Summary
생체발광-루시퍼라제 효소에 의해 방출되는 광은 소분자 기질인 루시페린-광감각 단백질을 활성화시키기 위해 이용될 수 있고, 이로써 광 자극에 또 다른 차원을 추가하고 시간적 및 공간적 스케일에 걸쳐 세포에서 다수의 광-매개 기능의 조작을 가능하게 한다.
Abstract
생체 발광 - 소분자 기질 인 루시페린을 산화시키는 루시퍼라제 효소에 의해 방출되는 빛은 뉴런에서 광 게이트 이온 채널 및 펌프를 활성화시키기 위해 시험관내 및 생체 내에서 사용되어 왔습니다. 이 생체 발광 광유전학 (BL-OG) 접근법은 광유전학 도구에 화학 유전 적 구성 요소를 부여하지만, 신경 과학에서 사용하는 것으로 제한되지는 않습니다. 오히려, 생체 발광은 임의의 광감각 단백질을 활성화시키기 위해 이용될 수 있고, 따라서 세포에서 다수의 광-매개 기능의 조작을 가능하게 한다. 다양한 루시페라아제-루시페린 쌍은 서로 다른 파장의 빛과 빛의 세기를 필요로 하는 광감각 단백질과 일치할 수 있다.
특정 용도에 따라, 효율적인 광 전달은 루시페라제-광수용체 융합 단백질을 사용하거나 간단한 공동-형질감염에 의해 달성될 수 있다. 광-의존성 이량체화 또는 형태적 변화에 기초한 광감각 단백질은 단백질 국소화, 전사에 이르는 세포내 신호전달 경로의 조절로부터 세포 과정에 영향을 미치기 위해 생체발광에 의해 구동될 수 있다. 아래의 프로토콜은 세포 및 유기체에서 생체 발광 활성화의 실험 실행을 자세히 설명하고 생체 발광 구동 재조합효소 및 전사 인자를 사용한 결과를 설명합니다. 이 프로토콜은 시험 관 내 및 생체 내에서 생체 발광 광유전학을 수행하기위한 기본 절차를 조사관 에게 제공합니다. 설명된 접근법들은 다수의 상이한 실험적 패러다임들로 더욱 확장되고 개별화될 수 있다.
Introduction
광감각 단백질은 물리적 광원 또는 그의 기질인 루시페린의 존재하에 루시퍼라제 효소로부터의 빛에 의해 활성화되어 생체발광을 생성할 수 있다. 밀리 또는 펨토초 시간 척도 및/또는 단일 셀 공간 분해능이 필요한 응용 제품의 경우 물리적 광원(레이저 및 발광 다이오드(LED))만이 이러한 스케일에 맞게 조정할 수 있는 유일한 광원입니다. 예를 들어 밀리 초 시간적 조절1을 가진 초파리 유충을 개발할 때 반대 극을 자극하는 데 사용되는 빛의 공간적 제한1 또는 미토콘드리아 세뇨관과 같은 단일 세포 구조의 정확한 자극2. 그러나 광 스위치에 대한 다른 많은 응용 분야는 확장된 공간 제어와 비침습적으로 그리고 빛 손상 없이 반복되는 적용을 포함하지만 미세한 시간 척도와 조정 가능한 강도로 정의된 시간 제어를 포함하여 우선 순위가 다릅니다. 여기서, 광감지 도메인을 활성화시키기 위해 대체 광원으로서 루시페라아제를 사용하는 것은 몇 가지 장점이 있다. 광섬유 광 활성화와는 달리, 생체 발광은 광원이 유전적으로 인코딩됨에 따라 표적 세포 집단에서 발현되는 모든 광 감지 도메인에 도달한다. 생체 발광을 사용하면 광섬유에 의한 조직 및 세포 손상에 대한 우려를 완화하고 물리적 광 노출을 확대합니다. 빛은 루시퍼라제 기질의 적용으로 켜집니다. 발병은 투여 경로에 따라 즉시 시험관내 및 생체내에서 지속되며 ∼15-30분 동안 지속된다; 빛의 연장된 존재 또는 phasic 자극은 상이한 루시페린과 기질의 추가적인 또는 반복적인 적용으로 달성될 수 있다3. 마지막으로, 생체 발광은 루시페린의 농도를 변화시킴으로써 조정될 수 있다.
이온-이동 광수용체, 즉 채널로돕신 또는 펌프와 같은 광유전학적 요소를 활성화시키기 위한 생체발광의 사용은 광범위하게 입증되었다4,5,6,7,8. 이러한 BioLuminescent OptoGenetics (BL-OG) 접근법은 마우스 및 래트5,6,7,9,10,11,12 에서 생체내 실험에 이용되었다. 옵신의 BL-OG 활성화는 적어도 ~33 μW/mm2의 생체 발광의 양을 필요로 하는 것으로 밝혀졌으며, 더 높은 발광으로 활성화 효율이 증가[6,9]. 이온-이동 감각 광수용체는 이온이 움직이지 않는 자연에서 발견되는 감각 광수용체의 큰 우발적 인 하위군이다13,14. 식물이나 박테리아의 광감지 도메인과 같은 비 이온 이동 광수용체를 활성화하는 생체 발광의 확장은 비 이온 이동 광 센서가 채널로돕신보다 훨씬 더 빛에 민감하여 이온 이동 광유전학 요소로 이미 얻은 것보다 생체 발광을 가진 광 센서의 더 나은 구동을 보장한다는 보고서15,16에 의해 권장됩니다. 최근에, 몇몇 간행물은 광-산소-전압-감지 (LOV) 도메인, 청색-광-플라빈 (BLUF) 도메인, 및 크립토크롬 (CRYs)3,17,18,19,20,21,22를 포함하는 다양한 광수용체의 활성화를 위한 광원으로서 생체발광의 사용을 보고하였다 (표 1 ). 반응성 산소 종-유도 세포 사멸, cAMP 합성, 단백질 모집 및 해리에서 게놈 재조합 및 전사 유도에 이르기까지 세포 내 과정을 표적으로 하는 광 스위치의 생체발광 구동 활성화를 위한 응용 분야.
이 프로토콜은 생체 발광 기반 광유전학 도구의 일반적인 설계를 간략하게 설명하고 세포 및 유기체에서 생체 발광 활성화의 실험 실행을위한 절차를 자세히 설명합니다. 여기에는 방, 조직 배양 후드 및 인큐베이터를 설치하는 방법에 대한 설명과 생체 발광 작업을위한 현미경뿐만 아니라 루시페린을 준비하는 단계부터 적용까지의 단계가 포함됩니다. 이 프로토콜은 시험 관내 및 생체내에서 BioLuminescent OptoGenetics (BL-OG)를 수행하기 위한 기본 절차를 조사관에게 제공합니다. 기술된 접근법들은 상이한 실험 패러다임들로 더욱 확장되고 개별화될 수 있다. 우리는이 프로토콜이 광유전학 생물학적 연구에서 생체 발광의 사용을 채택하는 것을 촉진 할 것으로 기대합니다.
Protocol
현재 연구의 모든 절차는 미주리주 센트럴 미시간 대학교에서 동물 취급을 위한 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 승인 프로토콜을 사용하여 수행되었습니다.
1. 체외에서 광감각 단백질의 생체발광 활성화
- 구문을
- 루시퍼라아제 서열 또는 루시페라아제-형광 단백질 융합 서열을 선택하면 광수용체와 일치하는 파장의 광을 생산하는 발광체의 발현이 활성화될 것이다.
참고: 예를 들어, 가우시아 루시퍼라제 변이체 또는 NanoLuc과 같은 청색 발광 루시페라제는 CRY/Ca2+- 및 인테그린 결합 단백질(CIB), LOV 또는 Vivid(VVD)와 같은 청색 광 감지 광수용체와 쌍을 이룰 수 있습니다. - 다른 연구자 또는 플라스미드 침착물로부터 아직 입수할 수 없는 경우, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 DNA를 포유동물 발현 플라스미드로 클로닝한다.
참고: 프로모터의 선택은 CAG 및 CMV 프로모터에 의해 제공되는 것과 같은 발광 모듈의 강력하고 구성적인 발현을 제공할 필요성에 의해 결정된다. - 초기 연구를 위해, 광 방출기와 광 센서의 공동 트랜스펙션을 위해 별도의 플라스미드를 사용하십시오. 필요에 따라 그리고 후속 연구를 위해 두 모이어티의 융합 단백질을 생성한다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 mini-, midi- 또는 maxiprep 키트를 사용하여 고품질 플라스미드 DNA를 얻습니다.
- 루시퍼라아제 서열 또는 루시페라아제-형광 단백질 융합 서열을 선택하면 광수용체와 일치하는 파장의 광을 생산하는 발광체의 발현이 활성화될 것이다.
- 세포 배양 및 형질감염
참고: HeLa 세포 및 HEK293 세포는 이 프로토콜의 예로서 사용된다.- 원하는 최종 용도에 따라 형식과 숫자로 세포를 플레이트합니다.
참고: 구체적인 예는 표 2에 나와 있습니다. 도금시의 세포 밀도는 세포가 얼마나 빨리 형질감염될 수 있는지를 결정할 것이다.- 형광 현미경에 의한 생체발광 활성화 전사를 평가하기 위해, HEK293 세포를 폴리-D-라이신(PDL)이 코팅된 12mm 커버슬립 상에 플레이트를 24웰 접시에 넣었다.
- 발광계에서 직교 리포터 루시퍼라아제로부터의 발광을 측정함으로써 생체발광 활성화 전사를 평가하기 위해, HeLa 세포를 형질감염을 위해 초기에 6- 또는 12-웰 디쉬에 플레이트하지만 트랜스펙션 후에 이를 재플레이트한다(단계 4 참조).
- 생체 발광 자극이 라이브 셀 이미징 챔버에서 수행되는 경우 적절한 크기의 커버슬립을 선택하고 적절한 크기의 멀티 웰 플레이트에 배치합니다 (12mm 커버슬립의 경우 24-웰 플레이트, 15mm 및 18mm 커버슬립의 경우 12-웰 플레이트). 표 2에 명시된 세포 번호를 사용하여 커버슬립 위에 세포를 시드한다. 선택된 세포 유형이 배양 표면에 잘 부착되지 않으면, 세포를 PDL 코팅된 접시 상에 플레이트한다.
- 제조자의 권고에 따라 리포펙션에 의한 형질감염을 수행하거나 선택된 세포 유형에 적합한 형질감염 방법을 사용한다.
참고: 표 3 은 서로 다른 발광 단백질 이외에 두 개의 상이한 광수용체, EL222 및 CRY2/CIB 및 이들의 각각의 리포터 플라스미드에 대한 형질감염 실험을 상세히 설명한다. 다양한 플라스미드의 비율은 선택한 예에서 잘 작동하지만 각 광 방출기 / 광 센서 쌍에 맞게 최적화되어야합니다. - 형질감염 후, 세포를 완전히 광밀폐된 인큐베이터에 놓는다(그림 1).
- 원하는 최종 용도에 따라 다음날 원래의 웰 / 접시에서 생체 발광 자극을 위해 세포를 사용하거나 lipofection 후 3-4 시간 후에 다시 플레이트하십시오. 반딧불이 루시퍼라아제 리포터 유전자의 전사를 발광계에서 판독하기 위해, 세포를 백색 96-웰 플레이트에 다시 플레이트한다.
참고: 적색광으로 비추는 층류 후드의 밀폐된 방에서 모든 조작을 수행하십시오(그림 2).- 형질감염된 세포를 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 또는 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 한 번 세척한다.
- 트립신화 시약의 최소 부피를 웰에 첨가하고(24-웰: 100 μL; 12-웰: 150 μL; 6-웰: 300 μL) 세포를 37°C에서 3분 동안 인큐베이션한다.
- 다음 도금 단계를 위한 적절한 세포 밀도를 산출할 세포 농도를 달성하기 위해 배지를 첨가한다(예를 들어, 96-웰 플레이트의 10웰에 플레이팅을 위해 최종 부피 1.2 mL의 24-웰에서 세포를 재현탁시키고; 96-웰 플레이트의 20 웰에서 플레이팅을 위해 2.4 mL의 최종 부피로 12-웰에서 세포를 재현탁시킨다). 형질감염된 세포를 결국 필요한 웰의 수에 따라 여러 웰에서 풀링한다.
- 형질감염된 세포를 그들의 최종 포맷으로 플레이트화하고, 플레이트를 광-보호 인큐베이터로 복귀시킨다.
- 원하는 최종 용도에 따라 형식과 숫자로 세포를 플레이트합니다.
- 생체 발광 활성화 in vitro
- 루시퍼라아제 기질(루시페린)을 준비한다.
- 5mg의 동결건조된 코엘렌테라진(CTZ)을 그의 특정 용매 250 μL에 용해시켜 50 mM 스톡을 제조하였다. 바이알의 벽을 따라 있는 모든 CTZ가 피펫팅 또는 볼텍싱에 의해 용해되도록 하십시오. 바이알을 직사광선으로부터 보호하십시오.
- 50 μL 분취량을 0.5 mL 검정 마이크로원심분리 튜브에 준비하고, 향후 사용을 위해 -80°C에서 보관한다.
참고: 용매에 용해된 CTZ는 -80°C에서 동결되지 않습니다. 분취량은 빛과 실온에 대한 노출이 최소한으로 유지되는 한 작업 솔루션을 만들기 위해 냉동실에서 여러 번 꺼내어 냉동실로 되돌릴 수 있습니다.
- 단일 생체 발광 광 자극
참고: 모든 조작은 적색광으로 비추는 층류 후드의 밀폐된 실내에서 수행됩니다(그림 2).- 세포 배양 배지 (DMEM 또는 NeuroBasal)에서 루시페린의 작동 용액을 준비하십시오. 루시페린의 농도를 최종 농도가 100 μM가 되도록 조정하십시오. CTZ가 시간이 지남에 따라 산화됨에 따라 세포에 첨가하기 직전에 CTZ의 모든 희석액을 배지에서 준비하십시오.
참고 : 매체의 전체 부피를 교체하면 작업 용액은 100 μM이됩니다. 루시페린 함유 배지가 세포에 첨가되는 경우, 희석 인자에 의해 농도가 더 높아질 것이다 (예를 들어, 웰 내의 배지 100 μL에 300 μM 루시페린을 함유하는 배지 50 μL를 첨가하는 것은 1:3 희석을 초래하고, 따라서 루시페린의 최종 농도에서 100 μM). - 루시페린 함유 배지를 세포에 첨가하고, 원하는 광자극 지속 기간 동안 인큐베이션한다.
참고: 이 시간은 1분 또는 15분 정도 짧을 수 있으며 더 짧거나 길어질 수 있습니다. 루시페린 함유 배지를 세포 상에 남겨두기 위한 시간의 길이는 선택된 루시페라제-루시페린 조합의 반감기 및 동역학에 의존한다. - 적색광을 끈 후 눈으로 100 μM 최종 루시페린 농도에서 발광을 모니터링하는 단계; 눈이 어둠을 완성하도록 조정될 때까지 몇 초 동안 기다리십시오. 사진을 찍어 발광을 문서화하십시오 (휴대 전화로도).
- 루시페린 함유 배지를 제거하고 이를 배양 배지로 대체하여 광 자극을 종료한다. 실험의 민감도에 따라, 루시페린 함유 배지를 제거한 후 배지로 한두 번 세포를 세척하여 모든 루시페린을 제거한다. 세포가 배양 표면에 잘 부착되지 않으면 세척 중에 세포가 손실되지 않도록 PDL 코팅 접시에 플레이트를 놓습니다.
- 세포를 16-24 h 동안 광 보호 인큐베이터로 되돌립니다.
- 세포 배양 배지 (DMEM 또는 NeuroBasal)에서 루시페린의 작동 용액을 준비하십시오. 루시페린의 농도를 최종 농도가 100 μM가 되도록 조정하십시오. CTZ가 시간이 지남에 따라 산화됨에 따라 세포에 첨가하기 직전에 CTZ의 모든 희석액을 배지에서 준비하십시오.
- 반복 생체 발광 광 자극
참고 : 모든 조작은 가볍게 만들고 붉은 빛으로 비출 수있는 방에서 수행됩니다.- 라이브 셀 이미징 챔버를 설치합니다. 상자와 검은색 플라스틱 시트 또는 검은색 커튼을 사용하여 라이브 셀 이미징 현미경 주위에 가벼운 구획을 만듭니다(그림 3). 가벼운 구획과 방 안에있는 모든 광원 (예 : 현미경 또는 기기의 LED 표시기)을 덮으십시오.
- 흡입구를 위해 원하는 용액과 폐기물 용기로 이어지는 챔버 아웃포트로 관류 시스템을 설정하십시오.
참고: 예를 들어, 이미징 용액은 티로이드 용액 (염화나트륨 (124 mM), 염화칼륨 (3 mM), HEPES (10 mM), 염화칼슘 이수화물 (2 mM), 염화마그네슘 육수화물 (1 mM), D-글루코오스 (20 mM))일 수 있다. - 이미징 용액에서 루시페린의 작업 용액을 준비하십시오. 반복 자극의 수만큼 많은 마이크로 원심분리 튜브에 분취한다. 루시페린의 농도를 이미징 챔버 내의 최종 농도가 100 μM가 되도록 조정한다.
- 형질감염된 세포가 있는 커버슬립을 챔버에 넣는다.
- 펌프를 계속 작동시키면서 흡기 비이커에서 펌프의 입구 튜브를 제거하고 루시페린 용액에 신속하게 담그고 튜브의 공기 공극을 피하기 위해 전환 시간을 가능한 한 짧게 유지합니다.
- 루시페린 용액을 섭취하자마자 입구 튜브를 흡기 비이커에 다시 넣으십시오. 이 과정을 필요한 횟수만큼 반복하고 세포가 노출되어야하는 생리 패턴에 따라 몇 분에서 몇 시간 간격으로 반복하십시오.
- 전사를 위해 16-24 h 동안 세포를 광보호 인큐베이터로 복귀시키거나, 또는 시간의 길이 동안 광 자극의 효과가 평가되어야 한다.
- 루시퍼라아제 기질(루시페린)을 준비한다.
2. 생체 내에서 광감각 단백질의 생체 발광 활성화
- 구문을
- 루시퍼라아제 서열 또는 루시페라아제-형광 단백질 융합 서열을 선택하면 광수용체와 일치하는 파장의 광을 생산하는 발광체의 발현이 활성화될 것이다.
- 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 DNA를 pAAV 플라스미드로 복제하고, 다른 연구자 또는 플라스미드 침착물로부터 아직 입수할 수 없는 경우.
- CAG 또는 CMV와 같은 발광 모듈의 발현을 위한 강력한 프로모터를 선택하십시오.
- 고역가 바이러스 스톡6 을 제조하기 위한 표준 접근법을 사용하거나 상업적으로 제조된 바이러스 벡터를 보유한다.
- 초기 연구를 위해, 광 방출기와 광 센서의 공동 전달을 위해 별도의 바이러스 벡터를 사용하여 필요한 경우 다른 구성 요소의 비율을 조정할 수 있습니다.
- AAV 형질도입
- 실험동물의 표적 장기를 시험관내 형질감염에 사용된 농도비와 유사한 광방출기, 광센서 및 리포터의 바이러스 벡터로 주입한다(표 3).
- 동물을 적어도 2 주 동안 집 케이지로 돌려 보내 모든 구성 요소의 최대한의 발현을 허용하십시오.
참고 : 대상 기관이 신체 내부에 있고 주변 빛으로부터 보호되는 경우, 동물은 정상적인 조명 조건에서 수용 될 수 있습니다.
- 생체 내 생체 발광 활성화
- 루시퍼라아제 기질(루시페린)을 준비한다.
- 수용성 CTZ 바이알을 -80°C 냉동고에서 꺼내어 실온으로 가온시킨다. 빛으로부터 보호하십시오.
- 500 μg 바이알 당 주사기를 사용하거나 바이알을 열고 피펫으로 물을 첨가 한 다음 고무 마개를 유리 병에 다시 올려 놓음으로써 멸균수 250 μL를 첨가하십시오.
- 재구성된 유리 바이알을 55°C 수조에서 몇 분 동안 인큐베이션하여 분말을 완전히 용해시킨다.
- 용액을 검정색 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 유리 바이알의 벽을 헹구어 모든 CTZ를 검색하십시오.
- 하루에 필요한 용액의 양을 제거하십시오. 다음 날 사용하기 위해 나머지 용액을 4°C에서 보관하십시오. 얼지 마십시오!
- 차량 바이알에 대해 동일한 단계 (2.3.1.1.-2.3.1.5)를 수행하십시오.
- 생체 발광 광 자극
- 선택한 동물 및 적용 경로의 크기에 필요한 루시페린/차량의 부피를 제거합니다(표 4).
- 동물에게 루시페린 또는 비히클을 주사하십시오. 실험 설계에 따라 생체발광 광 자극을 반복한다. 예를 들어, 특정 행동 패러다임 동안 재조합효소의 활성화가 요구된다면, 행동 테스트 직전에 동물을 주사하십시오. 분자의 phasic 전사가 목표라면, 며칠 동안 반복적으로 동물을 주사하십시오.
- 설계된대로 생체발광 자극된 동물로부터 데이터를 수집한다.
- 루시퍼라아제 기질(루시페린)을 준비한다.
Representative Results
빛에 반응하는 액추에이터로 조작 할 수있는 수많은 세포 내 사건이 있으며, 물리적 및 생물학적 광원으로 이중 모달 활성화가 가능합니다. 다음은 광감지 칼슘(Ca2+) 적분기, 광유도 단백질 전좌, 광감지 전사 인자 및 감광성 재조합효소를 채용한 예이다. 이 예는 다양한 종류의 광수용체를 활성화하기 위해 생체 발광을 사용하는 타당성을 보여줍니다. 제시된 실험은 발광 다이오드(LED) 적용, 선택된 루시퍼라제, 또는 루시페린 적용의 농도 및 타이밍에 대하여 특별히 최적화되지 않았다.
빠른 광- 및 활성-조절된 발현 (FLARE)은 증가된 세포내 Ca2+ 및 light23의 공동발생률을 갖는 리포터 유전자의 전사를 허용하는 광유전학적 시스템이다(도 4A). Ca2+의 존재는 프로테아제를 광 자극으로만 접근가능한 프로테아제 절단 부위에 근접하게 가져오는데 요구되며, 그 결과 전사 인자의 방출이 초래된다. HEK293 세포를 원래의 FLARE 성분, 이중 반딧불이 (FLuc)-dTomato 리포터 작제물, 및 막-고정된 가우시아 루시퍼라제 변이체 sbGLuc6과 공동-형질감염시켰다. 2 μM 이오노마이신 및 5 mM 염화칼슘(CaCl2)에 대한 세포의 노출을 통해 증가된 세포내 Ca2+의 존재하에, 청색 LED의 적용은 어둠 속에 남겨진 세포에 비해 형광 리포터의 강력한 발현을 유도할 뿐만 아니라, FLuc 기질을 첨가할 때 발광을 측정함으로써 결정된 FLuc의 발현을 유도하고, D- 루시페린. 유사한 수준의 FLuc 발현은 이오노마이신 및 CaCl2와 함께 sbGLuc 기질 (CTZ)의 적용시 sbGLuc에 의해 방출된 생체발광으로 달성되었다. 광 활성화 (sbGLuc) 및 광 활성화 (FLuc의 전사)의 효과를보고하기 위해 사용되는 루시페라제는 각각의 루시페린 (CTZ 대 D- 루시페린)과 함께 빛을 생성하고 교차 반응하지 않습니다.
상이한 성분들이 조합되어 크립토크롬23,24의 헤테로이량체화에 기초한 광유도된 전사 시스템을 생성하였다(도 4B). CRY2는 프로테아제에 융합되었고, 한편 막-결합된 CIB는 프로테아제 절단 부위 및 전사 인자에 융합되었다. 광-유도된 단백질 전좌는 전사 인자를 방출하여, 도 4A에 도시된 바와 같이 FLuc 및 dTomato의 발현을 유도한다. 전사 인자 성분 단독의 존재는 자발적인 단백질 분해로 인해 상당한 배경 신호를 초래했지만, 물리적 광 (LED) 및 생체 발광 (CTZ) 모두 생체 내 이미징 시스템 (IVIS)에서 측정 된 FLuc의 발현을 견고하게 증가시켰다.
또 다른 실험 세트에서, NanoLuc (루시페린: furimazine 또는 hCTZ)는 CRY/CIB와 감광성 전사 인자인 EL22225,26,27의 이량체화를 통한 전사의 광유전학적 조절을 위해 사용되었다. 도 5A, B는 어둡고 밝은 상태의 상이한 성분들과 광 센서에 공동-형질감염되거나 융합된 루시퍼라아제의 회로도를 보여준다. 다양한 비교가 도 5C에 도시되어 있다. 구축물을 발현하는 HEK293 세포에 hCTZ를 추가하고 15분 후에 제거함으로써 유도되는 생체 발광은 CRY/CIB 및 EL222 둘 다에 대해 LED 광 노출의 20분보다 리포터 전사를 구동하는데 더 효율적이었다. CRY/CIB의 경우, 한 시간의 LED 노출은 15분의 생체 발광에 필적하는 전사 수준에 도달하기에 충분했다. 대조적으로, EL222의 경우, 60분의 LED조차도 생체 발광에 대한 짧은 노출만큼 거의 절반도 효과적이지 않았습니다. 공동 형질감염되었을 때 두 시스템 간의 전사 효능에는 큰 차이가 없었지만 CRY/CIB의 융합 단백질은 EL222의 융합 단백질보다 더 효율적이었습니다. 두 시스템 모두에 대해, 융합 단백질은 공동-형질감염된 성분보다 유의하게 더 높은 전사 수준을 유도하였다. CRY/CIB는 무시할 수 있는 배경 전사를 가진 EL222에 비해 차량 적용으로 지속적으로 더 높은 배경 수준을 보였다. hCTZ 단독의 증가하는 농도는 리포터 유전자의 전사에 아무런 영향을 미치지 않았다.
광활성화 가능한 재조합효소는 옵토게놈 조작을 위한 다목적 도구를 제공합니다. 우리는 Vivid LOV 단백질, iCreV28에 기초한 감광성 분할 Cre 재조합효소의 생체발광 활성화를 시험하였다. 도 6A는 CTZ의 적용 전후의 상이한 성분, sbGLuc, iCreV, 및 록스-스톱-록스 형광 리포터(tdTomato)의 개략도를 도시한다. 대조군(CTZ 또는 LED 없음)에 대한 CTZ 적용으로부터의 결과를 도 6B에 나타내었다. 어둠 속에서도 배경 표현이 있습니다 (CTZ 없음). 그러나, CTZ의 존재하에서, 발현은 백그라운드에 걸쳐 견고하게 증가하고, LED 응용으로 유도된 것과 유사하다.
그림 1: 빛으로 밀봉된 인큐베이터. 조명이 켜진 제어판의 빛을 덮는 골판지 상자 플랩(위쪽 화살표). 광-불투과성 인큐베이터의 유리 도어 위에 (하단 화살표) 덮음으로써 세포를 광 노출로부터 보호한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 적색광으로 조명되는 층류 후드. 적색광에 의해 조명되는 표준 층류 조직 배양 후드를 보여주는 셋업. 화살표는 빨간색 전구가 있는 표준 데스크탑 램프를 나타냅니다. 붉은 빛 아래의 모든 조작은 어두운 빛이 밀집된 방에서 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 라이브 셀 이미징 현미경 주변의 가벼운 구획. 라이브 셀 이미징 현미경 설정의 두 가지 예는 앞면에만 플라스틱 커튼이있는 솔리드 박스 (왼쪽 패널 : 상단 및 하단) 또는 이미징 설정 주변의 검은 색 커튼 (오른쪽 패널 : 상단 및 하단)의 사용을 보여줍니다. 두 예제의 앞면은 사용하지 않을 때 열린 상태로 유지되고 롤업됩니다(상단 패널: 왼쪽 및 오른쪽). 전면 블랙 커튼은 라이브 셀 생체 발광 자극 및/또는 이미징(하단 패널: 왼쪽 및 오른쪽)을 수행할 때 실내의 모든 빛(예: 컴퓨터 스크린)이 이미징 영역으로 들어가는 것을 방지하기 위해 아래로 롤다운됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 세포내 신호전달 사건을 통합하기 위한 생체발광. (a) sbGLuc로 공동형질감염된 FLARE 성분의 개략도. Ca2+ 의 존재 및 프로테아제 절단 부위에 대한 프로테아제의 결과적인 근접성에서, 생체발광 또는 LED는 LOV의 전개, 절단 부위의 노출, 및 전사 인자의 방출을 야기할 것이다. 세포를 LED (듀티 사이클 33%, 40분 동안 2s on/4s 꺼짐; 3.5mW 광전력, 4.72mW/cm2 조도) 또는 생체발광 (15분 동안 100μM CTZ 최종 농도)에 노출시키거나 어둠 속에 방치하였다. 처리 후 상기 성분을 발현하는 HEK293 세포의 현미경 이미지는 Ca2+ 수준을 증가시키고 LED에 노출시킨다(왼쪽). FLuc 발광은 LED, 생체 발광 (CTZ) 또는 어둠 속에서 왼쪽 (오른쪽)에 대한 노출을 비교하는 발광계에서 측정되었습니다. (b) sbGLuc로 공동형질감염된 비-Ca2+-의존성 전사 시스템의 개략도. HEK293 세포를 4-웰 플레이트에서 개략적으로 묘사된 바와 같이 성분들의 4개의 상이한 배열로 형질감염시켰다. 플레이트를 CTZ를 추가하고 15분 동안 켜 두어 LED (듀티 사이클 33%, 40분 동안 2s on/4s 꺼짐; 3.5mW 광 전력, 4.72mW/cm2 조도) 또는 생체 발광 (100μM CTZ 최종 농도)에 노출시켰다. 대조군 플레이트는 어둠 속에 남겨졌다. FLuc 리포터의 전사는 IVIS에서 측정하였다. 대표 요리의 IVIS 이미지가 왼쪽에 표시됩니다. 어두운 컨트롤에 대한 기준선을 기준으로 한 여러 반복실험의 방사도 측정값이 오른쪽에 표시됩니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: FLARE = 빠른 조명 및 활동 조절 표현; LOV = 광-산소-전압-감지; LED = 발광 다이오드; CTZ = 코엘렌테라진; FLuc = 반딧불이 루시페라제; dTom = dTomato; CRY2 = 크립토크롬 2; CRY2PHR = CRY2 광분해효소 상동성 영역; CIB1 = Ca2+- 및 인테그린-결합 단백질 1; CIBN = CIB1의 N 말단; IVIS = 생체내 영상화 시스템. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 전사를 구동하기 위한 생체발광 . (A) 어둡고 밝은 상태에서 두 개의 광활성화 가능한 전사 시스템의 회로도. (b) 나노뤽은 묘사된 바와 같이 광감지 모이어티에 공동-형질감염되거나 융합되었다 (N-NanoLuc-CRY-GalDD-C; N-나노 뤽 - VP16-EL222-C). (C) 광원, 구성 설계 및 신호 대 잡음에 관한 두 시스템을 모두 사용한 비교. 세포를 LED (듀티 사이클 33%, 40분 동안 2s on/4s 꺼짐; 3.5mW 광전력, 4.72mW/cm2 조도) 또는 15분 동안 생체발광에 노출시켰다(100μM hCTZ 최종 농도; 다른 농도가 주목되는 경우를 제외하고). 어두운, 플레이트는 플라스미드의 초기 형질전환과 FLuc 측정 사이의 인큐베이터에 손대지 않은 채로 남겨졌다; VEH, 플레이트는 hCTZ를받는 것과 동일하게 처리되었지만 대신 차량을 받았습니다. 전사 수준의 차이: hCTZ, 공동-형질감염된 CRY 대 EL222-유의하지 않음; hCTZ, 루시퍼라아제-광단백질 융합 CRY 대 EL222 - p< 0.005; hCTZ, CRY 공동-형질감염 대 융합-p<0.005; hCTZ, EL222 공동-형질감염 대 융합-p<0.01; 비히클, CRY 대 EL222 - p < 0.05. 약어: UAS = 업스트림 활성화 시퀀스; LED = 발광 다이오드; CTZ = 코엘렌테라진; FLuc = 반딧불이 루시페라제; CRY = 크립토크롬; CIB = Ca2+- 및 인테그린 결합 단백질; VEH = 차량. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 광유전체학적 조작을 위한 생체발광. (A) 빛의 적용 전후에 sbGLuc, 분할된 iCreV 성분, 및 LSL 리포터 카세트를 이용한 생체발광 구동 광유전체학적 조작의 회로도. (b) HEK293 세포를 플라스미드로 리포펙션한 다음, 어둠 속에 보관하였다. 20-4시간 후, 세포를 양성 대조군으로서 단지 배지(CTZ 없음) 또는 CTZ(최종 농도 100μM) 또는 LED(듀티 사이클 25%, 5분 동안 5s on/15s off; 14.81 mW 광전력, 20 mW/cm2 조도)로 30분 동안 처리하였다. 지시된 바와 같은 조건을 이용한 tdTomato 형광의 현미경 이미지. 스케일 바 = 100 μm. 약어: LSL = lox-stop-lox; CTZ = 코엘렌테라진; LED = 발광 다이오드; VVD = 생생한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 광수용체의 생체발광 활성화. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2 : 다른 형식으로 셀을 도금하고 형질주입하기위한 지침. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 형질감염에 대한 다양한 플라스미드의 비율. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4: 생체내 응용을 위한 루시페린의 주입 경로, 부피 및 농도 (25 g 마우스). 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
청색에서 적색광까지 광감각 단백질의 활성화 스펙트럼과 일치하는 발광 파장을 가진 다양한 루시페라아제와 루시페린이 있습니다14,29. 방출 및 여기 파장을 정렬하는 것 외에도 페어링이 가장 잘 작동하는 선험적 인 방법을 결정할 수있는 신뢰할 수있는 방법이 없습니다. 따라서, 루시페린-루시퍼라제 쌍이 광감각 시스템을 구동하는 세포와 유기체에서 어떻게 작용하는지를 실험적으로 결정할 필요가 있다.
이 프리젠 테이션에 설명 된 프로토콜은 루시페린을 준비하는 방법과 생체 외 및 생체 내에서 루시페린을 적용하는 방법과 생체 발광을 활용한 실험을위한 방, 조직 배양 후드, 인큐베이터 및 현미경 설정에 대한 지침을 설명합니다. 대표적인 실험에서는 여러 광감각 단백질 (CRY/CIB, EL222, VVD, LOV)을 가진 다른 루시페라아제 (NanoLuc, Gaussia luciferase)가 사용되어 생체 발광 대 물리적 빛, 공동 형질감염 대 융합 단백질, 신호 대 잡음 비교 및 다른 판독 분석의 효과를 입증했습니다. 광감각 단백질을 활성화시키는 생체발광의 더 많은 응용은 전사 이외에 세포 사멸, cAMP 합성 및 단백질 이동의 유도를 표적화하는 몇몇 그룹으로부터의 간행물에 기술되어 있다(표 1).
단순히 발광 및 광 감지 부품을 공동 트랜스펙션하는 것이 좋은 시작입니다. 변수는 이미터와 센서의 몰비입니다. 알려지지 않은 것은 어둠 속에서의 센서 활동의 배경 수준, 빛의 강도 및 지속 시간과 관련된 센서 활동, 물리적 및 생물학적 빛을 비교하는 센서 활성화의 효율성입니다. 융합 구조는 이미터와 센서의 몰비를 1:1로 유지하고 광 이미터를 광 감지 도메인에 가깝게 하는 장점이 있지만, 광감각 액추에이터의 성능에 영향을 주지 않으면서 테더링할 위치(N- 또는 C-터미너스) 및 링크하는 방법(링커 길이 및 구성)과 같은 다른 고려 사항이 작용합니다.
시험관내 및 생체내 실험의 경우, 루시페린의 농도를 변화시키거나 루시페린이 각각의 센서에 이용가능하게 되는 시간을 변화시킴으로써 생체발광 발광을 튜닝하기 위한 다수의 옵션이 있다. 최소량 및 시간은 광 활성화와 함께 예상되는 효과의 존재 또는 부재에 의해 결정된다. 대조적으로, 각각의 최대치는 주로 장기간에 걸쳐 루시페린의 고농도에 대한 세포의 내성에 의해 결정됩니다. 상기 예에서 선택된 CTZ의 농도인 100 μM은 HEK293 세포에서 뉴런에 이르기까지 다양한 세포 유형에 대한 상한선에 가깝습니다. 목표는 표적 광감지 도메인의 활성화를 달성하기 위해 가능한 한 짧은 시간 동안 가능한 한 낮은 농도를 사용하는 것이다. 이것은 높은 발광을 가진 루시페라아제와 높은 광 감도를 가진 광수용체를 사용하여 더 쉽게 달성 될 것입니다.
광수용체를 구동하기 위한 생체발광은 설치류(마우스, 래트)에서 광감지 단백질이 발현될 뿐만 아니라 광수용체 발현 세포를 통해 피하 또는 복강내로 이식되어 왔다. 원칙적으로 인간이 아닌 영장류에서 물고기 또는 파리에 이르기까지 다른 종에 접근하는 것을 막는 데는 한계가 없습니다. 루시페린에 대한 유기체의 투과성에 따라, 적용은 루시페린을 주변 물(예를 들어, 물고기 유충(30))에 적용하는 것만큼 쉬울 수 있다. 새로운 유기체에서 BL-OG를 사용하기 전에 루시페린이 선택한 응용 경로를 통해 목표에 도달하는지 확인하기 위해 파일럿 실험을 수행해야합니다.
실험 설계의 중요한 측면은 결과 해석에 중요한 다양한 컨트롤입니다. 광감각 단백질에 작용하는 루시퍼라아제에 의해 구동되는 리포터를 발현하는 세포는 루시퍼라아제가 결여되거나 광감각 단백질이 결여된 세포와 비교되어야 한다. 또한, 루시페린에 노출된 세포, 비히클 또는 어둠 속에 보관된 세포들 사이에서 비교가 이루어져야 한다. 생체 발광 구동 광수용체 활성화의 효과를 평가하기 위한 다양한 분석의 한계를 깨닫는 것도 중요하다. 예를 들어, 생체발광 활성화 전사의 효능은 리포터 유전자가 직교 루시퍼라아제(luminometer, IVIS) 또는 형광 단백질(형광-활성화 세포 분류, 현미경 이미지 분석)인지 여부에 따라 상이한 방식으로 시험될 수 있다. 기본 효과는 테스트 플랫폼 간에 재현 가능해야 하지만 효과의 양적 측면은 상당히 다를 수 있습니다.
광수용체의 생체발광 활성화는 제한된 수의 루시페라아제 및 광감각 단백질에 대해 지금까지 시험 관 내 및 생체내 둘 다에 대해 입증되었다. 그것은 더 많은 생물학적 과정을 활성화시키기 위해 광수용체의 큰 부류로 확장될 수 있다. 접근법의 이러한 확장은 자연 발생 루시페라제보다 훨씬 높은 발광과 다른 용도로 조정 가능한 운동 적 특징을 가진 새로운 루시페라제 및 루시페라아제 - 형광 단백질 쌍의 지속적인 개발에 의해 더욱 촉진됩니다. 이러한 발전은 새로운 루시페린의 생성과 평행을 이루며 밝기와 색상 팔레트를 더욱 증가시킵니다29. 이 도구 플랫폼은 살아있는 세포, 조직 및 유기체 내부의 세포 내 역학 및 세포 상호 작용을 조작하고 조사하는 응용 프로그램을 제공합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 Ca-FLARE 프로테아제, 전사 인자 및 리포터 (Addgene # 92214, 92213, 92202), TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 및 NES-CRY2PHR-TevC (Addgene # 89878, 89877), CRY-GalΔDD (B1013) 및 CIB-VP64 (B1016) (Addgene # 92035, 92037)에 대한 C. Tucker (Addgene # 92035, 92037), pGL2-GAL4-UAS-Luc (Addgene #33020)의 경우 M. Walsh (Addgene #33020), VP-EL222 및 C120-Fluc의 K. Gardner, iCreV를 출판 전에 사용할 수있게 해준 A. Cetin 및 H. Zeng에 대한 동료들에게 감사드립니다. 이 연구는 NSF (NeuroNex 1707352), NIH (U01NS099709), W.M. Keck Foundation 및 스웨덴 연구위원회 A.B. (2016-06760)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABI 25W Deep Red 660 nm LED Light Bulb | Amazon | to be used with any lamp stand | |
| Black Microcentrifuge Tubes, 0.5 mL, Argos Technologies | Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Black Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL, Argos Technologies | Fisher Scientific | 03-391-161 | |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric (1.5 m x 2.7 m) x 0.12 mm (thick) | THOR LABS | BK-5 | |
| C120-Fluc | K. Gardner | ||
| CaCl2 | Sigma | C8106; CAS: 10035-04-8 | |
| Ca-FLARE protease, transcription factor and reporter | Addgene # 92214, 92213, 92202 | A. Ting | |
| CIB-VP64 (B1016) | Addgene # 92037 | C. Tucker | |
| CRY-GalΔDD (B1013) | Addgene # 92035 | C. Tucker | |
| CTZ | Prolume Inc. (NanoLight) | 303 | formulation for in vitro applications with Gaussia luciferases |
| CTZ (Water soluble native coelenterazine) | Prolume Inc. (NanoLight) | 3031 | formulation for in vivo applications with Gaussia luciferases |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270; CAS: 50-99-7 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechnology | LUCK | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11960044 | |
| D-PBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14190144 | |
| hCTZ | Prolume Inc. (NanoLight) | 301 | formulation for in vitro applications with Oplophorus luciferases |
| HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| HEPES | Sigma | H3375; CAS: 7365-45-9 | |
| iCreV | A. Cetin and H. Zeng | ||
| In Vivo Imaging System (IVIS) | Perkin-Elmer | Lumina LT | |
| KCl | Sigma | P5405; CAS: 7447-40-7 | |
| LED Array Driver | Amuza | LAD-1 | |
| LED Array for Multiwell Plates | Amuza | LEDA-x | |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent |
| Luminometer | Molecular Devices | SpectraMax L | |
| MgCl2 Hexahydrate | Sigma | M2670; CAS: 7791-18-6 | |
| NaCl | Sigma | S7653; CAS: 7647-14-5 | |
| NanoFuel Solvent | Prolume Inc. (NanoLight) | 399 | for dissolving CTZ preparations for in vitro use |
| NaOH | Sigma | 221465; CAS: 1310-73-2 | |
| NES-CRY2PHR-TevC | Addgene # 89877 | H. Kwon | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 11058021 | transfection medium |
| PDL coated coverslips (12 mm, 15 mm, 18 mm) | Neuvitro Corporation | GG-12-PDL, GG-15-PDL , GG-18-PDL | |
| pGL2-GAL4-UAS-Luc | Addgene #33020 | M. Walsh | |
| Prizmatix USB Pulser TTL Generator for Optogenetics | Goldstone Scientific | ||
| TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 | Addgene # 89878 | H. Kwon | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Vehicle (Water-soluble carrier without CTZ) | Prolume Inc. (NanoLight) | 3031C | control for in vivo applications with CTZ |
| VP-EL222 | K. Gardner |
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