Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

Published: August 5, 2022 doi: 10.3791/62949
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Chemistry, Bucknell University, 2Program in Cell Biology/Biochemistry, Bucknell University

Summary

DNA metiltransferazlar potansiyel kanser ilaç hedefleridir. Burada, DNA metiltransferaz inhibisyonu için küçük molekülleri değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlil, DNA metilasyonunu floresan üretimine bağlamak için bir endonükleaz kullanır ve enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Abstract

Epigenetik gen regülasyonunun bir formu olan DNA metilasyonu, normal hücresel fonksiyon için önemlidir. Hücrelerde, DNA metiltransferazlar (DNMT'ler) adı verilen proteinler, DNA metilasyon paternini oluşturur ve korur. Normal DNA metilasyon paternindeki değişiklikler, kanser gelişimi ve ilerlemesi ile bağlantılıdır ve DNMT'leri potansiyel kanser ilacı hedefleri haline getirir. Bu nedenle, bu enzimlerin yeni küçük molekül inhibitörlerinin tanımlanması ve karakterize edilmesi büyük önem taşımaktadır. Bu yazıda DNA metiltransferaz inhibitörlerinin taranmasında kullanılabilecek bir protokol sunulmaktadır. Sürekli eşleşmiş kinetik tahlil, potansiyel küçük molekül inhibitörlerinin varlığında ve yokluğunda DNA metilasyonunun başlangıç hızlarının belirlenmesini sağlar. Tahlil, bir hemimetillenmiş DNA substratının metilasyonunu floresan üretimine bağlamak için metile duyarlı endonükleaz Gla I'i kullanır.

Bu sürekli tahlil, enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Tahlilin mikrotitre plakalarında küçük hacimlerde yapılması, reaktiflerin maliyetini azaltır. Bu tahlil kullanılarak, insanlarda en bol DNMT izozimi olan DNMT1 inhibitörleri için küçük bir örnek tarama yapıldı. Yüksek oranda ikame edilmiş antrakinon doğal ürünü olan lakkaik asit A, DNMT1'in güçlü, DNA ile rekabet edebilecek bir inhibitörüdür. Burada, tahlil protokolünü tanımlamak için üç potansiyel küçük molekül inhibitörünü - antrakinonlar veya bir ila üç ikame maddeli antrakinon benzeri moleküller - iki konsantrasyonda inceliyoruz. Başlangıç hızları, her molekülün varlığında gözlenen yüzde aktivitesini hesaplamak için kullanılır. İncelenen üç bileşikten biri, DNMT1 aktivitesinin konsantrasyona bağlı inhibisyonunu sergiler ve bu da DNMT1'in potansiyel bir inhibitörü olduğunu gösterir.

Introduction

DNA metilasyonu, gen ekspresyonunu ve kromatin yapısını düzenleyen önemli bir epigenetik işarettir. Metilasyon ağırlıklı olarak CpG dinükleotidlerinde meydana gelir - sitozin ve ardından guanosin; metil grubu, sitozinin 5 pozisyonuna eklenir. Uygun hücresel gelişim ve fonksiyon için doğru DNA metilasyon paternleri ve dolayısıyla uygun gen ekspresyonu gereklidir. Birçok hastalık durumu, normal metilasyon paterni 1,2,3'teki değişikliklerle ilişkilendirilmiştir. Örneğin, kanser başlangıcı ile ilerlemesi ve DNA metilasyon paternindeki değişiklikler arasında bir bağlantı vardır. Tipik olarak, kanser hücreleri, genom instabilitesine katkıda bulunan daha düşük genel metilsitozin seviyeleri sergiler. Aynı zamanda, genomda bulunan metilsitozin, tümör baskılayıcı genlerin promotör bölgelerinde yoğunlaşır ve bu da bu önemli proteinlerin gen susturulmasına yol açar. Özellikle, epigenetik değişiklikler, tümörigenez ile ilişkili DNA mutasyonlarının aksine, dinamik ve geri dönüşümlüdür. Bu, epigenetik gen regülasyonunda yer alan proteinleri ilginç ilaç hedefleri 2,4 haline getirmiştir.

DNA metiltransferazlar (DNMT'ler), DNA metilasyon paternlerinin üretilmesinden ve korunmasından sorumlu proteinlerdir. Katalitik olarak aktif üç izozim, DNMT1, DNMT3a ve DNMT3b, insanlarda bulunur. Gelişim ve farklılaşma sırasında, de novo metiltransferazlar, DNMT3a ve DNMT3b, metilasyon paternleri oluşturur. Her iki enzim de katalitik olarak inaktif DNMT3L proteinini, artan aktivite 1,5 sergileyen kompleksler oluşturmak için bağlayabilir. Hücre bölünmesini takiben, yavru hücreler hemimetillenmiş DNA içerir - dubleksin sadece bir ipliğinde metilsitozin içeren DNA - çünkü yeni sentezlenen DNA metilasyon izlerinden yoksundur. DNMT1'in ana işlevi, bu hemimetillenmiş DNA'yı metillemek ve böylece tam metilasyon paterni 1,5'i yeniden oluşturmaktır.

DNMT aktivitesi ve kanser arasındaki bağlantılar iyi kurulmuştur. DNMT1'in transkripsiyonel veya post-translasyonel mekanizmalarla aşırı ekspresyonu, birkaç yaygın onkojenik yolunbir sonucudur 6,7,8,9. Hipomorfik aleller kullanarak DNMT1 aktivitesini düşürmeye yönelik genetik yaklaşımlar, Apc (Min) farelerde tümör oluşumunun azalmasına neden olur10. DNMT1'i deviren antisens oligonükleotidler hücre kültüründe neoplaziyi inhibe eder ve fare tümörü modelleri11,12. Bu nedenle, DNMT1 aktivitesini inhibe etmek umut verici bir kanser tedavisi yaklaşımı gibi görünmektedir. Bununla birlikte, DNMT3 izozimlerinin oynadığı roller o kadar basit değildir. DNMT3a mutasyonları akut miyeloid lösemi13 ve miyelodisplastik sendrom14'te bulunur. Tanımlanan mutasyonlardan en az birinin,enzim 15'in DNA metilasyon aktivitesini azalttığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, DNMT3b meme kanseri16 ve kolorektal kanser17'de aşırı eksprese edilir. Çeşitli DNMT izozimleri karsinogenezde farklı roller oynarken, izozime özgü inhibitörlerin tanımlanması kritik öneme sahip olacaktır. Bu bileşikler sadece terapötiklerin gelişimi için yararlı olmakla kalmayacak, aynı zamanda izozime özgü inhibitörler de her DNMT izoziminin kanser etiyolojisindeki rolünü incelemek için paha biçilmez bir araç olacaktır.

Literatürde çeşitli DNMT inhibitörleri bildirilmiştir. Bilinen DNMT inhibitörleri iki sınıfa ayrılabilir: nükleozid ve nükleozid olmayan. Nükleozid inhibitörleri tipik olarak sitidin analoglarıdır. 5-azasitidin ve 5-aza-2'-deoksisitidin miyelodisplastik sendrom ve akut miyeloid lösemi 4,18'in tedavisi için onaylanmıştır. Bu bileşiklerin yüksek toksisitesi, düşük biyoyararlanımı ve kimyasal instabilitesi sorun yaratmaktadır. Devam eden çalışmalar, yeni nesil nükleozid inhibitörlerinin etkinliğini incelemektedir; 5-aza-2'-deoksisitidinden türetilen SGI-110, bir örnek 19,20'dir. Nükleozid inhibitörleri izozime özgü değildir ve karşılaşılan herhangi bir DNMT izozimini inaktive eder. Bu nedenle, bir nükleozid demetilasyon ajanı ile tedavi, tüm DNMT izozimlerinin 4,18 tükenmesine neden olur. Nükleozid olmayan inhibitörlerin, inhibitör etkilerini göstermek için DNA'ya dahil edilmeleri gerekmez. Bunun yerine, bu moleküller doğrudan DNMT'lere bağlanır ve izozime özgü inhibisyon olasılığını ortaya çıkarır. SGI-1027 21, hidralazin 22, prokainamid23, RG108 ve türevleri 24 ve doğal ürünler, (-)-epigallocatechin 3-gallate (EGCG)25 ve lakkaik asit A26,27 dahil olmak üzere bugüne kadar çeşitli nükleozid olmayan inhibitörler keşfedilmiştir. Bugüne kadar keşfedilen nükleozid olmayan inhibitörlerin çoğu izozim seçici değildir veya bir DNMT izozimi için zayıf tercihler göstermektedir. Ek olarak, bu moleküllerin gücünün, özellikle 4,18 hücrelerinde iyileştirilmesi gerekir. Bu nedenle, daha güçlü, izoenzim seçici DNMT inhibitörlerini keşfetmeye veya geliştirmeye ihtiyaç vardır.

DNMT'lerin yeni küçük molekül inhibitörlerini keşfetmenin önündeki bir engel, DNMT aktivitesini incelemek için geleneksel olarak kullanılan zahmetli tahlillerdir28. Tahliller genellikle birden fazla adımda süreksizdir. DNMT'lerin enzimatik aktivitesi hala radyoaktif S-adenosil metiyonin (SAM) 29,30,31,32,33,34 kullanılarak rutin olarak test edilmektedir. DNA metilasyonu için radyoaktif olmayan testler de geliştirilmiştir. Örneğin, sindirim ürünlerini ayırmak için metile duyarlı kısıtlama endonükleazları ve elektroforez kullanan tahliller35,36 tanımlanmıştır. Bu tür süreksiz, çok adımlı analizler ilaç keşfine kolayca uygun değildir. 2000'li yılların ortalarından bu yana, daha yüksek verime sahip birkaç DNA metilasyon testi geliştirilmiştir28. DNMT1 inhibitörlerini taramak için bir sintilasyon yakınlık testi kullanıldı37. DNMT3a inhibitörleri 25,38'i taramak için metile duyarlı bir kısıtlama endonükleazı kullanan başka bir tahlil kullanıldı. Her iki tahlil de geleneksel DNA metilasyon tahlillerinden daha yüksek verime izin verirken, tahliller birden fazla adım gerektirir ve metilasyon aktivitesinin gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesine izin vermez. Daha yakın zamanlarda, metilasyon reaksiyonunun bir ürünü olan S-adenosilhomosistein (SAH) oluşumunu, NADPH oksidasyonu39 ile ilişkili 340 nm'deki spektroskopik değişimle eşleştiren sürekli bir kinetik tahlil tanımlanmıştır. Bu tahlil, spektroskopik bir sinyal üretmek için üç bağlantı enzimi kullanır.

Ticari olarak temin edilebilen tek bir kuplaj enzimi kullanan ve gerçek zamanlı olarak veri üretebilen floresan bazlı endonükleaz kuplajlı DNA metilasyon testi geliştirdik (Şekil 1). Substrat olarak üç metilsitozin içeren bir saç tokası oligonükleotid kullanılır. Substrat DNA'sı 5' ucunda bir florofor ve 3' ucunda bir söndürücü içerir. Hemimetile CpG bölgesinin metilasyonu, endonükleaz Gla I - tamamen metillenmiş GCGC için bölünme bölgesini oluşturur. Gla I ürün oligonükleotidinin bölünmesi, floroforu söndürücüden serbest bırakır ve gerçek zamanlı olarak floresan üretir. Tahlil, DNMT'nin herhangi bir izoformunun aktivitesini incelemek için kullanılabilir; Bununla birlikte, DNMT1 ile daha yüksek aktivite gözlenir, çünkü bu izoenzim tercihen hemimetillenmiş DNA 1,5'i metilleştirir. Otoinhibitör Replikasyon Odakları Hedefleme Dizisi (RFTS) etki alanı DNMT1'den kaldırılırsa daha da sağlam etkinlik gözlenir. N-terminal düzenleyici bölgede bulunan bu alan, katalitik bölgeye bağlanır ve DNA bağlanmasını önler. İlk ~ 600 amino asidin uzaklaştırılması, tam uzunluktaki enzimden önemli ölçüde daha aktif olan kesilmiş bir enzimle sonuçlanır (kcat / Km'de ~ 640 kat artış)40. RFTS'den yoksun DNMT1 (amino asitler 621-1616) olarak adlandırılan enzimin bu aktif formu, artan katalitik gücü nedeniyle inhibitörlerin daha kolay tanımlanmasını sağlar. Bu makale, potansiyel küçük molekül inhibitörlerini taramak için RFTS'den yoksun DNMT1'i testlerde kullanmak için bir protokol sunmaktadır. Endonükleaz ile eşleşmiş sürekli tahlil kullanılarak, başlangıç hızı birkaç küçük molekülün varlığında ve yokluğunda belirlenir. Her potansiyel inhibitör, konsantrasyona bağımlı DNMT1 inhibisyonunu aramak için iki konsantrasyonda incelenir. Küçük moleküllerin varlığında gözlenen yüzde aktivitesi her durumda hesaplandı.

Figure 1
Şekil 1: DNA metilasyon testi. Substrat olarak 5' ucunda bir florofor ve 3' ucunda bir söndürücü bulunan hemimetillenmiş bir saç tokası DNA'sı kullanılır. DNMT1, metil grubunun S-adenosilmetioninden metillenmemiş CpG bölgesine transferini katalize ederek S-adenosilhomosistein ve tamamen metillenmiş DNA üretir. DNA ürünü, tamamen metillenmiş GCGC bölgelerini parçalayan endonükleaz Gla I için bölünme bölgesini içerir. Ürün DNA'sının bölünmesi, 3' söndürücüden 5' floroforu serbest bırakarak floresan üretir. Kısaltmalar: Fl = florofor; Q = quencher; DNMT1 = DNA metiltransferaz 1; SAM = S-adenosilmetiyonin; SAH = S-adenosilhomosistein. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Ekran için tahlil çözümleri hazırlayın

NOT: Bu tahlilde kullanılan substratların konsantrasyonları uyarlanabilir. RFTS'siz DNMT1 için, saç tokası DNA substratı ve SAM için deneysel olarak belirlenen Km değerleri sırasıyla 1-2 nM ve 2 μM, 26,40'tır.

  1. Buz üzerindeki mikrosantrifüj tüplerinde test edilen her tahlil koşulunun 600 μL'sini hazırlayın.
    NOT: Gerekli tahlil çözümünün toplam hacmi, yürütülen çoğaltma sayısına bağlıdır. Her tahlil koşulu bu protokol için üçlü olarak çalıştırıldı.
    1. Son1xtampon konsantrasyonunu elde etmek için her tüpe ddH 2 O ve 5x metilasyon tamponu (250 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl 2, 500 mM potasyum glutamat, 5 mM ditiyotreitol (DTT),% 25 gliserol) ekleyin. 20 μM bileşiği içeren tahliller için, 472 μL ddH2O ve 120 μL 5x tampon ekleyin. 50 μM bileşik içeren tahliller için, 470 μL ddH2O ve 120 μL 5x tampon ekleyin.
    2. Her numuneye 3.15 μL 20 mg/mL sığır serum albümini (BSA) ekleyin.
    3. Her numuneye 2 μL 3.15 μM saç tokası DNA substratı ve 1.33 μL 4.75 mM SAM ekleyin.
      NOT: Tahlil çözeltisi karışımındaki substratların konsantrasyonu, istenen nihai konsantrasyonların 1.05 katıdır.
    4. Uygun numunelere 21 μM (10 mM'lik 1.26 μL) veya 52.5 μM (10 mM'lik 3.15 μL) nihai konsantrasyona inhibitör ekleyin. Bir kontrol numunesine eşdeğer miktarda dimetilsülfoksit (DMSO) ekleyin.
      NOT: Ekranda kullanılan inhibitör konsantrasyonu değişebilir. Maksimum nihai DMSO konsantrasyonu %≤5 (d/v) olmalıdır. %5'e (v/v) kadar DMSO konsantrasyonlarının tahlil26'da gözlenen aktivite üzerinde hiçbir etkisi yoktur.
  2. Çözeltileri vorteks (3.000 rpm) ile 3 s boyunca karıştırın. Çözeltinin tüpün dibinde toplandığından emin olmak için numuneleri masa üstü mini santrifüjde (1.200 × g) birkaç saniye döndürün.
  3. Her tahlil çözeltisinin Aliquot 95 μL'si, siyah yarım alanlı 96 kuyucuklu bir plakada 6 ardışık kuyucuk içine (Şekil 2).
    NOT: Bu tarama testleri iki grup halinde gerçekleştirilmiştir. İlk olarak, 20 μM inhibitör örneği (4 toplam koşul) incelendi, ardından 50 μM inhibitör örneği (4 toplam koşul) incelendi.

Figure 2
Resim 2: Tahlil plakası kurulumu. Her tahlil çözeltisi, siyah 96 kuyucuklu plakada altı kuyucuk halinde alınır: DMSO kontrolü (mavi), bileşik 1 (yeşil), bileşik 2 (kırmızı) ve bileşik 3 (sarı). Hem RFTS'den yoksun DNMT1 hem de Gla I üç kuyuya eklenecek. Kontrol olarak, Gla I tek başına diğer üç kuyuya eklenecek. Kısaltmalar: RFTS = Replikasyon Odakları Hedefleme Dizisi; DNMT1 = DNA metiltransferaz 1; DMSO = dimetilsülfoksit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Elek için enzim çözeltileri hazırlayın

NOT: RFTS'den yoksun DNMT1, E. coli ile ifade edilebilir ve homojenliğe saflaştırılabilir. RFTS'den yoksun DNMT1 için ekspresyon ve saflaştırma prosedürleri daha önce41 olarak tanımlanmıştır. İhtiyaç duyulan enzimin hacmi, yapılan tahlillerin sayısına bağlıdır. Burada her sette dört farklı tahlil yapılmaktadır; her tahlil üçlü olarak tamamlanır.

  1. Her enzim çözeltisinin 75 μL'sini buz üzerindeki mikrosantrifüj tüplerinde hazırlayın.
    NOT: İki enzim çözeltisine ihtiyaç duyulacaktır. Bir çözüm DNMT1 ve Gla I içerecektir; diğeri sadece Gla I'i içerecektir.
    1. Son1xtampon konsantrasyonunu elde etmek için her tüpe ddH 2 O ve 5x metilasyon tamponu (250 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl 2, 500 mM potasyum glutamat, 5 mM DTT,% 25 gliserol) ekleyin. Gla I enzim çözeltisi için, 15 μL 5x tampon ve 58.8 μL ddH2O ekleyin. DNMT1 + Gla I enzim çözeltisi için, 15 μL 5x tampon ve 58.2 μL ddH2O ekleyin.
    2. 0.16 U/μL'lik son konsantrasyon için her çözeltiye 1.2 μL 10 U/μL Gla I ekleyin.
    3. DNMT1+Gla I çözeltisine 40 nM'lik son konsantrasyon için 0,6 μL 5 μM RFTS eksikliği olan DNMT1 ekleyin.
  2. Çözeltileri karıştırmak için hafifçe dokunun. Çözeltinin tüpün dibinde toplandığından emin olmak için numuneleri masa üstü mini santrifüjde (1.200 × g) birkaç saniye döndürün.
  3. Her enzim çözeltisinin 12 μL'sini konik tabanlı 96 delikli bir plakada 6 kuyucuk halinde Aliquot (Şekil 3).

Figure 3
Resim 3: Enzim plakası kurulumu. Gla I (gri) ve DNMT1 + Gla I (mavi) çözümlerinin her biri 96 delikli plakada altı kuyuya ayrılır. Çok kanallı bir pipet kullanarak, enzim aynı anda bir dizi tahlil çözeltisine eklenebilir. Her tahlil koşulu için (altı kuyu), üç kuyu DNMT1 + Gla I alacak ve üç kuyu sadece Gla I'i alacaktır. Kısaltma: DNMT1 = DNA metiltransferaz 1. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Tahlili çalıştırın ve verileri analiz edin.

  1. Plaka okuyucuyu önceden 37 °C'ye ısıtın. Tahlil çözeltilerini içeren siyah plakayı yerleştirin. Plakayı sallayın (5 s için 425 cpm'de çift yörünge) ve floresanı 485 nm uyarma dalga boyu ve 528 nm emisyon dalga boyu ile okuyun. Plakayı 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Alternatif olarak, floresan okumaları için uygun dalga boyu kesiklerine sahip filtreler kullanılabilir.
  2. Tahlil plakasını çıkarın. Her bir oyuğa 5 μL enzim çözeltisi ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
    NOT: Bir dizi numunenin aynı anda başlatılabilmesi için çok kanallı pipetler kullanın.
  3. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin. 30 dakika boyunca her 53 saniyede bir floresan kaydedin. Her okumadan önce plakayı sallayın (4 s için 425 cpm'de çift yörüngeli).
  4. Ortalama üçlü Gla I her durum için kontrol tahlilleri. RFTS eksikliği olan DNMT1 varlığında elde edilen üçlü izlerden ortalama Gla I içeren kontrol reaksiyonu izini çıkarın. Düzeltilen çoğaltmalar için ortalamanın ortalama ve standart hatasını belirleyin.
  5. Ortalama düzeltilmiş reaksiyon izini çizin ve başlangıç hızını belirlemek için ilk doğrusal kısmı bir çizgiye sığdırın.
  6. Bir bileşiğin varlığında gözlenen hızı, DMSO içeren kontrol reaksiyonunda gözlenen hıza bölerek ve 100 ile çarparak yüzde aktivitesini belirleyin.

4. Ek tahlil kontrolü - enzimlerin sıralı olarak eklenmesi

  1. Buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpünde 550 μL tahlil çözeltisi hazırlayın. 110 μL 5x metilasyon tamponu, 3.88 μL 3.15 μM saç tokası DNA substratı, 6.43 μL 47.5 mM SAM, 3.06 μL 20 mg/mL BSA ve 426.6 μL ddH2O ekleyin.
  2. Çözeltiyi 3 s boyunca vorteks (3.000 rpm) ile karıştırın. Çözeltinin tüpün dibinde toplandığından emin olmak için numuneleri masa üstü mini santrifüjde (1.200 × g) birkaç saniye döndürün.
  3. Aliquot 90 μL tahlil çözeltisi siyah yarım alanlı 96 kuyucuklu bir plakada 6 ardışık kuyucuk içine alınır.
  4. DNMT1 enzim çözeltilerini buz üzerinde hazırlayın. Bir tüpe 4 μL 5x metilasyon tamponu, 0.76 μL 5 μM RFTS eksikliği DNMT1 ve 15.24 μL ddH2O ekleyin. Başka bir tüpe 4 μL 5x metilasyon tamponu ve 16 μL ddH2O ekleyin.
  5. Çözeltileri karıştırmak için hafifçe dokunun. Çözeltinin tüpün dibinde toplandığından emin olmak için numuneleri masa üstü mini santrifüjde (1.200 × g) birkaç saniye döndürün.
  6. DNMT1 içeren çözeltinin 5 μL'sini, siyah yarım alanlı 96 delikli plakadaki üç kuyucuğa ekleyin. Diğer üç kuyucuğa tampon kontrol çözeltisinden 5 μL ekleyin.
  7. Mikrotitre plakasını 37 °C'ye ısıtılmış plaka okuyucuya yerleştirin. Plakayı sallayın (3 s için 425 cpm'de çift yörünge) ve floresanı 485 nm uyarma dalga boyu ve 528 nm emisyon dalga boyu ile okuyun. Sallamayı tekrarlayın ve 30 dakika boyunca her 60 saniyede bir okuyun.
  8. Tahlil plakası plaka okuyucusundayken, Gla I çözeltisini buz üzerinde hazırlayın. Bir mikrosantrifüj tüpüne 8 μL 5x metilasyon tamponu, 0.64 μL 10 U/μL Gla I ve 31.4 μL ddH2O ekleyin. Çözeltiyi karıştırmak için hafifçe dokunun. Çözeltinin tüpün dibinde toplandığından emin olmak için numuneyi masa üstü mini santrifüjde (1.200 × g) birkaç saniye döndürün.
  9. Gla I çözeltisinin Aliquot 6 μL'si, konik tabanlı 96 kuyucuklu bir plakada 6 kuyucuk halindedir.
  10. İlk 30 dakikalık okumayı takiben, siyah plakayı plaka okuyucusundan çıkarın. 6 kuyucuğun hepsine 5 μL Gla I çözeltisi ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek, karıştırın.
    NOT: Tüm kuyuların aynı anda başlatılabilmesi için çok kanallı bir pipet kullanın.
  11. Siyah plakayı tekrar plaka okuyucuya yerleştirin. 35 dakika boyunca her 35 saniyede bir floresan kaydedin. Her okumadan önce plakayı sallayın (3 s için 425 cpm'de çift yörüngeli).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etkin DNMT1 bu analiz için bir önkoşuldur. RFTS'den yoksun DNMT1, E.coli'de eksprese edildi ve daha önce yayınlanmış prosedürleri takiben homojenliğe saflaştırıldı41. Saflaştırılmış enzimin aktif olduğundan emin olmak için, DNA metilasyon aktivitesini incelemek için süreksiz bir endonükleaz kuplajlı tahlil kullanıldı36. Bu tahlil, bir Sau3A1 bölünme bölgesine yerleştirilmiş tek bir hemimetillenmiş CpG ile 32 baz çifti dubleks DNA kullanır. Sau3A1, hemimetillenmiş substrat DNA'sını parçalayabilir; Bununla birlikte, DNA tamamen metillendiğinde bölünme bloke edilir. RFTS'siz DNMT1, 1 μM DNA ve 0.5 mM SAM içeren tahlillere eklendi ve alikotlar çıkarıldı ve 30 dakika boyunca flaşla donduruldu. Örnekler daha sonra Sau3A1 ile sindirildi ve ürünler jel elektroforezi ile ayrıldı. Şekil 4'te gösterildiği gibi, reaksiyon süresi arttıkça DNA bölünmeden korunur, bu da RFTS'den yoksun DNMT1'in hemimetillenmiş DNA'yı metilleştirdiğini gösterir. Tahlilde orijinal olarak bulunan 1 μM substrat DNA'sının çoğu, 30 dakikalık zaman dilimi boyunca ürüne dönüştürülmüştür.

Bu yazıda açıklanan endonükleaz kuplajlı tahlil, floresandaki bir artış olarak DNA metilasyon aktivitesinin gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesini sağlar. Bu tahlilin başarısının anahtarı, endonükleaz Gla I. Gla I'in metil duyarlılığıdır. Floroforu söndürücüden serbest bırakmak ve floresanda bir artış oluşturmak için saç tokası DNA'sının bölünmesi gerekir. Enzimlerin beklendiği gibi çalıştığını göstermek için, RFTS'den yoksun DNMT1 ve Gla I enzimlerinin eşzamanlı olarak değil, sırayla eklendiği bir kontrol reaksiyonu gerçekleştirildi. Birleştirilmiş tahlil doğru çalışıyorsa, DNMT1 ilavesi floresanı etkilememelidir, çünkü DNA substratının metilasyonunun dahili olarak söndürülmüş saç tokası DNA'sının arka plan floresansını etkilemesi beklenmez. Bununla birlikte, Gla I'in metiltransferaz içeren tahlillere daha sonra eklenmesi, tamamen metillenmiş saç tokası DNA'sının bölünmesi nedeniyle floresan oluşumuna neden olmalıdır. Hemimetillenmiş saç tokası DNA substratının kendisi arka plan floresansına sahiptir (Şekil 5); Bu testler 20 nM saç tokası DNA'sı ve 500 μM SAM içeriyordu. RFTS'siz DNMT1 veya tampon tahlillere eklendi ve floresan 30 dakika boyunca takip edildi.

Şekil 5'te görüldüğü gibi, floresan, bağlantı enziminin yokluğunda RFTS'siz DNMT1'den etkilenmez (mavi tonlar 10 nM RFTS'den yoksun DNMT1 içerirken, kırmızı tonlar tampon kontrolüdür). Bu nedenle, DNMT1 tarafından hemimetillenmiş CpG bölgesinin metilasyonu, floresan sinyalini önemli ölçüde değiştirmez. Bununla birlikte, Gla I tüm kuyucuklara eklendiğinde, sağlam floresan üretimi sadece RFTS'den yoksun DNMT1 içeren tahlillerde gözlenmiştir (Şekil 5). Bu, hemimetillenmiş substrat DNA'sının DNMT1 tarafından metilasyonunun, Gla I bölünmesi ve floresan üretimi için gerekli olduğunu göstermektedir. Bu kontrol testinde gözlenen floresan artışının, enzimler sırayla eklendiği için Gla I'in aktivitesini yansıttığı belirtilmelidir. Alternatif olarak, bu reaksiyon karışımları Gla I ile sindirilebilir ve elde edilen oligonükleotidler, bölünmeyi görselleştirmek ve enzimlerin beklendiği gibi çalışmasını sağlamak için elektroforez ile ayrılabilir.

DNMT1'in başlangıç hızlarını doğrudan belirlemek için bu birleştirilmiş tahlili kullanmak için, RFTS'den yoksun DNMT1 ve Gla I enzimlerinin her ikisinin de aynı anda eklenmesi gerekir. Ürün DNA'sının Gla I bölünme hızı, DNMT1 tarafından DNA metilasyon hızından daha hızlı olduğu sürece, üretilen floresan sinyali DNA metilasyon aktivitesini yansıtacaktır. DNMT1 aktivitesinin hız sınırlayıcı olmasını sağlamak için, DNMT1 konsantrasyonu, diğer tüm tahlil koşulları sabit tutulurken değiştirilebilir. Floresan üretim hızı, DNMT1 konsantrasyonu ile orantılı olmalıdır. Bu daha önce RFTS'den yoksun DNMT1 için burada kullanılan koşullar altında gösterilmiştir40. DNMT aktivitesini incelemek için bu birleştirilmiş tahlil kullanıldığında, hem DNMT1 hem de Gla I içeren reaksiyona ek olarak Gla I içeren bir kontrol reaksiyonu gerçekleştirilir (Şekil 6A). Gla I kontrolünün birkaç işlevi vardır. Gla I kontrol reaksiyonu izinin DNMT içeren reaksiyon izinden çıkarılması, hem hemimetillenmiş DNA substratının yavaş bölünmesinin hem de arka plan floresansının hesaplanmasına izin verir. Üretilen düzeltilmiş reaksiyon izleri, DNMT1'in DNA metilasyon aktivitesini yansıtır. Düzeltilmiş reaksiyon izinin ilk doğrusal kısmının takılması, başlangıç hızının belirlenmesine izin verir (Şekil 6B). 10 nM saç tokası DNA substratı ve 10 μM SAM ile 113 ± 2 RFU / dak başlangıç hızı elde edildi.

İkame edilmiş antrakinonların daha önce DNMT1'in aktivitesini inhibe ettiği gösterilmiştir. Doğal ürün, lakkaik asit A, yüksek oranda ikame edilmiş bir antrakinon, DNMT127'nin güçlü, DNA ile rekabet eden bir inhibitörüdür. Daha basit yapılara sahip birkaç bileşiğin, antrakinon çekirdeği üzerinde bir veya iki ikameci, biri hacimli bir aromatik ikame maddesi olmak üzere, DNMT1'i DNA ile rekabet edebilecek bir şekilde inhibe ettiği gösterilmiştir41. Burada, Gla I-kuplajlı tahlilde RFTS'den yoksun DNMT1 aktivitesini inhibe etmek için üç ikame edilmiş antrakinon veya antrakinon benzeri molekülün yeteneği, bu tarama testlerinin nasıl yapılacağına bir örnek olarak incelenmiştir. Bu bileşikler, hepsi antrakinon çekirdeğinin bir tarafında bir ila üç ikame madde içeriyordu (Tablo 1). Bu testler için kullanılan substrat konsantrasyonları (10 nM DNA ve 10 μM SAM), her substrat için Km'den ~ 5 kat daha yüksektir. Tahlilde üretilen sinyal doğrudan substrat DNA'sından gelir. Bu nedenle, Km'nin yakınındaki veya altındaki konsantrasyonlarda tahlil yapmak zordur; tespit etmek için yeterli sinyal yok. Bu substrat konsantrasyonları, inhibitörlerin yokluğunda bu koşullar altında sağlam aktivite görüldüğü için seçilmiştir (Şekil 6B). Diğer substrat konsantrasyonları tarama tahlillerinde kullanılabilir. Örneğin, SAM konsantrasyonlarını doyurmak için bir tarama yapmak, aramayı SAM-rekabetçi inhibitörlere karşı önyargılı hale getirmek için bir strateji olarak kullanılabilir.

Her tahlil, saç tokası DNA substratını, metil bağışlayan ko-faktör SAM'ı ve ekran için bir kontrol olarak potansiyel bir inhibitör veya DMSO'yu içeriyordu. Tahlillerde kullanılmak üzere DMSO'daki tarama bileşiklerinin 10 mM çözeltilerini rutin olarak üretiyoruz. Burada incelenenler gibi antrakinonlar, sulu çözeltilerde zayıf çözünürlük gösterir. Böylece, konsantre stoklar oluşturmak için, DMSO bir çözücü olarak kullanılır. DMSO'nun% 5'e kadar (v / v) nihai konsantrasyonun eklenmesi, tahlil26'daki aktiviteyi etkilemez. Bununla birlikte, sulu çözeltide düşük çözünürlüğe sahip bileşiklerle uğraşırken, bileşiğin seçilen son eleme konsantrasyonlarında çözünür olmasını sağlamak için özen gösterilmelidir.

Ekranda incelenen her durum için, Gla I içeren bir kontrol testi yapılır. Arka plan floresansını ve substrat saç tokası DNA'sının yavaş bölünmesini hesaba katmanın yanı sıra, bu kontrol, potansiyel inhibitörün spektroskopik sinyale müdahale edip etmediğinin belirlenmesine izin verir (örneğin, floresandır). Enzimler eklenerek reaksiyon başlatıldıktan sonra, tarama verilerinde 53 s'lik bir zaman aralığı ile 30 dakika boyunca floresan ölçüldü. Bu, bu laboratuvardaki plaka okuyucusunda 96 delikli bir plakanın tamamını okurken mevcut olan en hızlı zaman aralığıdır. Reaksiyon izlerini oluşturmak için diğer zaman aralıkları kullanılabilir. Uygun bir zaman aralığı, kullanılan cihaza ve okunan kuyu sayısına bağlı olacaktır. Tekrarlanabilirliği sağlamak için, her tahlil üçlü olarak gerçekleştirilir. Ortalama Gla I içeren kontrol izi, RFTS eksikliği olan DNMT1 varlığında gözlenen reaksiyon izlerinden çıkarılır. Reaksiyonun başlangıç hızı, düzeltilmiş reaksiyon izlerinin ilk doğrusal kısmına uyutularak belirlenebilir.

Başlangıçta, üç potansiyel inhibitörün floresan üretimi üzerindeki etkisi, 20 μM'lik bir son konsantrasyonda incelendi. İlk olarak, tahlildeki substrat konsantrasyonlarının her ikisi de kendi Km değerlerinin üzerindedir. Bu, özellikle inhibitörler rekabetçiyse, kinetik tahlillerde inhibisyonu tespit etmeyi zorlaştırabilir. İkincisi, bu ekranda kullanılan antrakinon benzeri bileşikler, bilinen inhibitör lakkaik asit A'dan yapı olarak önemli ölçüde daha basittir. Bu moleküller çekirdek yapının etrafında sadece birkaç ikame madde içerdiğinden, daha zayıf etkileşimler öngördük. DMSO içeren kontrol testinde başlangıç hızı 111 ± 5 RFU/dk elde edilmiştir (Şekil 7A). Bunun, DMSO'nun yokluğunda daha önce bildirilen orana çok benzediğini ve düşük miktarda DMSO eklenmesinin gözlemlenen aktiviteyi etkilemediğini doğruladığını unutmayın. İki bileşiğin eklenmesi, gözlemlenen başlangıç hızını azaltırken, üçüncü bileşiğin eklenmesinin aktivite üzerinde hiçbir etkisi olmamıştır. İlk hızlar, her bir bileşiğin varlığında gözlenen yüzde aktivitesini belirlemek için kullanıldı. 20 μM'de, bileşik 1 ve 2'nin eklenmesi ~% 80'lik bir yüzde aktivite ile sonuçlanırken, bileşik 3'ün varlığında% 100 aktivite gözlenmiştir, bu da bu molekülün enzimi inhibe etmediğini göstermektedir (Tablo 1).

İnhibitörlerin konsantrasyona bağlı inhibisyon göstermesi beklenir. Daha sonra, bu moleküller 50 μM'lik daha yüksek bir konsantrasyonda yeniden incelendi. Bu tahlil seti için, DMSO içeren kontrol testinin başlangıç hızı 125 ± 7 RFU / dak'ydı (Şekil 7B). Bu hız daha önce belirlenen oranlardan biraz daha yüksektir; ancak, bu hızların hepsi hata içinde nispeten yakındır. Yine, bileşik 3'ün başlangıç hızı üzerinde çok az etkisi varken, bileşik 1 ve 2'nin eklenmesi gözlemlenen başlangıç hızını azalttı. Beklendiği gibi, daha yüksek konsantrasyonda, bileşik 1'in aktivite üzerinde daha büyük bir etkisi vardı. 50 μM'de, bileşik 1'in eklenmesi ~% 60'lık bir yüzde aktivitesi ile sonuçlandı (Tablo 1). Bununla birlikte, daha yüksek bir bileşik 2 konsantrasyonunun eklenmesi, daha sağlam bir inhibisyona neden olmamıştır. 50 μM bileşik 2 varlığında gözlenen yüzde aktivite yine% 80'e yakındı.

Sunulan verilerde görülebileceği gibi, endonükleaz kuplajlı floresan bazlı DNA metilasyon testi, potansiyel DNMT inhibitörlerini taramak için kullanılabilir. Veriler, bileşik 1 ve bileşik 2'nin potansiyel inhibitörler olduğunu, bileşik 3'ün ise olmadığını göstermektedir. Potansiyel inhibitörleri gerçek DNMT1 inhibitörleri olarak doğrulamak için ek çalışmalara ihtiyaç vardır.

Figure 4
Şekil 4: DNMT1 etkinlik kontrolü. Hemimetile dubleks DNA metilasyonu, Sau3A1 bölünmesine karşı korur. RFTS'siz DNMT1, 1 μM DNA ve 500 μM SAM içeren tahlil karışımlarına eklendi. Örnekler, 37 ° C'de 30 dakikalık bir inkübasyon sırasında belirtilen zaman noktalarında toplandı, Sau3A1 ile sindirildi ve% 18 PAGE'de jel elektroforezi ile çözüldü. Burada 5, 10, 15 ve 30 dakikalık örnekler gösterilmektedir. İlk şerit, DNMT1'den yoksun bir kontroldür. Kısaltmalar: DNMT1 = DNA metiltransferaz 1; RFTS = Çoğaltma Odakları Hedefleme Dizisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Floresan bazlı tahlil kontrolü. RFTS'den yoksun DNMT1 (10 nM nihai konsantrasyon) ve Gla I (0.8 U), 20 nM saç tokası DNA substratı ve 500 μM SAM içeren üçlü tahlillere sırayla eklendi. DNMT1 (mavi daireler) veya tampon (kırmızı daireler) eklenmesinin tek başına arka plan floresansı üzerinde hiçbir etkisi olmamıştır. Gla I'in tüm tahlillere eklenmesi, DNMT1 içeren tahlillerde floresan üretimi ile sonuçlanır, ancak içermeyen tahlillerde değil. Kısaltmalar: DNMT1 = DNA metiltransferaz 1; RFTS = Çoğaltma Odakları Hedefleme Dizisi; RFU = bağıl floresan birimleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Floresan reaksiyon izleri. Üçlü testler 10 nM saç tokası DNA substratı ve 10 μM SAM içeriyordu. (A) RFTS'den yoksun DNMT1 (2 nM) ve Gla I (0.8 U) üç tahlil (mavi) ve üç tahlil (kırmızı) tek başına Gla I (0.8 U) eklendi. Sağlam floresan üretimi sadece her iki enzimi de içeren tahlillerde gözlenir. (B) Ortalama Gla I reaksiyon izi DNMT1+Gla I reaksiyon izlerinden çıkarıldı. Üçlü verilerin ortalamasının ortalama ve standart hatası gösterilir. İzin doğrusal kısmının takılması, 113 ± 2 RFU / dak başlangıç hızı verir. Kısaltmalar: DNMT1 = DNA metiltransferaz 1; RFTS = Çoğaltma Odakları Hedefleme Dizisi; RFU = bağıl floresan birimleri; SAM = S-adenosilmetiyonin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Potansiyel inhibitörlerin varlığında DNA metilasyon aktivitesi. RFTS eksikliği olan DNMT1'in DNA metilasyon aktivitesi, DMSO (siyah), bileşik 1 (kırmızı), bileşik 2 (mavi) veya bileşik 3 (yeşil) varlığında incelendi. 20 μM bileşik (A) ve 50 μM bileşikte (B) düzeltilmiş reaksiyon izleri, başlangıç hızını belirlemek için uygundu. Bileşik 1 ve 2'nin eklenmesi gözlenen hızı azaltırken, bileşik 3'ün aktivite üzerinde çok az etkisi oldu. Üçlü tahliller için ortalamanın ortalama ve standart hatası gösterilmiştir. Kısaltmalar: DNMT1 = DNA metiltransferaz 1; RFTS = Çoğaltma Odakları Hedefleme Dizisi; RFU = bağıl floresan birimleri; DMSO = dimetilsülfoksit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Potansiyel küçük molekül inhibitörlerinin varlığında gözlenen başlangıç hızları ve yüzde aktiviteleri. Başlangıç hızı, düzeltilmiş reaksiyon izlerinin ilk doğrusal kısmının bir çizgiye sığdırılmasıyla belirlendi; sığdırma ile ilişkili hata bildirilir. Yüzde aktivitesi, bileşik varlığında belirlenen oranın DMSO kontrol reaksiyonunda belirlenen orana bölünmesi ve 100 ile çarpılması ile belirlendi; ilişkili hata yayıldı. Kısaltmalar: Cmpd = bileşik; DMSO = dimetilsülfoksit; RFU = bağıl floresan birimleri. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DNA metiltransferazların inhibitörlerini tanımlamak ve karakterize etmek için, enzimin aktivitesi ölçülmelidir. DNA metiltransferaz aktivitesini incelemek için çeşitli yöntemler mevcuttur. Aktivite genellikle radyoaktivite kullanılarak izlenir; SAM'ın etiketli metil grubunun transferi 29,30,31,32,33,34 olarak ölçülebilir. Metil-duyarlı endonükleazları kullanan jel bazlı tahliller de35,36 olarak tanımlanmıştır. Bu testler genellikle süreksizdir ve aktiviteyi incelemek için birden fazla adım gerektirir. Burada, potansiyel DNA metiltransferaz inhibitörlerini taramak için bir endonükleaz eşleşmiş DNA metilasyon testi tanımlanmıştır. Bu tekniğin birkaç avantajı vardır. Tahlil nispeten basittir. Bir sinyal elde etmek için ayırma teknikleri (örneğin, elektroforez, filtre bağlama) gerektirmez. Ek olarak, tahlil süreklidir ve verilerin gerçek zamanlı olarak toplanmasına izin verir. Metilasyon aktivitesi için farklı bir sürekli kinetik testi yakın zamanda tanımlanmıştır39. Bununla birlikte, bu tahlil spektroskopik bir sinyal üretmek için üç bağlantı enzimi gerektirir. Burada açıklanan tahlil tek bir bağlantı enzimi gerektirir.

Bu DNMT aktivite testleri, önce enzimler dışındaki tüm tahlil bileşenlerini içeren bir tahlil çözeltisi üretilerek gerçekleştirilir. Tahlil çözeltileri substratları, saç tokası DNA'sını ve SAM'ı içerir; 0.1 mg / mL BSA da rutin olarak tahlillere dahil edilir. Tahlilde kullanılan DNA ve DNMT1'in son derece düşük konsantrasyonları (nanomolar aralıkta) ile BSA, pipet uçlarına, tüplere ve mikrotiter plakalarına yapışmayı ve enzim aktivitesini etkileyebilecek çevresel hakaretleri önlemeye yardımcı olmak için genel protein konsantrasyonunu arttırır. Reaksiyon daha sonra tahlil çözeltilerine enzimler eklenerek başlatılır. Tüm tahlil bileşenlerinin nihai konsantrasyonları belirlenirken bu seyreltmeler dikkate alınmalıdır. Reaksiyonlar, 95 μL tahlil çözeltisine 5 μL enzim çözeltisi eklenerek başlatılır. Bu nedenle, tahlil çözeltilerindeki DNA, SAM ve BSA konsantrasyonları, istenen nihai konsantrasyonun 1.05 katıdır. Örneğin, 10 nM DNA isteniyorsa, 10.5 nM DNA ile tahlil çözeltileri üretilir. Enzim çözeltisindeki RFTS eksikliği olan DNMT1 konsantrasyonu, istenen nihai konsantrasyonun 20 katıdır. Burada, enzim çözeltisinde 40 nM RFTS eksikliği olan DNMT1 kullanıldı, böylece her tahlilde DNMT1'in son konsantrasyonu 2 nM idi.

Gla I ticari olarak temin edilebilen bir enzim olduğundan, miktarı üretici tarafından sağlandığı gibi birim (U) cinsinden verilir. Üretilen enzim çözeltileri 0.16 U / μL Gla I içerir, böylece her bir kuyucuğa toplam 0.8 U Gla I eklenir. Reaktif maliyetlerinden tasarruf etmek için, uygun enzim çözeltilerinin küçük hacimleri hazırlanır ve bu çözeltiler daha sonra konik tabanlı 96 delikli plakalara alınır. Çok kanallı pipetler kullanılarak, 5 μL enzim çözeltisi konik tabanlı plakadan siyah 96 kuyucuklu yarım alan plakasındaki tahlil çözeltilerine aktarılır. Bu işlem, bir dizi tahlilin aynı anda başlatılmasına izin verir. Alternatif olarak, farklı bir tahlil plakası kurulumuyla, enzim çözeltileri reaktif rezervuarlarına yerleştirilebilir ve daha sonra tahlil çözeltilerine enzim eklemek için çok kanallı pipetler kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, rezervuarlardaki sıvı geri kazanım atıkları nedeniyle daha yüksek miktarda enzim çözeltisi gerektirecektir. Tahlilleri 96 kuyulu yarım alan plakalarda yapıyoruz; Bu plakalardaki daha küçük kuyu boyutu, geleneksel 96 delikli plakalardan daha küçük bir toplam tahlil hacmine (100 μL) izin verir ve yine reaktif maliyetlerinden tasarruf sağlar.

Burada tarif edilen DNA metilasyon testi, kuplajlı endonükleaz Gla I'in özgüllüğü nedeniyle bir hemimetillenmiş substrat DNA'sı gerektirir. Bu, tahlili DNMT1'in aktivitesini incelemek için özellikle iyi kılar, çünkü bu izoenzim tercihen hemimetillenmiş DNA1'i metilleştirir. DNMT3 izozimleri, metillenmemiş ve hemimetillenmiş DNA1 arasında bir tercih göstermez. Bu nedenle, bu test DNMT3 izozimlerinin aktivitesini incelemek için de kullanılabilir. Aslında, DNMT3a'nın küçük moleküller tarafından inhibisyonu bu tahlil 26,27,41 kullanılarak değerlendirilmiştir. Hemimetile substrat DNA'sının gerekliliği, bu tahlilin substrat özgüllüğünü veya metillenmemiş ve hemimetillenmiş CpG bölgeleri arasındaki tercihi incelemek için kullanılamayacağı anlamına gelir.

Bu tahlil spektroskopik bir sinyale dayanır: florofor ve söndürücü ayrıldığında floresandaki artış. Böylece, kendileri floresan veya söndüren küçük moleküller tahlil ile etkileşime girebilir. Her tahlil koşulu için Gla I içeren kontrolü yapmanın bir nedeni, bu olasılığı kontrol etmektir. Küçük molekülün spektroskopik özellikleri, Gla I kontrol verileri kullanılarak basitçe açıklanabilir (örneğin, molekülün zayıf bir floresan sinyali varsa). Bununla birlikte, molekül kuvvetli bir floresan veya güçlü bir susturucu ise, bu test DNA metilasyon aktivitesini tespit etmek için kullanılamaz.

Burada açıklanan ekran, potansiyel DNMT inhibitörlerini tespit etmek için yapılan ilk tahlildir. İlk ekranda "isabet" olan bileşikler, gerçek DNMT inhibitörleri olduklarından emin olmak için ikincil testlerde doğrulanmalıdır. Bu tahlil birleştirilmiş bir kinetik tahlil olduğundan, sadece belirli bir küçük molekülün varlığında floresan üretimindeki bir azalmayı gözlemlemek, bileşiğin mutlaka metiltransferazı inhibe ettiği anlamına gelmez. Bağlantı enzimi Gla I'i inhibe edebilen küçük bir molekül de floresan üretiminde gözlenen bir azalmaya neden olacaktır. Basit bir ikincil tarama, potansiyel inhibitörlerin varlığında ve yokluğunda Gla I'in aktivitesini belirlemeyi içerir. Bu test için, tamamen metillenmiş dahili olarak söndürülmüş saç tokası DNA'sı,26,41 substratı olarak kullanılır. Agregasyona bağımlı inhibisyon ve DNA interkalasyonunu incelemek için tasarlanmış ek testler, potansiyel inhibitörleri daha da doğrulamak için ikincil testler olarak da kullanılabilir26,41. Burada sunulan verilerde, bileşik 1 ve bileşik 2, potansiyel DNMT1 inhibitörleri olarak tanımlanmıştır. Çeşitli ikincil tahliller kullanılarak, bileşik 1, DNMT141'in doğrudan bir inhibitörü olarak doğrulanmıştır. Daha önce yayınlanan bu çalışma, antrakinon çekirdeğinin C2 pozisyonunda hacimli ikameler içeren bileşiklerin DNMT1'in daha etkili inhibitörleri gibi göründüğünü göstermiştir. Bununla birlikte, DNMT1 inhibisyonu için yapısal belirleyicileri tam olarak anlamak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

Burada açıklanan birleştirilmiş tahlilin birkaç potansiyel kullanımı vardır. Tahlil, kararlı durum kinetiği deneyleri için kullanılabilir. Tahlil sürekli olduğundan, başlangıç hızlarının belirlenmesi basittir. Bu tahlil daha önce çeşitli kesilmiş DNMT1 proteinlerinin makroskopik kinetiği parametrelerini (yani, Km, V max ve kcat) incelemek için kullanılmıştır40. Tahlil, DNMT1 inhibisyonu 41 için küçük bir molekül setini incelemek ve DNMT3a aktivitesi26,27,41 üzerindeki etkilerini inceleyerek tanımlanmış inhibitörlerin izoenzim özgüllüğünü değerlendirmek için kullanılmıştır. Tahlil ayrıca inhibitörleri karakterize etmek için de kullanılmıştır. Hem inhibitör protein alanları36,40 hem de yeni küçük moleküller 27,41'in inhibisyon ve potens mekanizması (örneğin, Ki, IC 50) bu birleştirilmiş kinetik testi kullanılarak belirlenmiştir. Tahlil ayrıca bir HTS kampanyasında kullanılmak üzere uyarlandı. Bu durumda, tahlil 384 kuyucuklu bir formata daha da küçültüldü ve ilk ekran26 için bir uç nokta testi olarak kullanıldı. Bu nedenle, burada açıklanan floresan bazlı endonükleaz kuplajlı DNA metilasyon testi, DNA metiltransferazlarının aktivitesini incelemek için kullanılabilecek çok yönlü bir testtir ve bu önemli epigenetik değiştiricilerin küçük molekül inhibitörlerinin tanımlanmasına ve karakterizasyonuna izin verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Yazarlar, bu çalışmaya verdikleri destek için Bucknell Üniversitesi ve Kimya Bölümü'ne teşekkür eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate Corning 3694
96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates ThermoFisher 249570
Bovine Serum Albumin NEB B9000S
compound 1 ChemBridge 5812086 screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 2 ChemBridge 6722175 screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 3 ChemBridge 5249376 screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
Dithiothreitol Sigma D0632
Gla I SibEnzyme E494 methyl-sensitive endonuclease
Glycerol RPI G22025
Magnesium Chloride Sigma M0250
Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher) IDT custom synthesized internally quenched hairpin DNA (substrate)
Potassium Glutamate Sigma G1501
S-adenosylmethionine Sigma A4377 methyl-donating co-factor (substrate)
Tris Base RPI T60040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).
  2. Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases. Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).
  3. Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. S., Gowher, H. Effect of disease-associated germline mutations on structure function relationship of DNA methyltransferases. Genes. 10 (5), 369 (2019).
  4. Foulks, J. M., et al. Epigenetic drug discovery: targeting DNA methyltransferases. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 2-17 (2012).
  5. Goll, M. G., Bestor, T. H. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annual Review of Biochemistry. 74, 481-514 (2005).
  6. Bigey, P., Ramchandani, S., Theberge, J., Araujo, F. D., Szyf, M. Transcriptional regulation of the human DNA Methyltransferase (dnmt1) gene. Gene. 242 (1-2), 407-418 (2000).
  7. Detich, N., Ramchandani, S., Szyf, M. A conserved 3'-untranslated element mediates growth regulation of DNA methyltransferase 1 and inhibits its transforming activity. Journal of Biological Chemistry. 276 (27), 24881-24890 (2001).
  8. MacLeod, A. R., Rouleau, J., Szyf, M. Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway. Journal of Biological Chemistry. 270 (19), 11327-11337 (1995).
  9. Slack, A., Cervoni, N., Pinard, M., Szyf, M. DNA methyltransferase is a downstream effector of cellular transformation triggered by simian virus 40 large T antigen. Journal of Biological Chemistry. 274 (15), 10105-10112 (1999).
  10. Eads, C. A., Nickel, A. E., Laird, P. W. Complete genetic suppression of polyp formation and reduction of CpG-island hypermethylation in Apc(Min/+) Dnmt1-hypomorphic mice. Cancer Research. 62, 1296-1299 (2002).
  11. MacLeod, A. R., Szyf, M. Expression of antisense to DNA methyltransferase mRNA induces DNA demethylation and inhibits tumorigenesis. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 8037-8043 (1995).
  12. Ramchandani, S., MacLeod, A. R., Pinard, M., von Hofe, E., Szyf, M. Inhibition of tumorigenesis by a cytosine-DNA, methyltransferase, antisense oligodeoxynucleotide. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 94 (2), 684-689 (1997).
  13. Ley, T. J., et al. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 363, 2424-2433 (2010).
  14. Walter, M. J., et al. Recurrent DNMT3A mutations in patients with myelodysplastic syndromes. Leukemia. 25 (7), 1153-1158 (2011).
  15. Russler-Germain, D. A., et al. The R882H DNMT3A mutation associated with AML dominantly inhibits wild-type DNMT3A by blocking its ability to form active tetramers. Cancer Cell. 25 (4), 442-454 (2014).
  16. Roll, J. D., Rivenbark, A. G., Jones, W. D., Coleman, W. B. DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines. Molecular Cancer. 7, 15 (2008).
  17. Nosho, K., et al. DNMT3B expression might contribute to CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 15 (11), 3663-3671 (2009).
  18. Erdmann, A., Halby, L., Fahy, J., Arimondo, P. B. Targeting DNA methylation with small molecules: what's next. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (6), 2569-2583 (2015).
  19. Chuang, J. C., et al. S110, a 5-Aza-2'-deoxycytidine-containing dinucleotide, is an effective DNA methylation inhibitor in vivo and can reduce tumor growth. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (5), 1443-1450 (2010).
  20. Issa, J. J., et al. Safety and tolerability of guadecitabine (SGI-110) in patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukaemia: a multicentre, randomised, dose-escalation phase 1 study. Lancet Oncology. 16 (9), 1099-1110 (2015).
  21. Datta, J., et al. A new class of quinoline-based DNA hypomethylating agents reactivates tumor suppressor genes by blocking DNA methyltransferase 1 activity and inducing its degradation. Cancer Research. 69 (10), 4277-4285 (2009).
  22. Zambrano, P., et al. A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes. BMC Cancer. 5, 44 (2005).
  23. Lee, B. H., Yegnasubramanian, S., Lin, X., Nelson, W. G. Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 280 (49), 40749-40756 (2005).
  24. Asgatay, S., et al. Synthesis and evaluation of analogues of N-phthaloyl-l-tryptophan (RG108) as inhibitors of DNA methyltransferase 1. Journal of Medicinal Chemstry. 57 (2), 421-434 (2014).
  25. Ceccaldi, A., et al. C5-DNA methyltransferase inhibitors: from screening to effects on zebrafish embryo development. Chembiochem. 12 (9), 1337-1345 (2011).
  26. Fagan, R. L., Wu, M., Chédin, F., Brenner, C. An ultrasensitive high throughput screen for DNA methyltransferase 1-targeted molecular probes. PLoS One. 8 (11), 78752 (2013).
  27. Fagan, R. L., Cryderman, D. E., Kopelovich, L., Wallrath, L. L., Brenner, C. Laccaic acid A is a direct, DNA-competitive inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 288 (33), 23858-23867 (2013).
  28. Eglen, R. M., Reisine, T. Screening for compounds that modulate epigenetic regulation of the transcriptome: an overview. Journal of Biomolecular Screening. 16 (10), 1137-1152 (2011).
  29. Holz-Schietinger, C., Matje, D. M., Reich, N. O. Mutations in DNA methyltransferase (DNMT3A) observed in acute myeloid leukemia patients disrupt processive methylation. Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 30941-30951 (2012).
  30. Norvil, A. B., et al. Dnmt3b methylates DNA by a noncooperative mechanism, and its activity is unaffected by manipulations at the predicted dimer interface. Biochemistry. 57 (29), 4312-4324 (2018).
  31. Bashtrykov, P., Ragozin, S., Jeltsch, A. Mechanistic details of the DNA recognition by the Dnmt1 DNA methyltransferase. FEBS Letters. 586 (13), 1821-1823 (2012).
  32. Bashtrykov, P., et al. Targeted mutagenesis results in an activation of DNA methyltransferase 1 and confirms an autoinhibitory role of its RFTS domain. Chembiochem. 15 (5), 743-748 (2014).
  33. Berkyurek, A. C., et al. The DNA methyltransferase Dnmt1 directly interacts with the SET and RING finger-associated (SRA) domain of the multifunctional protein Uhrf1 to facilitate accession of the catalytic center to hemi-methylated DNA. Journal of Biological Chemistry. 289 (1), 379-386 (2014).
  34. Kanada, K., Takeshita, K., Suetake, I., Tajima, S., Nakagawa, A. Conserved threonine 1505 in the catalytic domain stabilizes mouse DNA methyltransferase 1. Journal of Biochemistry. 162 (4), 271-278 (2017).
  35. Bashtrykov, P., et al. Specificity of Dnmt1 for methylation of hemimethylated CpG sites resides in its catalytic domain. Chemistry & Biology. 19 (5), 572-578 (2012).
  36. Dolen, E. K., McGinnis, J. H., Tavory, R. N., Weiss, J. A., Switzer, R. L. Disease-associated mutations G589A and V590F relieve replication focus targeting sequence-mediated autoinhibition of DNA methyltransferase 1. Biochemistry. 58 (51), 5151-5159 (2019).
  37. Kilgore, J. A., et al. Identification of DNMT1 selective antagonists using a novel scintillation proximity assay. Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 19673-19684 (2013).
  38. Ceccaldi, A., et al. Identification of novel inhibitors of DNA methylation by screening of a chemical library. ACS Chemical Biology. 8 (3), 543-548 (2013).
  39. Duchin, S., Vershinin, Z., Levy, D., Aharoni, A. A continuous kinetic assay for protein and DNA methyltransferase enzymatic activities. Epigenetics & Chromatin. 8, 56 (2015).
  40. Syeda, F., et al. The replication focus targeting sequence (RFTS) domain is a DNA-competitive inhibitor of Dnmt1. Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 15344-15351 (2011).
  41. Switzer, R. L., Medrano, J., Reedel, D. A., Weiss, J. Substituted anthraquinones represent a potential scaffold for DNA methyltransferase 1-specific inhibitors. PLoS One. 14 (7), 0219830 (2019).

Tags

Biyokimya Sayı 186 Biyokimya Sayı,
DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Switzer, R., Ward, K. A., Medrano,… More

Switzer, R., Ward, K. A., Medrano, J. Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors. J. Vis. Exp. (186), e62949, doi:10.3791/62949 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter