Summary
Ett förfarande för kapillärelektrofores elektrosprayjonisering masspektrometri för absolut kvantifiering av inositolpyrofosfater från däggdjurscellextrakt beskrivs.
Abstract
Inositol pyrofosfater (PP-InsPs) är en viktig grupp av intracellulära signalmolekyler. Härledd från inositolfosfater (InsPs), dessa molekyler har närvaron av minst en energisk pyrofosfatdel på myo-inositol ringen. De existerar allestädes närvarande i eukaryoter och fungerar som metaboliska budbärare som undersöker fosfathomeostas, insulinkänslighet och cellulär energiladdning. På grund av frånvaron av en kromofor i dessa metaboliter, en mycket hög laddningstäthet och låg överflöd, kräver deras analys radioaktivt spårämne, och därmed är det invecklat och dyrt. Här presenterar studien ett detaljerat protokoll för att utföra kvantifiering av inositolpyrofosfater från däggdjursceller genom kapillärelektrofores elektrosprayjoniseringsmasspektrometri (CE-ESI-MS). Denna metod möjliggör känslig profilering av alla biologiskt relevanta PP-InsPs-arter i däggdjursceller, vilket möjliggör baslinjeseparation av regioisomerer. Absoluta cellulära koncentrationer av PP-InsPs, inklusive mindre isomerer, och övervakning av deras temporala förändringar i HCT116-celler under flera experimentella förhållanden presenteras.
Introduction
Sedan den första upptäckten av myo-inositol pyrofosfater (PP-InsPs) i 19931,2, betydande framsteg har gjorts för att belysa deras biosyntes, omsättning, och funktioner3. Inositolpyrofosfater förekommer allestädes närvarande i eukaryota celler4 och fungerar som metaboliska signalmolekyler som är kritiskt involverade i t.ex. fosfathomeostas5,6, insulinkänslighet7, kalciumoscillationer8,9, vesikulär handel 10, apoptos 11, DNA-reparation 12, immunsignalering 13 och andra. Den uppsjö av viktiga processer under kontroll av inositol pyrofosfater kräver en djupare förståelse för deras cellulära överflöd, fluktuationer, och lokalisering.
Även om InsP: er och PP-InsPs väckte uppmärksamhet över discipliner, utförs analysen av deras överflöd rutinmässigt med hjälp av en metod som utvecklats under 80-talet, bestående av märkning av celler med tritierad inositol, som löser de extraherade PP-InsP: erna genom stark anjonbyteskromatografi Sax-HPLC med efterföljande scintillationsräkning. Nyare metoder baserade på masspektrometri står fortfarande inför betydande utmaningar: inositolpyrofosfater med upp till åtta fosfatenheter hamnar fosfatestrar och anhydrider, vilket leder till en betydande negativ laddning och potentiell fosfatförlust under jonisering. Det finns fyra huvudtyper av PP-InsP som finns hos däggdjur (figur 1): 1,5-(PP)2-InsP 4 (eller 1,5-InsP8), 5-PP-InsP 5 (eller 5-InsP 7), 1-PP-InsP 5 (eller 1-InsP7) och 5-PP-Ins(1,3,4,6)P 4 (eller5-PP-InsP 4)3,14. De fysiologiska nivåerna av PP-InsPs ligger vanligtvis i nano- till lågmikromolära intervallet, med 5-PP-InsP 5 som de vanligaste med cellulära koncentrationer på 0,5 - 5 μM. 1,5-(PP)2-InsP4 och 1-PP-InsP 5 tros vara upp till cirka 10% av 5-PP-InsP 5-poolen och förblir svåra att spåra i många celler15. 5-PP-InsP4 med en fri OH-grupp är ännu lägre i överflöd och blir vanligtvis bara detekterbar när fosfathydrolaser hämmas med natriumfluorid (NaF)16.
Den höga laddningstätheten hos PP-InsPs gör deras separation svår, och förekomsten av PP-InsP-regioisomerer komplicerar dessa ansträngningar ytterligare. Som ett resultat förlitade sig de flesta experiment på kvantifiering genom metabolisk radioaktiv märkning av celler med [3H] -inositol, eftersom bakgrund från matrisen utesluts och hög känslighet uppnås17,18. Denna metod är dock kostsam, tidskrävande och tillåter inte att korrekt skilja relaterade PP-InsP-regioisomerer. Dessutom, [3H]-inositol märkning inte konto för endogena inositol syntes från glukos. En polyakrylamidgelelektrofores (PAGE)-baserad metod är ett allmänt tillämpat billigt alternativ men begränsat i sin känslighet 19,20,21,22. Andra metoder för att undvika radiomärkning har publicerats, inklusive jonkromatografi följt av UV-detektion23 efter kolonnderivatisering, hydrofil interaktionskromatografi (HILIC)24 eller svagt anjonutbyte (WAX) i kombination med masspektrometri (MS)25. Emellertid, de är inte (ännu) i nivå med den klassiska [3H]-inositol SAX-HPLC protokoll.
Nyligen introducerades kapillärelektrofores elektrosprayjoniseringsmasspektrometri (CE-ESI-MS) som en transformativ strategi för analys av InsP- och PP-InsPs-metabolism, som uppfyller alla krav som diskuterats ovan16. I kombination med nuvarande toppmodern InsP-extraktion med perklorsyra följt av anrikning med titandioxidpärlor26 lyckades CE-ESI-MS med alla organismer som testats hittills, från jäst till växter och däggdjur. Samtidig profilering av InsP: er och PP-InsPs, inklusive alla möjliga regioisomerer, uppnåddes enkelt. Stabila isotopmärkta (SIL) interna standarder möjliggjorde en snabb och exakt absolut kvantifiering, oavsett matriseffekter. Eftersom MS kan fånga isotopiska massskillnader kan CE-ESI-MS också tillämpas för att studera uppdelade cellulära syntesvägar för InsPs och PP-InsPs, t.ex. genom att mata celler med [13 C 6] -myo-inositol eller [13C6] -D-glukos.
Här beskrivs ett detaljerat steg-för-steg-protokoll för den absoluta kvantifieringen av PP-InsPs och InsPs från däggdjursceller av CE-ESI-MS. Förutom den stora 5-PP-InsP 5-isomeren kvantifieras också 1,5-(PP)2-InsP 4 och 1-PP-InsP5 i denna studie, trots deras lägre förekomst. Två HCT116-cellinjer från olika laboratorier (NIH, UCL) studeras, och det valideras att HCT116UCL-celler innehåller 7-faldigt högre nivåer av 1,5-(PP)2-InsP4 än vad som finns i HCT116NIH, medan 5-PP-InsP 5-koncentrationer är jämförbara. Dessutom ökar inte 1-PP-InsP5-syntesen i HCT116UCL signifikant. Ökningen av PP-InsP-nivåer genom att blockera deras defosforylering med användning av natriumfluorid studeras också kvantitativt.
Protocol
1. Inrättande av CE-ESI-MS-systemet
- Ställ in ett CE-ESI-MS-system bestående av ett kommersiellt CE-system - och en trippel quadrupole tandemmasspektrometer, utrustad med en Agilent Jet Stream (AJS) elektrosprayjoniseringskälla (ESI). Ett CE-ESI-MS-sprutpaket och en isokratisk LC-pump (vätskekromatografi) krävs.
- Anslut mantelflödet 1:100 splitter (ingår i CE-MS sprutsatsen) och det isokratiska LC-pumputloppet.
- Se till att CE-systemets inloppsflaska är på samma höjd som sprutspetsen på massanalysatorn.
- Använd MassHunter Workstation (version 10.1) eller jämförbar MS-programvara för att styra hela systemet och för datainsamling och analys.
2. Förbereda buffert-, kapillär- och CE-MS-system
- Förbered CE-körbuffert: Justera pH-värdet på 40 mM ammoniumacetat till 9,0 med ammoniumhydroxid. En 250 ml mätkolv rekommenderas. Filtrera 250 ml buffert med membranfilter med 0,2 μm porstorlek. Se till att endast använda ultrarent avjoniserat vatten och reagenser av MS-kvalitet.
OBS: Denna buffert kan förvaras vid rumstemperatur i 2-3 veckor eller i flera månader i kylskåp. - Förbered mantelvätska: Blanda 100 ml ultrarent vatten och 100 ml isopropanol av LC-MS-kvalitet i en 250 ml flaska. Byt mantelvätskan minst en gång i veckan. Lägg till massreferens i mantelvätskan när du använder en högupplöst masspektrometer.
- Installera mantelvätska: Rensa vid 5 ml/min i 5 min och ställ in flödeshastigheten på 1 ml/min (10 μl/min i CE-MS-sprutan). Pumptrycket kommer att ligga på ca 180 bar. Se till att återvinningsslangen ansluts tillbaka till mantelvätskeflaskan för att återanvända lösningsmedlet.
- Förbered kapillär: Köp en CE-MS-kapillär (50 μm i.d. och 365 μM o.d. med en längd av 125 cm) med ett UV-detekteringsfönster. Användaren kan också få mycket billigare bar-smälta kiseldioxidkapillärer från specialiserade distributörer. Skär en kapillär med en längd av 100 cm. Skär båda kapillärändarna ordentligt med en kapillärkolonnskärare med ett roterande diamantblad och ta bort 2-3 cm polyimidbeläggning i båda ändarna med en tändare. Rengör kapillärytan med isopropanol.
- Installera kapillär: Matcha kapillären i CE-MS-kassetten. Klicka på knappen Ändra kassett och installera kassetten i CE-enheten. Kapillärens inloppsände är cirka 2 mm lägre än elektroden. Se till att inloppsänden är lägre än provets yta under injektionsprocessen.
- Aktivera kapillär: Spola kapillären före första användningen med 1 M NaOH, följt av vatten i 10 minuter och CE-körbuffert i 15 min.
- Sätt in kapilläränden i CE-MS-sprutan: Sätt försiktigt kapillären i CE-MS-sprutan och se till att kapilläränden sticker ut cirka 0,1 mm ur sprutspetsen. Se till att göra exakt justering av kapillärutloppsänden med ett förstoringsglas och justeringsskruven i sprutan. Sätt tillbaka sprutan i jonkällan och undvik att vidröra justeringsskruven. MS är i vänteläge när du utför den här åtgärden.
- Kontrollera ESI-spray: Kontrollera ESI-sprutans stabilitet i fullt skanningsläge. Fluktuationen av totala jonelektroferogram måste ligga inom 5%.
- Utför en testkörning med InsP-standarder: Använd en blandning av 2 μM InsP 3-InsP8-standarder (justerad med kvantitativ 31P NMR 15,27) för testkörningar med en injektion vid 50 mbar i 10 s (10 nL). Ange de detaljerade ESI- och MS-parametrarna enligt tabell 1. CE-strömmen är ca 26 μA. Toppbredden är cirka 0,4-0,5 min. Se till att signal-brusförhållandet når minst 400.
3. Extraktion av lösliga inositolfosfater från däggdjursceller
OBS: HCT116NIH-celler var en vänlig gåva från Stephen Shears28. HCT116UCL-celler var från Saiardis Lab26.
- Såning av celler
- Odla HCT116NIH - eller HCT116UCL-celler i T75-kolvar vid 37 °C i en 5% hög luftfuktighet CO2-atmosfär (vidare kallad standardförhållanden) i Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS).
- Tvätta stamkulturerna HCT116NIH och HCT116UCL med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (5 ml) och inkubera cellerna med trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) (3 ml, 0,25 %) under standardförhållanden tills de är helt fristående. Släck trypsinaktiviteten genom att tillsätta medium (7 ml), samla cellerna i ett centrifugrör och centrifugera (200 x g, 3 min).
- Ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i medium (10 ml). Räkna cellerna och bestäm livskraften via trypanblå uteslutning.
- Frö cellerna (6 miljoner HCT116-celler per analys) i en 150 mm skål och justera totalt 20 ml cellodlingsmedium. Blanda mediet och cellerna i ett centrifugrör före sådd för att uppnå en jämn fördelning av cellerna i skålen. Förbered en parallell skål när normalisering med cellnummer krävs.
- Odla cellerna under standardförhållanden i 72 timmar. Cellerna kommer att nå cirka 80% -90% sammanflöde.
- Modulering av inositolfosfatnivåer med NaF och cellskörd
- NaF-behandling: Tillsätt NaF (10 mM) 1 h innan du skördar i mediet. Blanda mediet genom att virvla plattan/pipettera och inkubera cellerna i 60 minuter under standardförhållanden.
- Efter NaF-behandlingen, ta bort mediet från cellerna och placera cellerna på is.
- Tvätta cellerna två gånger med PBS (5 ml, 4 °C) och ta bort PBS helt från skålen.
- Tillsätt perklorsyra (PA) (1 ml, 1 m, 4 °C). Se till att täcka hela ytan med PA (cellerna blir vita när proteiner fälls ut). Inkubera cellerna i 10 minuter på ett tiltbord vid 4 °C.
- Samla PA i ett centrifugrör och avlägsna det förorenande skräpet genom centrifugering (17 000 x g, 5 min, 4 °C). Lägg till supernatanten i de förberedda TiO2-pärlorna för neddragning av InsP.
- Tvätta skålen efter extraktion två gånger med PBS (5 ml, r.t.) för avsyrning; ta bort PBS helt från skålen.
- Lösgör proteinerna på plattan via tillsats av celllysbuffert (1,5 ml, r.t.; 0,1% natriumdodecylsulfat [SDS] i 0,1 M NaOH). Inkubera skålen i 15 min på ett tiltbord vid r.t. Överför celllysatet till ett centrifugrör och centrifug (17 000 x g, 5 min, 4 °C). Förvara supernatanten vid -80 °C tills proteinkoncentrationen bestäms via DC-proteinanalysen med bovint serumalbumin som kalibreringsstandard (vanligtvis innehåller en 150 mm skål cirka 10 mg proteiner).
- Bestämning av cellnummer från parallella rätter: Skörda cellerna i den parallella skålen via trypsin enligt beskrivningen i steg 3.1.2 (använd 5 ml trypsin-EDTA för 150 mm-skålen) och ta bort mediet. Återsuspendera cellpelleten i PBS (5 ml), blanda ordentligt och räkna cellerna. Utför detta steg precis före skörd via direkt släckning för att få representativa cellantal. Mät dessutom cellernas volym med en lämplig metod (t.ex. med en multisizermaskin).
- TiO2 anrikning av inositolfosfater
OBS: För att undvika sur nedbrytning av fosforylerade föreningar, utför alla anrikningssteg tills eluering på is och kyla alla reagenser till 4 °C. Håll tiden för extraktionen till ett minimum (1,5-2 h). Utför alla extraktionssteg med 1 M PA.- Beredning av pärlor: Tvätta TiO2-pärlor (5 mg per prov) med ddH2O(1 ml) och centrifugera (3 500 x g, 1 min, 4 °C). Ta bort ddH2O och tvätta pärlorna med PA (1 ml). Ta bort PA genom centrifugering (3 500 x g, 1 min, 4 °C). Återsuspendera pärlorna i PA (50 μl per prov).
- Tillsätt supernatanten som innehåller fosforylerade föreningar (jämför avsnitt 3.2, steg 3.2.5) till pärlsuspensionen, virveln, och rotera sedan provet i 20 minuter vid 4 °C.
- Centrifugera provet (3 500 x g, 1 min, 4 °C) och kassera supernatanten. Tvätta pärlorna med PA (500 μl) och centrifugera (3 500 x g, 1 min, 4 °C). Kassera supernatanten och upprepa tvättsteget.
- TillsättNH4OH (200 μL, 3%) till pärlorna och återupplivningen. Rotera provet i 5 minuter vid r.t.
- Centrifugera provet (3 500 x g, 1 min) och överför supernatanten till ett nytt centrifugrör.
- Upprepa elueringsstegen 3.3.4 och 3.3.5 och kombinera elueringsmedlen. Kasta pärlorna.
- Centrifugera de kombinerade elueringsmedlen (17 000 x g, 1 min, 4 °C) för att avlägsna eventuella olösliga rester.
- Torka supernatanten helt under vakuumindunstning (70 min, 60 °C, V-AQ). TillsättddH2O(50 μl) till de torkade extrakt som innehåller InsP. Vortex för att blanda provet tills det är helt upplöst. Förvara provet vid -20 °C tills CE-ESI-MS-analys.
4. Utföra CE-ESI-MS-körningar
- Bered en blandning av interna standarder som innehåller 40 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4, 80 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5, 80 μM [13 C 6]1-PP-InsP 5, 400 μM [13 C 6]InsP 6 och 400 μM [13C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5. Bestäm koncentrationerna av SIL IS-lösningar med kvantitativ 31P och 1H NMR, med hjälp av en certifierad referensstandard, dvs fosfoättiksyra.
OBS: Alla ovanstående SIL interna standarder (IS) med renheter högre än 96% syntetiserades och tillhandahölls av Fiedler-gruppen15,27. Samma som med nukleotider kan dessa IS bära många kristallvattenmolekyler och olika motjoner. I stället för att väga ämnet och beräkna koncentrationen rekommenderas koncentrationsbestämning av 13C6 standardlösningar med kvantitativ 31P NMR. - Blanda 10 μl av provet med 0,5 μl blandning av interna standarder i en injektionsflaska med CE-prov. 2 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4, 4 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5, 4 μM [13 C 6]1-PP-InsP 5, 20 μM [13 C 6]InsP 6 och 20 μM [13C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5 är de slutliga koncentrationerna inuti proverna.
- När du använder påfyllningssystemet klickar du på knappen Byt flaska, lägger den förberedda 250 ml CE-löpande bufferten i elektrolytflaskan och klickar på Rengör rör. Förvara påfyllningsnålen i en vattenflaska.
- Ange ESI- och MS-parametrar enligt tabell 1. Optimera källparametrarna med hjälp av en Source Optimizer med en blandning av inositol polyfosfat standarder. Få inställningarna för multipel reaktionsövervakning (MRM) med Masshunter Optimizer med alla standarder. Justera ESI- och MS/MS-inställningarna för olika instrumenteringar.
- Utför en körning för InsP-extrakten och kontrollera resultatet (bild 2). Ställ in en sekvens när det finns fler prover.
- Låt MS vara i vänteläge efter mätningar. Stäng inte av LC-pumpen. Flödet av mantelvätska skyddar sprutnålen. Byt ut CE-ESI-MS-sprutan mot en LC-ESI-MS-spruta när det inte finns någon vätsketillförsel i manteln.
5. Analys av data
- Öppna kvantitativ analys (för QQQ) programvara, skapa en batch för alla prover.
- Skapa en ny metod från inhämtade MRM-data. Ställ in [13C6] InsP: er som interna standarder - (ISTD). Kontrollera MRM-sammansatt inställning, inställning av kvarhållningstid, ISTD-inställning, koncentrationsinställning och kvalificeringsinställning. Skicka valideringen och avsluta för att tillämpa metoden på den aktuella batchen. Spara metoden.
- Kontrollera om varje topp i satsen är korrekt integrerad; Annars integrerar du toppen manuellt.
- Exportera resultaten till ett kalkylblad. Utför kvantifieringen av inositol (pyro)fosfater genom att jämföra analytens topprespons med respektive topprespons av SIL IS med kända koncentrationer. Teoretiska och experimentella kalibreringskurvor visas i tabell 2 för 5-PP-InsP 5, InsP 6 och Ins(1,3,4,5,6)P 5 med det linjära intervallet.
OBS: Förutsättningen för tillämpning av teoretisk kalibreringskurva är användningen av ett högkvalitativt isotopmönster av riktade analyter och med trovärdig koncentration. Utvärdera det linjära intervallet. En kalibreringskurva är nödvändig för absolut kvantifiering när det är opraktiskt att fullt ut förvärva ovannämnda isotopstandarder. - Med den uppmätta koncentrationen i InsP-extraktlösningen och dess volym beräknar du de absoluta mängderna. Vidare normalisera mängden efter cellantal eller proteininnehåll. Beräkna cellkoncentrationen baserat på cellantal och genomsnittlig cellvolym av HCT116 (1,68 fL).
Representative Results
Resultaten som visas här syftar till att illustrera potentialen i CE-ESI-MS-analys. De rapporterade siffrorna är beskrivande för en tekniskt felfri CE-ESI-MS-körning. För det första presenteras en blandning av inositolpyrofosfatstandarder (figur 1) och ett däggdjurscellsextrakt (figur 2). För det andra tillhandahålls en jämförelse av två HCT116-cellinjer (figur 3) och NaF-behandlade HCT116 (figur 4) celler.
Extraherade jonelektroferogram (EIE) av inositol (pyro)fosfatstandarder i en koncentration av 2 μM visas i figur 1. Metabolism av inositolpyrofosfater hos däggdjur med sina förenklade strukturer införs. De fyra inositolpyrofosfaterna hos däggdjur, 1,5-(PP)2-InsP 4, 5-PP-InsP 5, 1-PP-InsP 5, och5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 är väl utmärkta med hjälp av den beskrivna metoden. En CE-ESI-MS-körning av HCT116UCL visas i figur 2. Med hjälp av stabila isotopmärkta (SIL) interna standarder kan en absolut kvantifiering lätt uppnås genom att jämföra signalresponsen med den spikade SIL med känd koncentration. De integrerade EIEs av inositolfosfat från InsP5 till (PP)2-InsP 4 och icke-integrerade EIE av deras isotopmönster visas. RSD för alla analyter från sex tekniska repetitioner ligger inom 4%. Med den uppmätta koncentrationen och volymen extrakt kan mängden analyter beräknas. Med cellantal och cellvolym eller proteininnehåll är absolut cellulär koncentration (μM) eller mängd normaliserad av proteininnehåll (pmol / mg-protein) vanligtvis de slutliga resultaten av en sådan analys.
Enligt en tidigare studie har två satser divergerade HCT116-celler en variation av InsP 8-nivåer, HCT116UCL-celler innehåller 6-faldigt högre nivåer av InsP8 än HCT116 NIH-celler 29. Med CE-MS-metoden kunde 1,5-(PP)2-InsP 4 i HCT116 NIH enkelt kvantifieras (figur 3), och HCT116UCL-celler innehåller 7 gånger högre nivåer av InsP8 än i HCT116NIH. Dessutom parallelliseras signifikant ackumulering av 1,5-(PP)2-InsP 4 i HCT116UCL-celler med en signifikant ökad 1-PP-InsP5, som nu visas kvantitativt i figur 3.
PP-InsPs-nivåerna ökar genom att hämma deras defosforylering med natriumfluorid. CE-ESI-MS-analys av NaF-behandlade HCT116NIH-celler visade -5-PP-InsP 5-höjden tillsammans med en minskning av InsP6 och ett utseende av 5-PP-Ins (1,3,4,6) P 4 (Figur 4). Dessutom är höjningen av InsP8-nivåer märkbar, medan 1-PP-InsP5 minskar till viss del. 1-PP-InsP5 saknas inte helt i NaF-behandlad HCT116NIH, men oftast antingen under detektionsgränsen eller kvantifieringsgränsen.
Figur 1: Typiska extraherade jonelektroferogram (EIE) av inositol (pyro)fosfatstandarder i CE-ESI-MS-analys med hjälp av det beskrivna protokollet. Koncentrationen av varje analyt är 2 μM. Injicerad provvolym är ca 10 nL med en injektion vid 50 mbar i 10 s. Inlägg visar metabolismen av inositolpyrofosfater hos däggdjur. IPPK: inositol pentakisfosfat 2-kinas, IP6K: inositol hexakisfosfat kinas, PPIP5K: difosfoinositol pentakisfosfat kinas, DIPP1: difosfoinositolpolyfosfat fosfohydrolas 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativ InsP-profil för HCT116 UCL-celler. (A) EIE av de viktigaste inositolfosfaterna (pyro)fosfater i HCT116NIH och spetsade SIL ISs 2 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4 (1), 4 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5 (2), 4 μM [13 C 6]1-PP-InsP5 (3), 20 μM [13C 6]InsP 6 (4), och 20 μM [13C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5 (5). Inlägg visar sex tekniska upprepningar av InsP-analys av CE-ESI-MS, data presenteras som medel ± SD. (B) Cellulär koncentration av PP-InsPs och InsPs i humana cellinjer HCT116UCL och (C) PP-InsPs och InsPs mängd normaliserad av proteininnehåll. Data är medel ± SEM från tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Variation i InsP8-nivåer mellan två divergerade HCT116-celler. a) EIE av inositolpyrofosfat i HCT116 UCL och HCT116NIH. InsP8 i HCT116UCL är markant rikligare än i HCT116NIH. (B) Förhållandet mellan inositolpyrofosfat och InsP6 (%) i båda HCT116-cellerna. HCT116UCL-celler innehåller 7 gånger högre nivåer av InsP8 jämfört med i HCT116NIH, medan 5-PP-InsP5-nivåerna är lika. Data är medel ± SEM från tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Inositol (pyro)fosfatnivåer i HCT116NIH-celler, med NaF-behandling. (A) EIE av inositol (pyro)fosfat i HCT116NIH med natriumfluoridbehandling (NaF, 10 mM). Nivåer av inositolpyrofosfat inklusive 1,5-(PP)2-InsP 4, 5-PP-InsP 5, och5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 öka genom att blockera deras defosforylering med hjälp av NaF. (B) Inositol (pyro)fosfatnivåer (mängder normaliseras av proteininnehåll) i obehandlade och NaF-behandlade HCT116NIH-celler. Data är medel ± SEM från tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: CE-ESI-MS-parameterinställningar. Parametrarna Source och iFunnel optimeras av Source och iFunnel Optimizer. MSM parameterinställningar för inositol (pyro)fosfater optimeras av MassHunter Optimizer. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 2: Teoretisk och experimentell regressionsekvation. Koncentrationen av [13 C 6]5-PP-InsP 5 [13 C 6]InsP 6 och [13C 6]Ins (1, 3, 4, 5, 6)P5 är 4 μM, 20 μM respektive 20 μM. För regressionsekvation är 5-PP-InsP 5-koncentrationen vid 0,04 μM, 0,1 μM, 0,2 μM, 0,4 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 24 μM. InsP6 och Ins (1, 3, 4, 5, 6) P 5 koncentration är vid 0,2 μM,0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 120 μM. x är koncentration, y är (Area InsP)12C/(Area InsP)13C. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Discussion
Här presenteras en praktisk och känslig metod för kvantifiering av högladdade inositolpyrofosfater i däggdjursceller. Genom att kombinera denna analysmetod med nuvarande toppmodern InsP-extraktion med perklorsyra följt av anrikning med TiO2, har CE-ESI-MS-analys oöverträffade fördelar. När det gäller dess genomströmning, känslighet, stabilitet, absolut kvantifiering, isomeridentifiering och matrisberoende sticker denna metod ut jämfört med andra tillvägagångssätt. Detta protokoll är tillämpligt på däggdjursceller, men denna strategi lyckas faktiskt i många olika prover (t.ex. jäst, växter, parasiter, musvävnader etc.).
Det tillämpade extraktionsprotokollet återvinner PP-InsPs och InsP6 helt från däggdjurscellsextrakt16,19. Det kommer också att extrahera många andra anjoniska metaboliter, särskilt fosfatinnehållande arter, t.ex. sockerfosfater och nukleotider. Utvärdering av återhämtning och sönderdelning för användarens analyter med detta protokoll skulle vara nödvändigt.
I allmänhet fungerar CE-ESI-MS-systemet smidigt och kan rymma cirka 200 prover varje vecka med detta protokoll. Till skillnad från HPLC har CE dock länge betraktats som en metod för experter och specialiserade personer, vilket begränsade dess marknad och begränsade dess tillämpning. Således är en CE-ESI-MS-enhet vanligtvis frånvarande i analytiska fakulteter. Människor som vill utföra CE-ESI-MS-analys saknar förmodligen CE-erfarenhet och kommer att spendera mer tid på felsökning. Här markeras de kritiska stegen. Först och främst är kvaliteten på kapillärskärningen. Känsligheten och stabiliteten hos ESI-spray är mestadels beroende av ett förstklassigt kapillärsnitt. För det andra bör kapillärutloppsänden vara exakt 0,1 mm ut ur sprutspetsen. Sprutnålen och CE-kapillären ska vara i axiell riktning. Kvaliteten på ESI-sprayen är avgörande för kvantifiering; Tekniska körningar bör utföras för att utvärdera repeterbarheten.
Med det beskrivna protokollet är kvantifieringsgränsen (LOQ) för PP-InsPs 40 nM med en injektion vid 50 mbar i 10 s (10 nL). Det finns flera tillvägagångssätt för att ytterligare öka metodens känslighet. För det första kommer en injektion vid 100 mbar i 20 s (40 nL) fortfarande att resultera i en bra toppform och tillräcklig upplösning för regioisomererna 5-PP-InsP 5 och 1-PP-InsP5. För det andra kan InsP-extrakt lösas i en mindre mängd vatten. För det tredje kan uppehållstiden ökas när man använder mindre MRM-övergångar för kvantifiering. Dessutom skulle en CE-MS-jonkälla som använder ultralågt vätskeflöde i manteln avsevärt öka känsligheten.
CE-körbufferten med pH 9 ger den bästa upplösningen mellan InsP 6-InsP 8. Vid ökning av pH till 9,7 kommer upplösningen bland InsP3-InsP 6 att förbättras avsevärt. På grund av den utmärkta upplösningen rekommenderas en kortare kapillärlängd på 72 cm för att ytterligare öka genomströmningen. Dessutom minskar en högre CE-kassetttemperatur vid 40 ° C viskositeten hos den vattenhaltiga elektroforetiska bufferten och påskyndar deras rörelse under EOF. Enligt olika forskningskrav kan modifieringar av denna metod ytterligare underlätta InsP- och PP-InsPs-analys. Därför har de beskrivna CE-ESI-MS-protokollen potential att öppna nya forskningsvägar i denna mångfacetterade familj av signalmolekyler.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta projekt har fått finansiering från Europeiska forskningsrådet (ERC) under Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 (bidragsavtal nr 864246, till HJJ). DQ erkänner det ekonomiska stödet från Brigitte-Schlieben-Lange-Programm. AS stöds av MRC-programbidraget MR/T028904/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | - |
| 15 cm tissue culture dishes | Thermo Fisher | 168381 | - |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 623201 | - |
| 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 227261 | - |
| 96-well plates | Thermo Fisher | 260836 | for the DC protein assay |
| CE fused silica capillary | CS Chromatographie | 105180 | 50 µM i.d. 360 µM o.d. |
| Pipette tips | Starlab | I1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-3700 | 10 mL, 1000 µL, 200 µL, 10 µL pipette tips |
| Serological pipets | TPP | 94550, 94525, 94010, 94005 | 50 mL, 25, mL, 10 mL, 5 mL serological pipettes |
| T75 flasks | TPP | 90076 | - |
| Chemicals and Reagents | |||
| NaOH | AppliChem | A6829,0500 | sodium hydroxide pellets for molecular biology, for preparation of cell lysis buffer |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | - |
| Ammonium acetate | Thermo Fisher | 1677373 | HPLC grade |
| BSA | Thermo Fisher | 23209 | albumin standard (2.0 mg/mL) for standard curve preparation |
| DC protein assay | Biorad | 5000116 | DC protein assay reagents package |
| DMEM | Gibco | 41966029 | high glucose, pyruvate |
| FBS | Gibco | 10270106, 10500064 (heat inactivated) | 10270106 for HCT116UCL, 10500064 for HCT116NIH |
| Isopropanol | Carl Roth | AE73.2 | 99.95% LC-MS grade |
| NH4OH, 10% | Carl Roth | 6756.1 | for preparation of 3% NH4OH |
| PBS | Gibco | 10010015 | - |
| Perchloric acid, 70% | Carl Roth | 9216.1 | for preparation of 1 M perchloric acid |
| SDS | SERVA | 20760.02 | for preparation of cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | - |
| TiO2 beads | GL Sciences | 5020-75000 | 5 µm particle size |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | trypan blue stain (0.4%) |
| Ultrapure (Type 1) water | Milli-Q | ZRQSVP3WW | model: Direct-Q 3 UV Water Purification System |
| Equipment | |||
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30105893 | model: XPE26; for weighing of beads (5-6 mg per sample) |
| Automated cell counter | Logos Biosystems | L40002 | model: LUNA-II Automated Cell Counter |
| Benchtop centrifuge | Hettich | 1401 | model: UNIVERSAL 320 |
| Benchtop centrifuge with cooling | VWR | 521-1647P | model: Microstar 17R |
| CE system | Agilent | G7100A | - |
| CE/MS Adapter Kit | Agilent | G1603A | - |
| CE/MS Sprayer Kit | Agilent | G1607A | - |
| Cell counting slides | Logos Biosystems | L12001 | LUNA Cell Counting Slides |
| Centrifugal evaporator | Eppendorf | 5305000304 | model: Concentrator plus complete system |
| ESI source | Agilent | AJS ESI | - |
| Super Support Film | Nisshin EM Co. Ltd, Tokyo | 647 | |
| Humidified incubator | Binder | 9040-0088 | model: CB E6.1, for cultivation of mammalian cells |
| Ice box | - | - | should provide enough space for samples, dishes, etc. |
| Isocratic LC system | Agilent | G7110B 1260 Iso Pump | model: Infinity II Quaternary system |
| MSD | Agilent | G6495C | triple quadrupole |
| Multiplate reader | Tecan | 30086375 | model: SPARK 10 M |
| Pipette filler | Thermo Fisher | 10072332 | for serological pipettes |
| Pipettes | Brand | 705884, 705880, 705878, 705872, 705870 | various pipettes |
| Rotator | Labnet | H5500 | model: Mini LabRoller Rotator |
| Shortix capillary column cutter | SGT | S0020 | - |
| Test tube shaker (vortex mixer) | Carl Roth | HXH6.1 | model: Rotilabo-Mini Vortex |
| Tilt table | Labnet | S0600 | model: EDURO MiniMix Nutating Mixer |
| Water bath | Thermo Fisher | FSGPD05 | model: Isotemp GPD 05 |
| Software | |||
| MassHunter Workstation | Agilent | Version 10.1 | - |
| MassHunter Workstation LC/MS Data Acquisition | Agilent | Version 10.1 | - |
| MassHunter Workstation Optimizer | Agilent | Version 10.1 | - |
| MassHunter Workstation Qualitative Analysis | Agilent | Version 10.0 | - |
| QQQ Quantitaion Analysis | Agilent | Version 10.1 | - |
References
- Stephens, L., et al. The detection, purification, structural characterization, and metabolism of diphosphoinositol pentakisphosphate(s) and bisdiphosphoinositol tetrakisphosphate(s). The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 4009-4015 (1993).
- Menniti, F. S., Miller, R. N., Putney, J. W. Jr, Shears, S. B. Turnover of inositol polyphosphate pyrophosphates in pancreatoma cells. The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 3850-3856 (1993).
- Shears, S. B. Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates. Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).
- Irvine, R. F., Schell, M. J. Back in the water: the return of the inositol phosphates. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (5), 327-338 (2001).
- Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
- Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
- Chakraborty, A., et al. Inositol pyrophosphates inhibit Akt signaling, thereby regulating insulin sensitivity and weight gain. Cell. 143 (6), 897-910 (2010).
- Bittner, T., et al. Photolysis of caged inositol pyrophosphate InsP8 directly modulates intracellular Ca2+ oscillations and controls C2AB domain localization. Journal of the American Chemical Society. 142 (24), (2020).
- Hauke, S., et al. Photolysis of cell-permeant caged inositol pyrophosphates controls oscillations of cytosolic calcium in a β-cell line. Chemical Science. 10 (9), 2687-2692 (2019).
- Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14206-14211 (2002).
- Koldobskiy, M. A., et al. p53-mediated apoptosis requires inositol hexakisphosphate kinase-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (49), 20947 (2010).
- Rao, F., et al. Inositol hexakisphosphate kinase-1 mediates assembly/disassembly of the CRL4-signalosome complex to regulate DNA repair and cell death. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16005 (2014).
- Williams, S. P., Gillaspy, G. E., Perera, I. Y. Biosynthesis and possible functions of inositol pyrophosphates in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 67 (2015).
- Wilson, M. S. C., Livermore, T. M., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates: between signalling and metabolism. The Biochemical Journal. 452 (3), 369-379 (2013).
- Harmel, R. K., et al. Harnessing 13C-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR. Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).
- Qiu, D., et al. Analysis of inositol phosphate metabolism by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nature Communications. 11 (1), 6035 (2020).
- Azevedo, C., Saiardi, A. Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast. Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of radioactive labelling to elucidate inositol polyphosphate signalling. Phosphate Labeling and Sensing in Chemical Biology. , 67-87 (2017).
- Wilson, M. S. C., Bulley, S. J., Pisani, F., Irvine, R. F., Saiardi, A. A novel method for the purification of inositol phosphates from biological samples reveals that no phytate is present in human plasma or urine. Open Biology. 5 (3), 150014 (2015).
- Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis. PloS One. 4 (5), 5580 (2009).
- Dong, J., et al. Inositol pyrophosphate InsP8 acts as an intracellular phosphate signal in arabidopsis. Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).
- Riemer, E., et al. ITPK1 is an InsP6/ADP phosphotransferase that controls systemic phosphate homeostasis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2020).
- Whitfield, H., et al. An ATP-responsive metabolic cassette comprised of inositol tris/tetrakisphosphate kinase 1 (ITPK1) and inositol pentakisphosphate 2-kinase (IPK1) buffers diphosphosphoinositol phosphate levels. The Biochemical Journal. 477 (14), 2621-2638 (2020).
- Ito, M., et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates. Journal of chromatography. A. 1573, 87-97 (2018).
- Mantilla, B. S., Amaral, L. D. D., Jessen, H. J., Docampo, R. the inositol pyrophosphate biosynthetic pathway of Trypanosoma cruzi. ACS Chemical Biology. 16 (2), 283-292 (2021).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Inositol phosphates purification using titanium dioxide beads. Bio-Protocol. 8 (15), 2959 (2018).
- Puschmann, R., Harmel, R. K., Fiedler, D. Scalable chemoenzymatic synthesis of inositol pyrophosphates. Biochemistry. 58 (38), 3927-3932 (2019).
- Gu, C., et al. KO of 5-InsP7 kinase activity transforms the HCT116 colon cancer cell line into a hypermetabolic, growth-inhibited phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 11968-11973 (2017).
- Gu, C., Wilson, M. S. C., Jessen, H. J., Saiardi, A., Shears, S. B. Inositol Pyrophosphate Profiling of Two HCT116 Cell Lines Uncovers Variation in InsP8 Levels. PloS One. 11 (10), 0165286 (2016).
