (40x उद्देश्य) का उपयोग करके पता लगाया गया था। (ए) सकारात्मक नमूना (एंटी-सीडी 63-एलेक्सा फ्लोर 488 लेबल ईवी)। (बी) ईवी लेबलिंग के लिए नकारात्मक नियंत्रण 1 (2 एंटीबॉडी (एलेक्सा फ्लोर 488) के साथ ईवी केवल, 1 एंटीबॉडी के बिना)। (सी) नकारात्मक नियंत्रण 2 (माउस (एमएस) आईजीजी एंटीबॉडी और दूसरे एंटीबॉडी (एलेक्सा फ्लोर 488)) के साथ ईवी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: एक 2D छवि में कोशिकाओं में आंतरिक EVs की इमेजिंग। (A) फ्लोरोसेंटली लेबल (एंटी-CD63-Alexa Fluor 488, हरा) EVs और कोशिकाओं (CMTMR, लाल) का पता इनक्यूबेशन के बाद confocal माइक्रोस्कोप (20x उद्देश्य) का उपयोग करके लगाया गया था। (बी) केवल फ्लोरोसेंटली लेबल वाले ईवी की एक अलग छवि। (C) केवल फ्लोरोसेंटली लेबल वाली कोशिकाओं की एक अलग छवि। CMTMR और Alexa Fluor 488 के लिए उत्तेजना / उत्सर्जन लेजर तरंग दैर्ध्य 560.6/595 (±50) एनएम और 487.8/525 (±50) एनएम हैं। लेजर पावर सेटिंग्स CMTMR के लिए 3.0% और एलेक्सा फ्लोर 488 के लिए 10.0% हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पोस्ट-इमेजिंग प्रक्रिया द्वारा आंतरिक ईवी का परिमाणीकरण। (ए) रॉ कॉन्फोकल छवि ईवी-अपटेक परख से प्राप्त की गई है। (बी) छवि-प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक बिंदु (हरे) के रूप में ईवी एस का आभासी प्रतिपादन और सतह (लाल) के रूप में कोशिकाओं का। (C, i-iv) सॉफ्टवेयर प्रदान एल्गोरिथ्म का उपयोग कर internalized EVs (पीले डॉट्स) और गैर internalized EVs (हरे डॉट्स, सफेद तीर) के भेदभाव. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: इनक्यूबेशन समय के एक समारोह के रूप में EV uptake की मात्रा। (ए) प्रति सेल आंतरिकीकृत ईवी की संख्या। (बी) प्रति सेल वॉल्यूम आंतरिक ईवी की संख्या। आंतरिक ईवी की संख्या इनक्यूबेशन समय के आधार पर बढ़ाई गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: आंतरिक ईवी डॉट्स का आकार वितरण। ईवी डॉट्स के आकार को मापा गया था और एक वितरण के लिए प्लॉट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: एंटी-CD63-एलेक्स फ्लोर 488 लेबल ईवी के एनटीए माप। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 2: इनक्यूबेशन समय के एक समारोह के रूप में लाइसोसोम के साथ सह-स्थानीयकृत ईवी की मात्रा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 3: इनक्यूबेशन समय के एक समारोह के रूप में EV uptake की मात्रा। (ए) प्रति सेल आंतरिकीकृत ईवी की संख्या। (बी) प्रति सेल वॉल्यूम आंतरिक ईवी की संख्या। आंतरिक ईवी की संख्या इनक्यूबेशन समय के आधार पर बढ़ाई गई थी। ईवी नमूने को आरएनए स्टेनिंग डाई द्वारा लेबल किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से 3 डी प्रतिदीप्ति इमेजिंग पर आधारित एक ईवी अपटेक परख एक कुशल पद्धति और संवेदनशील विश्लेषण प्रदान करता है। इस फ्लोरोसेंट ईवी लेबलिंग EVs के विज़ुअलाइज़ेशन की सुविधा देता है और सफलतापूर्वक एक सटीक EV uptake परख प्रदर्शन करता है. ईवी को लेबल करने और अवशिष्ट डाई को हटाने के लिए पिछले तरीकों को अल्ट्रासेंट्रिफ्यूजेशन (यूसी) का उपयोग करके वर्षा को हटाकर सूचित किया गया है; हालांकि, यूसी ईवी को सह-अवक्षेपित कर सकता है, और स्थिर डाई एक झूठी-सकारात्मक सिग्नल 12,13 का कारण बन सकती है। नैनो निस्पंदन आधारित माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण ईवी और डाई के इस सह-वर्षा को समाप्त करते हैं, इस प्रकार फ्लोरोसेंटली लेबल वाले ईवी की गुणवत्ता और परख की विशिष्टता को बढ़ाते हैं। ईवी अपटेक को वॉल्यूमेट्रिक विश्लेषण द्वारा मापा गया था ताकि सेल की सतह पर सतही ईवी से अलग आंतरिक ईवी को अलग और निर्धारित किया जा सके। ईवी अपटेक का वॉल्यूमेट्रिक विश्लेषण सेल के आकार द्वारा ईवी अपटेक के सामान्यीकरण के लिए अनुमति देता है। लाइव सेल ईवी अपटेक परख पर चरण confocal माइक्रोस्कोप इनक्यूबेटर का उपयोग करके हासिल किया गया था. प्रोटोकॉल लाइव सेल संस्कृतियों और ईवी की आवश्यकता वाले अध्ययनों पर लागू होता है। रियल-टाइम इंट्रासेल्युलर ईवी ट्रैकिंग को 3 डी विंडो में किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, उपकोशिकीय ऑर्गेनेल के साथ ईवी के सह-स्थानीयकरण के साथ-साथ स्थानिक-अस्थायी संकल्प के ईवी तस्करी विश्लेषण को प्रोटोकॉल (पूरक चित्रा 2) के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल ईवी के सेलुलर विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

प्रोटोकॉल के सभी फायदों के बावजूद, संभावित सीमाएं हैं। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले नैनो-निस्पंदन माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस ईवी अलगाव के दौरान अन्य संदूषकों को सह-पृथक कर सकते हैं। कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन ईवी के आकार में समान होते हैं और अलगाव 28 के दौरान झिल्ली में पकड़े जा सकते हैं। हालांकि ईवी-विशिष्ट मार्कर ईवी को निर्दिष्ट कर सकते हैं, सह-पृथक संदूषक डाउनस्ट्रीम विश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं। इस पांडुलिपि में, ईवी को एक सीडी 63 संयुग्मित एलेक्सा फ्लोर 488 डाई के साथ लेबल किया गया था। यह लेबलिंग ईवी का पता लगाने के लिए विशिष्टता को बढ़ाती है; हालांकि, यह ईवी सतह अणु को भी बांधता है और प्रतिस्पर्धी बंधन को बढ़ाता है। इसके अतिरिक्त, EV अपटेक का स्तर सेल लाइन और CCM पर निर्भर हो सकता है। इस प्रोटोकॉल में विस्तृत लेबलिंग विधियों को लिपोफिलिक रंजक, साइटोसोलिक रंजक और आरएनए रंजक (पूरक चित्रा 3) जैसे अन्य धुंधला रंगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल ईवी के छोटे संकेत का पता लगाने के लिए एक प्रकाश स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (एलएससीएम) का उपयोग करता है। LSCM तीव्र लेजर पर निर्भर करता है और, नतीजतन, जीवित कोशिकाओं को दीर्घकालिक लेजर उत्तेजना द्वारा क्षतिग्रस्त या परिवर्तित किया जा सकता है। तेजी से अधिग्रहण की गति एक कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोप (एसडीसीएम) का उपयोग करके photodamage को कम कर सकते हैं। एसडीसीएम का उपयोग ईवी ट्रैकिंग में भी किया जा सकता है जिसके लिए कम दूरी के आंदोलनों की कल्पना करने के लिए कम समय-अंतराल इमेजिंग की आवश्यकता होती है।

इन संभावित सीमाओं के बावजूद, प्रस्तावित प्रोटोकॉल ईवी-अपटेक मूल्यांकन के लिए एक कुशल विधि प्रदान करता है और इसमें आगे लाइव-सेल ईवी-ट्रैकिंग विश्लेषण की क्षमता है।

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Disclosures

Y.-K. Cho नैनो-निस्पंदन-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस, एक्सोडिक पर पेटेंट का एक आविष्कारक है, जो लैबस्पिनर (Ulsan, कोरिया) को लाइसेंस प्राप्त है। अन्य सभी लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस कार्य को NCI अनुदान संख्याओं द्वारा समर्थित किया गया था। U54CA143803, CA163124, CA093900, और CA143055 के लिए K. J. P. इस शोध को कोरिया स्वास्थ्य उद्योग विकास संस्थान (KHIDI) के माध्यम से कोरिया स्वास्थ्य प्रौद्योगिकी अनुसंधान और विकास परियोजना के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, जिसे स्वास्थ्य और कल्याण मंत्रालय, कोरिया गणराज्य (अनुदान संख्या: HI19C1122) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। जे किम और वाई-के द्वारा काम। चो को बुनियादी विज्ञान संस्थान (IBS-R020-D1) द्वारा समर्थित किया गया था, जिसे कोरियाई सरकार द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लेखकों ने ब्रैडी यूरोलॉजिकल इंस्टीट्यूट के वर्तमान और पिछले सदस्यों को धन्यवाद दिया, विशेष रूप से पिएंटा-संशोधन प्रयोगशाला के सदस्यों को पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए धन्यवाद दिया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody Biolegend 353038 Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody
CellTracker Orange CMTMR Dye Thermo Fisher Scientific C2927 Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent
CFI Apo Lambda S 40XC WI Nikon MRD77400 Objective for confocal imaging, NA=1.25
CFI Plan Apo VC 20X Nikon MRD70200 Objective for confocal imaging, NA=0.75
Exodisc Labspinner Inc. EX-D1001 A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation
ExoDiscovery Labspinner Inc. EX-R1001 Operation device for Exodisc
Exosome-depleted FBS Thermo Fisher Scientific A2720801 Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection
Fetal bovine serum (FBS) VWR 1500-500 Nutrient for cell cultivation
Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed abcam  ab7063 Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling
Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm Ibidi 81156 Culture dish for confocal imaging
Imaris 9.7.1 Oxford Instruments 9.7.1 Post-image processing software
Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer Live Cell Instrument TU-O-20 Incubator system for live cell imaging
Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera Nikon NA Camera for confocal imaging
Nikon Eclipse Ti microscope Nikon NA Inverted microscope for confocal imaging
NIS-Elements AR 4.50.00 Nikon 4.50.00 Image processing software for Nikon microscope
NTA, NanoSight NS500 Malvern Panalytical NS500 Measurement device for EV concentration
OriginPro 2020 OriginLab 9.7.0.185 Graphing software
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Antibiotics for cell cultivation
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 21875034 Cell culture media for PC3 cell line cultivation
SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO Thermo Fisher Scientific S32703 RNA staining fluorescent dye for the EV labeling

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जीव विज्ञान अंक 180
Confocal माइक्रोस्कोप इमेजिंग विश्लेषण <em>के माध्यम से</em> बाह्य कोशिकीय पुटिका अपटेक परख
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Kim, C. J., Kuczler, M. D., Dong,… More

Kim, C. J., Kuczler, M. D., Dong, L., Kim, J., Amend, S. R., Cho, Y. K., Pienta, K. J. Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis. J. Vis. Exp. (180), e62836, doi:10.3791/62836 (2022).

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