Summary
このプロクトーコルは、アストロサイトおよびニューロン におけるインビトロ および インビボ ミトコンドリアCa2+ イメージングの方法を提供することを目的としています。
Abstract
ミトコンドリアCa2+は、細胞質Ca2+緩衝、エネルギー代謝、細胞シグナル伝達を制御する上で重要な役割を果たしています。ミトコンドリアCa2+の過負荷は、神経変性および神経疾患におけるアポトーシス細胞死を含む様々な病理学的状態に寄与する。ここでは、インビトロおよびインビボのアストロサイトおよびニューロンにおけるミトコンドリアCa2+イメージングに対する細胞型特異的およびミトコンドリア標的分子アプローチを提示する。ミトコンドリア標的化遺伝子組み換えCa2+指標(GECIs)GCaMP5GまたはGCaMP6s(GCaMP5G/6s)をコードするDNAプラスミドをアストロサイトおよびニューロン特異的プロモーターgfaABC1DおよびCaMKIIおよびミトコンドリアターゲティング配列(ミトコンドリア標的配列)で構築した。インビトロミトコンドリアCa2+イメージングでは、PMIDを培養したアストロサイトおよびニューロンにトランスフェクトしてGCaMP5G/6sを発現させた。インビボミトコンドリアCa2+イメージングでは、アデノ関連ウイルスベクター(AAV)を調製し、マウス脳に注入し、アストロサイトおよびニューロンのミトコンドリアでGCaMP5G/6sを発現させた。我々のアプローチは、細胞質とミトコンドリアCa2+シグナル伝達の関係を研究するために、アストロサイトとニューロンにおけるミトコンドリアCa2+ダイナミクスを画像化する有用な手段を提供する。
Introduction
ミトコンドリアは、細胞内の動的な小器官であり、エネルギー生産のための細胞大国と考えられています。一方、ミトコンドリアは、局所的または細胞質Ca2+上昇に応答して、母体にCa2+を取ることができます。ミトコンドリアCa2+取り込みは、三カルボン酸(TCA)サイクルおよび酸化リン酸化における反応などの代謝過程を含むミトコンドリア機能に影響を及ぼし、生理学的条件下でCa2+感受性タンパク質を調節する1、2、3、4。ミトコンドリアCa2+過負荷はまた、細胞死の決定要因であり、様々な脳障害における壊死およびアポトーシスを含む5、6、7。これは、ミトコンドリア透過性遷移細孔(mpPPs)の開口部とアポトーシス細胞死を開始するカスパーゼ補因子の放出を引き起こす。したがって、細胞生理学と病理をよりよく理解するために、生きている細胞におけるミトコンドリアCa2+のダイナミクスと取り扱いを研究することが重要です。
ミトコンドリアは、Ca2+取り込みと流出のバランスをとってマトリックスCa2+ホメオスタシスを維持します。ミトコンドリアCa2+取り込みは主にミトコンドリアCa2+ユニポーター(MCUs)によって媒介され、ミトコンドリアCa2+流出はNa+-Ca2+-Li+交換器(NCLX)とH+/Ca2+交換器(mHCXs)8によって媒介される。バランスは、Gタンパク質共役受容体(GPDR)9の刺激を通じて摂動することができる。ミトコンドリアCa2+ホメオスタシスも、不溶性xCa 2+-xPO4 x-xOH複合体8の形成によるミトコンドリア緩衝の影響を受ける。
細胞内およびミトコンドリア濃度の変化([Ca2+])は、蛍光または発光Ca2+指標によって評価することができる。標識へのCa2+結合はスペクトル修飾を引き起こし、生細胞でのリアルタイムでの自由な細胞[Ca2+]の記録を可能にする。現在、細胞内のCa2+の変化を監視するために、有機化学指標と遺伝的にコード化されたCa2+指標(GECI)の2種類のプローブが利用可能です。一般的に、異なるCa2+親和性(Kdに基づく)、スペクトル特性(励起および発光波長)、動的範囲、および感度が調査中の生物学的問題に対して利用可能である異なる変異体が利用可能である。多くの合成有機Ca2+指標が細胞質Ca2+イメージングに使用されていますが、ミトコンドリアCa2+イメージング用のミトコンドリアマトリックスに選択的にロードできるのはごくわずかですが、Rhod-2が最も広く使用されています(レビューでは10,11を参照)。しかし、Rhod-2 は、長い時間経過実験の間に漏れの大きな欠点があります。さらに、ミトコンドリア、他のオルガネラ、サイトゾルの間で分割され、異なるサブコンパートメントでの絶対測定が困難になります。対照的に、細胞型プロモーターおよび細胞内区画ターゲティング配列を用いることによって、GECIは、インビトロまたはインビボで細胞およびコンパートメント特異的なCa2+イメージング用の異なる細胞タイプおよび細胞下コンパートメントで発現することができる。単一波長蛍光強度ベースのGCaMP Ca2+指標は、最近、主要なGEIS12、13、14、15、16として登場しました。本稿では、アストロサイトおよびニューロンにおけるGCaMP5GおよびGCaMP6s(GCaMP5G/6s)のミトコンドリア標的化および細胞型特異的発現のプロトコルと、これらの細胞タイプにおけるミトコンドリアCa2+の取り込みについて説明する。このプロトコルを用いて、個々のミトコンドリアにおけるGCaMP6G/6sの発現が明らかにでき、そして単一ミトコンドリア分解能におけるCa2+取り込みは、インビトロおよびインビボのアストロサイトおよびニューロンにおいて達成することができる。
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Protocol
動物に関する手続きは、ミズーリ大学コロンビア校の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. DNAプラスミドの構築
注: インビトロ および インビボ イメージングでは、アストロサイトおよびニューロン特異的プロモーターおよびミトコンドリア標的配列を有するGCaMP5G/6sをコードするDNAプラスミドが構築される。
- ミトコンドリアマトリックス(MM)ターゲティングシーケンス(ミト-)ATGT CCGTCCCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGGGCTCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAG GATCCATTCG TTG17クローニング部位にエコRIとバムHIアデノ関連ウイルスの骨格内の(AAV)プラスミドpZac2.1は、アストロサイトgfaABC1DプロモーターまたはニューロンCaMKIIプロモーター18、19、20を含むプラスミドを得る。
- サブクローンGCaMP5G/6sをクローニング部位にBamH IとNot 1を上のプラスミドで、新しいプラスミドpZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6sおよびpZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6sのミトコンドリアインストロサイトおよび211ニューロンで遺伝子の遺伝子発現を標的とする。
- pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5GおよびpZac-CaMKII-mito-GCaMP6s DNAプラスミドを インビトロ 試験用トランスフェクション用に準備します(セクション2)。 インビボ 研究18 のためのニューロンのためのアストロサイトと血清型9のための血清型5でAAVベクターを生成する(セクション3)。
2. インビトロ ミトコンドリアCa2+ アストロサイトおよびニューロンにおけるイメージング
- E15-16胚18、22、23、24の皮質からP1新生児マウスおよび一次ニューロンの皮質から一次アストロサイトを調製し、10%の胎児ウシ血清(FBS)を含むダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)を使用して直径12mmのガラスカバーリップで培養する それぞれ。
- pZac-gfaABC1D-GCaMP6sおよびpZac-CaMKII-GCaMP5Gプラスミドを有するトランスフェクト成熟した星細胞およびニューロンは、脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いて、アストロサイトのミトコンドリアおよびGCaMP5GのミトコンドリアでGCaMP6を発現させる。各ウェルの細胞を0.5μgのDNAでトランスフェクトし、後で培地を6時間変更します。
注:アストロサイトとニューロンは、トランスフェクションの1〜2日後にイメージングする準備ができています。 - トランスフェクション後1~2日目 にインビトロ ミトコンドリアCa2+ イメージングを行う。
- アストロサイトまたはニューロンで培養したガラスのカバーリップを、蛍光または2つの光子顕微鏡下でPH-1灌流室に移します。
- ACSFで100 μM ATPで占星ミトコンドリアCa2+取り込みを刺激するか、100 μMグルタミン酸/10 μMグリシン20,25で神経細胞ミトコンドリアを刺激する(図2および図3)。
注: ACSF から ATP およびグルタミン酸/グリシン含有 ACSF へのソリューションの変更は、ALA-VM8 灌流システム21によって制御されます。溶液の変化の速度は弁を調節することによって1-2 mL/minで制御される。
3. 生体内 ミトコンドリアCa2+ アストロサイトおよびニューロンにおけるイメージング
- AAV製剤。
- セクション1で作成したDNAプラスミドを使用して、次の組換えアデノ関連ウイルス(rAAV)ベクターを調製する:rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5GおよびrAAV2/9-CaMKII-ミト-GCaMP6sベクター。
注:本実験では、血清型5のrAAVベクターを、細胞球中のミトコンドリアでGCaMP5Gを発現し、血清型9のrAAVベクターを作製し、細胞内のミトコンドリアでGCaMP6を発現するように調製した。
- セクション1で作成したDNAプラスミドを使用して、次の組換えアデノ関連ウイルス(rAAV)ベクターを調製する:rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5GおよびrAAV2/9-CaMKII-ミト-GCaMP6sベクター。
- 立体的なAAV注射。
- 3%イオブルランでマウスを麻酔します。
注:手術中の後、イオブルランレベルは2%に減少します。 - マウスが手術レベルの麻酔に達した後、尾とつま先のピンチによって決定されるように、手術部位、運動または体性感覚皮質の上に髪を剃り、毛トリマーで剃る。
- マウスステレオタックスデバイスにマウスを置き、ヘッドをイヤーバーで固定します。眼の軟膏を眼に適用して、手術中に保護します。手術中は、マウスの体温を37°Cに保つために加熱パッドを使用してください。
注:無菌の手順を使用して手術を行います。すべての外科用具は、オートクレーブまたはホットビード滅菌装置によって滅菌される必要があります。 - マウスを立体装置に取り付けた後、ヨウ素ベースのスクラブと70%エタノールを3回交互に頭皮を殺菌します。注射部位を露出させるために頭皮の正中線に切開を行います。
- ブレグマ・ラムダ軸で皮膚を切り開き、運動または体性感覚皮質の意図された注入位置に高速ドリルで〜1mmの直径のバリ穴を作成します。
- アデノ関連ウイルス(rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5Gベクター[1 x 1011 GC]またはrAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6sベクター[1 x 1011 GC])を含む33 Gハミルトン注射器を使用して、標的領域に最大1μLのウイルスを注入する。
注: たとえば、皮質ウイルスの配信の場合は、複数の手順で 2 つの深さでウイルス溶液を注入します。まず、針を硬膜から1mmの深さまで挿入し、脳が回復するために5分を許します。次に、マイクロシリンジポンプコントローラで制御されるハミルトンシリンジを使用して、針を~700 μmの深さまで移動し、500 nLの注入速度で500 nLのウイルス溶液を注入します。注射が完了したら、ウイルスが脳に拡散できるように5分間待ちます。次に、針を300μmの深さで第2の注入位置まで移動します。ここでは、さらに500nLのウイルス溶液を注入する。ウイルスが脳に拡散できるように10分待ちます。 - ティッシュ接着剤を使って頭皮と皮膚を閉じます。マウスは、加熱パッド上で回復してみましょう。回復後にマウスを動物施設に送り返す。
- 3%イオブルランでマウスを麻酔します。
- 頭蓋窓の内接および 生体内2光子(2-P)ミトコンドリアCa2+ 信号のイメージング。
注:頭蓋窓の移植は、運動または体性感覚皮質26、27、28、29の上にAAV注入の3週間後に行われます。カルプロフェン(10mg/kg)は、手術前に潜在的な痛みから救済を提供するために皮下注射される。頭蓋窓の外科処置はAAVの注入の外科プロシージャと同一であり、無菌状態で行われる。- 3%イオブルランでマウスを麻酔します。
注:これは最初の用量であり、後で手術のために2%に減らします。イメージングの際、ACSFに溶解した130mgケタミン/10mgのキシラジン/kg体重の腹腔内(IP)注射が麻酔に使用されます。 - マウスステレオタックスデバイスにマウスを置き、ヘッドをイヤーバーで固定します。眼科軟膏を目に適用する。手術中は、マウスの体温を37°Cに保つために加熱パッドを使用してください。
注:すべての外科用具は殺菌される必要がある。 - 頭皮の中線に長さ5〜8mmの切開を行い、はさみを使用して皮膚のフラップを取り除きます。
- 頭蓋骨が露出した後、ウイルス注入領域(すなわち、運動皮質または体性感覚皮質、 図1B)上の高速ドリルを使用して直径2.0〜3.0mmの開頭術を行う。まず、4つの小さな穴を作り、その後、穴を接続する円でドリルします。その後、鋭いはさみで骨を持ち上げて取り除き、取り除きます。露出した硬膜は頭蓋窓の突起のために取除くか、またはそのまま保つことができる。
- 透明なシリコーンを担い、直径3~5mmのガラスカバースリップを開きます。爪楊枝を使って頭蓋の窓を脳の表面にそっと押し込みます。次に、少量のシリコーン接着剤で縁を密封する。
注:または、シリコーンディスクの代わりに、1.2%低融点アガロースゲルは、カバーガラスと脳組織の間で使用することができます。 - 最後に、カバースリップの端を歯科用セメントで密封します。強い結合のために頭蓋窓の端にセメントをわずかに適用するように注意してください。歯科用セメントで、カスタムメイドの金属製ヘッドプレートを頭蓋骨に取り付けます。
メモ:金属板は、イメージングセッション中にマウスの頭部を2-P顕微鏡のステージに固定するために使用されます(図1C)。 - イメージング中に水浸漬のために頭蓋窓のカバースリップの上に0.5 mLのACSFソリューションを追加します。
- 脳の窓を通して910 nm波長のニューロンにおける星状細胞およびミトGCaMP6sのミト-GCaMP5Gのイメージングのin vivo 2-Pの時間経過を行う(図1C)、20、27。
注:イメージング中、マウスは生理学的温度を維持するために加熱パッド上にあります。マウスは、イメージングセッションが完了した直後に犠牲になります。 - 共局在化を決定する必要がある場合 には、インビボに スルフォホダミン101(SR101)を標識する。
- ステップ3.3.4の終わりに、100 μM SR101の100 μLを1-5分間皮質表面のACSFに塗布して下さい。
- ACSF で表面を洗い流して、非結合 SR101 を洗い流します。2-Pイメージングを使用して、星状細胞におけるmito-GCaMP5GおよびSR101の共標識は、45〜60分後に観察することができる(図4A)。
- 3%イオブルランでマウスを麻酔します。
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Representative Results
本研究の目的は、インビトロおよびインビボのアストロサイトおよびニューロンにおけるGECを用いたミトコンドリアCa2+シグナルを画像化する方法論を提供することであった。インビトロおよびインビボミトコンドリアCa2+イメージングの結果をここに提示する。
培養されたアストロサイトおよびニューロンにおけるインビトロミトコンドリアCa2+シグナル伝達
ミトコンドリアCa2+アストロサイトへの取り込みはATPアプリケーションによって引き出され、ニューロンにおけるミトコンドリアCa2+取り込みは、灌流系を介したグルタメートおよびグリシンの適用によって引き出すことができる。図2および図3は、GCaMP6sがそれぞれ、培養されたアストロサイトおよびGCaMP5Gでニューロンにおいて発現されていることを示す。アストロサイトにおけるミトコンドリアCa2+取り込みは、単一ミトコンドリア分解能を有する100 μM ATPによって引き出された(図2B-D)。ニューロンにおけるミトコンドリアCa2+取り込みは、100μMグルタミン酸および10μMグリシン(図3B-D)で単一のミトコンドリア分解能を有して引き出された。
ア ストロサイトおよびニューロンにおけるGCaMP5Gまたは6Sのミトコンドリア発現のインビボ2-Pイメージング
イメージングは、ウルティマ2-P顕微鏡システムを用いたアストロサイトおよびニューロンにおけるミトコンドリア蛍光シグナルのインビボ2-Pイメージングでのタイムラプスを収集することによって行われます。励起波長880-910nmを使用しています。図4は、マウス皮質におけるアストロサイトにおけるミトコンドリアにおけるGCaMP5Gの発現を示す。GCaMP5Gのアストロサイト特異的発現は、SR101と単一ミトコンドリア分解能(図4A)を用いたGR101の共局在化により確認され、個々のミトコンドリアにおける自発的なCa2+変化が観察される(図4B-E)。図5Aは、ニューロンマーカーNeuNと共局化した有糸GCaMP6sのニューロン特異的発現を示す。ニューロンにおけるミト-GCaMP6sの蛍光は、樹状突起におけるミトコンドリア形態を示す(図5B)。樹状突起の自発的なミトコンドリアCa2+の増加が観察され得る(図5C-F)。
ミトコンドリアCa2+シグナルの解析
画像解析ソフトウェアを用いて、細胞体またはアストロサイトおよびニューロンの個々のミトコンドリアの平均ピクセル強度を計算して、蛍光シグナルを定量化します。Ca2+の変更残業(t)は、F/Fo(t)値対時間、Foはバックグラウンド差引されたベースライン蛍光、Fはベースライン減蛍光変化20,21と表現する。ピークF/Fo値を使用して、Ca2+信号の振幅を比較します。
図1: アストロサイトおよびニューロン特異的ミトコンドリア標的性トランスジーン発現に対するDNA構築in vivo 2-Pイメージング( A)pZac2.1プラスミド中の遺伝的にコードされたCa2+指標GCaMP5GまたはGcaMP6sのDNA構築物は、それぞれgfaABC1D(up)およびCaMKII(低)プロモーターを有し、アストロサイトおよび神経細胞ミトコンドリアマトリックスに送達する。ミトコンドリア標的化は、蛍光タンパク質のN末流に付加されたミトコンドリアマトリックス(MM)特異的配列(ミト)を用いて達成される。(B) マウスの皮質の上に起こされる頭蓋骨の下層術。(C)マウスの頭蓋骨は、2-P顕微鏡のステージ上で固定されたポストに接続された金属板に取り付けられています。差し込み物は、頭蓋骨に取り付けられた金属板を持つ頭蓋窓を示しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:培養されたアストロサイトのミトコンドリアCa2+イメージング(A-B)ミトGCaMP6s(A)を発現するアストロサイトの2-P画像と、示された時間における100μM ATPの刺激に対する応答(B)(C) ATP刺激後の異なる時期における4つの個別のミトコンドリア(A、円)におけるミト-GCaMP6の画像。(D) ATP刺激後の4つのミトコンドリアにおいてΔF/Foとしてプロットされた、mito-GCaMP6s蛍光変化の時間コース。赤い矢印は、イメージングの開始時刻を示します。擬似色のスケールは、この数値および他の図における蛍光強度の線形表現です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:培養ニューロンのミトコンドリアCa2+ イメージング (A-B)ミト-GCaMP5G発現ニューロン(A)の2-P画像と、示された時間における100μMグルタミン酸および10μMグリシンに対する応答(B)を示す。(C) グルタミン酸刺激後の異なる時期における4個のミトコンドリア(A、円)におけるミト-GCaMP5Gの画像。(D) 4つのミトコンドリアにおけるミトGCaMP5G蛍光変化の時間コース この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:アストロサイトにおけるミトコンドリアCa2+シグナリングのin vivo 2-Pイメージング(A)SR101と同局化したアストロサイトを発現するミト-GCaMP5Gの2-P画像。(B-C)自発的なCa 2+増加の分析のためのミト-GCaMP5Gを発現するアストロサイトの2-P画像。(C-E)異なる時間(C)におけるアストロサイトの4つの個々のミトコンドリア(B、円)におけるミト-GCaMP5Gの画像と、4つの個々のミトコンドリア(E)でΔF/Foとしてプロットされたミト-GCaMP5G蛍光変化の時間コース。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ニューロンにおけるミトコンドリアCa2+シグナル伝達のin vivo 2-Pイメージング(A)脳内の神経マーカーNeuN(中央)とのGCaMP6s(上)の共局在化。(B) ミトコンドリア形態を有するGCaMP6sを発現する樹状突起の高解像度画像(*sで示される)。(C) GCaMP6sは神経細胞のミトコンドリアで発現する。(D-F)自発的なミトコンドリアCa2+ニューロンの増加の分析.ミトコンドリアの擬似色2-P画像は、異なる時間でCでミト-GCaMP6sを発現する(D)。Cの4つの個別のミトコンドリアにおけるミト-GCaMP6の画像(E-F)と、4つの個々のミトコンドリア(F)において、蛍光変化の経時変化をΔF/Foとプロットした( F)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
動画:ミトコンドリアCa2+は、培養されたアストロサイトでの100 μ M ATPに対応してGCaMP5G蛍光変化に基づいて増加します。
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Discussion
本稿では、アストロサイトやニューロンにおけるミトコンドリアCa2+信号をイメージングする方法とプロトコルを提供します。GECI GCaMP5G/6sを表現するために、ミトコンドリアターゲティングおよび細胞型特異的戦略を実施しました。ミトコンドリアでGCaMP5G/6sを標的にするために、プラスミドにミトコンドリアターゲティング配列を含む。生体内のアストロサイトおよびニューロンにおけるGCaMP5G/6sを発現させるために、アストロサイト特異的プロモーターgfaABC1Dおよびニューロン特異的プロモーターCaMKIIをプラスミドに挿入した。アストロサイトおよびニューロンにおけるGCaMP5G/6sの細胞型特異的発現は、アストロサイトにおけるSR101標識およびNeuNを有するニューロンの免疫染色によって確認することができる。我々のデータから、これらの戦略は、生体内のアストロサイトおよびニューロンにおけるミトコンドリアCa2+イメージングに対する信頼できる細胞型特異的アプローチを提供する。
GECI 発現の潜在的な問題の 1 つは、Ca2+ バインディングによって空き Ca2+ を減らす可能性があるため、Ca2+ バッファリングを引き起こす可能性があることです。注意を払う可能性のあるもう一つの問題は、注入されるウイルスの量です。過剰なウイルスが注入された場合、GECIを発現する個々の細胞は同定されない場合がある。これらの問題は、AAVの滴下によって効果的に改善することができる。フォトブリーチも問題になる可能性があります。理論的には、すべての蛍光指標は光漂白の対象となります。GCaMP5G/6sは非常に安定していますが、励起光への継続的な暴露の下で漂白されます。光の漂白を避けるための一般的なプラクティスは、十分な蛍光が収集されることを保証しながら、レーザー光への組織の露出時間を短縮することです。高感度PMTと高光伝送目標を使用すれば、これを実現できます。画像間のシャッターを閉じることで、フォトブリーチを軽減することもできます。
インビボ2-Pイメージングの結果では、自発的なミトコンドリアの増加は、アストロサイトとニューロンの両方で観察することができます。特に、これらのミトコンドリアCa2+過渡は長い持続時間を有する(図4Eおよび図5E)、Gobelららによる最近の報告と一致する。この現象の根本的なメカニズムは明らかではないが、さらに追求される価値がある。細胞質Ca2+増加の場合、アストロサイトとニューロンは異なるメカニズムを有する。Gタンパク質受容体刺激はアストロサイトにおけるERのCa2+増加を引き起こし、電圧ゲート付きCa2+チャネルまたはグルタミン酸受容体の活性化は、ミトコンドリアによって取り込むことができるニューロンの細胞質Ca2+増加を引き起こす。我々の前の研究20では、ミト-GCaMP5GがIP3 5-ホスファターゼ(5ppase)培養アストロサイトにコトランスフェクトされた場合、ATP誘発ミトコンドリアCa2+の増加は大部分廃止される可能性があることがわかった。しかし、5ppaseの2つの変異体、すなわち、酵素活性を欠くR343AおよびR343A/R350A 5ppaseは、ATP刺激後のミトコンドリアCa2+増加に影響を及ぼさなかった。これらの結果は、細胞質およびミトコンドリアCa2+レベルが高度に結合されていることを示しており、アストロサイトにおけるERとミトコンドリアの間の密接な物理的な関係のために、細胞質体がCa2+送達の仲介導管となる可能性が高い。また、グルタミン酸刺激がミトコンドリアCa2+ニューロンの増加を引き起こしたことも明かし、グルタミン酸受容体が細胞外空間からのCa2+侵入に役割を果たしていることを示唆した。将来的には、感覚駆動のミトコンドリアCa2+のアストロサイトとニューロンの増加を研究することは興味深いでしょう。
我々のアプローチは、異なる蛍光波長の2つのGECIが発現する場合、例えば、細胞質における赤い蛍光GECI RCaMPおよびミトコンドリアのGCaMP、またはその逆31の細胞質およびミトコンドリアCa2+信号を同時に画像化するために使用することができる。このアプローチは、ニューロンのアストロサイトおよびRCaMPで発現されるGCaMPによる生理学および病理学におけるアストロサイトとニューロンの相互作用のインビボ研究にも使用することができ、またはその逆も可能である。
GCaMPはGFPベースの単一波長蛍光素蛍光素GECIです。現在、GCAMP は、信号対雑音比(SNR)と大きなダイナミックレンジ(DR)が最も好ましいため、最も好ましい Ca2+インジケータです。最近、jGCaMP7センサは、GCaMP6の最適化されたバージョンで、個々のスパイク16に対する感度を向上させたと報告された。GCaMP7センサーはミトコンドリアCa2+イメージング用のプラスミドで簡単にサブクローニングすることができます。要約すると、ここで提示した戦略は、単一のミトコンドリアレベルでのCa2+変化を生体内で解決するのに十分な感度を有するニューロンおよびアストロサイトにおけるミトコンドリアCa2+の取り込みおよび取り扱いを画像化するために使用することができる。このプロトコルは、アストロサイトおよびニューロンにおける細胞質およびミトコンドリアCa2+シグナル伝達、ならびにアストロサイトとニューロンの相互作用を研究するのに有用な手段を表す。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所神経障害・脳卒中研究所(NINDS)がR01NS069726とR01NS094539をSDに付与することによって支援されました。私たちは、オーディオ録音のためにエリカDeMersに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
| Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
| Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
| High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
| Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
| Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
| Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
| Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
| Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
| Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |
References
- Griffiths, E. J., Rutter, G. A. Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Llorente-Folch, I., et al. Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons. The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).
- Burkeen, J. F., Womac, A. D., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes. The Journal of Neuroscience. 31 (23), 8432-8440 (2011).
- Duchen, M. Mitochondria, calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 111-121 (2012).
- Gouriou, Y., Demaurex, N., Bijlenga, P., De Marchi, U. Mitochondrial calcium handling during ischemia-induced cell death in neurons. Biochimie. 93 (12), 2060-2067 (2011).
- Qiu, J., et al. Mitochondrial calcium uniporter Mcu controls excitotoxicity and is transcriptionally repressed by neuroprotective nuclear calcium signals. Nature Communications. 4, 2034 (2013).
- Filadi, R., Greotti, E. The yin and yang of mitochondrial Ca2+ signaling in cell physiology and pathology. Cell Calcium. 93, 102321 (2021).
- Finkel, T., et al. The ins and outs of mitochondrial calcium. Circulation Research. 116 (11), 1810-1819 (2015).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T.
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Yamada, Y., et al. Quantitative comparison of genetically encoded Ca2+ indicators in cortical pyramidal cells and cerebellar Purkinje cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 5, 18 (2011).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology: CB. 5 (6), 635-642 (1995).
- Xie, Y., Wang, T., Sun, G. Y., Ding, S. Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction. Neuroscience. 170 (4), 992-1003 (2010).
- Lee, Y., et al. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
- Li, H., et al. Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store. Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).
- Zhang, N., Ding, S. Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).
- Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models. Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).
- Wang, X., Li, H., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia. Scientific Reports. 6, 32416 (2016).
- Wang, X., et al. Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury. Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).
- Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).
- Ding, S. In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes. Milner, R. , Humana Press. 545-554 (2012).
- Li, H., et al. Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke. Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).
- Ding, S., et al. Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo. Glia. 57 (7), 767-776 (2009).
- Ding, S., et al. Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus. The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).
- Gobel, J., et al. Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling. Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle. eLife. 10, 64821 (2021).
