Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Rekonstitution af Msp1 udvindingsaktivitet med fuldt rensede komponenter

Published: August 10, 2021 doi: 10.3791/62928
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Toledo

Summary

Her præsenterer vi en detaljeret protokol for rekonstitution af Msp1 ekstraktionsaktivitet med fuldt rensede komponenter i definerede proteolipoomer.

Abstract

Som centrum for oxidativ fosforylering og apoptotisk regulering spiller mitokondrier en afgørende rolle i menneskers sundhed. Korrekt mitokondriefunktion afhænger af et robust kvalitetskontrolsystem for at opretholde protein homøostase (proteostase). Fald i mitokondrie proteostase har været forbundet med kræft, aldring, neurodegeneration, og mange andre sygdomme. Msp1 er en AAA+ ATPase forankret i den ydre mitokondriemembran, der opretholder proteostase ved at fjerne fejllokerede haleforankrede proteiner. Ved hjælp af rensede komponenter rekonstitueret i proteoliposomes, har vi vist, at Msp1 er nødvendig og tilstrækkelig til at udtrække en model hale-forankret protein fra en lipid bilayer. Vores forenklede rekonstituerede system overvinder flere af de tekniske barrierer, der har hindret detaljeret undersøgelse af membranproteinudvinding. Her giver vi detaljerede metoder til generering af liposomer, membranprotein rekonstitution, og Msp1 ekstraktion assay.

Introduction

Korrekt cellulær funktion afhænger af en proces kaldet proteostase, som sikrer, at funktionelle proteiner er i den korrekte koncentration og cellulære placering1. Fejl i proteostase fører til kompromitteret organellefunktion og er forbundet med mange neurodegenerative sygdomme2,3,4. Membranproteiner udgør unikke udfordringer for proteostasenetværket, da de skal målrettes mod den korrekte membran, samtidig med at man undgår sammenlægning fra hydrofobiske transmembrandomæner (TED'er)5. Derfor har specialiserede maskiner udviklet sig til at beskytte den hydrofobiske TMD fra cytosolen og lette målretning og indsættelse i den korrekte cellulæremembran 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

Mitokondrier er cellens metaboliske knudepunkt og er involveret i mange væsentlige cellulære processer som: oxidativ fosforylering, jern-svovlklyngegenerering og apoptotisk regulering16,17. Disse endosymbiotiske organeller indeholder to membraner, kaldet den indre mitokondriemembran (IMM) og den ydre mitokondriemembran (OMM). Over 99% af de 1.500 humane mitokondrieproteiner er kodet i det nukleare genom og skal omfordeles på tværs af en eller to forskellige membraner18,19. Korrekt mitokondriefunktion afhænger således af et robust proteostasenetværk for at rette eventuelle fejl i proteinmålretning eller translokation.

Vores laboratorium fokuserer på en delmængde af mitokondriemembranproteiner kaldet haleforankrede (TA) proteiner, som har et enkelt transmembrandomæne på selve C-terminus20,21,22,23,24. TA proteiner er involveret i en række væsentlige processer, såsom apoptose, vesikel transport, og protein translokation25. Den unikke topologi af TA proteiner kræver post-translationel indsættelse, som forekommer i endoplasmisk reticulum (ER) ved Guided Entry of Tail-forankret (GET) eller Endoplasmic reticulum Membrane protein Complex (EMC) veje eller ind i OMM af en dårligt karakteriseret vej20,26,27,28. TMD'ens biofysiske egenskaber er nødvendige og tilstrækkelige til at lede TA-proteiner til den korrektemembran 29. Anerkendelsen af biofysiske egenskaber snarere end et defineret sekvensmotiv begrænser troskaben af målretningsvejene5. Således er fejllocalization af TA proteiner en fælles stress for proteostase netværk. Cellulær stress, såsom hæmning af GET-stien, forårsager en stigning i proteinfejllocalisering til OMM og mitokondrie dysfunktion, medmindre disse proteiner straks fjernes30,31.

Et fælles tema i membran proteostase er brugen af AAA +(ATPase Associated med cellulære Activities) proteiner til at fjerne gamle, beskadigede eller fejllokerede proteiner fra lipid bilayer1,32,33,34,35,36,37,38 . AAA + proteiner er molekylære motorer, der danner hexameriske ringe og gennemgår ATP-afhængige bevægelser for at ombygge et substrat, ofte ved translokation gennem en smal aksial pore39,40. Selv om der er gjort en stor indsats for at studere udvindingen af membranproteiner af AAA + ATPases, er rekonstitutionerne komplekse eller involverer en blanding af lipider og vaskemiddel41,42, hvilket begrænser den eksperimentelle kraft til at undersøge mekanismen for substratudvinding fra lipid-bilayeren.

Msp1 er en meget bevaret AAA + ATPase forankret i OMM og peroxisomes, der spiller en afgørende rolle i membran proteostase ved at fjerne fejllokaliserede TA proteiner43,44,45,46,47. Msp1 blev også for nylig vist sig at lindre mitokondrie protein import stress ved at fjerne membran proteiner, stall under translokation på tværs af OMM48. Tab af Msp1 eller den menneskelige homolog ATAD1 resulterer i mitokondrie fragmentering, svigt i oxidativ fosforylering, anfald, øget skade efter slagtilfælde, og tidlig død31,49,50,51,52,53,54,55,56.

Vi har vist, at det er muligt at co-rekonstruere TA proteiner med Msp1 og opdage ekstraktionen fra lipid bilayer57. Dette forenklede system anvender fuldt rensede proteiner rekonstitueret i definerede liposomer , der efterligner OMM (Figur 1)58,59. Dette niveau af eksperimentel kontrol kan løse detaljerede mekanistiske spørgsmål om substratudvinding, der er eksperimentelt uhåndterlige med mere komplekse rekonstitutioner, der involverer andre AAA+ proteiner. Her leverer vi eksperimentelle protokoller, der beskriver vores metoder til liposompræparat, membranproteinkonstitution og ekstraktionsanalysen. Det er vores håb, at disse eksperimentelle detaljer vil lette yderligere undersøgelse af den væsentlige, men dårligt forstået proces med membran proteostase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Liposomforberedelse

  1. Kombiner kloroform lagre af lipider i passende forhold til at efterligne den ydre mitokondriemembran.
    1. Forbered 25 mg lipidblanding. Vi bruger en tidligere etableret blanding af lipider, der efterligner mitokondriemembraner, bestående af et 48:28:10:10:4 molarforhold mellem kyllingægphosphatidyl cholin (PC), kyllingæg fosfatyl ethanolamin (PE), kvægleverphosphatidyl inositol (PI), syntetisk 1,2-dioleoyl-sn -glycero-3-fosfo-L-serin (DOPS) og syntetisk 1',3'bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo]-glycerol (TOCL)58,59. Eksempelberegninger vises i tabel 1.
    2. Bring alle lipid lagre til stuetemperatur før åbning, da dette vil begrænse kondens. Da de fleste laboratorier ikke har en præcis måde at måle koncentrationen af lipider, ethvert vand absorberes af chloroform bestand vil ændre koncentrationen af lipid bestanden og dermed forholdet mellem lipider, der anvendes i analysen.
    3. Som lipid lagre kommer i glas ampuller, overføre den nødvendige mængde lipid til et glas hætteglas ved hjælp af en 1 ML sprøjte. Tilsæt 2 mg dithiothreitol (DTT) til hætteglasset for at forhindre lipidoxidation. Arbejd hurtigt, da fordampning af kloroform vil ændre koncentrationen af lipiden.
    4. Overfør eventuelle resterende lipid til et separat glasglasglas og passer med en PFTE septa. Tilsæt 2 mg DTT til hætteglasset, wrap med parafilm og opbevares ved -20 °C for at forhindre lipidoxidation. Prøv at bruge lipider inden for 3 måneder efter overførsel til hætteglass. For at undgå potentiel forurening af kloroformlagrene ved markørafstrømning skal klistermærkerne overføres fra de originale ampuller til glasglasglassene i stedet for at mærke med markør.
  2. Fordampe kloroform under en meget blid strøm af kvælstof, mens du spinder glasglasset kontinuerligt i hånden i en røghætte, der hovedsagelig fungerer som en manuel rotovap. Drej hætteglasset med en ensartet hastighed (20-40 rpm) i hånden for at holde lipider i bevægelse. Målet er at fordampe alle kloroform og få en jævn belægning af lipider over hele glas hætteglasset.
    FORSIGTIG: Kloroform er neurotoksisk, og dette trin skal udføres i røghætten.
    1. Fastgør en frisk Pasteur pipette til nitrogenrøret. Lad ikke nogen af lipiderne sprøjte ud af hætteglasset eller på Pasteur-pipetten. Sigt spidsen i bunden af hætteglasset, så luften hopper ud af bunden og skubber lipiderne op mod midten af hætteglasset. Få en jævn belægning over hele hætteglasset, samtidig med at du undgår ophobning i hjørnerne eller ved hætten. Hele denne proces tager cirka 5 minutter.
    2. Når blandingen tykner ind i en "perle" af lipider, skal du guide den ind i midten af hætteglasset ved at ændre hætteglasets vinkel. Når perlen begynder at blive mindre, skru lidt op for at sprede perlen, hvilket sikrer, at ingen af lipiderne blæser ud af hætteglasset.
  3. Fjern eventuelle resterende kloroform under vakuum.
    1. Sæt glasglasset på et husvakuum eller membranvakuumpumpe i 1 time for at fjerne størstedelen af resterende kloroform. Disse støvsugere er generelt ikke stærke nok til at fjerne alle kloroformen, men de kan tolerere små mængder opløsningsmiddel bedre end roterende forgæves støvsugere.
    2. Sæt hætteglas på et stærkt vakuum (<1 mTorr) i 12-16 timer for at fjerne alle resterende kloroform. Sørg for at undgå at støde på hætteglasset under denne proces.
  4. Resuspend lipiderne i 1,25 mL liposombuffer (50 mM HEPES KOH pH 7,5, 15% glycerol, 1 mM DTT). Da vi startede med 25 mg lipider, resulterer dette i en koncentration på 20 mg/mL. Fuldt resuspend lipider uden synlige bidder. Hvis lipider samlet i hjørnet af hætteglasset, kan dette være en langvarig proces.
    1. Vortex hætteglasset kraftigt, indtil prøven er mælkeagtig glat. Vi finder ud af, at hvis kloroformfordampelsen blev udført korrekt natten før, tager denne proces ca. 5-10 minutter.
    2. For at sikre fuldstændig resuspension af lipider, rotere på et hjul ved stuetemperatur i 3 timer ved ~ 80 rpm. Fjern hætteglastet fra hjulet en gang i timen i 1 minuts hvirvlen for at sikre jævn blanding.
  5. Overfør lipider forsigtigt til et rent 1,5 mL mikrocentrifugerør. Udfør 5 fryse-optøningscyklusser ved hjælp af flydende nitrogen til at fryse og en 30 °C varmeblok til at tø op. Dette trin hjælper med at konvertere multilamellar vesikler til unilamellar vesikler.
  6. Ekstruder lipiderne.
    1. Under fryse tø cykler, forberede mini-ekstruder. Saml miniekstruderen med 10 mm filterstøtter og en polycarbonatmembran af den ønskede porestørrelse (vi bruger 200 nm). Filterets størrelse vil påvirke liposomets størrelse, hvilket vil påvirke koncentrationen af proteiner, der kræves til rekonstitutionen (trin 2.3).
    2. Sæt miniekstruderen på en kogeplade, og lad ekstrudertemperaturen være op til 60 °C.
    3. Træk lipiderne op i en 1 mL gastæt glassprøjte, og placer forsigtigt i den ene ende af miniekstruderen. Placer den tomme gastætte sprøjte i den anden side af miniekstruderen. Lad lipider til at ekvilibrere til ekstruder stå temperatur i 5-10 minutter.
    4. Overfør lipiderne til den alternative sprøjte ved forsigtigt at skubbe stemplet på den fyldte sprøjte. Skub opløsningen fra den alternative sprøjte ind i den originale sprøjte. Gentag denne frem og tilbage proces 15 gange, så ved 15th passere lipider ende i den alternative sprøjte. Overvåg lydstyrken i hvert gennemløb for at sikre, at der ikke er lækager.
  7. Tilbered engangs aliquots af lipider, flash fryse i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C. Liposomer er stabile ved -80 °C i flere måneder. Rekonstitutionerne kræver 10 μL liposomer ad gangen (trin 2.3.4), så det er praktisk at forberede 10 μL eller 20 μL aliquots.

2 Rekonstitution af Msp1 og Model TA protein

  1. Forbered rekonstitutionsbufferen: 50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM kaliumacetat, 7 mM magnesiumacetat, 2 mM DTT, 10% saccharose, 0,01% natrium azid, 0,2-0,8% Deoxy Big Chaps (DBC).
    1. Optimer rekonstitutionsbetingelserne for det nye parti liposomer. Koncentrationen af DBC og bioperler, der kræves for optimal rekonstitution, varierer afhængigt af det anvendte parti liposomer. For at begrænse prep til prep variabilitet, skal du bruge den samme masse DBC for alle eksperimenter. Når du ændrer mange DBC'er, skal du gentage optimeringsprocessen.
    2. Opret en række rekonstitutioner med forskellige koncentrationer af DBC (0,2% - 0,8%) og bioperler (25 mg - 100 mg), hver gang der fremstilles et nyt parti liposomer. Det er vigtigt ikke at droppe DBC under den kritiske micelle koncentration (CMC) på ~ 0,12%. Når forholdene er optimeret, anbefaler vi at indsamle alle data ved hjælp af de samme liposomforberedelses- og rekonstitutionsforhold.
    3. Analysere effektiviteten af de forskellige rekonstitutionsbetingelser ved hjælp af den ekstraktionsanalyse, der er beskrevet i trin 3.
  2. Forberede bioperler ved en endelig koncentration på 250 mg/mL.
    1. Afvej 2,7 g tørrede bioperler og resuspend i et 50 mL centrifugerør på 100% methanol (ca. 45 mL) for at fugte perlerne. I første omgang våd bioperler i methanol for at forhindre luft i at blive fanget i porerne af perlerne. Når du er i metanol, skal du holde bioperlerne våde, da enhver luft fanget af bioperlerne vil ændre deres evne til at absorbere vaskemiddel.
    2. Fjern methanol ved at vaske perlerne 8x med ca. 45 mL ultrapurt vand (18,2 mΩ), herefter benævnt ddH2O. Pellet perler ved at dreje på 3.200 x g i 1 minut. Dekanter væsken og genanvendes i ddH2O.
    3. Efter vask genbruges den i 10 ml ddH2O med 0,02% natriumazid og opbevares ved 4 °C. Bioperler kan opbevares ved 4 °C i flere måneder. Denne bestand er 250 mg/mL, da det antages ~ 0,2 g går tabt under vasketrinene.
  3. Beregn størrelsen af liposomet og det ønskede antal molekyler af TA-protein og Msp1 pr. liposom. Dette vil bestemme den koncentration af Msp1 og TA protein, der kræves for rekonstitutionen.
    1. Først beregne antallet af lipid molekyler pr unilamellar liposom (Ni alt) ved hjælp af ligningen, hvor Equation 1 d er diameteren af liposom, h er tykkelsen af bilayer, og a er lipid hovedgruppe område.
      1. Mål liposomdiameteren med DLS. I vores eksempel blev der opnået en værdi på 70 nm for liposomdiameteren (d).
      2. Brug en værdi på 5 nm for h og 0,71 nm2 for en, som er hovedgruppens størrelse for fosfattidylcholin. I denne særlige situation er Ni alt 37.610.
    2. Derefter beregnes molarkoncentrationen af lipid MLipid ved hjælp af lipidernes gennemsnitlige molekylvægt i blandingen. I dette eksempel er koncentrationen af lipider 20 mg/mL (trin 1,4), og den gennemsnitlige molekylvægt af lipider er 810 g/mol (Tabel 1). Dette resulterer i en værdi på 0,0247 M for MLipid.
    3. Dernæst beregne molarkoncentrationen af liposomer, MLiposom, ved hjælp af ligningen, Equation 2 hvor M Lipid er molarkoncentrationen af lipid fra trin 2.3.2, og N ialt er det samlede antal lipider pr. liposom beregnet i trin 2.3.1. I dette eksempel er 20 mg/mL-lagerkoncentrationen af liposomer ca. 660 nM.
    4. Den mængde Msp1- og TA-protein, der kræves for en rekonstitutionsreaktion på 100 μL.
      BEMÆRK: Den endelige koncentration af lipider i rekonstitutionen er 2 mg/mL, hvilket er en 10x fortynding af liposombestanden. Dette giver en endelig liposomkoncentration på 66 nM. Den endelige koncentration af Msp1 er 792 nM, hvilket giver et gennemsnit på 12 samlede kopier (2 funktionelle hexamerer) pr. liposom. Den endelige koncentration af TA protein er 660 nM, hvilket giver et gennemsnit på 10 eksemplarer pr liposom.
  4. I et PCR-rør blandes renset Msp1, TA-protein og liposomer i rekonstitutionsbuffer. Rækkefølgen af tilsætning er buffer, proteiner, og liposomer sidste. Den samlede volumen er 100 μL. Lad blandingen sidde på is i 10 minutter. Rense Msp1 og TA protein som tidligere beskrevet57.
    1. Brug det velkarakteriseret model TA protein His-Flag-Sumo-Sec22 som et positivt kontrolsubstrat, når analysen først etableres. Denne konstruktion har en His-tag for nem rensning, 3x-Flag tag til påvisning af vestlige blot, en Sumo domæne for øget opløselighed, og TMD af ER-TA protein Sec22 til rekonstitution og anerkendelse af Msp1.
    2. Sørg for, at lageropløsninger af både Msp1 og TA-proteinet er ca. 100 μM for at minimere effekten af N-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) fra proteinrensningen på rekonstitutionen. Renset Msp1 er i 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM natriumchlorid, 0,1 mM Tris(2-carboxyethyl)fosphinhydrochlorid (TCEP), 0,05% DDM, mens det rensede TA-protein er i 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM natriumchlorid, 10 mM magnesiumchlorid, 5 mM β-mercaptoethanol, 10% glycerol, 0,1% DDM. Lageropløsninger på ca. 100 μM TA-protein og Msp1-monomer sikrer, at disse komponenter vil udgøre < 5% af det endelige rekonstitutionsvolumen, hvilket resulterer i en fortynding af DDM under CMC.
  5. Tilsæt den ønskede mængde bioperler til prøven for at fjerne vaskemiddel.
    1. Skær spidsen af en p200 pipette spids til omkring 1/8th tommer i diameter, så perler kan passe gennem spidsen. Vortex bioperler rør grundigt for at opnå en ensartet blanding og hurtigt fjerne låget og pipette op volumen, før bioperler bosætte sig. Overfør bioperlerne til et tomt PCR-rør.
    2. Når rekonstitutionen er færdig med sin 10-minutters inkubation på is, skal du bruge en usleben pipettespids til at fjerne al væsken fra bioperlerne. Overfør derefter 100 μL rekonstitutionen ind i røret med bioperlerne. Dette skal gøres hurtigt, så bioperlerne ikke fanger luft, hvilket vil få perlerne til at flyde.
  6. Lad rekonstitutionen rotere på et hjul ved ~80 omdr./min i 16 timer ved 4 °C.
  7. Fjern rekonstitueret materiale fra bioperler. Gør en hurtig spin i en picofuge at pellet bioperlerne, og derefter bruge en uncut pipet tip til at overføre rekonstitueret materiale til en ren PCR rør. Gentag denne proces 1-2 gange, indtil der ikke er nogen bioperler tilbage i prøven. Hold rekonstitutionen på is.
  8. Ryd det rekonstituerede materiale for at fjerne proteiner, der ikke kunne rekonstrueres i liposomer.
    1. Forbered Ekstraktion Buffer: 50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM kaliumacetat, 7 mM magnesiumacetat, 2 mM DTT, 100 nM calciumchlorid.
    2. Ekvilibrere glutathion spin kolonner med Ekstraktion Buffer i henhold til producentens anvisninger. Dette indebærer typisk 3-runder af vask med 400 μL buffer og derefter centrifugering ved 700 x g i 2 minutter ved stuetemperatur for at fjerne bufferen.
    3. Der tilsættes 5 μM af hver chaperone (GST-SGTA og GST-Calmodulin) til det rekonstituerede materiale. Disse chaperoner vil binde sig til TMD af proteiner, som undlod at rekonstruere i liposomer. Rensning af chaperoner blev beskrevet tidligere6,57.
      BEMÆRK: Disse chaperoner er kommercielt tilgængelige, men vi foretrækker at rense i huset for at kontrollere for omkostninger og kvalitet. Begge proteiner er i 20 mM Tris pH 7,5, 100 mM natriumchlorid og 0,1 mM TCEP, og har en bestandskoncentration omkring 160 μM. SGTA genkender substrater med en meget hydrofob TMD , mens Calmodulin binder TMD'er med moderat hydrofobicity6,29. Sammen kan denne chaperone cocktail genkende en bred vifte af substrater.
    4. Der tilsættes 100 μL ekstraktionsbuffer til det rekonstituerede materiale, hvilket bringer volumen op på 200 μL. Tilføj dette til de ekvilibrerede glutathion spin kolonner. Bemærk, at glutathion spin kolonner giver den højeste prøve opsving, når pre-clearing volumen er 200 – 400 μL.
    5. Sæt spinsøjlerne på, og drej ved ~80 omdr./min ved 4 °C i 30 minutter, så chaperoner kan binde sig til harpiks.
    6. Drej kolonnerne ved 700 x g i 2 minutter ved stuetemperatur. Strømmen igennem er forklaret materiale, der er udtømt af aggregerede proteiner. Opbevar materiale på is og fortsæt direkte med udvindingsanalysen.

3. Udvinding Assay

  1. Forbered rør til SDS PAGE analyse. Hver reaktion vil have 4 rør: INPUT (I), FLOW THROUGH (FT), WASH (W) og ELUTE (E).
    1. Der tilsættes 45 μL ddH2O-prøve til INPUT-røret, 40 μL ddH2O til FLOW THROUGH-røret og 0 μL til WASH- og ELUTE-rørene.
      BEMÆRK: Det bedste signal til støjforhold i denne analyse opnås, når WASH- og ELUTE-prøverne er 5x koncentrerede i forhold til INPUT- og FLOW THROUGH-prøverne. På grund af fortyndingerne under analysen kræver dette, at der udtages 5 μL prøve til INPUT-prøven, 10 μL prøve til FLOW THROUGH-prøven og 50 μL prøve til WASH- og ELUTE-prøverne.
    2. Der tilsættes 16,6 μL 4x SDS PAGE Loading Buffer til hvert rør. Den samlede volumen for hver prøve er 50 μL før SDS PAGE Loading Buffer. Det endelige volumen er 66,6 μL (50 μL prøve + 16,6 μL af 4x SDS PAGE Loading Buffer).
  2. Saml udsugningsanalysen.
    1. Ekstraktionsreaktionen indeholdende 60 μL forforgodttede proteolipoomer, 5 μM GST-SGTA, 5 μM GST-Calmodulin og 2 mM ATP. Kombiner alle reagenser undtagen ATP, som bruges til at starte reaktionen. Medbring et endeligt volumen på 200 μL med ekstraktionsbuffer.
      BEMÆRK: Da der anvendes 60 μL prøve til hver ekstraktionsanalyse, kan der anvendes en rekonstitution til tre forskellige ekstraktionsanalyser. Udfør positive og negative kontroller (+ATP og -ATP) på materiale fra samme rekonstitution.
    2. Forvarm udsugningsanalyse i 30 °C varmeblok i 2 minutter.
  3. Start udsugningsanalysen ved at tilføje ATP til den endelige koncentration på 2 mM og starttimeren.
    1. Giv en 5 sekunders spin i en picofuge at blande ATP i reaktionen. Inkuberes ved 30 °C i 30 minutter.
    2. Under inkubationen skal du tage 5 μL af reaktionen og tilsætte INPUT-røret. Timingen af dette er fleksibel.
    3. I denne inkubationsperiode ekvilibreres en glutathion spin kolonne for hver prøve i ekstraktionsanalysen.
  4. Udfør træk ned på chaperoner for at isolere ekstraheret materiale.
    1. Når inkubationen på 30 minutter er færdig, tilsættes 200 μl ekstraktionsbuffer til røret for at bringe det samlede volumen op på 400 μL. Tilsæt til ekvilibreret glutathionharpiks og lad det binde på hjulet ved 4 ° C i 30 minutter.
    2. Drej kolonnerne ved 700 x g i 2 minutter ved stuetemperatur for at samle strømmen igennem. Tag 10 μL for FLOW THROUGH-røret. Denne prøve indeholder substrater, som stadig er integreret i lipid bilayer.
    3. Vask harpiks to gange med 400 μL ekstraktionsbuffer, og kassér strømmen igennem. Ved den tredje vask holdes strømmen igennem og tager 50 μL for WASH-røret.
    4. Forbered 5 mL Elution Buffer ved at tilføje reduceret glutathion til en endelig koncentration på 5 mM i ekstraktionsbufferen. Forbered denne buffer frisk hver gang.
    5. Der tilsættes 200 μL Elution Buffer til spinkolonnen. Inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter. Drej ved 700 x g i 2 minutter ved stuetemperatur for at elute. Hold strømmen igennem. Gentag processen en anden gang, så det samlede elutionsvolumen er 400 μL.
    6. Tag 50 μL prøve fra Elution-prøven, og tilsæt den til ELUTE-røret.
  5. Analyser ekstraktionsaktivitet ved hjælp af SDS-PAGE og western blot.
    BEMÆRK: Som en vestlig blot er en temmelig standard procedure, en grundlæggende protokol er fastsat, der fremhæver et par af de detaljer, der er unikke for denne analyse.
    1. Læg prøver i en pletfri polyacrylamidgel (4% stabling, 15% adskillelse) og kør ved 200 V i 50 minutter i Tris-glycin buffer. Hvis rummet tillader det, skal du bruge både en uplettet og plettet stige til at tillade visualisering på pletfri gelbilledtør og overførsel til henholdsvis PVDF-membranen. Pletten fri gel tillader kvantitativ visualisering af tryptofan indeholder proteiner ved aktivering med ultraviolet lys, samtidig med at gelen, der skal anvendes til en vestlig blot.
    2. Billede pletten gratis gel for at bekræfte, at der er lige belastning på tværs af alle prøver. Dette er en væsentlig kontrol, der sikrer eventuelle ændringer i signal opdaget af vestlige blot er ikke et resultat af variabel protein belastning. Der bør kun være synlige bånd til chaperoner (GST-calmodulin og GST-SGTA) i INPUT- og ELUTION-prøverne. Husk, at ELUTE-prøven vil være mere koncentreret end INPUT-prøven.
    3. Saml en western blot kassette ved hjælp af en 45 μm PVDF membran. Overfør ved en konstant strøm på 300 mA i 60 minutter.
    4. Efter blokering af membranen bindes til det primære antistof i 16 timer ved 4 °C med skånsom rystelse ~15 omdr./min. Blot for substrat med kanin Anti-FLAG ved en 1:1,000 fortynding.
      BEMÆRK: De primære og sekundære antistoffer, der anvendes, vil være substratspecifikke, og koncentrationen til brug skal muligvis optimeres.
    5. Vask membran og inkuber med sekundært antistof, ged anti-kanin ved en 1:10,000 fortynding, med blid rystelse i 1 time ved stuetemperatur.
    6. Vask membran og billede til analyse ved hjælp af vestlige blotting detektionsmiddel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at fortolke resultaterne korrekt skal pletten fri gel og den vestlige blot ses sammen. Pletten fri gel sikrer lige belastning på tværs af alle prøver. Når du ser pletfri gel, vil chaperoner (GST-calmodulin og GST-SGTA) være synlige i INPUT (I) og ELUTE (E) baner. Dobbelttjek, at intensiteten af disse bånd er ensartet på tværs af alle INPUT-prøverne. På samme måde skal du sikre dig, at intensiteten er ensartet på tværs af ELUTE-prøverne. ELUTE er 5x mere koncentreret end INPUT, og denne intensitetsforskel vil være synlig i gelerne.

Efter at have brugt pletten fri gel til at bekræfte korrekt belastning, undersøge den vestlige blot for at bestemme ekstraktion aktivitet. Mål ekstraktionsaktiviteten ved at sammenligne mængden af substrat i ELUTE(E)-fraktionen i forhold til INPUT-(I)brøken. Signalet i Flow Through (FT) viser en vis variation, men ligner generelt INPUT-brøken. Der bør ikke være noget signal i VASKE(W) brøken. Typisk er der ~ 10% ekstraktionseffektivitet for den positive kontrol og 1-2% ekstraktionseffektivitet i den negative kontrol (Figur 2). Husk, at ELUTE-fraktionen er 5x så intens som INPUT-brøken, så dette skal tages i betragtning, når man dømmer ekstraktionseffektiviteten. Hvis rekonstitutionsbetingelserne ikke optimeres, er der typisk sammenlignelige ekstraktionsniveauer i både + ATP- og - ATP-prøverne (Figur 3). Dette resultat tilskrives en fejl af Msp1 til effektivt rekonstruktion, hvilket resulterer i mange proteoliposomes uden en funktionel Msp1 hexamer.

Lipid Muldvarp % MW Gennemsnitligt MW μmol i 25 mg mg i 25 mg Klorlager (mg/mL) μL for 25 mg
PERSONLIG COMPUTER 48% 770 369.6 14.82 11.41 25 456.4
PE 28% 746 208.88 8.64 6.45 25 258.0
PI 10% 902 90.2 3.09 2.78 10 278.5
DOPS 10% 810 81 3.09 2.50 10 250.1
TOCL 4% 1502 60.08 1.23 1.85 25 74.2
Conc. Corr Avg MW 809.76
μmol i 25 mg 30.87

Tabel 1: Prøveberegninger for liposompræparat. De vigtigste mål med denne tabel er at beregne koncentrationen korrigeret gennemsnitlige molekylvægt af lipid blandingen og mængden af hver lipid bestand kræves for at gøre liposomer. MW og lagerkoncentration kommer fra produktetiketter. Lipider og muldvarp % vælges af brugeren.

Figure 1
Figur 1: Cartoon af ekstraktion assay og liste over centrale trin.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative data, der viser en velfungerende analyse. Ekstraktionseffektiviteten bestemmes ved at sammenligne mængden af substrat i ELUTE-fraktionen med INPUT-fraktionen. Husk, at gelen har 5x højere belastning af ELUTE-fraktionen i forhold til INPUT-brøken. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative data for en fejlslagen rekonstitutions- og udvindingsanalyse. Her kan aktiviteten i + ATP-prøven sammenlignes med aktiviteten i - ATP-stikprøven. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Korrekt mitokondriefunktion afhænger af et robust proteinkvalitetskontrolsystem. På grund af iboende grænser i troskab ta protein målretning veje, mislocalized TA proteiner er en konstant kilde til stress for mitokondrier. En vigtig komponent i mitokondrie proteostase netværk er Msp1, som er en membran forankret AAA + ATPase, der fjerner fejllocalized TA proteiner fra OMM. Her har vi beskrevet, hvordan man forbereder proteoliposomes, co-rekonstrueret Msp1 og en model TA protein, og udføre en ekstraktion assay. Vi har tidligere brugt denne analyse til at påvise, at Msp1 direkte genkender mislocalized TA proteiner og er i stand til at udvinde disse proteiner fra en lipid bilayer uden tilbehør proteiner eller cofactors57.

En ulempe ved analysen er, at der er en vis variation i rekonstitutionsprocessen. For at kontrollere for prep-to-prep variabilitet, vi altid medtager en positiv og negativ kontrol på den samme gel / vestlige blot for at sikre, at vores analyse fungerer efter hensigten. Vi undgår at foretage sammenligninger mellem rekonstitutioner, der blev udført på forskellige dage eller drage sammenligninger mellem forskellige vestlige blots. De eneste sammenligninger, vi foretager, er for prøver rekonstitueret parallelt og kører på den samme gel / vestlige blot. Vi er også ret konservative i vores datafortolkning. Selvom det er muligt at kvantificere ekstraktionseffektiviteten ved hjælp af ImageJ, beskriver vi typisk vores eksperimenter som havende fuld aktivitet, mellemaktivitet eller ingen aktivitet.

En kilde til variation er den samlede mængde protein rekonstitueret. Mens størstedelen af unincorporated proteiner fjernes ved pre-clearing proces, mindre end perfekt rekonstitution effektivitet Msp1 kan have en outsized effekt på den observerede effektivitet af substrat ekstraktion. Denne effekt skyldes det faktum, at Msp1 fungerer som en homohexamer, men renser som en monomer57. Liposomer, der indeholder andet end 6x kopier af Msp1 vil være inaktive. For eksempel vil et liposom med kun 5 kopier af Msp1 være inaktiv. Den eneste måde at danne stabile Msp1 hexamers i fuld længde er at inaktivere ATPase aktivitet med ikke-hydrolyserbare ATP analoger (ATPγS) eller inaktivering E193Q Walker B mutant, hvoraf ingen er forenelige med en aktivitet assay. Overvinde denne tekniske hurdle er et område med aktiv forskning i vores laboratorium.

Et andet område af aktiv forskning fokuserer på at gøre ekstraktion assay mere kvantitativ. Den nuværende metode er afhængig af pull downs og vestlige blotting for signaldetektering, som begge kun er semi-kvantitative og viser assay til assay variabilitet. Kovalent modifikation af ekstraherede substrater ville fjerne den variation, der opstår fra pull downs. På samme måde vil brugen af radioaktive eller fluorescerende etiketter på substrater fjerne behovet for vestlige blotter og den tilhørende variabilitet.

En stor styrke ved analysen er, at systemet er helt defineret. Membranproteinerne udtrykkes og renses igen, og det er muligt at lave definerede mutanter i både Msp1 og substratet for at studere specifikke aspekter af reaktionen. Lipidmiljøets rolle i proteostase er stort set blevet ignoreret på grund af de tekniske udfordringer ved at studere dette på en detaljeret måde. Fordi vores analyse bruger liposomer med en defineret lipid sammensætning, dette giver mulighed for fuld eksperimentel kontrol af lipid miljø. Vi kan nemt modulere faktorer som: lipid fluiditet, bilayer tykkelse, headgroup identitet, og liposom størrelse. Vi arbejder aktivt på at bruge vores analyse til at undersøge lipidmiljøets rolle på Msp1-aktiviteten. Det er vores håb, at in vitro rekonstitution og ekstraktion assay beskrevet her kan tjene som en forenklet model system til at studere den fælles cellulære proces af AAA + ATPase medieret udvinding af membran proteiner fra en lipid bilayer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen

Acknowledgments

MLW udviklede en del af denne protokol under sine postdocstudier med Dr. Robert Keenan ved University of Chicago.

Dette arbejde er finansieret af NIH tilskud 1R35GM137904-01 til MLW.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biobeads Bio-Rad 1523920
Bovine liver phosphatidyl inositol Avanti 840042C PI
Chicken egg phosphatidyl choline Avanti 840051C PC
Chicken egg phosphatidyl ethanolamine Avanti 840021C PE
ECL Select western blotting detection reagent GE RPN2235
Filter supports Avanti 610014
Glass vial VWR 60910L-1
Glutathione spin column Thermo Fisher PI16103
Goat anti-rabbit Thermo Fisher NC1050917
Mini-Extruder Avanti 610020
Polycarbonate membrane Avanti 610006 200 nM
PVDF membrane Thermo Fisher 88518 45 µM
Rabbit anti-FLAG Sigma-Aldrich F7245
Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Avanti 840035C DOPS
Synthetic 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol Avanti 710335C TOCL
Syringe, 1 mL Norm-Ject 53548-001
Syringe, 1 mL, gas-tight Avanti 610017

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Song, J., Herrmann, J. M., Becker, T. Quality control of the mitochondrial proteome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22, 54-70 (2021).
  2. Phillips, B. P., Miller, E. A. Membrane protein folding and quality control. Current Opinion in Structural Biology. 69, 50-54 (2021).
  3. Jiang, H. Quality control pathways of tail-anchored proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1868, 118922 (2020).
  4. McKenna, M. J., et al. The endoplasmic reticulum P5A-ATPase is a transmembrane helix dislocase. Science. 369, New York, N.Y. (2020).
  5. Hegde, R. S., Zavodszky, E. Recognition and Degradation of Mislocalized Proteins in Health and Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11, 033902 (2019).
  6. Shao, S., Hegde, R. S. A calmodulin-dependent translocation pathway for small secretory proteins. Cell. 147, 1576-1588 (2011).
  7. Samuelson, J. C., et al. YidC mediates membrane protein insertion in bacteria. Nature. 406, 637-641 (2000).
  8. Anghel, S. A., McGilvray, P. T., Hegde, R. S., Keenan, R. J. Identification of Oxa1 Homologs Operating in the Eukaryotic Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21, 3708-3716 (2017).
  9. Aviram, N., et al. The SND proteins constitute an alternative targeting route to the endoplasmic reticulum. Nature. 540, 134-138 (2016).
  10. Voorhees, R. M., Hegde, R. S. Structure of the Sec61 channel opened by a signal sequence. Science. 351, New York, NY. 88-91 (2016).
  11. Cichocki, B. A., Krumpe, K., Vitali, D. G., Rapaport, D. Pex19 is involved in importing dually targeted tail-anchored proteins to both mitochondria and peroxisomes. Traffic. 19, Copenhagen, Denmark. 770-785 (2018).
  12. Mateja, A., et al. Protein targeting. Structure of the Get3 targeting factor in complex with its membrane protein cargo. Science. 347, New York, NY. 1152-1155 (2015).
  13. Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138, 628-644 (2009).
  14. Chitwood, P. J., Hegde, R. S. An intramembrane chaperone complex facilitates membrane protein biogenesis. Nature. , (2020).
  15. Chitwood, P. J., Juszkiewicz, S., Guna, A., Shao, S., Hegde, R. S. EMC Is Required to Initiate Accurate Membrane Protein Topogenesis. Cell. 175, 1-30 (2018).
  16. Bock, F. J., Tait, S. W. G. Mitochondria as multifaceted regulators of cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21, 85-100 (2020).
  17. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, (2019).
  18. Bykov, Y. S., Rapaport, D., Herrmann, J. M., Schuldiner, M. Cytosolic Events in the Biogenesis of Mitochondrial Proteins. Trends in Biochemical Sciences. 45, 650-667 (2020).
  19. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 427, 1135 (2019).
  20. Borgese, N., Coy-Vergara, J., Colombo, S. F., Schwappach, B. The Ways of Tails: the GET Pathway and more. The Protein Journal. , 1-17 (2019).
  21. Mateja, A., Keenan, R. J. A structural perspective on tail-anchored protein biogenesis by the GET pathway. Current Opinion in Structural Biology. 51, 195-202 (2018).
  22. Chio, U. S., Cho, H., Shan, S. Mechanisms of Tail-Anchored Membrane Protein Targeting and Insertion. Annual review of cell and developmental biology. 33, 417-438 (2017).
  23. Denic, V. A portrait of the GET pathway as a surprisingly complicated young man. Trends in biochemical sciences. , (2012).
  24. Hegde, R. S., Keenan, R. J. Tail-anchored membrane protein insertion into the endoplasmic reticulum. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12, 787-798 (2011).
  25. Kalbfleisch, T., Cambon, A., Wattenberg, B. W. A bioinformatics approach to identifying tail-anchored proteins in the human genome. Traffic. 8, Copenhagen, Denmark. 1687-1694 (2007).
  26. Doan, K. N., et al. The Mitochondrial Import Complex MIM Functions as Main Translocase for α-Helical Outer Membrane Proteins. Cell Reports. 31, (2020).
  27. McDowell, M. A., et al. Structural Basis of Tail-Anchored Membrane Protein Biogenesis by the GET Insertase Complex. Molecular Cell. 80, (2020).
  28. Guna, A., Volkmar, N., Christianson, J. C., Hegde, R. S. The ER membrane protein complex is a transmembrane domain insertase. Science. 591, New York, NY. 3099 (2017).
  29. Rao, M., et al. Multiple selection filters ensure accurate tail-anchored membrane protein targeting. eLife. 5, 21301 (2016).
  30. Schuldiner, M., et al. The GET complex mediates insertion of tail-anchored proteins into the ER membrane. Cell. 134, 634-645 (2008).
  31. Chen, Y. -C., et al. Msp1/ATAD1 maintains mitochondrial function by facilitating the degradation of mislocalized tail-anchored proteins. The EMBO journal. 33, 1548-1564 (2014).
  32. Wu, X., Rapoport, T. A. Translocation of Proteins through a Distorted Lipid Bilayer. Trends in Cell Biology. , (2021).
  33. Phillips, B. P., Gomez-Navarro, N., Miller, E. A. Protein quality control in the endoplasmic reticulum. Current Opinion in Cell Biology. 65, 96-102 (2020).
  34. van de Weijer, M. L., et al. Quality Control of ER Membrane Proteins by the RNF185/Membralin Ubiquitin Ligase Complex. Molecular Cell. 79, (2020).
  35. Weir, N. R., Kamber, R. A., Martenson, J. S., Denic, V. The AAA protein Msp1 mediates clearance of excess tail-anchored proteins from the peroxisomal membrane. eLife. 6, 28507 (2017).
  36. Gardner, B. M., et al. The peroxisomal AAA-ATPase Pex1/Pex6 unfolds substrates by processive threading. Nature communications. 9, 135 (2018).
  37. Puchades, C., et al. Unique Structural Features of the Mitochondrial AAA+ Protease AFG3L2 Reveal the Molecular Basis for Activity in Health and Disease. Molecular Cell. , (2019).
  38. Castanzo, D. T., LaFrance, B., Martin, A. The AAA+ ATPase Msp1 is a processive protein translocase with robust unfoldase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 14970-14977 (2020).
  39. Wang, L., Myasnikov, A., Pan, X., Walter, P. Structure of the AAA protein Msp1 reveals mechanism of mislocalized membrane protein extraction. eLife. 9, (2020).
  40. Puchades, C., Sandate, C. R., Lander, G. C. The molecular principles governing the activity and functional diversity of AAA+ proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , 1-16 (2019).
  41. Yang, Y., et al. Folding-Degradation Relationship of a Membrane Protein Mediated by the Universally Conserved ATP-Dependent Protease FtsH. Journal of the American Chemical Society. , 10 (2018).
  42. Baldridge, R. D., Rapoport, T. A. Autoubiquitination of the Hrd1 Ligase Triggers Protein Retrotranslocation in ERAD. Cell. 166, 394-407 (2016).
  43. Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Sorting out how Msp1 maintains mitochondrial membrane proteostasis. Mitochondrion. 49, 128-134 (2019).
  44. Wang, L., Walter, P. Msp1/ATAD1 in Protein Quality Control and Regulation of Synaptic Activities. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 1-24 (2020).
  45. Dederer, V., et al. Cooperation of mitochondrial and ER factors in quality control of tail-anchored proteins. eLife. 8, 1126 (2019).
  46. Matsumoto, S., et al. Msp1 Clears Mistargeted Proteins by Facilitating Their Transfer from Mitochondria to the ER. Molecular Cell. , (2019).
  47. Li, L., Zheng, J., Wu, X., Jiang, H. Mitochondrial AAA-ATPase Msp1 detects mislocalized tail-anchored proteins through a dual-recognition mechanism. EMBO Reports. 20, (2019).
  48. Weidberg, H., Amon, A. MitoCPR - a surveillance pathway that protects mitochondria in response to protein import stress. Science. 360, New York, NY. (2018).
  49. Okreglak, V., Walter, P. The conserved AAA-ATPase Msp1 confers organelle specificity to tail-anchored proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (2014).
  50. Piard, J., et al. A homozygous ATAD1 mutation impairs postsynaptic AMPA receptor trafficking and causes a lethal encephalopathy. Brain. , (2018).
  51. Zhang, J., et al. The AAA+ ATPase Thorase regulates AMPA receptor-dependent synaptic plasticity and behavior. Cell. 145, 284-299 (2011).
  52. Prendergast, J., et al. Ganglioside regulation of AMPA receptor trafficking. The Journal of Neuroscience. 34, 13246-13258 (2014).
  53. Umanah, G. K. E., et al. Thorase variants are associated with defects in glutamatergic neurotransmission that can be rescued by Perampanel. Science Translational Medicine. 9, 4985 (2017).
  54. Pignatelli, M., et al. Synaptic Plasticity onto Dopamine Neurons Shapes Fear Learning. Neuron. 93, 425-440 (2017).
  55. Zhang, J., et al. The AAA Thorase is neuroprotective against ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , 271678 (2018).
  56. Umanah, G. K. E., et al. AMPA Receptor Surface Expression Is Regulated by S-Nitrosylation of Thorase and Transnitrosylation of NSF. Cell Reports. 33, 108329 (2020).
  57. Wohlever, M. L., Mateja, A., McGilvray, P. T., Day, K. J., Keenan, R. J. Msp1 Is a Membrane Protein Dislocase for Tail-Anchored Proteins. Molecular Cell. 67, 194-202 (2017).
  58. Lovell, J. F., et al. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cell. 135, 1074-1084 (2008).
  59. Leshchiner, E. S., Braun, C. R., Bird, G. H., Walensky, L. D. Direct activation of full-length proapoptotic BAK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 986-995 (2013).

Tags

Biokemi udgave 174
Rekonstitution af Msp1 udvindingsaktivitet med fuldt rensede komponenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fresenius, H. L., Wohlever, M. L.… More

Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components. J. Vis. Exp. (174), e62928, doi:10.3791/62928 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter