Summary
מטרת פרוטוקול זה היא לפתח מערכת מודל להשפעת היפרוקסיה על קהילות המיקרואורגניזמים של סיסטיק פיברוזיס דרכי הנשימה. מדיום כיח מלאכותי מחקה את הרכב הכיח, ותנאי התרבות ההיפרוקסית מדגימים את ההשפעות של חמצן משלים על קהילות מיקרוביות ריאות.
Abstract
קהילות מיקרוביות בדרכי הנשימה נחשבות לשחק תפקיד חשוב בהתקדמות של סיסטיק פיברוזיס (CF) ומחלות ריאות כרוניות אחרות. חיידקים סווגו באופן מסורתי על סמך יכולתם להשתמש או לסבול חמצן. חמצן משלים הוא טיפול רפואי נפוץ שניתן לאנשים עם סיסטיק פיברוזיס (pwCF); עם זאת, מחקרים קיימים על חמצן ועל המיקרוביום דרכי הנשימה התמקדו באופן שבו היפוקסיה (חמצן נמוך) ולא היפרוקסיה (חמצן גבוה) משפיעה על קהילות מיקרוביות הריאות האירוביות והפקולטיביות בעיקר. כדי לטפל בפער ידע קריטי זה, פרוטוקול זה פותח באמצעות מדיום כיח מלאכותי המחקה את הרכב הליחה מ- pwCF. השימוש בעיקור מסננים, המניב מדיום שקוף, מאפשר לשיטות אופטיות לעקוב אחר הצמיחה של חיידקים חד-תאיים בתרביות השעיה. כדי ליצור תנאים היפרוקסיים, מערכת מודל זו מנצלת טכניקות פולחן אנאירובי מבוססות כדי ללמוד תנאים היפרוקסיים; במקום להסיר חמצן, חמצן מתווסף לתרבויות על ידי התכתות יומית של בקבוקי סרום עם תערובת של חמצן דחוס ואוויר. כיח מ 50 pwCF עבר סטרינג יומי לתקופה של 72 שעות כדי לאמת את היכולת של מודל זה לשמור על תנאי חמצן דיפרנציאליים. רצף מטגנומי רובה ציד בוצע על דגימות כיח מתורבתות ולא תרבותיות מ 11 pwCF כדי לאמת את היכולת של מדיום זה כדי לתמוך בצמיחה של חיידקים קומנסליים ופתוגניים הנפוצים בליח סיסטיק פיברוזיס. עקומות גדילה התקבלו מ 112 מבודדים שהתקבלו מ- pwCF כדי לאמת את היכולת של מדיום כיח מלאכותי זה לתמוך בצמיחה של פתוגנים סיסטיק פיברוזיס נפוצים. אנו מוצאים כי מודל זה יכול תרבות מגוון רחב של פתוגנים ו commensals כיח CF, משחזר קהילה דומה מאוד כיח לא תרבותי בתנאים נורמוקסיים, ויוצר פנוטיפים תרבות שונים בתנאי חמצן שונים. גישה חדשה זו עשויה להוביל להבנה טובה יותר של השפעות בלתי צפויות הנגרמות על ידי שימוש בחמצן ב- pwCF על קהילות מיקרוביות בדרכי הנשימה ופתוגנים נשימתיים נפוצים.
Introduction
סיסטיק פיברוזיס (CF) היא מחלה גנטית המאופיינת בחוסר יכולת לנקות ריר סמיך מהריאות, מה שמוביל לזיהומים חוזרים ונשנים ולירידה בתפקוד הריאות המתקדמת, שלעתים קרובות גורמת לצורך בהשתלת ריאות או למוות. המיקרוביום דרכי הנשימה של אנשים עם סיסטיק פיברוזיס (pwCF) נראהלעקובאחר פעילות המחלה 1 , עם ירידה במגוון מיקרוביאלי הקשורים לתוצאות שליליות לטווח ארוך2,3. במחקרים קליניים של pwCF, טיפול בחמצן משלים קושר למחלה מתקדמת יותר4,5, אם כי באופן מסורתי, השימוש בטיפול בחמצן נתפס פשוט כסמן לחומרת המחלה6. מחקרים אחרונים מניסוי קליני של חולים עם כשל נשימתי הראו כי רמות חמצן גבוהות יותר של המטופל קשורות באופן פרדוקסלי לעלייה בזיהומים חיידקיים חמורים ותמותה גבוהה יותר7, דבר המצביע על כך שחמצן משלים עשוי לתרום לפתוגנזה של המחלה. ההשפעה של חמצן משלים על מיקרוביום הריאות סיסטיק פיברוזיס וקהילות מיקרוביות הקשורות לריאות ודמתי הנשימה לא נחקרה היטב.
לעתים קרובות לא ניתן לבצע מחקרים מכניים ישירות בנושאים אנושיים בשל קשיים לוגיסטיים וסוגיות אתיות פוטנציאליות הקשורות להתערבויות של תועלת רפואית לא ידועה או נזק. גישות תרגומיות המשלבות ביו-פיסצימנים אנושיים במערכות מודל יכולות להציע תובנות ביולוגיות חשובות במקרים אלה. בעוד היכולת להשתמש או לסבול חמצן היה באופן מסורתי מרכיב חשוב של סיווג מיקרוביאלי, מעט מאוד ידוע על איך הקדמה טיפולית של חמצן משלים לסביבה עלולה להרגיז קהילות מיקרוביות דרכי הנשימה. כדי לשפוך אור על ההשפעות הלא ידועות של חמצן משלים על המיקרוביום דרכי הנשימה של pwCF, היינו צריכים להתמודד עם שני אתגרים עיקריים; ראשית, יצירת מדיום תרבותי המהוער מבחינה פיזיולוגית את הרכב כיח CF; שנית, יצירת מערכת מודל המאפשרת שמירה על ריכוזי חמצן גבוהים בתרבות על פני פרקי זמן ממושכים.
מדיה כיח מלאכותי (ASM) נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקות כיח ריאות ex vivo8,9,10, אבל אין קונצנזוס ברור על מתכון מסוים. פרוטוקול זה מתאר מתכון בינוני כיח מלאכותי ואסטרטגיית הכנה שתוכננה בקפידה כדי לתבח פיזיולוגית מ- pwCF. טבלה 1 מתארת את ערכי המתכון הנבחרים בהתבסס על ספרות שפורסמה. רכיבים כימיים בסיסיים ו- pH הותאמו לערכים שזוהו על ידי מחקרים של כיח CF אנושי11,12,13. חומרים מזינים פיזיולוגיים בריכוז נמוך נוספו באמצעות חלמון ביצה, אשר נכלל כמו 0.25% של נפח סופי10, כמו גם ויטמין ומתכת קורט מתערבב14,15. Mucin, המרכיב העיקרי של כיח16,נכלל ב 1% w / v14. למרות שעיקור מסנן אינטנסיבי יותר נבחר על פני הנוהג הקונבנציונלי יותר של עיקור חום כדי להפחית בעיות פוטנציאליות מפני denaturation הנגרמת על ידי חום של רכיבי מדיה חיוניים10. יתרון נוסף של עיקור מסנן הוא שהוא מייצר מדיה שקופה (עיקור חום יכול ליצור מדיה עכורה עקב משקעים ו קרישה של מלחים וחלבונים), ומאפשר מדיה כיח מלאכותי זה לשמש כדי לעקוב אחר צמיחה מיקרוביאלית המבוססת על עליות עכורה.
מערכת מודל זו לתרבות ההיפרוקסיקית מבוססת על טכניקות פולחן אנאירוביות שבהן מוסיפים חמצן ולא מוסרים, ויוצרים מודל להשפעת שימוש בחמצן משלים עבור pwCF. איור 1 ופרוטוקול התזת החמצן הנלווה מתארים את הרכיבים של מערכת שפיצוח חמצן, שניתן להשיג בעלות נמוכה מספקי מעבדה כלליים ומכלי בית חולים. מערכת זו מאפשרת ערבוב של חמצן דחוס ואוויר לריכוזים קבועים הנעים בין 21%-100% חמצן. השילוב של חיישן חמצן מאפשר אימות של ריכוז תערובת גז הפלט, כמו גם בדיקת הרכב גז הזרימה של בקבוקי סרום שהופצו בעבר כדי לוודא שתנאי החמצן נשמרו בטווח הרצוי.
פרוטוקול זה מתאר נהלים ליצירת מדיום כיח מלאכותי, בנייה ושימוש במערכת התזת חמצן, ויישום של שניהם על כיח CF תרבית בתנאי חמצן דיפרנציאליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה קיבל את אישור הוועדה לבדיקה מוסדית של השותפים (פרוטוקול מס' 2018P002934). קריטריון ההכללה כלל חולים מבוגרים עם סיסטיק פיברוזיס שסיפקו הסכמה מדעת בכתב למחקר. לא היה קריטריון אי-הכללה. על פי הנחיות הפרוטוקול, כל דגימות כיח נאספו מחולים עם סיסטיק פיברוזיס במהלך ביקור אשפוז מתוכנן עם הספק הקליני שלהם.
1. הכנה בינונית של כיח מלאכותי
הערה: הכמויות המפורטות כאן מיועדות לייצור של 1 ליטר של מדיום כיח מלאכותי סופי, ולהניח את ריאגנטים ספציפיים המפורטים בטבלת החומרים. יש להתאים מספרים עבור אמצעי אחסון אחרים או לשימוש של ריאגנטים שונים כדי להבטיח את אותו מוצר סופי. ראה טבלה 1 לריכוזים של יעד.
- תערובת כימית כיח מלאכותי (ASCM)
הערה: ASCM מהווה 25% מהנפח הבינוני הסופי. הוא יציב מדף וניתן להכין אותו בכמויות גדולות או מראש. אם מכינים אותו לשימוש מאוחר יותר, יש לאחסן את התערובת הכימית ולאחסן אותה בבטחה בטמפרטורת החדר.- מערבבים את פתרונות המניות הכימיים המרכיבים.
- הכן 1 M מלאי NaCl: להוסיף 58.44 גרם של NaCl לליטר מים סטריליים.
- הכן 1 M KCl: הוסף 74.55 גרם של KCl לליטר מים סטריליים.
- הכן 1 M MgSO4 מלאי: להוסיף 246.47 גרם של MgSO4·7H2O לליטר מים סטריליים, או 120.37 גרם של MgSO4 נטול מים נטולי מים סטריליים.
- הכן 1 M ציר גלוקוז: להוסיף 180.16 גרם של גלוקוז לליטר מים סטריליים.
- Autoclave לעקר את פתרונות מלאי כימי, כמו גם בקבוק ריק 250 מ"ל. בצע את שלבי השעבוד האוטומטי לערכים סטנדרטיים לפחות של 121 °C (70 °F) ו- 15 PSI למשך 30 דקות.
- הוסף 80.59 מ"ל של מים סטריליים לבקבוק ריק 250 מ"ל.
- הוסף 152.30 מ"ל של מניית NaCl 1 M לתערובת.
- הוסף 15.8 מ"ל של מניית KCl 1 M לתערובת.
- הוסף 610 μL של 1 M MgSO4 מניות לתערובת.
- מוסיפים 700 μL של 1 M ציר גלוקוז לתערובת.
- מערבבים את פתרונות המניות הכימיים המרכיבים.
- תערובת מוצין כיח מלאכותי (ASMM)
הערה: ASMM מהווה 50% מהנפח הבינוני הסופי. ודא שהוא מוכן באותו יום כמו האצווה הבינונית הסופית.- מוסיפים 450 מ"ל של מים סטריליים לבקבוק ריק של 1 ליטר.
- הוסיפו לבקבוק 50 מ"ל של תמיסת מלח עם אגירה בפוספט פיזפט (PBS).
- מוסיפים לבקבוק מוט ערבוב מגנטי חד פעמי.
- יש לאכוף אוטומטית את הבקבוק המכיל PBS ואת הבר המהומה.
- למדוד 10 גרם של אבקת mucin ולהוסיף אותו PBS.
- לנער את הבקבוק במרץ לערבוב ראשוני.
- מניחים את הבקבוק על צלחת חמה עם מערבב מגנטי. הגדר חום למיקוד בינוני-גבוה 50 °C (50 °F) ומהירות ערבוב ל 1100 סל"ד. שפר את המהירות בהדרגה כך שהבר לא יעוף מהמגנט.
- אפשר לחמם ומערבבים במשך 15 דקות.
- הרימו את הבקבוק עם כפפות עמידות בחום. יש לבחון אם אבקת מוצין מתיישבת מהתמיסה.
- אם אבקת mucin אינו מומס לחלוטין, להחזיר את הבקבוק לחום / stirrer במשך מרווחים של 5 דקות עד שהוא מומס לחלוטין.
- אפשר תערובת mucin להתקרר לטמפרטורת החדר.
- תערובת ביולוגית של כיח מלאכותי (ASBM)
הערה: ASBM הוא 25% מהנפח הבינוני הסופי. הכן אותו באותו יום כמו אצווה בינונית הסופית, ובניגוד תערובות אחרות, לא לחשוף את מרכיביו לכל חום.- הפשירו את מלאי הוויטמינים 100x במקרר 4 מעלות צלזיוס או בקרח.
הערה: מנה מראש את מלאי הוויטמינים ל-10 מ"ל כדי למזער את מספר מחזורי ההקפאה/הפשרה. - הוסף 124.24 מ"ל של מים סטריליים לבקבוק 250 מ"ל אוטומטי ריק.
- הוסיפו לתערובת 25.76 מ"ל של ציר חומצות אמינו חיוניות פי 50.
- הוסיפו לתערובת 80.14 מ"ל של ציר חומצות אמינו לא חיוניות 100x.
- הוסיפו לתערובת 10 מ"ל של מלאי ויטמינים 100x (מופשר).
- הוסף 1 מ"ל של 1000x עקבות מתכות מלאי לתערובת.
- מוסיפים לתערובת 8.33 מ"ל של 30% תחליב חלמון ביצה.
- הוסף 400 μL של 10 גרם / ליטר ציר פריטין לתערובת.
- מערבבים היטב את הפתרון באמצעות רעד ידני.
- הפשירו את מלאי הוויטמינים 100x במקרר 4 מעלות צלזיוס או בקרח.
- מדיום כיח מלאכותי (ASM)
- הוסף 250 מ"ל של ASCM לבקבוק 1 L המכיל ASMM.
- מוסיפים 250 מ"ל של ASBM לבקבוק הבינוני.
- יש לתמצת את המדיום עם מאגר MOPS בסיסי (1 M) כדי להגיע ל- pH של 6.3 בנייר pH לטווח צר. לפני טיטציה, התערובת הבינונית תהיה חומצית מדי.
- יש לשמור בקירור את מדיום הליחה המלאכותי המתקבל ב-4 °C (70 °F) עד שיהיה מוכן לסינון.
- כדי להתחיל את תהליך הסינון, העבר 200 מ"ל של מדיום כיח מלאכותי לא מסונן למערכת סינון ואקום עם מסנן בגודל נקבובית 0.22 מיקרומטר.
- חבר את מערכת הסינון למשאבת הוואקום, הפעל את משאבת הוואקום, הגדר אותה ל-70 מ"ר ולאחר מכן הנח את התא על שייקר מסלולית רועד במהירות של 90 סל"ד בחדר קר במהירות של 4 מעלות צלזיוס.
- למעלה עם 150 מ"ל נוספים של המדיום כמו כמות ניכרת מסוננת. זה לוקח 1-2 ימים כדי לסנן 1 L של בינוני לחלוטין.
- חזור על הפעולה עם תאים נוספים עד שכל המדיה מסוננת.
הערה: נסה לא לסנן יותר מ 350 מ"ל של המדיום באמצעות אותו מסנן 0.22 מיקרומטר מאז mucin יהיה לחבר את המסנן לאורך זמן.
- יש לשמור בקירור מדיום כיח מלאכותי מסונן ב-4 °C (70°F) עד שיהיה מוכן לשימוש. השתמש ASM בתוך חודש אחד של הכנה לתוצאות הטובות ביותר.
2. התזת חמצן
- הגדרת תחנת התזתה
הערה: פרוטוקול זה צריך להיעשות במלואו רק פעם אחת, ולאחר מכן ניתן לשמור על ההתקנה באמצעות תחזוקה פשוטה לפי הצורך. ראה איור 1 לקבלת סכמטי חזותי של מערכת זרימת החמצן.- להשיג ולאבטח כראוי את האוויר הדחוס ואת מיכלי החמצן.
זהירות: לחץ גבוה הופך את הטנקים למסוכנים ביותר כאשר מטפלים בהן שלא כהלכה. ודא כי הטנקים אטומים ומאובטחים לחלוטין, אין דליפות כאשר הטנק סגור, וכי כל אנשי הטיפול מאומנים באופן מלא בשימוש בהם. - חברו מוטת אוויר למיכל האוויר הדחוס עם מפתח ברגים. לקריאת זרימה אופטימלית על הרגולטור, צרף את הרגולטור קרוב ככל האפשר למיקום זקוף.
- חברו ווסת חמצן למיכל החמצן הדחוס, והצמידו קרוב ככל האפשר לתנוחה זקופה. בהתאם למיכל החמצן, ייתכן שיהיה צורך הפוך את הכיוון כדי להדק.
- חבר את הצינורות מהרגולטורים למחבר Y כדי לשלב את זרימת הגז משני המיכלים.
- חבר את הפלט של מחבר Y לשסתום צומת T המרכזי.
- חבר צד אחד של שסתום צומת T המרכזי למד לחץ גז.
- חבר את הצד השני של מד לחץ הגז למסנן מזרק סטרילי בקוטר 25 מ"מ עם גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר.
- חבר מסנן מזרק נוסף בקוטר 25 מ"מ למזרק ללא בוכנה שישמש לשחרור גז במהלך השרצה.
- חבר את הצד האחרון של שסתום צומת T המרכזי לשסתום צומת T שני לצג החמצן.
- חבר מסנן מזרק בקוטר 25 מ"מ לצד אחד של שסתום צומת T השני, יחד עם צינורות לחבר מחטים 18 G.
- חבר את הצד האחרון של שסתום צומת T השני למנגנון ניטור החמצן.
- חבר צינור מנותק לצד השני של מנגנון ניטור החמצן שישמש כשחרור גז במהלך הניטור.
אזהרה: בעת בדיקה/שימוש במערכת שפיצול החמצן, שים לב היטב למיקום צמתי ה- T והבטח שהוא תואם את הנתיב המיועד דרך המערכת. כישלון לעשות זאת יגרום להצטברות לחץ בתוך המערכת ולגרום לרכיבים להיכשל ולפרק . - לתחזוקת המערכת ולשומר על ביצועים מיטביים, הפרקטיקות הבאות מועילות.
- לחזק את הקשרים עם כמויות ליברליות של סרט טפלון כדי לשפר מאוד את החותם שלהם ולהפחית את הסיכוי של רכיבים מתפרקים מהלחץ הפנימי.
- שמור על קצב זרימה משולב מתחת ל-10 ליטר לדקה כדי למתן לחץ מרבי ולמנוע כשלים.
- אם יש חשד לדליפה, השתמש בתמיסת חומר ניקוי כגון גלאי דליפות נוזלים זמינים מסחרית כדי לזהות את מיקומה בקלות, מכיוון שהוא יבעבע מעל כל דליפות גז. תיקון דליפות באמצעות סרט פוליטרפלואורואתילן (למשל, טפלון).
- החלף את מסנני המזרק בקוטר 25 מ"מ במערכת שפיצול החמצן דו-שבועי, אך זה משתנה בהתאם לתדירות השימוש. עם הזמן, חלקיקים שנתפסו במסנן מפחיתים את קצב זרימת הגז וגורמים להצטברות לחץ.
- כייל את צג החמצן ל-21% חמצן דחוס לפני ביצוע מדידות.
- עם השלמת השימוש במערכת, לכבות את המיכלים ולדמם את הגז העודף מן הרגולטורים עד הזרימה מפסיקה לחלוטין.
- להשיג ולאבטח כראוי את האוויר הדחוס ואת מיכלי החמצן.
- תרבית בקבוק סרום
- תווית 500 מ"ל בקבוקי סרום אוטומטית עם מזהים מדגם, תאריך / שעה של חיסון, ואחוז חמצן היעד.
- בברדס ביולוגי, הוסיפו 24 מ"ל של מדיום הכיח המלאכותי לכל בקבוק סרום שמוקם.
- הוסף 1 מ"ל של כיח החולה הומוגני עם מחט 18-G (מדולל עם תמיסת מלח סטרילית במידת הצורך כדי להשיג נפח מספיק של מדגם עבור כל מצב תרבית) לכל בקבוק סרום.
- בעזרת פינצטה סטרילית, הניחו את פקקי הגומי האוטומטיים על החלק העליון של כל בקבוק סרום.
- לחץ על פקקי הגומי, הדאג לא לגעת בחלק התחתון של פקק הידיים.
- מוציאים את הבקבוקים מהמכסה המנוע, מורחים ומכווצים את אטמי האלומיניום. מוציאים את החלק המרכזי מהחותמים.
- נגב את החלק העליון של הבקבוקים עם לנגב אלכוהול ולהעביר אותם דרך להבת מבער Bunsen.
- הדביק מחט סטרילית 18-G למזרק ללא בוכנה עם מסנן. הכנס את שחרור הגז לבקבוק תחילה.
- הצמד מחט סטרילית 18-G לפלט הגז מהמערכת ולהכניס את מחט פלט הגז לתוך הבקבוק גם כן.
- לנתב את הצמתים מהמיכלים דרך צג החמצן. ודא שריכוז החמצן של המטרה זורם במערכת. כוון כ-5 ליטר לדקה של זרימת גז.
- לנתב מחדש את צמתי T מהמיכלים עד לתפוקת הגז. הגז מתחיל לזרום דרך בקבוק הנסיוב.
זהירות: שים לב למד הלחץ במהלך התזת חמצן. אם הלחץ עולה באופן בלתי צפוי, כבה את המערכת באופן מיידי. - הפעל חמצן sparge דרך בקבוק הסרום במשך 1 דקות. ב 5 L / min, זה מאפשר 10 חילופי אוויר ומבטיח את האטמוספירה הפנימית מגיע ללחץ החלקי הרצוי.
- הסר את גז שחרור מחט 18-G.
- אפשר ללחץ בבקבוק הסרום לבנות לאטמוספירה +1 (2 אטמוספרות בגובה פני הים) ולאחר מכן הסר מיד את מחט פלט הגז.
הערה: שמירה על לחץ מסייעת שמירה על תנאים היפרוקסיים לאורך זמן. - מניחים את בקבוק הסרום בשייקר אינקובטור 37 מעלות צלזיוס במהירות של 150 סל"ד. לדגור את הדגימות במשך שלושה מרווחי זמן של 24 שעות. בכל מרווח של 24 שעות, קחו aliquot לניתוח במורד הזרם, סובבו מחדש את הדגימות והחזירו אותן לדגירה לזמן דגירה כולל של 72 שעות.
- מדידת חמצן תזרים
- כייל את מד החמצן ל-21% אוויר דחוס, ואז כבה את המיכל.
- לנתב את צריכת בקבוק הסרום דרך צג החמצן ולהדביק מחט סטרילית עד הסוף.
- הכנס את המחט דרך פקק הגומי לתוך בקבוק הסרום.
- המתן עד שקריאת היציאה תתייצב. קצב זרימה נמוך מבקבוקי הסרום אומר שזה עשוי לקחת עד 2 דקות. דווח על הפרש השיא מאוויר החדר (מספר הרחוק ביותר מ-21%).
- אם מבצע קריאות מרובות, לשטוף את המערכת עם אוויר דחוס בין קריאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקולים אלה הוחלו על 50 דגימות כיח צפויות מ pwCF המציגות לטיפול שגרתי במרפאת סיסטיק פיברוזיס באשפוז בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס בבוסטון, מסצ'וסטס. הכיח של כל מטופל היה בתרבית מתחת ל-21%, 50% ו-100% בתנאי חמצן באמצעות מדיום הכיח המלאכותי, עם 0.5 מ"ל עליקוטים שנלקחו מכל תרבית ב-24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות של זמן תרבות לבדיקה. תרבויות צולמו כאשר החילוצים נעשו כדי לעקוב אחר שינויים חזותיים. בנוסף, 0.5 מ"ל aliquot של כל דגימת כיח ראשוני נלקח לפני culturing. התוצאה הייתה 10 דגימות נפרדות לכל מטופל ו- N סופי של 500 דגימות. מתורבת אלה, כיח מ 11 חולים (11 כיח לא תרבותי, 11 כיוטה מתורבתת מ 21% חמצן ב 48 שעות של דגירה) עבר חילוץ חומצת גרעין17, ספריות ריצוף נוצרו באמצעות ערכת הכנה ספריית DNA מסחרית, ורצף מטגנומי בוצע על פלטפורמת ריצוף גנום שלם מיקוד ~ 5 Gb של רצף לכל מדגימה עם 150 זוג בסיס, קריאות מזוגות. קריאות גולמיות עובדו באמצעות חבילת bioBakery של כלים18, הכוללת בקרת איכות והסרה של רצפי "מזהמים" אנושיים ופרופיל טקסונומי עם מאבחן MetaPhlAn319. בזמן הפקת חומצת גרעין, 10 מיליון תאים של halotolerans Imtechella, מין halotolerant נמצא בדרך כלל במערכות אקולוגיות שפך ולא בקהילות מיקרוביות אנושיות, היו מזונקים לתוך כל מדגם, המאפשר כימות של עומס מיקרוביאלי מוחלט עבור כל מדגם20.
איור 2 מציג מדידות חמצן תזרים בודדות וממוצעות ורמות חומציות במהלך תהליך התרבות עבור 50 דגימות כיח בתרבית תחת כל מצב חמצן ודוגמה לפנוטיפ של תרבות דיפרנציאלית חזותית. תרבויות נשמרו ב 37 °C (50 °F) למעט בתקופות קצרות כאשר התיזצים והסרה של aliquots מדגם בוצע. עם שני מרווחי התזת של 12 שעות ו 24 שעות, ריכוזי חמצן גבוהים נשמרו, אם כי ירידה לאורך זמן נצפתה עבור כל שלושת תנאי החמצן, עם 100% חמצן יורד לכ 85%, 50% חמצן נופל ל 40%, ו 21% חמצן נופל ל 18%. תנאי החמצן נותרו ברורים, וחשוב מכך, ריכוזי חמצן גבוהים נשמרו לאורך כל התהליך עבור דגימות היפרוקסיות. מדידות ה-pH הראו מידה רבה יותר של שונות, אך נשארו היטב בטווח הנורמלי מבחינה פיזיולוגית ללא שינויים משמעותיים סטטיסטית לאורך זמן. מדידות אלה מצביעות על כך ששיטות אלה שומרות על תנאי חמצן דיפרנציאליים נפרדים לאורך כל תהליך התרבות. לבסוף, דוגמה של אחד פנוטיפים רבים של תרבות חזותית כי להבדיל על פני ריכוז חמצן מוצג. מדגם זה סימן הבדלי עכירות לאחר 72 שעות של תרבות, עם חמצן גבוה יותר הקשורים לערפילות ראייתית נמוכה יותר. פנוטיפים של תרבות דיפרנציאלית תומכים בנוכחות השפעות הנגרמות על ידי היפרוקסיה על קהילות תרבות.
איור 3 משווה עומס מיקרוביאלי, מגוון מיקרוביאלי והרכב קהילתי מיקרוביאלי בין כיח לא תרבותי לבין כיח בתרבית (21% מצב חמצן לתקופה של 48 שעות). המדידות חושפות את ההבדל העיקרי היחיד שהוצג על ידי מעשה פולחן להיות גידול של כ -20 פי בעומס מיקרוביאלי בהשוואה לליחה לא תרבותית. המערכת החיסונית ומנגנוני פינוי כיח מכניים טיפוסיים כגון שיעול משמשים בדרך כלל כתהליך רגולטורי המגביל את העומס המיקרוביאלי בריאה, גם במקרים של תפקוד לקוי וזיהום כמו אלה שנראו ב- pwCF. לתרבות Ex vivo אין מנגנוני רגולציה כאלה, וקהילות מיקרוביות חופשיות במקום זאת להתקדם לעבר רוויה תאית. מדדי גיוון אלפא ובטא מצביעים על כך שלמרות הבדל זה בעומס המיקרוביאלי, הרכב הקהילה הבסיסית נשאר שמור היטב, עם הבדלים גלובליים מינימליים שהוצגו על ידי תהליך התרבות.
איור 4 מרחיב את ההשוואה בין דגימות כיח לא תרבותיות ומתורבתות, ומסתכל על הנוכחות הבינארית/היעדרם של 120 המינים המיקרוביאליים שזוהו באופן חד משמעי על ידי מטגנומיקה של רובה ציד המנציח את הכיח התרבותי והלא תרבותי המתקבל מ-11 חולים. חיידקים מקובצים על בסיס קווי דמיון פילוגנטיים. 46 (38.3%) מהמינים הללו זוהו בדגימות לא תרבותיות והן בדגימות מתורבתות (צבע ציאן), בעוד ש-35 (29.2%) זוהו באופן בלעדי בדגימות לא תרבותיות (צהוב) ו-39 (32.5%) זוהו באופן בלעדי בדגימות מתורבתות (כחול). סביר להניח כי יש זוגיות גדולה יותר ממה שזיהינו באמצעות רצף במונחים של מה קיים ומה נעדר, אבל כמה מסה נופל מתחת לסף זיהוי הרצף במקרים מסוימים. ההבדלים מצביעים על כך שתהליך התרבות מציג הטיה מסוימת בתרבות בהשוואה לליחה לא תרבותית. בעיקר, culturing מגביר את נוכחותם של פטריות כגון קנדידה אספרגילוס, כמו גם חברי Enterobacterales כולל Escherichia, Serratia, ו Streptococcus חברים. לעומת זאת, חברי Bacteroidetes כגון Prevotella ו Clostridiales, שהם אנארובים, היו נוכחים בדגימות לא תרבותיות אך לא היו נוכחים בדגימות מתורבתות. זה עשוי להיות מיוחס לחוסר מצב אנאירובי במודל הניסיוני שלנו.
איור 5 מראה עקומות גדילה מבוססות ספיגה של פתוגנים נפוצים של ריאות CF המבודדים מהליחה המתקבלת מ-50 pwCF שונים. מבודדים אלה מייצגים בידודים קליניים שונים פנוטיפיים המתקבלים באמצעות הליכי תרבות העשרה מהמעבדה למיקרוביולוגיה קלינית של בית החולים הכללי במסצ'וסטס, וכוללים פסאודומונס ארוגינוזה (N = 53), סטפילוקוקוס אאורוס (N = 37), מלטופיליה סטנוטרופיומונס (N = 12), דלקת ריאות קלבסילה (N = 3) ואקרומובקטרי sp (N = 7). עקומות גדילה הושגו על ידי פולחן כל מבודד במדיה כיח מלאכותי ב 37 °C (50 °F) בחושך, עם ASM sans חיסון חיידקי המשמש כשליטה שלילית. האיכות השקופה של ASM (אשר בשל סינון ולא עיקור חום) מאפשרת ביצוע אמצעים אופטיים כדי להעריך עקומות צמיחה. קריאות אופטיות ב 600 ננומטר (OD600) נלקחו כל 10 דקות, ואת 24 השעות הראשונות של כל עקומה מוצגים. היעדר שינויים בקריאה אופטית בשליטה השלילית של ASM בלבד מצביע על תרבויות ללא זיהום. העקומות המופגנות המוצגות כאן עוקבות אחר דפוסי עקומת גדילה טיפוסיים המציינים את הכדאיות של מתכון ASM זה כאמצעי לדור מבוסס ספיגה של עקומות צמיחה.
| עמודה 1 | עמודה 2 | עמודה 3 | עמודה 4 | עמודה 5 | עמודה 6 | עמודה 7 | עמודה 8 | עמודה 9 | |
| ערך | קומסטוק | קירשנר | סרירמולו | פאלמר | פלין | גלאגר | לאי | מקור | |
| מוצין | 2% w/v | 0.5% w/v | 0.5% w/v | - | 1% w/v | 2% w/v | 1% w/v | פלין | |
| נתרן כלורי | 85.5 מ"ר | 85.5 מ"ר | 85.5 מ"ר | 66.6 מטרמטר | 89.8 מ"מ | 85.5 מ"ר | 152.3 מ"ר | לאפייר | |
| אשלגן כלורי | 29.5 מ"מ | 29.5 מ"מ | 29.5 מ"מ | 15.8 מ"מ | - | 2.95 מ"מ | 15.8 מ"מ | פאלמר | |
| מגנזיום סולפט | - | - | - | 0.6 מ"מ | 1 מ"מ | 1 מ"מ | 0.61 מ"מ | פאלמר | |
| ברזל גופרתי | - | - | - | 0.0036 מ"מ | - | - | - | - | |
| אמוניום כלוריד | - | - | - | 2.3 מ"מ | 60 מ"ר | - | - | - | |
| מונופוטסיום פוספט | - | - | - | 2.5 מ"מ | 60 מ"ר | - | - | - | |
| גלוקוז | - | - | - | 3.2 מ"מ | 13 מ"ר | 40 מ"ר | 0.7 מ"מ | סמבק | |
| לקטט | - | - | - | 9 מ"ר | - | - | - | - | |
| חומצות אמינו חיוניות | 14.45x | 0.25 גרם/ל' | 0.25 גרם/ל' | לכל חומצה | 0.5x | 0.375x | 1.29x | פאלמר | |
| חומצות אמינו לא חיוניות | 28.9x | 0.25 גרם/ל' | 0.25 גרם/ל' | לכל חומצה | 0.25x | 0.5x | 8.01x | פאלמר | |
| ויטמינים | - | - | - | - | - | 1x | 1x | גלאגר | |
| עקבות מתכות | - | - | - | - | 1x | 1x | 1x | פלין | |
| חלמון ביצה | 0.25% | 0.25% | 0.25% | - | - | 0.25% | 0.25% | קירשנר | |
| פריטין | 0.0003 גרם/ל' | - | - | - | - | 0.0004 גרם/ל' | 0.0004 גרם/ל' | גלאגר | |
| DNA זרע סלמון | 1.4 גרם/ל' | 4 גר'/ל' | 4 גר'/ל' | - | - | 1.4 גרם/ל' | - | - | |
| DPTA | - | - | 0.0059 גרם/ל' | - | - | - | - | - | |
| pH | - | 6.9 | - | 6.8 | - | - | 6.3 | לאפייר | |
| אחסון | 0 | 4° | - | - | 4° | 4° | 4° | קירשנר | |
| עיקור | הפעלה אוטומטית | מסנן | הפעלה אוטומטית | - | הפעלה אוטומטית | הפעלה אוטומטית | מסנן | קירשנר | |
טבלה 1: מתכון בינוני של כיח מלאכותי הנגזר מסקירת הספרות. (עמודה 1) ריאגנטים וערכי מפתח בניסוח מדיום כיח מלאכותי. (עמודים 2–7) השוואת מתכונים מספרות8,9,10,12,14,15. (עמודים 8–9) מתכון בינוני כיח מלאכותי מפורט בפרוטוקול זה ואת המקורות המתאימים שהודיעו כל ערך נבחר10,11,12,13,14,15.
| עמודה 1 | עמודה 2 | עמודה 3 |
| כיח CF | ASM | |
| סה"כ חומצות אמינו | 10.25 מ"מ | 10.76 מ"מ |
| אלנין | 0.96 מ"מ | 0.80 מ"מ |
| ארגינין | 0.17 מ"מ | 0.94 מ"מ |
| אספרגין | 0.91 מ"מ | |
| חומצה אספרטית | 0.45 מ"מ | 0.80 מ"מ |
| ציסטאין | 0.09 מ"מ | 0.33 מ"מ |
| חומצה גלוטמית | 0.84 מ"מ | 0.80 מ"מ |
| גליצין | 0.65 מ"מ | 0.80 מ"מ |
| היסטידין | 0.28 מ"מ | 0.35 מ"מ |
| איזולאוצין | 0.60 מ"מ | 0.52 מ"מ |
| לאוצין | 0.87 מ"מ | 0.52 מ"מ |
| ליזין | 1.15 מ"מ | 0.64 מ"מ |
| מתיונין | 0.34 מ"מ | 0.13 מ"מ |
| אורניתין | 0.36 מ"מ | |
| פנילאלנין | 0.29 מ"מ | 0.26 מ"מ |
| פרולין | 0.90 מ"מ | 0.80 מ"מ |
| סרין | 0.78 מ"מ | 0.80 מ"מ |
| ת'ינין | 0.58 מ"מ | 0.52 מ"מ |
| טריפטופן | 0.07 מ"מ | 0.06 מ"מ |
| טירוזין | 0.43 מ"מ | 0.26 מ"מ |
| ואלין | 0.60 מ"מ | 0.52 מ"מ |
טבלה 2: ריכוזי חומצות אמינו שתוארו בעבר בליח סיסטיק פיברוזיס ובמתכון בינוני כיח מלאכותי המפורט בפרוטוקול זה. (עמודה 1) חומצות אמינו מרכזיות. (עמודה 2) ריכוזי חומצות אמינו של כיח מאנשים עם סיסטיק פיברוזיס12. (עמודה 3) ריכוזי חומצות אמינו במדיום כיח מלאכותי המפורטים בפרוטוקול זה
איור 1: שרטוט חיבור של רכיבי מערכת זרימת חמצן. תרשים זרימה של הקשרים בין רכיבי המערכת המשמשים לתדלוק בקבוקי סרום לריכוז החמצן הרצוי בין 21% ל -100%. למערכת יש 3 מצבי שימוש שנקבעו על ידי המיקום של שני שסתומי צומת T. המערכת יכולה לנתב גז מהמיכלים דרך תפוקת הגז או דרך צג אחוז החמצן, כמו גם לנתב גז זרימה מבקבוקי סרום שהופצו בעבר דרך הצג כדי לבדוק את הריכוז לאחר שחלף הזמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ריכוזי חמצן ממוקדים נשמרים בערך עם מרווחי זמן של 12 שעות ו-24 שעות, ו-pH נשאר בטווח הפיזיולוגי במהלך התרבות. (A)זרם חמצן קריאות מ 12 שעות ו 24 שעות חמצן זרמים מרווחים על פני תקופה של 72 שעות. (B)קריאות pH עבור דגימות נמדדו כל 24 שעות. (C) תמונה לדוגמה של מדגם CFB010 לדוגמה לאחר 72 שעות, המציג עכוז דיפרנציאלי על פני ריכוזי חמצן. הצבע מציין אחוז חמצן היעד; קווי שגיאה מציינים מרווחי ביטחון של 95%. סף קריטי מודגש בקווים מקווקווים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: פולחן מגביר את העומס המיקרוביאלי, אך ההרכב הקהילתי הבסיסי נשמר. כיח לא תרבותי (צהוב) וליחה בתרבית (כחול) באמצעות מדיום כיח מלאכותי ב-21% חמצן ל-48 שעות. Aliquots עבר מיצוי חומצת גרעין ורצף מטגנומיקה רובה ציד כדי לזהות הטיה אפשרית שהוצגה מתנאי תרבות. (A)עומס מיקרוביאלי מוחלט (נקבע על ידי פקדי ספייק-אין) ומדדי גיוון אלפא. באמצעות מודלים ליניאריים של אפקטים מעורבים, כיח לא תרבותי לעומת כיח תרבותי חזה עומס מיקרוביאלי אך לא מגוון אלפא. (B)הסמכה של שני הרכיבים הראשונים של מדדי גיוון בטא, שליטה על ההבדל בעומס המיקרוביאלי. אין הבדל משמעותי באף אחד מהמדדים אחרי PERMANOVA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: רוב המסה המזוהה נוכחים הן בליח המקור והן בתרבות, בעוד שאחרים מופיעים רק ביאוש המקור או בתרבות. רצף מטגנומיקה של רובה ציד המשמש להשוואה בין הבדלים בהרכב הקהילתי המיקרוביאלי בין דגימות כיח לא תרבותיות. עץ פילוגנטי של כל המינים המיקרוביאליים שזוהו בדגימות רצפות (N = 120). מינים המסומנים בצהוב (N = 35, 29.2%) נראו רק בדגימות כיח לא תרבותיות. מינים המסומנים בכחול (N = 39, 32.5%) נצפו רק בדגימות של תרבות בינונית של כיח מלאכותי. מינים המסומנים בציאן (N = 46, 38.3%) נצפו בדגימות לא תרבותיות והן בדגימות תרבותיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מדיום כיח מלאכותי שקוף מספיק כדי לשמש כאמצעי עקומת גדילה לפולחן מבודדים קליניים. קריאות צפיפות אופטימליות ב 600 ננומטר נלקחו כל 10 דקות, ואת 24 השעות הראשונות של כל עקומה מוצגים. קווים אפורים מייצגים קריאות בודדות, וקווים כתומים מייצגים את הספיגה הממוצעת עבור כל טקסון. כיח מלאכותי בינוני ריק כלול כפקד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה פותח מודל במבחנה כדי לחקור את ההשפעה של היפרוקסיה על קהילות חיידקי ריאות. מודל זה, המבוסס על כיח מלאכותי בינוני ויומיומי של בקבוקי סרום, שומר על ריכוזי חמצן גבוהים ותומך בצמיחת חיידקים המזוהים בליחה מ- pwCF.
ישנם מספר שלבים קריטיים של גישה זו. הראשון הוא הבחירה להשתמש סינון עיקור ולא עיקור חום של מדיום כיח מלאכותי. עיקור מסנן מונע דנטורינג של מוצין ורכיבים רגישים אחרים לחום של המדיום ומניב מדיום ברור שניתן להשתמש בו לאמצעים אופטיים של צמיחה מיקרוביאלית. בעוד סינון-עיקור הוצע בפרוטוקולים אחרים10, מצאנו כי תוספת של רעד מסלולי במהלך תהליך הסינון היה חיוני כדי למנוע סתימה של המסנן כי אחרת התרחש כאשר כמות מינימלית של המדיום מוכן היה מסונן. בעוד המדיום מליחה מלאכותית מסונן עשוי להיות ריכוז מוצין סופי נמוך מהמתוכנן עקב פגיעת mucin במסנן, כיח מ pwCF הוכח יש ריכוזי מוצין נמוכים יותר מאשר כיח מאנשים ללא סיסטיק פיברוזיס21. ריכוז המוצין ההתחלתי של 1% בשימוש בפרוטוקול זה גבוה יותר מאשר בגישות אחרות שהשתמשו בעיקור מסננים, כאשר קבוצה אחת משתמשת בריכוז מוצין התחלתי של 0.5%10, בעוד מתכונים טיפוסיים משתמשים בריכוזים מוצין הנעים בין 0.5%-2% (טבלה 1). לכן, גם עם אובדן mucin בתהליך סינון-עיקור, המדיום הסופי מוכן באמצעות פרוטוקול זה צפוי להיות ריכוזי mucin בתוך הטווח הפיזיולוגי22.
השני הוא הרכב של מדיום כיח מלאכותי. המתכון למדיום כיח מלאכותי נבחר על סמך מחקרים פיזיולוגיים קיימים של כיח מ pwCF (טבלה 1). באמצעות ריצוף מטגנומיקה של רובה ציד, הצלחנו לוודא כי כיח בתרבית עם מדיום כיח מלאכותי זה משחזר באופן רחב את ההרכב הקהילתי המיקרוביאלי של כיח לא תרבותי (איור 3). בתנאים נורמוקסיים, מדיום זה תמך גם בצמיחה של 112 מבודדים קליניים שונים המייצגים פתוגנים נפוצים המבודדים מהליחה של חולי סיסטיק פיברוזיס. לכן, נתונים אלה מדגימים כי ניסוח זה של מדיום כיח מלאכותי תומך בצמיחה של מיקרוביוטה דרכי הנשימה מ pwCF. DNA זרע סלמון, תוספת נפוצה מתכונים קיימים (טבלה 1), הושמט. יישום אחד המיועד של מודל זה הוא ריצוף metagenomics, ולכן DNA זרע סלמון לא נכלל על מנת להפחית את התוספת של חומצות גרעין לא מיקרוביאלי כמו קריאות אלה יסננו החוצה לאחר הרצף, ובכך להקטין את עומק הרצף האפקטיבי שלנו. בעוד שלכיח מ- pwCF יש ריכוזים גבוהים של DNA חוץ תאי23, חלק ניכר ממנו הוא מיקרוביאלי במקור24, ולא ברור אם התוספת של DNA זרע סלמון למדיום כיח מלאכותי עושה את זה יותר פיזיולוגי או אם הגישה התרבותית המתוארת בפרוטוקול זה מובילה לרמות גבוהות של DNA חוץ תאי נגזר מיקרוביאלי; במחקרים שלנו לא הבחנו בין ריכוזי דנ"א חוץ-תאיים ותוך-תאיים. מחקרים עתידיים עשויים לרצות לאמת את הריכוז של DNA חוץ תאי שנוצר על ידי שיטת פולחן זו.
שלישית, למיטב ידיעתנו, לא פורסמו מחקרים על קהילות חיידקי ריאות סיסטיק פיברוזיס התייחסו לתנאים היפרוקסיים. מודל זה משתמש בציוד זול וזמין בדרך כלל מספקי מעבדה כללית או בית חולים כדי לבנות מערכת התזת חמצן. שיקולים חשובים לשמירה על תנאים היפרוקסיים כוללים את נפח המדיום התרבותי ביחס למרחב הראש הזמין בבקבוקי הסרום. בניסיונות ראשוניים במהלך פיתוח פרוטוקול, נעשה שימוש בבקבוקי סרום 125 מ"ל. עם זאת, השימוש בבקבוקי סרום 500 מ"ל (המאפשר מרחב ראש של 475 מ"ל ליחס תרבית של 25 מ"ל) אפשר את תחזוקת הריכוז הרצוי עד 24 שעות, ובכך הפחית את תדירות התזת החמצן. גישה זו מייצרת תנאי חמצן נפרדים, ובכך מאפשרת את התרבות בו זמנית של דגימות מטופלים שונות על פני תנאי חמצן מרובים. כלים אחרים מתרבות אנאירובי ניתן למנף לתרבות היפרוקסית, כולל שימוש בצנצנות אנאירוביות או צינורות מסוג Balch מפוצצים בחמצן. ניתוחים של קהילות מיקרוביאליות ריאות באמצעות ריצוף metagenomics מצביעים על כך מגוון אלפא ובטא הכולל דומים בין כיח תרבותי ולא תרבותי. בעת הערכת השפע הדיפרנציאלי ברמת המינים, פולחן ב 21% חמצן, מועשר לצמיחה של אירובים ואנרובים פקולטיים, כולל Enterobacterale, סטרפטוקוקוס ופטריות. זה ככל הנראה בשל הדרה של מצב אנאירובי אשר נצפתה דרכי הנשימה של pwCF25,26. מחקרים עתידיים יכולים לשקול את הכללת גז החנקן במודל זה כדי לחקור מגוון של תנאים אנאוקסיים ואוקסיים ומיקרוביוטה אירובית ואנאירובית מקבילה שנמצאה בקהילות מיקרוביות דרכי הנשימה.
העקרונות המרכזיים המתוארים בפרוטוקולים אלה עשויים להיות מאלפים להתנהלות מחקרים דומים הקשורים להשפעת חמצן על קהילות מיקרוביות מורכבות או פתוגנים נפוצים של ריאות. חמצן הוא הטיפול הנפוץ ביותר המשמש לטיפול בכל מחלות הריאות המתקדמות, והבנה טובה יותר של האופן שבו הוא עלול להוביל להשפעות בלתי צפויות על קהילות מיקרוביות בדרכי הנשימה ופתוגנים נשימתיים נפוצים תהיה חשובה לטיפול ב- pwCF ובמחלות ריאות כרוניות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
חלק מעבודה זו בוצע במעבדה הביולוגית הימית בתמיכת המעבדה הביולוגית הימית, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (מספר מענק 5600373) ומתנה מקרן סימונס.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
| Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
| Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
| Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
| Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
| FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
| Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
| Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
| Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
| Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
| In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
| Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
| Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
| Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
| LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
| Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
| Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
| MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
| MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
| Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
| Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
| NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
| Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
| Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
| PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
| Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
| PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
| PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
| Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
| Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
| Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
| Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
| Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
| Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
| Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
| Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
| Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
| Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
| Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
| USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
| USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |
References
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).
- Acosta, N., et al. Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis. Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).
- Muhlebach, M. S., et al. Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).
- Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).
- Ramos, K. J., et al. Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States. Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).
- Ramos, K. J., et al. Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).
- Girardis, M., et al. Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial. JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).
- Comstock, W. J., et al. The WinCF model - An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532 (2017).
- Diraviam Dinesh, S.
- Kirchner, S., et al. Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).
- Grandjean Lapierre, S., et al. Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study. Medicine. 96 (47), Baltimore. 8423 (2017).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study. PLoS One. 10 (3), 0119938 (2015).
- Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).
- Gallagher, T., et al. Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).
- Voynow, J. A., Rubin, B. K.
- Sui, H. Y., et al. Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing. Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).
- McIver, L. J., et al. bioBakery: a meta'omic analysis environment. Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).
- Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).
- Stammler, F., et al. Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria. Microbiome. 4 (1), 28 (2016).
- Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy. American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).
- Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities. Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).
- Tunney, M. M., et al. Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).
