Summary
Extracellulära blåsor (EVs) bidrar till cellulär biologi och intercellulär kommunikation. Det finns ett behov av praktiska analyser för att visualisera och kvantifiera EVs-upptag av cellerna. Det nuvarande protokollet föreslår EV-upptagsanalysen genom att använda tredimensionell fluorescensavbildning via konfokal mikroskopi, efter EV-isolering av en nanofiltreringsbaserad mikrofluidisk enhet.
Abstract
Det finns ett behov av praktiska analyser för att visualisera och kvantifiera cellernas extracellulära vesikel (EV) upptag. Ev-upptagning spelar en roll i intercellulär kommunikation inom olika forskningsområden; cancerbiologi, neurovetenskap och läkemedelsleverans. Många EV upptag analyser har rapporterats i litteraturen; Det saknas dock praktisk, detaljerad experimentell metodik. EV-upptag kan bedömas genom att fluorescerande märka EVs för att upptäcka deras plats i celler. Att skilja mellan internaliserade EVs i celler och de ytliga EVs på celler är svårt, men ändå kritiskt, att exakt bestämma EV-upptaget. Därför föreslås en analys som effektivt kvantifierar EV-upptag genom tredimensionell (3D) fluorescenskonfokal mikroskopi i detta arbete. Fluorescerande märkta EVs förbereddes med hjälp av en nanofiltreringsbaserad mikrofluidisk enhet, visualiserad av 3D-konfokal mikroskopi och analyserades sedan genom avancerad bildbehandlingsprogramvara. Protokollet ger en robust metodik för att analysera EVs på cellnivå och ett praktiskt tillvägagångssätt för effektiv analys.
Introduction
Extracellulära blåsor (EVs) är nanostora, lipidmembranbundna partiklar som kategoriseras efter deras storlekar: ectosomer (100-500 nm) och exosomer (50-150 nm)1. EVs innehåller olika biomolekyler, såsom proteiner, nukleinsyror och lipider. Dessa biomolekyler härstammar från cellerna innan de kapslas in som last och släpps ut i det extracellulära utrymmet via EVs1,2,3.
På grund av mångfalden av deras last tros EVs spela en aktiv roll i intercellulär kommunikation. Utsättning och användning av EVs av celler möjliggör överföring av biomolekyler mellan cellerna4,5. Införandet av EV-last i en cell kan ändra mottagarcellens funktioner och homeostatiska tillstånd4,5,6. EVs internaliseras genom flera vägar; De exakta mekanismerna har dock inte visats korrekt.
Majoriteten av EV-upptagsanalyser, såsom genetisk märkning, märker fluorescerande enskilda EVs7. Den resulterande signalen kan mätas med mikroplate-fotometer, flödescytometri eller mikroskopi, där varje teknik har betydande begränsningar. Mikroplate-fotometrar, flödescytometri eller standard tvådimensionell (2D) mikroskopi kan inte skilja mellan internaliserad och ytligt fäst EVs8,9. Dessutom kan den nödvändiga provberedningen för var och en av dessa tekniker medföra ytterligare problem i utvärderingen av upptagningen av ev. Till exempel kan lyft av vidhäftade celler med trypsin före EV-upptagsanalys klyva några ytligt fästa EVs på cellens yta10,11. Trypsin kan också interagera med cellytan, vilket påverkar cell- och EV-fenotyp. Dessutom kan trypsin inte lossa ytliga EVs helt och hållet, skeva isolerade populationer.
För att noggrant märka EL med fluorescerande färgämnen krävs ytterligare tvättsteg för att ta bort restfärgen7. Accepterade isoleringstekniker kan också bidra till falskt positiva signaler på grund av koagulering som uppstår under EV-isolering. Till exempel används seriell ultracentrifugation (UC) ofta för att isolera EVs och ta bort det immobiliserade färgämnet. UC kan dock fälla ut EVs tillsammans, och restfärgen kan leda till en falskt positiv signal12,13. Andra nanofiltreringsmetoder, såsom kolumnbaserad filtrering, används också ofta för icke-immobiliserad färgborttagning. Den komplexa karaktären hos EVs och färgämne som interagerar inom kolonnmatrisen kan leda till ofullständigt avlägsnande av restfärg på grund av att kolonnens molekylära avskärning ändras av den komplexa indata14,15,16.
Det nuvarande protokollet föreslår en nanofiltreringsbaserad mikrofluidisk enhet för att isolera och tvätta fluorescerande märkta isolerade EVs. Den nanofiltreringsbaserade mikrofluidiska enheten kan ge effektiv filtrering via vätskeassisterad separationsteknik (FAST)17,18. FAST minskar tryckfallet över filtret, vilket minskar den potentiella aggregeringen mellan EVs och färgämnen. Genom att effektivt avlägsna restfärg är det möjligt att förbättra kvaliteten på fluorescerande märkta EVs och analysens specificitet.
Konfokal mikroskopi kan skilja mellan internaliserade och ytligt fästa EVs på cellytan och grundligt undersöka cellulära mekanismerna för EV-upptag i en spatiotemporal upplösning19,20,21,22,23,24,25. Till exempel beskrev Sung et al. visualiseringen av exosomlivscykeln med hjälp av deras utvecklade live-cell reporter. Platsen för de internaliserade EVs upptäcktes och analyserades med hjälp av ett konfokalt mikroskop i tredimension (3D) och efterbild bearbetningsverktyg20. Även om storleken på små EL (40-200 nm) ligger under upplösningsgränsen för det optiska mikroskopet, kan de fluorescerande märkta EVs detekteras av konfokal mikroskopi eftersom fotodetektorn kan upptäcka det förbättrade fluorescensutsläppet. Därför kan subcellulär lokalisering av fluorescerande märkta EVs i en cell exakt bestämmas genom att förvärva flera z-staplade bilder av EVs och de omgivande cellulära organellerna.
Dessutom kan 3D-rekonstruktion och efterdatabehandling ge ytterligare insikt i positionering av internaliserade, ytliga och fritt flytande EVs. Genom att använda dessa processer i samband med den tidsfördröjning live-cell imaging som erbjuds av konfokal mikroskopi, nivån av EV-upptag kan utvärderas exakt, och realtidsspårning av EV-upptag är också möjligt. Vidare kan ev trafficking analys utföras med hjälp av konfokal mikroskopi genom att bedöma samlokalisering av EVs med organeller, ett första steg för att avgöra hur internaliserade EVs är involverade i den intracellulära funktionen. Detta protokoll beskriver metoden för att utföra en EV-upptagsanalys med hjälp av nanofiltreringsbaserad mikrofluidisk enhet17,26, konfokal mikroskopi och analys efter bilden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. EV-isolering och immuno fluorescerande EV-märkning på chip
- Insamling av cellodlingsmedier (CCM) och förbehandling av CCM för EV-isolering
- Frö PC3-celler vid 30% sammanflöde i en 75 cm2 cellodlingskolv. Låt kontrollceller växa till 90% sammanflöde (~ 48 h) i standard media och celllinjespecifika kosttillskott.
OBS: För att förhindra att EV-innehållande komponenter påverkar cellulärt upptag (dvs. fetalt bovinserum), använd exosomfattiga medier och kosttillskott. - Skörda CCM.
- Centrifugera CCM vid 1000 x g i 10 min vid rumstemperatur (RT) för att pelletera eventuella obundna celler och stort skräp som skördats med mediet. Överför supernatanten till ett nytt koniskt rör.
- I det nya röret, centrifugera supernatanten vid 10 000 x g i 20 min vid 4 °C för att pelletera mindre skräp och apoptotiska kroppar som finns kvar i media. Några större elbilar kommer att pellet. Överför supernatanten till ett nytt rör.
- Filtrera supernatanten genom ett 0,45 μm hydrofilt polyvinylidenfluoridsprutfilter (PVDF).
OBS: Om du inte omedelbart bearbetar CCM för EV-isolering, förvara den förbehandlade CCM vid -80 °C tills isoleringen utförs. Om den är frusen, begränsa frys-tina-cyklerna till en.
- Frö PC3-celler vid 30% sammanflöde i en 75 cm2 cellodlingskolv. Låt kontrollceller växa till 90% sammanflöde (~ 48 h) i standard media och celllinjespecifika kosttillskott.
- EV-isolering från CCM med hjälp av en nanofiltreringsbaserad mikrofluidisk enhet
- Om den är frusen, tina helt CCM och virvel i 30 s före steg 1.2.2.
- Injicera 1 ml förbehandlad CCM (steg 1.1) i provkammaren på den nanofiltreringsbaserade mikrofluidiska enheten (se Materialförteckning)17,26.
OBS: Följ standardrutinerna för den nanofiltreringsbaserade mikrofluidiska enheten17,26. - Snurra vid 3000 varv/min i 10 minuter i bänkens spinnmaskin (se Tabell över material) för att använda den mikrofluidiska enheten.
OBS: Om CCM finns kvar på provkammaren efter den första körningen, utför ytterligare snurr tills alla CCM har tömts från provkammaren. - Ta ut vätskan ur avfallskammaren genom pipettering och upprepa steg 1.2.1, 1.2.2 och 1.2.3 två gånger.
OBS: Totalt kommer 3 ml CCM att bearbetas för EV-isolering. - Injicera 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i provkammaren för att tvätta de isolerade EL:erna. Snurra i bänkspinnmaskinen för användning av den mikrofluidiska enheten enligt steg 1.2.3. Hitta de rena EL-apparaterna på enhetens membran.
OBS: Kvaliteten på EVs som isolerats från den nanofiltreringsbaserade mikrofluidiska enheten, specifikt, bekräftades och jämfördes med den konventionella UC-metoden genom transmissionselektronmikroskopi (TEM), scanningelektronmikroskop (SEM), nanopartikelspårningsanalys (NTA), strukturerad belysningsmikroskopi, enzymlänkad immunosorbentanalys och PCR i realtid i den tidigare forskningen17,26.
- Immunofluorescent märkning av EV med hjälp av nanofiltreringsbaserad mikrofluidisk enhet (figur 1)
- Välj en EV-specifik antikropp enligt syftet med analysen (se Tabell över material).
OBS: Vissa antikroppar kan störa ligandbindningsställen som är specifika för EV-upptagsvägar (dvs. endocytos). - Injicera 1 μg/ml ev-specifik antikropp i elutionshålet på den anordning som innehåller 100 μL isolerade ELV.
- Inkubera i 1 h i mörker vid RT på en plattskakapparat för att säkerställa jämn fördelning av antikroppen över provet.
- Fäst en tejp på elutionshålet. Injicera 1 ml PBS i provkammaren för att tvätta bort eventuella kvarvarande antikroppar.
- Snurra enheten vid 3000 varv/min tills provkammaren är tom. Ta bort eventuell vätska från avfallskammaren genom pipettering. Injicera 1 ml PBS i provkammaren.
OBS: Fluorescerande märkta EL-fordon kommer att placeras i membrankammaren. - Pipettera de fluorescerande märkta EVs (figur 2) från membrankammaren till ett bärnstensrör. Blockera från ljus tills det används.
- Välj en EV-specifik antikropp enligt syftet med analysen (se Tabell över material).
2. Inkubation av cellerna med fluorescerande märkta EVs för EV-upptagsanalysen
- Rikta cellsådd och kultur på de cellkulturkompatibla rätterna.
- Frö 1 x 104 PC3-celler i mikroslide 8-brunnsplattan (9,4 x 10,7 mm för varje brunn) med 0,2 ml media eller 4 x 104 PC3-celler i en 35 mm skål med 1 ml media. Plätera cellerna i en cellodlingskompatibel skål bestående av ett tunt täckslip (tjocklek: 0,18 mm).
OBS: Det tunna täcket minimerar den negativa ljusspridningen. - Låt cellerna klibba över natten under optimala cellodlingsförhållanden (37 °C, 5% CO2-koncentration , 90% luftfuktighet).
- Tvätta vidhäftade celler två gånger med exosomfattiga medier (beskrivs i steg 1.1.1).
- Frö 1 x 104 PC3-celler i mikroslide 8-brunnsplattan (9,4 x 10,7 mm för varje brunn) med 0,2 ml media eller 4 x 104 PC3-celler i en 35 mm skål med 1 ml media. Plätera cellerna i en cellodlingskompatibel skål bestående av ett tunt täckslip (tjocklek: 0,18 mm).
- Cellinkubation med fluorescerande märkta EL.
- Mät koncentrationen av fluorescerande märkta EL -fordon (steg 1.3.5) genom analys av nanopartiklar (NTA, kompletterande figur 1). Bestäm den optimala koncentrationen av fluorescerande märkta EL-fordon som ska läggas till de odlade cellerna (steg 2.1.2.).
- Späd ut de fluorescerande märkta EVs med exosomuttömda medier för att matcha önskad koncentration mätt i steg 2.2.1. (dvs. 7,80 x 109 EVs (i NTA-värde) i 200 μL exosomfattiga medier.)
- Tillsätt de utspädda EVs (steg 2.2.2) till de vidhäftade målcellerna som är förberedda vid 2.1.2. Inkubera för experimentell tid (dvs. 4, 8 eller 12 h).
- Tvätta cellerna tre gånger med exosomfria medier för att ta bort eventuella icke-internaliserade EVs.
OBS: Valfritt: Celler kan fixeras efter tvätt. - Märk cytoplasman hos de vidhäftade cellerna med 1 μg/ml CMTMR ((5-(och-6)-(((4-klorometyl)bensoyl)amino) tetrametylrhodamin) (se Tabell över material) och inkubera under optimala cellodlingsförhållanden (37 °C, 5% CO2-koncentration , 90% fuktighet).
OBS: Färgämnen i cellområdet bör fluorescera separat från märkta EL-fordon för att underlätta fastställandet av den rumsliga platsen (internaliserad eller ytlig) för de spikade EVs under EV-upptagsanalysen. - Tvätta märkta celler två gånger med exosomuttömda medier för att avlägsna restfärgen. Tillsätt färska exosomuttömda medier till cellerna som förberedelse för levande cell confocal imaging.
3. Konfokal mikroskopi
- För att utföra live-cell imaging, använd en inkubator på scenen för att upprätthålla optimala cellodlingsförhållanden (37 °C, 5% CO2-koncentration , 90% fuktighet).
- Placera de beredda cellerna i inkubatorn på scenen.
- Ställ in bildparametrarna baserat på kontrollexempel.
Obs: Föreslagna kontrollprover inkluderar: Fluorescerande märkta EVs, fluorescerande märkta celler, omärkta EVs och omärkta celler. - Bestäm målcellernas djup och staplingsstorleken i z-riktningen för att hämta 3D-konfokala bilder.
OBS: Tjockleken på en Z-stack är 1 μm. Det konfokala 3D-bildförvärvet varade i 2 min 34 s (varje Z-plan bildförvärv tog cirka 8 s; totalt tjugo Z-stackbilder). - Ställ in bildförvärv på flera z-staplade bilder av både cellspecifikt färgämne (dvs rött) och EV-specifikt färgämne (dvs. grönt) samtidigt (figur 3 och figur 4A).
4. Bildbehandling
- Använd automatisk bildbehandlingsprogramvara för att analysera de råa z-staplade konfokala bilderna och bestämma EV-upptaget av celler (se Tabell över material).
- Ställ in tröskelvärdesparametrar på cellernas fluorescerande signal och EV-specifika färgämnen. Bygg cellernas virtuella ytor (figur 4A, B).
- Om du vill skapa cellernas virtuella ytor klickar du på knappen Lägg till nya ytor.
- Välj Kortaste avståndsberäkning som "Algoritminställningar" för att använda den medföljande algoritmen av programvaran och klicka sedan på Nästa: Källkanal.
- Välj Kanal 2 - CMTMR som "Källkanal" i det här experimentet.
- Välj Utjämna och sätt rätt värde i "Surfaces Detail" för ytutjämning.
OBS: 0,57 μm i detta experiment eftersom 1 pixel representerar 0,57 μm i rådata. - Välj Absolut intensitet som "Tröskelvärde".
- Om du automatiskt vill tröskel för den fluorescerande bilden med den angivna algoritmen klickar du på Tröskelvärde (absolut intensitet): Värdet anges automatiskt.
- Välj Aktivera som "Split touch Objects (Region Growing)" och placera värdet för uppskattad cellstorlek i "Seed Points Diameter", 10,0 μm i det här experimentet. Klicka sedan på Nästa: Filtrera fröpunkter.
- Om du vill konfigurera de virtuella cellytorna klickar du på + Lägg till och väljer sedan Kvalitet som "Filtertyp". Tröskelvärdet för lämpligt värde (210 i det här experimentet) för den låga gränsen genom en visuell inspektion och det maximala värdet (1485) för den övre gränsen och klicka sedan på knappen Slutför .
OBS: En visuell inspektion innebär att en forskare kan skilja cellområdet från en rå fluorescerande bild. - Klicka sedan på knappen Lägg till nya fläckar om du vill skapa virtuella punkter med EVs.
- Välj Olika dekorstorlekar (regionodling) och kortaste avståndsberäkning som "Algoritminställningar" och klicka sedan på Nästa: Källkanal.
- Välj Kanal 1 - Alexa Fluor 488 som "Källkanal" i det här experimentet.
- Sätt det lämpliga värdet i "Uppskattad XY Diameter" för spotdetekteringen, 1 μm i detta experiment. Klicka sedan på Nästa: Filtrera fläckar.
- Om du vill konfigurera de virtuella EV-prickarna klickar du på + Lägg till knappen, väljer Kvalitet som "Filtertyp" och ställer in "Lägre tröskelvärde" genom en visuell inspektion, 100 i det här experimentet. Klicka sedan på knappen Nästa: Dekorregiontyp .
- Välj Absolut intensitet som "Dekorregioner Typ" och klicka sedan på Nästa: Dekorregioner.
- Till tröskelvärdet sätter regionen EV-prickar det lämpliga värdet i "regiontröskel" genom en visuell inspektion, 100 som "regiontröskel" i det här experimentet.
OBS: En visuell inspektion innebär att en forskare kan skilja EVs-området från en rå fluorescerande bild. - Välj Regionvolym som "Diameter från" och klicka sedan på Slutför.
- Använd programvarans medföljande algoritmer för att dela de grupperade fläckarna inuti den byggda ytan i steg 4.2 (figur 4C, i-iv).
- Klicka på de byggda fläckarna och gå sedan till Filter.
- Klicka på + Lägg till knappen och välj sedan Kortaste avstånd till ytor = Surface 1 som filtertyp och klicka sedan på Duplicera markering till knappen Nya fläckar . Det lägsta tröskelvärdet (-7,0 i det här experimentet) för den låga gränsen och lämpligt värde (-0,5) för den övre gränsen.
OBS: Ställ in den övre gränsen med den uppskattade radien av Fläckar. I detta experiment fastställdes den uppskattade diametern på fläckar, dvs. den övre gränsen kan alltså vara 0,5.
- Automatisk räkning av EL-fordon inuti cellerna
OBS: Programvaran räknar automatiskt antalet EVs inuti cellerna, vilket anger antalet internaliserade av målcellerna.- Klicka på det byggda valet Fläckar 1 [Kortast avstånd till ytor = ytor 1 mellan -7,00 och -0,500].
- Gå till statistiken och exportera värdet från "Totalt antal fläckar"
OBS: Programvarans medföljande algoritmer beräknar automatiskt antalet och volymen av celler.
- Bestäm avkastningen av EV-upptag per inkubationsperiod baserat på ovanstående beräknade värden (figur 5).
- Om du vill hämta antalet celler klickar du på de byggda ytorna 1 och går sedan till statistiken och exporterar värdet "Totalt antal ytor" från Övergripande.
- Gå till Detaljerad i statistik för att exportera volymen från detaljerad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av en nanofiltreringsbaserad mikrofluidisk enhet isolerades EVs från PC3 CCM och märktes med en fluoroforkonjugerad EV-specifik (CD63) antikropp (figur 1). De märkta EVs visualiserades framgångsrikt av 3D confocal mikroskopi (figur 2). De märkta EVs inkuberades med celler i flera timmar i exosom-utarmade medier. Efter inkubation tvättades cellerna med exosom utarmade medier. De återstående EVs internaliserades eller följdes till celler under inkubation. Cellområdet var märkt. Internaliserade EVs visualiserades som punkta19,20,24,27 och en individuell EV (figur 3 och figur 4A). Efterbehandling av dessa bilder möjliggör visualisering och kvantifiering av EV-internalisering i cellerna (figur 4). Stegen tillsammans möjliggör korrekt EV-upptagsanalys som utförs effektivt. Figur 5 visar de representativa resultaten av ev-upptagningsanalysen. Analysen visar att nivån på ev-upptaget beror på inkubationstidens längd. Förfarandet gör det möjligt att systematiskt utesluta icke-internaliserade elfordon (figur 4C) till exakt mea+säker på antalet internaliserade EL-fordon. Storleksfördelningen för internaliserade EV-punkter beräknades (figur 6). Dessutom kan antalet internaliserade EVs normaliseras till mottagarcellernas volym för att bestämma den faktiska frekvensen av EV-upptag för den specifika cellen. Normalisering står för den heterogena cellstorleken och representerar antalet internaliserade EVs när det gäller den cellulära ytan. Cellulär yta definieras som cellområdet i kontakt med EV-spetsade, exosomfattiga odlingsmedier under inkubation.
Bild 1: Schematisk illustration av EV-isoleringen och märkning på chip med hjälp av en nanofiltreringsbaserad mikrofluidisk enhet. A) Elfordon som är isolerade från CCM. B) Immunofluorescent märkning av elfordon på chip. C) Avlägsnande av obundna antikroppar. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Bildbehandling av fluorescerande märkta elfordon. De fluorescerande märkta (anti-CD63-Alexa Fluor 488) EVs upptäcktes med hjälp av confocal mikroskop (40x mål). (A) Positivt prov (anti-CD63-Alexa Fluor 488 märkt EL). (B) Negativ kontroll 1 för EV-märkning (EVs med endast andra antikroppen (Alexa Fluor 488), utan första antikroppen). (C) Negativ kontroll 2 (EVs med musen (MS) IgG-antikropp och andra antikroppen (Alexa Fluor 488)). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3: Avbildning av de internaliserade EVs i celler i en 2D-bild. (A) De fluorescerande märkta (anti-CD63-Alexa Fluor 488, grön) EVs och cellerna (CMTMR, röd) upptäcktes med hjälp av det konfokala mikroskopet (20x-objektivt) efter inkubationen. B) Endast en separat bild av de fluorescerande märkta EL-fordonen. C) Endast en separat bild av de fluorescerande märkta cellerna. Excitations-/emissionslaservåglängderna för CMTMR och Alexa Fluor 488 är 560,6/595 (±50) nm och 487,8/525 (±50) nm. Lasereffektinställningarna är 3,0 % för CMTMR och 10,0 % för Alexa Fluor 488. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Kvantifiering av de internaliserade EVs genom efteravbildningsprocessen. (A) Rå konfokal bild som erhållits från EV-upptagsanalysen. (B) Virtuell återgivning av EL-fordonen som en punkt (grön) och cellerna som en yta (röd) med hjälp av bildbehandlingsprogramvaran. (C, i-iv) Diskriminering av internaliserade EVs (gula prickar) och icke-internaliserade EVs (gröna prickar, vit pil) med hjälp av den medföljande algoritmen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Mängden EV-upptag som en funktion av inkubationstiden. A) Antalet internaliserade EVs per cell. B) Antalet internaliserade EVs per cellvolym. Antalet internaliserade EVs ökade beroende på inkubationstiden. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 6: Storleksfördelningen för internaliserade EV-prickar. Storleken på EV-prickar mättes och ritades till en fördelning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1: NTA-mätning av anti-CD63-Alex Fluor 488-märkta EVs. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Mängden samlokaliserade EL-fordon med lysosomer som inkubationstid. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: Mängden EV-upptag som en funktion av inkubationstiden. A) Antalet internaliserade EVs per cell. B) Antalet internaliserade EVs per cellvolym. Antalet internaliserade EVs ökade beroende på inkubationstiden. EV-provet var märkt med RNA-färgämne (se Materialtabell). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En EV-upptagsanalys baserad på 3D-fluorescensavbildning via konfokal mikroskopi ger en effektiv metodik och känslig analys. Denna fluorescerande EV-märkning underlättar visualiseringen av EVs och utför framgångsrikt en exakt EV-upptagsanalys. Tidigare metoder för märkning av elfordon och avlägsnande av restfärgen har rapporterats genom att nederbörd med hjälp av ultracentrifugation (UC) har avlägsnats. UC kan dock samfällera EVs, och det immobiliserade färgämnet kan leda till en falskt positiv signal12,13. Nanofiltreringsbaserade mikrofluidiska enheter eliminerar denna samutfällning av EL och färgämnen, vilket förbättrar kvaliteten på de fluorescerande märkta EVs och analysens specificitet. EV-upptag mättes genom volymetrisk analys för att skilja och kvantifiera de internaliserade EVs separat från ytliga EVs på cellytan. Den volymetriska analysen av EV-upptag möjliggör normalisering av EV-upptag efter cellstorlek. Live-cell EV upptag assay uppnåddes genom att använda på scenen confocal mikroskop inkubator. Protokollet gäller studier som kräver levande cellkulturer och EVs. Intracellulär EV-spårning i realtid kan utföras i ett 3D-fönster. Dessutom kan analys av fysisk-temporal upplösning tillsammans med samlokalisering av elfordon med subcellulära organeller uppnås genom protokollet (kompletterande figur 2). Protokollet som beskrivs här är ett kraftfullt verktyg för cellulär analys av EVs.
Trots alla fördelar med protokollet finns det potentiella begränsningar. Den mikrofluidiska nanofiltreringsanordningen som används i denna studie kan samissolera andra föroreningar under EV-isolering. Lipoproteiner med låg densitet liknar EVs och kan fångas i membranet under isolering28. Även om EV-specifika markörer kan ange elfordon, kan de samisolerade föroreningarna påverka nedströmsanalysen. I detta manuskript var EVs märkta med en CD63 konjugerad Alexa Fluor 488 färgämne. Den här märkningen ökar specificiteten för EV-identifiering. men det binder också EV-ytmolekylen och ökar konkurrensbindningen. Dessutom kan nivån på EV-upptaget vara beroende av cellinjen och CCM. De märkningsmetoder som beskrivs i detta protokoll kan anpassas till andra färgämnen som lipofila färgämnen, cytosoliska färgämnen och RNA-färgämnen (kompletterande figur 3). Protokollet använder ett ljusskanningskonfokalt mikroskop (LSCM) för att upptäcka den lilla signalen från EVs. LSCM förlitar sig på intensiva lasrar och som ett resultat kan levande celler skadas eller ändras av långsiktig laserexcitation. Den snabba förvärvshastigheten kan minska fotodamage genom att använda ett snurrande skivkonfokalt mikroskop (SDCM). SDCM kan också användas i EV-spårning som kräver kort tidsfördröjning för att visualisera kortdistansrörelser.
Trots dessa potentiella begränsningar ger det föreslagna protokollet en effektiv metod för ev-upptag bedömning och har potential för ytterligare live-cell EV-spårning analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Y.-K. Cho är uppfinnare av patenten på den nanofiltreringsbaserade mikrofluidiska enheten Exodisc, som är licensierad till Labspinner (Ulsan, Korea). Alla andra författare har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NCI-bidragsnr. U54CA143803, CA163124, CA093900 och CA143055 till K. J. P. Denna forskning stöddes av ett bidrag från Korea Health Technology R&D Project genom Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansierat av Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (bidragsnummer: HI19C1122). Arbete av J. Kim och Y.-K. Cho stöddes av Institute for Basic Science (IBS-R020-D1), finansierat av den koreanska regeringen. Författarna tackar de nuvarande och tidigare medlemmarna i Brady Urological Institute, särskilt medlemmar av Pienta-Amend-laboratoriet, för den kritiska läsningen av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
References
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -K., Cho, Y. -K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics. The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).
- Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Bonsergent, E., et al. Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells. Nature Communications. 12, 1864 (2021).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R.
- Ragni, E., et al. Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments. Cells. 9 (5), 1180 (2020).
- Saari, H., et al. FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel. Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).
- Franzen, C. A., et al. Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells. BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).
- Feng, D., et al. Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Hoen, E. N. M. N. -T., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van Der Vlist, E. J., Nolte-'T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Singh, K., et al. Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges. The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).
- Woo, H. -K., et al. Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples. ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).
- Kim, T. -H., et al. FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface. Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).
- Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
- Sung, B. H., et al. A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells. Nature Communications. 11, 2092 (2020).
- Heusermann, W., et al. Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER. Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).
- Reclusa, P., et al. Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion. Scientific Reports. 10, 6494 (2020).
- Verweij, F. J., et al. Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo. Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., Stępień, E. 3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells. Cellular & Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).
- Sunkara, V., et al. Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring. Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).
- Li, H., et al. Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).
- Dong, L., et al. Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium. Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).
