Summary
Fettsyra β-oxidation är en viktig metabolisk väg som är ansvarig för att generera energi i många olika celltyper, inklusive hepatocyter. Här beskriver vi en metod för att mäta fettsyra β-oxidation i nyisolerade primära hepatocyter med 14C-märkt palmitinsyra.
Abstract
Fettsyra β-oxidation är en viktig metabolisk väg för att möta leverns energibehov och tillhandahålla substrat och kofaktorer för ytterligare processer, såsom ketogenes och glukoneogenes, som är väsentliga för att upprätthålla hela kroppens glukoshomeostas och stödja extra-hepatisk organfunktion i fastande tillstånd. Fettsyra β-oxidation sker inom mitokondrierna och peroxisomerna och regleras genom flera mekanismer, inklusive upptag och aktivering av fettsyror, enzymuttrycksnivåer och tillgänglighet av kofaktorer såsom koenzym A och NAD+. I analyser som mäter fettsyra β-oxidation i leverhomogenater maskerar celllys och den vanliga tillsatsen av suprafysiologiska nivåer av kofaktorer effekterna av dessa regleringsmekanismer. Dessutom är organellernas integritet i homogenaten svår att kontrollera och kan variera avsevärt mellan beredningarna. Mätningen av fettsyra β-oxidation i intakta primära hepatocyter övervinner ovanstående fallgropar. Detta protokoll beskriver en metod för mätning av fettsyra β-oxidation i en suspension av nyligen isolerade primära mushepatocyter inkuberade med 14C-märkt palmitinsyra. Genom att undvika timmar till dagar av kultur har denna metod fördelen att bättre bevara proteinuttrycksnivåerna och metaboliska vägaktiviteten hos den ursprungliga levern, inklusive aktivering av fettsyra β-oxidation observerad i hepatocyter isolerade från fastande möss jämfört med matade möss.
Introduction
Fettsyra β-oxidation är en viktig process i lipidmetabolism, vilket ger en katabol väg för att balansera fettsyrasyntes och intag från kosten. Denna process genererar energi för flera organ, inklusive hjärtmuskeln, njurbarken och fastande lever, och använder fettsyror erhållna från kosten, fettvävnadslipolys och inre triglyceridlager 1,2.
Oxidation av fettsyra genom β-oxidationsvägen resulterar i sekventiell förkortning av fettacylkedjan med två kol i taget, frisatt som acetyl-CoA, och denna process sker både i mitokondrierna och peroxisomerna. Medan de flesta fettsyror endast genomgår β oxidation, oxideras vissa vid olika kol innan de går in i denna väg. Till exempel genomgår 3-metylsubstituerade fettsyror, såsom fytansyra, avlägsnande av ett kol genom α-oxidation i peroxisomerna innan de går in i β-oxidationsvägen. På liknande sätt omvandlas vissa fettsyror först till dikarboxylfettsyror genom oxidation av den terminala metylgruppen (ω-oxidation) i endoplasmatisk retikulum innan de företrädesvis oxideras i peroxisomerna genom β-oxidation3.
Oavsett den specifika organellen måste en fettsyra först omvandlas till ett koenzym A (CoA) tioester, eller acyl-CoA, för att oxideras genom β-oxidationsvägen. β-oxidation av långkedjiga acyl-CoAs i mitokondriell matris kräver karnitinskytteln för deras translokation, där karnitinpalmityltransferas 1 (CPT1) katalyserar omvandlingen av acyl-CoAs till acylkarnitiner och är det hastighetsbegränsande enzymet i denna process4. När de väl har translokerats till mitokondriell matris ombildas acyl-CoA och fungerar som substrat för mitokondriella β-oxidationsmaskineriet. I fastande tillstånd kanaliseras acetyl-CoA som produceras genom β-oxidation i hepatiska mitokondrier primärt till ketogenes. Peroxisomer fungerar som den primära platsen för β-oxidation av mycket långkedjiga, grenade kedjor och dikarboxylfettsyror. Peroxisomer kräver inte att karnitinskytteln importerar fettsyrasubstrat, utan importerar korrespondenten acyl-CoAs genom aktiviteten hos ATP-bindande kassetttransportörer ABCD1-35. Inom peroxisomerna oxideras acyl-CoAs sedan av en dedikerad uppsättning enzymer, som skiljer sig från mitokondriell fettsyra β-oxidationsmaskineriet. Både mitokondrier och peroxisomer kräver också en tillförsel av NAD+ och fri CoA för att oxidera fettacylkedjor. CoA-nivåer i levern har visat sig öka som svar på fasta, stödja den ökade hastigheten av fettsyra oxidation som sker i detta tillstånd6. Dessutom resulterar ökad CoA-nedbrytning i peroxisomerna i en selektiv minskning av peroxisomal fettsyraoxidation7. Därför regleras processen med fettsyraoxidation i cellen av uttrycksnivåer och aktiviteter hos enzymer som är involverade i aktivering, transport och oxidation av fettsyror, liksom koncentrationerna av kofaktorer och andra metaboliter genom flera subcellulära fack.
Procedurer som använder vävnadshomogenater för att mäta fettsyraoxidation förstör den cellulära arkitekturen som reglerar och stöder denna process, vilket leder till en insamling av data som inte korrekt återspeglar in vivo-metabolismen. Medan tekniker som använder pläterade primära hepatocyter bevarar detta system, resulterar odling av isolerade celler under längre tidsperioder i en förlust av den in vivo-genuttrycksprofil som fanns i cellerna när de fortfarande levde i djuret 8,9. Följande protokoll beskriver en metod för att isolera primära hepatocyter och analysera deras kapacitet för fettsyra β-oxidation omedelbart efter isolering och suspension, med användning av [1-14C] palmitinsyra. Analysen är baserad på mätningen av radioaktiviteten associerad med de syralösliga metaboliterna (ASM) eller produkter, som acetyl-CoA, som produceras genom β-oxidation av [1-14C] palmitinsyra10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer på möss (C57BL / 6J, män, 9-11 veckors ålder) godkändes av Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) vid West Virginia University.
1. Hepatocytisolering
- Förberedelse
- Under dagarna före hepatocytisoleringen, förbered de buffertar och cellodlingsmedier som anges i tabell 1. Ställ in ett vattenbad med temperaturen inställd på 37 °C nära den plats där operationen ska utföras.
- På dagen för hepatocytisoleringen, under en laminär flödeshuv, överför 35 ml buffert 1 till ett sterilt 50 ml centrifugrör och 70 ml buffert 2 till en 100 ml steril bägare eller flaska.
- Tillsätt antibiotika gentamicin (50 μg/ml) och penicillin/streptomycin (1x) till båda buffertarna.
- Överför 20 ml buffert 2 enligt beredning i steg 1.1.3 till en 100 mm cellodlingsskål och lägg på is.
- Överför de återstående 50 ml buffert 2 till ett sterilt 50 ml centrifugrör. Placera de 50 ml rör som innehåller de antibiotikakompletterade buffertrarna 1 och 2 i ett vattenbad inställt på 37 °C och låt dem värmas upp i minst 15 minuter innan perfusionen påbörjas.
OBS: Om du utför flera hepatocyterisoleringar i en session, skala upp antalet antibiotikakompletterade alikvoter av buffertar 1 och 2 för att förbereda därefter. - Tina en alikvot kollagenaslösning och håll på is.
OBS: Om det förvaras korrekt finns det ingen signifikant förlust av enzymaktivitet i kollagenaslösningar som frysts och tinats upp till 3 gånger och använts inom 3 veckor från beredningen. - Förbered de kirurgiska instrumenten och peristaltisk pump. Sterilisera linjerna i den peristaltiska pumpen genom att cirkulera 15 ml 70% etanol, följt av 15 ml sterilt vatten.
- Anslut en 22 G nål till utgångsledningen (bild 1A). Det ihåliga filtret på en kateter fungerar bra som kontakt. Fyll linjerna med buffert 1 och inspektera ledningarna, kontakten och nålen för att säkerställa att inga luftbubblor fångas.
Figur 1: Perfusionsapparat och perfuserad lever. (B) Framgångsrik kannulering indikeras genom omedelbar och homogen blanchering av levern. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Leverperfusion och dissociation
- Bedöva en mus via isofluraninhalation med luft av medicinsk kvalitet som bärgas, med 4% isofluran för induktion och 1,5% isofluran för att upprätthålla anestesi. Verifiera anestesidjupet genom att bedöma förlusten av pedalreflex.
- När det inte finns något svar på tåknipning, placera musen i ryggläge på en operationsbräda, sträck ut lemmarna och säkra dem på brädet med stift.
- Spraya rikligt buken och bröstet på musen med 70% etanol.
- Dra upp huden och bukväggen nära bukväggen med hjälp av pincett och skär i sidled, på vardera sidan av mittlinjen och upp till membranet, för att exponera organen.
- Exponera den underlägsna vena cava (IVC) genom att flytta tarmarna till höger sida och försiktigt vända upp leverloberna. Sätt i ett litet cylindriskt föremål, t.ex. ett nålskydd, under musens baksida för att luta IVC något och underlätta dess kannulering (figur 1B).
- Starta pumpen med lägsta hastighet och sätt in nålen i IVC med buffert 1 flytande.
- Skär portalvenen för att lindra trycket och möjliggöra dränering av blod- och perfusionsbuffertar och öka sedan omedelbart flödeshastigheten till 7 ml / min. Om det görs korrekt kommer levern att blanchera jämnt inom några sekunder (figur 1B).
- För mer konsekventa resultat, håll nålen på plats för hand under hela perfusionsperioden.
- Perfuse levern med varm buffert 1. För att undvika att luftbubblor införs, se till att linjen som sätts in i röret som innehåller buffert 1 förblir kontinuerligt nedsänkt.
- Medan perfusion inträffar, tillsätt 130 μL kollagenaslösning till buffert 2 och blanda genom pipettering upp och ner eller omrörning med en 5 ml eller 10 ml serologisk pipett.
- Eftersom volymen i röret som innehåller buffert 1 minskar till cirka 5 ml, tillsätt långsamt 5 ml buffert 2 till buffert 1 genom pipettering på sidan av röret. Målet är att undvika att införa luftbubblor i linjen samtidigt som man byter från buffert 1 till buffert 2.
- Vänta tills volymen minskar igen till 5 ml och tillsätt långsamt ytterligare 5 ml buffert 2. Upprepa en gång till. När buffert 2 ersätter buffert 1 och dissociationen börjar kommer levern att svälla.
- Tillsätt den återstående bufferten 2 till röret som ursprungligen innehöll buffert 1. Stoppa perfusionen när det finns cirka 5-10 ml buffert 2 kvar i röret.
OBS: Medan buffert 2 genomsyrar levern kan portalvenen ibland klämmas fast med pincett i 5 s. Detta steg är valfritt, men den resulterande ökningen av trycket i hela levern kan förbättra dess dissociation och därmed det slutliga hepatocytutbytet. - Skär försiktigt ut levern och överför den till 100 mm odlingsskål som innehåller 20 ml iskall buffert 2 som avsatts i steg 1.1.4.
- Under den laminära flödeshuven, bryt försiktigt levern isär med kirurgisk sax och pincett.
- Tillsätt cirka 20 ml iskall M199 till hepatocytsuspensionen och filtrera den genom en 100 μm cellsil med hjälp av kolven på en spruta för att försiktigt främja frisättningen av ytterligare hepatocyter från större leverbitar.
- Tvätta 100 mm odlingsskålen och cellsilen med ytterligare M199 tills uppsamlingsröret är fullt.
- Centrifugera suspensionen vid 50 x g i 2 min vid 4 °C. Aspirera försiktigt supernatanten och återsuspendera försiktigt hepatocytpelleten i 30 ml kall M199 genom att virvla.
- Pelletera hepatocyterna enligt beskrivningen i steg 1.2.18. Upprepa tvätten en gång till.
- Resuspendera hepatocyterna i 10 ml varm M199 och bestäm livskraften och utbytet med hjälp av trypanblå exkluderingsmetoden och en hemocytometer12.
- Späd cellerna i M199 uppvärmda till 37 ºC till en slutlig koncentration av 1,0 x 106 livskraftiga celler/ml och starta omedelbart analysen.
2. Fettsyra β-oxidationsanalys
OBS: Analysen utförs i tre exemplar och varje reaktionsblandning innehåller 750 000 celler, 1,35 mg/ml bovint serumalbumin (BSA), 100 μM palmitinsyra och 0,4 μCi [1-14C]palmitinsyra i en slutlig volym på 2 ml.
VARNING: Radioaktiva föreningar är farliga. Köp, hantera, lagra och bortskaffa radioaktivt material i enlighet med institutionella, statliga och federala bestämmelser.
- Förberedelse
- Under dagarna före analysen, förbered palmitinsyra- och BSA-lösningarna (tabell 1) och förvara dem vid -20 °C.
- På analysdagen, slutför steg 2.1.3-2.1.9 innan du börjar leverperfusionen.
- Tina palmitinsyra- och BSA-lösningarna. Förbered substratblandningen för flera reaktioner plus ett överskott på 20%-30%, med en typisk analysinställning som visas i tabell 2.
- Alikvot 13,5 μl BSA-lösning per reaktion i ett mikrocentrifugrör och värm till 41 °C, tillsätt sedan 1 μl av 200 mM palmitinsyralösning (BSA: molförhållande för palmitinsyra = 1:5) per reaktion.
OBS: Det är att föredra att dispensera lösningar framställda med organiska lösningsmedel, såsom radioaktiva och icke-radioaktiva palmitinsyralösningar, med en positiv förskjutningspipett och lämpliga spetsar. - Virvel kraftigt och inkubera vid 41 °C för att underlätta bildandet av den lösliga palmitinsyran: BSA-komplex. Virvel ibland under inkubationsperioden.
- Blandningen kommer inledningsvis att verka grumlig men kommer att klargöras helt efter 20-30 minuters inkubation vid 41 °C. Förvara den vid 41 °C tills den är klar att starta reaktionerna.
- Alikvot 133 μl 1 M perklorsyra i 1,5 ml mikrocentrifugrör för att stoppa reaktionerna.
VARNING: Perklorsyra är en stark syra och en stark oxidant. Lämplig skyddsutrustning krävs för hantering av denna förening. - Alikvot 485,5 μL M199 per reaktion i ett rör och håll det vid 37 °C för att späda ut det radioaktiva BSA: palmitinsyrakomplex framställt i steg 2.1.4-2.1.6 innan reaktionerna påbörjas.
- Dispensera 750 μL M199 i lika många 14 ml rundbottenrör som proverna. Om så önskas, lägg till hämmare av fettsyra β-oxidation, såsom etomoxir, rotenon och antimycin, inklusive en vehikelkontroll (tabell 2).
- Under hepatocyttvättstegen, 10-15 minuter innan reaktionerna påbörjas, överför rören som förberetts i steg 2.1.9 till ett skakningsbad inställt på 37 °C och skaka vid 180-200 rpm.
- Starta, stoppa och analysera fettsyran β-oxidationsreaktioner
- Om hepatocyternas livskraft är acceptabel (vanligtvis ≥ 75%, figur 2), överför du för varje reaktion 0,8 μl [1-14 C] palmitinsyra (0,5 mCi / ml) till mikrocentrifugröret som innehåller den klarade BSA: palmitinsyralösning (steg 2.1.4-2.1.6). Virvel och återgå till vattenbadet vid 41 °C.
- För att balansera hepatocyterna till 37 °C och förinkubera dem med hämmare (om sådana finns), omedelbart efter den slutliga hepatocytåtersuspensionen (steg 1.2.21), överför 750 μL av hepatocytsuspensionen med en 1 ml pipett till vart och ett av de 14 ml rundbottenrören i skakningsbadet (steg 2.1.9-2.1.10) och virvel kort med låg hastighet för att blanda.
- Förskjut varje tillsats med 30 s och inkubera i 15 min. För att spara ett prov för proteinbestämning, överför en annan alikvot av hepatocyter till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och snurra vid 3 000 x g i 5 minuter.
OBS: Under doseringen måste hepatocytsuspensionen kontinuerligt virvlas eller försiktigt omröras med doseringspipetten på 1 ml för att förhindra sedimentering och stor variation i cellantal över prover. - Ta bort supernatanten och förvara pelleten vid -80 °C tills den är klar att mäta den totala mängden protein i provet för att normalisera resultaten (figur 3).
- Medan hepatocyterna är under förinkubation vid 37 °C, tillsätt det radioaktiva BSA: palmitinsyrakomplexet till det varma mediet i 2.1.8 och håll vid 37 °C tills reaktionerna är redo att starta. Detta är den slutliga substratblandningen.
- För att starta reaktionerna, ta bort hepatocyterna från vattenbadet och tillsätt 500 μL substratblandning.
- Virvel med låg hastighet i 5 s för att helt återsuspendera cellerna och återgå till vattenbadet. Upprepa med alla prover, svindlande med 30 s.
- Inkubera i 15 min. Starta en uppsättning reaktioner och stoppa omedelbart (se steg 2.2.10-2.2.11) för att bestämma bakgrundsradioaktiviteten (tabell 2).
- Överför dubbla alikvoter (200–250 μl) av den kvarvarande substratblandningen till 6 ml scintillationsflaskor och lägg åt sidan för räkning. Använd dessa räkningar för att beräkna radioaktiviteten som motsvarar de totala nmolerna av palmitinsyra som är tillgängliga för oxidation i 500 μL substratblandning.
- För att stoppa reaktionerna, ta bort hepatocytocyterna från vattenbadet, återsuspendera hepatocyterna genom virvel med måttlig hastighet och överför sedan 400 μL av hepatocytsuspensionen till mikrocentrifugrören innehållande perklorsyra.
- Täck omedelbart rören. Upprepa denna sekvens för alla prover, svindlande med 30 s.
- Virvla kraftigt 1,5 ml mikrocentrifugrören och snurra dem ner i 1,5 ml mikrocentrifugrör vid 13 000 x g i 10 minuter.
- Överför 300 μL av supernatanten till en 6 ml scintillationsflaska, tillsätt 4 ml scintillationsvätska och räkna radioaktiviteten i proverna och substratblandnings alikvoterna (steg 2.2.9) i en scintillationsräknare.
VARNING: Efter centrifugering, öppna rören under en dragskåp för att undvika att andas in 14C-CO2 som produceras genom fullständig oxidation av 14C-acetyl-CoA som genereras av fettsyra β-oxidation och frigörs av de sura förhållandena.
| Buffertar/mediekomponenter | Belopp | Slutlig koncentration | Instruktioner |
| Lösning C | |||
| KCl | 1,79 g | 480 mM | Tillsätt vatten till 50 ml. Förvaras vid 4 °C |
| MgSO4 heptahydrat | 1,48 g | 120 mM | |
| KH2PO4 | 0,81 g | 119 mM | |
| Krebs-Henseleit Buffer (KHB), kalciumfri | |||
| NaCl | 7,0 g | 120 mM | Tillsätt vatten till 900 ml, justera pH till 7,4 och bringa den slutliga volymen till 1 L. Förvaras vid 4 °C |
| NaHCO3 | 2,0 g | 24 mM | |
| 1 M HEPES pH 7,45 | 5 ml | 5 mM | |
| Glukos | 1 eller 2 g | 5,6 eller 11 mM | |
| Lösning C | 10 ml | ||
| Buffert 1 | |||
| Khb | 500 ml | Blanda komponenter och filtrera sterilisera. Förvaras vid 4 °C | |
| 50 mM EGTS | 1,0 ml | 0,1 mM | |
| Buffert 2 | |||
| Khb | 500 ml | Blanda komponenter och filtrera sterilisera. Förvaras vid 4 °C | |
| 1 M CaCl2 dihydrat | 686 μl | 1,4 mM | |
| Gentamicin lösning | |||
| Gentamicinsulfat | 0,5 g | 50 mg/ml | Tillsätt vatten till 10 ml och filtrera sterilisera. Alikvot och förvaras vid -20 °C |
| Kollagenas lösning | |||
| Kollagenas I och II blandning | 10 mg | 7 mg/ml | Lös upp hela innehållet i injektionsflaskan i 1,43 ml vatten. Alikvot och förvaras vid -20 °C |
| M199 | |||
| M199 | 1 påse | Tillsätt vatten till 900 ml och justera pH till 7,2-7,4. Ta den slutliga volymen till 1 liter och filtrera sterilisera. Förvaras vid 4 °C | |
| NaHCO3 | 2,2 g | 26 mM | |
| 1 M HEPES (cellodlingskvalitet) | 25 ml | 25 mM | |
| Extra glukos (endast för matade möss) | 1 g | 11 mM | |
| BSA-lösning | |||
| Fettsyrafri BSA | 400 mg | 20 % (vikt/volym) | Lös upp i 2 ml vatten. Alikvot och förvaras vid -20 °C |
| Icke-radioaktiv palmitinsyralösning | |||
| Palmitinsyra | 103 mg | 200 mM | Lös upp i 2 ml etanol, förvaras vid -20 °C |
| 1 M perklorsyra | |||
| 70% perklorsyra | 3,5 ml | 1 M | Späd till 40 ml med vatten. Förvaras i rumstemperatur |
Tabell 1: Buffertar, media och andra lösningar som krävs för hepatocytisolering och fettsyra β-oxidationsanalys
| Reaktionsnummer | M199 ±-hämmare | Hepatocytsuspension (μl) | Substratblandning (μl) | ||||
| Volym (μl) | Etomoxir | ||||||
| 1 | 750 | - | Förvarm vid 37 °C | 750 | Förinkubera vid 37 °C i 15 minuter | 500 | Inkubera vid 37 °C i 15 min |
| 2 | |||||||
| 3 | |||||||
| 4 | + | ||||||
| 5 | |||||||
| 6 | |||||||
| 7 | + | Sluta omedelbart | |||||
| 8 | |||||||
| 9 | |||||||
Tabell 2: Exempel på experimentell uppställning för en hepatocytsuspension som analyserats i tre exemplar i närvaro och frånvaro av etomoxir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den leverperfusion som beskrivs här ger vanligtvis 30-40 miljoner celler/lever med en genomsnittlig livskraft på 80%, enligt uppskattning av trypan blue exclusion (Figur 2). Den typiska koncentrationen av glukos i Krebs-Henseleit-bufferten (KHB), som används för att framställa perfusionsbuffertarna 1 och 2, är 11 mM. Vid mätning av fettsyra β-oxidation i hepatocyter isolerade från fastande möss kan koncentrationen av glukos i KHB sänkas för att bättre representera det fasta tillståndet. Som visas i figur 2 har sänkning av glukoskoncentrationen till 5,6 mM ingen negativ effekt på hepatocyternas utbyte eller livskraft.
Tabell 2 visar en typisk experimentell inställning för en hepatocytsuspension som analyseras i tre exemplar i närvaro och frånvaro av etomoxir, en potent hämmare av CPT1 och därmed mitokondriell fettsyraoxidation10,13. I närvaro av denna eller andra hämmare av mitokondriell fettsyraoxidation kan alla kvarvarande 14C-märkta produkter som genereras av [1-14C] palmitinsyraoxidation tillskrivas den första cykeln av β-oxidation i peroxisomerna. Således kan bidraget från mitokondriell fettsyraoxidation till total fettsyra β-oxidation beräknas som skillnaden mellan total (-etomoxir) och peroxisomal (+ etomoxir) fettsyraoxidation 7,14,15 (Figur 3).
För hepatocyter finns mer än 95% av radioaktiviteten associerad med produkterna från β-oxidation av [1-14C] palmitinsyra i ASM, och resten frigörs som 14C-CO210. Antalet per minut (CPM) associerat med bakgrundsradioaktiviteten varierar med satsen [1-14C] palmitinsyra. De är emellertid fortfarande signifikant lägre än CPM erhållen i prover som får inkubera med substratblandningen i 15 minuter (figur 3A). Som förväntat visar hepatocyter isolerade från fastande möss en robust ökning av hastigheterna för både mitokondriell och peroxisomal fettsyra β-oxidation, i överensstämmelse med den kända aktiveringen av dessa vägar 16,17,18,19.
Figur 2: Viabilitet och utbyte av hepatocyter isolerade med hjälp av det förfarande som beskrivs häri. Hepatocyter isolerades från hanmöss som matades ad libitum eller fastade över natten i 16-18 timmar, med fri tillgång till vatten. (A) Hepatocytviabilitet och (B) avkastning per lever. Data rapporteras som medelvärdet (staplarna) av mätningar på enskilda hepatocytpreparat (cirklar) ± SEM. * p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Fettsyra β-oxidationskapacitet i hepatocyter isolerade från utfodrade och fastande hanmöss och analyserade i suspension. Nyligen isolerade hepatocyter förinkuberades med etomoxir (45 μM, +Eto) eller DMSO (vehikel, -Eto) före tillsats av substratblandningen. (A) Total CPM som introduceras i varje analys och återvinns i ASM-fraktionen av reaktioner som ställts in för att uppskatta bakgrundsradioaktiviteten, total (-Eto), peroxisomal (+ Eto) och mitokondriell fettsyra β-oxidation. Dessa data visas innan någon korrigering (för bakgrund, cellnummer eller proteinnivåer) eller andra beräkningar tillämpades. (B) Data i (A) korrigerade för bakgrunden, den totala volymen av analysen, normaliserad till 1 miljon livskraftiga celler och uttryckt som den hastighet med vilken palmitinsyra oxideras i hepatocyter isolerade från matade och fastande möss. C) Totalt protein motsvarande de uppskattningsvis 750 000 använda hepatocyterna/halterna. (D) Data i (A) korrigerade som i (B) men normaliserade till mg protein. Data rapporteras som medelvärdet (staplarna) av mätningar på enskilda hepatocytpreparat (cirklar) ± SEM. * p < 0,05; ** p < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under leverperfusionen är det viktigt att undvika införandet av luftbubblor, eftersom de blockerar mikrokapillärerna i levern, förhindrar eller begränsar buffertcirkulationen och totalt sett minskar hepatocytutbytet och livskraften20,21. Försiktighetsåtgärder, såsom att noggrant inspektera den buffertfyllda inloppsledningen före kannulering av IVC och undvika att lyfta inloppsledningen från röret som innehåller buffert 1 för att växla till buffert 2, som beskrivs häri, kan framgångsrikt minska antalet misslyckade perfusioner (livskraft <70%). Användningen av bubbelfällor i perfusionssystemet kan också avsevärt minska denna risk20,21.
Kollagenasaktiviteten är en annan kritisk parameter för isolering av hepatocyter, vilket historiskt sett kräver testning och optimering av varje ny sats som förvärvas12,20. Användningen av en högrenad och definierad blandning av kollagenaser minskar dramatiskt batch-till-batch-variationen, vilket eliminerar behovet av att testa varje ny sats. När dessa blandningar används är dessutom små justeringar i den använda volymen (±10-20 μl) vanligtvis tillräckliga för att återställa höga utbyten eller livskraft hos hepatocytpreparaten.
Hepatocyter är känsliga celler. Alla resuspensions- och dispenseringssteg bör göras försiktigt genom att virvla eller pipettera långsamt för att minska skjuvskador och lys. Användningen av bredborrade spetsar kan också ytterligare minimera hepatocytskador. Virveltagning vid steg 2.2.2 och 2.2.7 i testet bör göras med lägsta möjliga inställning som fortfarande säkerställer god blandning av komponenterna.
Jämfört med traditionella protokoll 20,21,22 är en av de största förändringarna som införts i hepatocytisoleringsproceduren som beskrivs här ersättningen av intravenös kateterinsättning och ligering med införandet av en hypodermisk nål som hålls på plats av operatören. Denna modifiering ger två huvudfördelar. För det första minskar risken för att införa luftbubblor vid anslutning av änden av den intravenösa katetern till linjen, eftersom bufferten redan flyter när den hypodermiska nålen sätts in i IVC. För det andra minskar risken för perforering av IVC under manipuleringar av katetern, såsom indragning av nålen eller dess säkring med suturer. En av nackdelarna med denna modifiering är att det vanligtvis är nödvändigt att hålla nålen på plats för hand under perfusionens varaktighet för att säkerställa procedurens konsekventa framgång. Detta kan vara tröttsamt för den person som utför operationen och kan begränsa antalet på varandra följande perfusioner som kan göras under en session. För att begränsa rörelserna hos den person som håller nålen, vilket kan orsaka oavsiktlig perforering av IVC, är det lämpligt att arbeta i par, med en person som utför operationen och en annan person som ändrar perfusionsbuffertarna utan avbrott i perfusionen. Flera rygg-mot-rygg-perfusioner skulle kräva att en tredje person startar fettsyran β-oxidationsanalys inom 1-2 minuter efter varje avslutad hepatocytisolering.
I likhet med andra hepatocytisoleringsmetoder ger proceduren som beskrivs här hepatocyter som kan användas i suspension eller i odling för att bedöma en mängd andra leverprocesser, inklusive ytterligare metaboliska vägar och förändringar i genuttryck på grund av olika behandlingar 23,24,25. För att odla hepatocyterna kan steg 1.2.20-1.2.21 enkelt modifieras genom att återsuspera cellerna i lämpligt medium, följt av plätering i cellodlingsrätter och inkubation 20,22,26. Dessutom, även om det inte krävs för β-oxidationsanalys, om det behövs av andra applikationer, kan andelen viabla hepatocyter ökas genom att avlägsna de döda cellerna genom ett Percoll-lager22,26.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll en robust analys för att mäta graden av fettsyra β-oxidation i intakta hepatocyter och utan tillsats av exogena kofaktorer, vilket bevarar de endogena regleringsmekanismerna för denna väg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-bidraget R35GM119528 till Roberta Leonardi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (R)-(+)-Etomoxir sodium salt | Tocris Bioscience | 4539/10 | |
| [1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL | American Radiolabeled Chemicals | ARC 0172A | |
| 1 M HEPES, sterile | Corning | 25060CI | |
| 10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette | Mettler Toledo | 17008604 | |
| 1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips | |||
| 5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes | |||
| 50 mL sterile centrifuge tubes | CellTreat | 229421 | |
| 70% Perchloric acid | Fisher Scientific | A2296-1LB | |
| BSA, fatty acid-free | Fisher Scientific | BP9704100 | |
| CaCl2 dihydrate | MilliporeSigma | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | |
| EGTA | Gold Biotechnology | E-217 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200CSPP | |
| Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, Sterile | CellTreat | 229707 | |
| Gentamicin sulphate | Gold Biotechnology | G-400-25 | |
| HDPE, 6.5 mL scintillation vials | Fisher Scientific | 03-342-3 | |
| Hemocytometer | |||
| Hypodermic needles 22 G, 1.5 in | BD Biosciences | 305156 | |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| KH2PO4 | MilliporeSigma | P5655 | |
| Liberase TM Research Grade | MilliporeSigma | 5401119001 | Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin |
| M199 medium | MilliporeSigma | M5017 | |
| MgSO4 heptahydrate | MilliporeSigma | M1880 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5980 | |
| NaCl | Chem-Impex International | 30070 | |
| NaHCO3 | Acros Organics | 424270010 | |
| Palmitic acid | MilliporeSigma | P0500 | |
| Penicillin/streptomycin (100x) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cytiva Life Sciences | SH30256.01 | |
| Positive displacement pipette MR-10, 10 µL | Mettler Toledo | 17008575 | |
| Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes | Eppendorf | 5810 R | |
| Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes | Fisher Scientific | 14-956-9A | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | TriCarb 4810 TR | |
| ScintiVerse BD cocktail | Fisher Scientific | SX18-4 | |
| Shaking water bath, 30 L capacity | New Brunswick Scientific | Model G76 | |
| Sterile cell strainers, 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Thumb Dressing Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | RS-8120 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Variable-flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 138762 | |
| Water baths, 2–2.5 L capacity |
References
- Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E.
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).
- Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation. Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).
- Kerner, J., Hoppel, C. Fatty acid import into mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).
- Baker, A., et al. Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).
- Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PloS One. 5 (6), 11107 (2010).
- Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).
- Richert, L., et al. Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).
- Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture. Clinical Chemistry. 30 (12), Pt 1 2053-2058 (1984).
- Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures. Biochemical Journal. 323, Pt 1 119-122 (1997).
- Consitt, L. A., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals. Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615 (2013).
- Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases. Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs. Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets. Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).
- Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).
- Hakvoort, T. B., et al. Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).
- Sokolovic, M., et al. The transcriptomic signature of fasting murine liver. BMC Genomics. 9, 528 (2008).
- Kersten, S., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting. Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Ng, I. C., et al. Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289 (2021).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
- Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).
- Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).
- Bougarne, N., et al. PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).
