Summary
麻醉小鼠的精制尾静脉横断（TVT）出血模型是评估血友病出血的灵敏 体内 方法。这种优化的TVT出血模型使用失血和出血时间作为终点，完善其他模型并避免死亡作为终点。
Abstract
尾出血模型是血友病研究的重要工具，专门用于评估促凝剂效应。由于对临床相关剂量的FVIII敏感，尾静脉横断（TVT）生存模型在许多地区是首选，而其他已建立的模型（如尾夹模型）需要更高水平的促凝剂化合物。为了避免使用生存作为终点，我们开发了一个TVT模型，将失血和出血时间确定为终点，并在整个实验期间进行全麻醉。简而言之，将麻醉的小鼠定位，将尾巴浸没在温带盐水（37°C）中，并在右侧尾静脉中与测试化合物一起给药。5分钟后，使用模板导轨切除左外侧尾静脉，将尾巴返回到盐水，并在收集血液的同时监测并记录所有出血发作40分钟。如果在受伤后10分钟，20分钟或30分钟没有发生出血，则用湿纱布拭子拭子两次，轻轻地挑战凝块。40分钟后，通过出血到盐水中的血红蛋白量来量化失血量。这种快速且相对简单的过程导致一致且可重复的出血。与TVT生存模型相比，它使用更人道的程序，而不会影响对药物干预的敏感性。此外，可以使用两种性别，减少需要繁殖的动物总数，符合3R的原则。出血模型的潜在局限性是止血的随机性，这会降低模型的可重复性。为了解决这个问题，手动破坏凝块可确保在监测期间对凝块进行挑战，防止原发性（血小板）止血。对出血损伤模型目录的这一补充提供了一种选择，以标准化和人道的方式表征促凝剂效应。
Introduction
动物模型对于了解血友病的发病机制以及开发和测试治疗方案和疗法至关重要。因子VIII敲除小鼠（F8-KO）是研究血友病A1，2的广泛使用的模型。这些小鼠概括了该疾病的关键特征，并已被广泛用于开发治疗，例如重组FVIII产品3，4，5 和基因治疗策略6，7。
有多种出血损伤模型用于评估不同止血化合物 在体内的药理作用。这些凝血模型之一是尾静脉横断术存活模型8，9，10，11，12，13，14，测量血友病小鼠在尾部横断后血血后存活的能力。这种方法是在四十多年前15 年引入的，至今仍在使用9，16，17。然而，该模型利用生存作为终点，需要在长达24小时的时间内观察动物，在此期间动物是有意识的，因此可以经历疼痛和痛苦。
以前已经描述过持续时间较短且完全麻醉下的出血模型，例如尾夹模型（也称为尾尖）8，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28.然而，为了在出血激发后使失血完全正常化，这些模型需要远高于临床施用的促凝剂化合物（例如FVIII）的剂量29。麻醉下的另一种损伤模型，即沙芬纳静脉出血法，对较低剂量的促凝剂化合物30敏感，但需要高水平的实验者干预，因为凝块必须经常破坏（而不是所提出的模型中的3次）。
标准化为测试新的促凝剂化合物的通用方案将大大促进实验室之间的数据比较31，32，33。在TVT模型中，关于研究的终点（失血量7，26，出血时间9，34和存活率35，36）尚未达成共识，并且实验长度因研究而异13。
我们的主要目标是描述和表征具有高可重复性的优化模型，按需研究的可能性以及预防性治疗，对相当于生存模型的药物干预的敏感性，但不使用死亡或濒临死亡作为终点。为了减轻疼痛和痛苦，动物在出血期间不应该有意识，需要实施更合乎道德的终点37。
尾夹模型通常以两种变体之一进行，要么截肢尾尖，例如截肢1-5毫米18，19，20，21，23，24，或者在更严重的变体中，在尾部直径约1-3毫米8，22，25处截断.这会导致联合动静脉出血，因为侧静脉和背静脉以及腹动脉通常被切断，并且通常截肢越大，对促凝化合物的敏感性越低。此外，由于尾尖被截肢，动静脉损伤暴露在没有任何对立组织的情况下;因此，至少在理论上，它与最常见的血友病出血不同。
顾名思义，在如本文所述的尾静脉横断模型中，只有静脉受伤，从而导致完全静脉出血。由于血管未完全切断，因此预计损伤将小于截肢模型，并且保留切口周围的组织（凝块可能粘附）。此外，与动脉相比，静脉中的血压较低。这些因素有助于相对于截肢模型增加敏感性，因此可以通过临床相关剂量的替代治疗（例如，在血友病A中使用rFVIII）实现出血正常化，这有助于评估促凝治疗效果的大小和持久性26，38，39。
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Protocol
本议定书中描述的所有程序均已获得诺和诺德公司动物福利机构以及丹麦食品、农业和渔业部丹麦动物实验监察局的批准。优化的 40 分钟方法在设计中包括麻醉和给药时间（图 1）。该手术需要10-16周龄的两性血友病小鼠。
1. 研究前的准备工作
- 以正确的浓度制备加液。
- 开始水浴并加热至37°C。 用盐水（0.9%NaCl）填充15mL离心管以收集血液。
- 在实验开始前至少15分钟，将15mL盐水管置于加热底板的孔中。
- 识别小鼠并记录其重量。避免处理不必要的老鼠，因为这会导致压力并影响研究。
- 在继续之前，在通风橱中准备工作站，以便一切都触手可及：餐巾纸，尾架，纱布，注射器，手术刀，秒表和血流记谱纸。
- 将尾印和切割块放在加热板上 - 冷块会使静脉收缩，从而影响出血。
2. 麻醉
- 在通风橱内进行异氟醚麻醉程序。
- 将气体汽化器最初设置为5%异氟醚，在麻醉室中以30%O2/70%N2O，流量为1 L / min。允许足够的时间使麻醉室充满（约5分钟，具体取决于腔室体积和气体流速）。确保快速诱导（少于一分钟）。
- 将小鼠置于麻醉室中，直到它们失去意识。
注意：如果腔室充满，这应该在一分钟或更短的时间内发生。 - 通过对踏板反射（牢固的脚趾捏合）没有痛苦的反应来确保适当的麻醉。
- 将小鼠放在加热板上，确保鼻子在鼻锥中。
- 将麻醉剂在30%O 2/70%N2 O中降低至2%异氟醚的维持水平，并在小鼠上方放置塑料盖以减少热量损失。涂抹合适的眼药膏，以防止麻醉时干燥。
- 使用尾部标记块以直径2.5毫米标记尾巴。不要将尾巴强行插入块中的狭缝中 - 它必须紧贴（补充图1）
- 将尾部置于盐水管中至少5分钟，以确保温暖的尾静脉最适合静脉注射（静脉注射）。
3. 测试溶液的加样
- 将一只小鼠放在尾架中，将鼻子放在麻醉面罩中。
- 用目标化合物（在本例中为rFVIII）给动物加药，然后立即启动秒表（t = 0）。
- 将鼠标放回加热板上，尾巴在盐管中。与其他小鼠重复该过程。
4. 进行尾静脉横断
- 给药后正好5分钟进行尾静脉横断。将尾部放在切割块中并转动90°以暴露静脉（补充图2）。
- 在从测试溶液加样的另一侧/静脉进行切割。
- 将#11手术刀刀片穿过夹持尾巴的切割块的狭缝，以产生出血。重置秒表，立即将尾部放回盐水。
5. 观测时间及挑战
- 观察出血并注释整个40分钟内出血的开始和停止;在血流记谱纸上注释它。
注意：由于主观性，这种出血的视觉评估可能略有不同。 - 原发性出血必须在切口后3分钟内停止。如果不是这种情况，请取消小鼠的资格，安乐死和更换（未能停止原发性出血可能表明损伤太严重或缺乏原发性止血，如vWF KO小鼠）。
- 如果在受伤后 10 分钟、20 分钟和 30 分钟没有出血，请按照步骤 4-5 中所述挑战尾部切口。
- 使用浸泡在温盐水中的纱布拭子，从保存在水浴中的单独管中。将尾巴从生理盐水中取出，用湿纱布在尾巴切口的远端方向轻轻擦拭两次。
- 每次挑战后，立即将尾巴再次浸入盐管中。
- 在t = 40分钟时，通过从盐管中取出尾巴来停止采血。
6. 血液采样
- t = 40分钟后，从眶上静脉获取血液样本。
7. 安乐死
- 在完全麻醉下通过宫颈脱位对小鼠实施安乐死。
8. 样品处理
- 在室温下用盐水在4000× g 下离心15mL血液收集管5分钟。
- 从15mL管中弃去上清液，将沉淀重悬于2-14mL红细胞（RBC）裂解溶液中，然后稀释至达到淡咖啡色。
- 注意总体积（血液体积+使用管上的刻度标记添加的红细胞（RBC）裂解溶液体积）。
- 将2mL稀释液转移到血红蛋白管中并冷藏直至血红蛋白分析。
- 通过测量生理盐水中的血红蛋白浓度来确定失血量。在酶标仪上测量550nm处的吸光度（材料表）。
- 使用从人血红蛋白制备的标准曲线（材料表）将吸光度转换为nmol血红蛋白，并用RBC裂解溶液校正稀释。
9. 统计分析
- 使用适当的软件分析数据。这里使用了GraphPad Prism软件。在一系列研究中，发现以下统计方法表现良好。
注意：分析失血量，出血时间，暴露，血小板计数和血细胞比容;使用Brown-Forsythe和Welch方差分析检验（因为数据是连续的，但没有残差的方差均匀性），应用Dunnett检验来调整多重比较。皮尔逊测试用于测试出血时间，失血量和剂量之间的相关性。为了确定ED50 值，将四参数逆对数（剂量）反应方程拟合到出血和失血数据。为了分析性别效应，使用了双向方差分析检验，应用Bonferroni校正来调整多重比较。显著性水平定义为 P < 0.05。数据显示为SEM±均值。
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Representative Results
为了评估优化模型的适用性，在用市售重组因子VIII替代疗法（rFVIII）施用的F8-KO（C57BL遗传背景）小鼠中进行了研究;测试了四种不同的剂量：1 IU / kg，5 IU / kg，10 IU / kg和20 IU / kg。此外，我们使用C57BL小鼠作为阳性对照组，在F8-KO小鼠和野生型（WT）组中测试了相应的载体（阴性）对照，以评估模型中的反应范围。
在优化方案之后，与载体组相比，rFVIII治疗组的失血量显着减少。此外，与载体组相比，5 IU / kg，10 IU / kg和20 IU / kg治疗组观察到出血时间减少（图2）。在WT小鼠中，总失血量范围为201.8-841.9 nmol Hgb（95%CI），在载体小鼠中范围为5335至7148 nmol Hgb（95%CI）。在1000 nmol Hgb〜125μL全血的近似等效性之后，载体治疗小鼠的平均出血为780.25μL，而20 IU / kg组的平均出血为89.95μL。因此，20 IU / kg的剂量使出血完全正常化，并且施用10 IU / kg引起显着效果，将失血量减少到接近WT范围的上限（图3）。WT小鼠的出血时间范围为0.98-9.16分钟（95%CI），10 IU / kg和20 IU / kg的剂量水平将出血时间减少到该范围内。在组合数据中观察到失血量与出血时间之间的强相关性（r = 0.9357，P <0.0001）（图4）。
为了评估模型的敏感性，在失血量和出血时间观察结果上拟合了四参数逆对数（剂量）反应方程，并观察到rFVIII给药对失血和出血时间的明确剂量依赖性影响（图3）。估计ED50 的失血量和出血时间值分别为2.41±1.69 IU / kg和2.55±2.80 IU / kg。
为了说明模型中出血是如何发生的，已经绘制了所有记录的出血发作，以提供每只小鼠出血长度和数量的可视化（图5）。所有组的原发性出血都非常相似。大多数血友病载体组在第二次激发20分钟之前开始再出血，对于大约一半的这些动物，出血在第一次激发后不会停止。最后，如上所述，与载体相比，rFVIII治疗减少了治疗的F8-KO小鼠出血发作的长度，并且在最低剂量下已经观察到可观察到的变化。在最高剂量水平下，大多数小鼠在受到挑战后只会短暂出血。
通过荧光氧通道测定（LOCI）检测hFVIII和类似物来测量血浆rFVIII浓度，以验证观察到的减少失血和出血时间的效果是浓度依赖性的（图6）。每组之间存在差异（平均CV 46%），但仍然可以观察到组间显着差异，从而证实在失血和出血时间观察到的影响取决于FVIII的血浆浓度。测量的所有载体处理的小鼠低于测定的定量下限（2 U / L），并用该值表示。未测量WT小鼠，因为应用的FVIII测定是检测人FVIII的特异性。
使用出血后收集的血液样本测定所有组的血小板计数和血细胞比容（图7 ，并用血液学分析仪测量（材料表）。组间血小板计数没有变化，表明血小板数量不受影响，因此小鼠仍然能够进行原发性止血。对于血细胞比容测量，在接受中等和较高FVIII剂量（5 IU / kg，10 IU / kg和20 IU / kg）的动物中观察到正常水平，而在载体和1 IU / kg治疗组中观察到显着较低的水平（与WT动物相比）。这是血友病动物在大量出血后经常观察到的情况。
传统上，动物研究中只使用了一种性别的动物（通常是雄性），这也被描述为TVT生存模型8，9，11，12。努力减少未来研究（用于育种和研究）所需的血友病小鼠总数，使用两性。为了评估性别在该优化模型中的影响（图8），失血和出血时间结果均进行双向方差分析，性别和剂量为因素。在该分析中，rFVIII剂量的效果具有统计学意义（P<0.0001），但小鼠性别对结果没有显着影响（P 0.35），并且参数之间未发现显着的相互作用，表明两性之间对治疗的反应没有差异。
图1：实验装置的时间设计。 尾静脉横断术 （TVT） 之前的阶段包括麻醉诱导、盐水加热尾部和给药。在TVT损伤后，进行40分钟的麻醉下监测出血，随后每10分钟进行一次激发。实验过程通过收集血液样本和安乐死来完成。 请点击此处查看此图的大图。
图2：静脉内给药后rFVIII的作用。 F8-KO小鼠的总失血量（左图）和总出血时间（右图）。每只鼠标显示为单独的观察结果，平均±SEM。rFVIII的不同测试剂量以x轴表示。Brown-Forsythe和Welch方差分析了数据，应用Dunnett的测试来调整多重比较。P < 0.0001。 请点击此处查看此图的大图。
图3：失血和出血时间的剂量反应曲线。 失血（左面板）和出血时间（右面板）。灰色区域代表来自6个未经处理的野生型C57BL / 6小鼠的值的95%CI。 请点击此处查看此图的大图。
图4：失血量和出血时间的相关图。 R2 = 0.8755，P < 0.0001。 请点击此处查看此图的大图。
图5：野生型，载体，1IU / kg，5 IU / kg，10 IU / kg和20 IU / kg rFVIII处理的小鼠的个体出血情况。 每条线代表单个鼠标的出血曲线，而每个虚线代表出血发作。 请点击此处查看此图的大图。
图6：暴露于rFVIII。 通过发光氧通道测定（LOCI）测量血浆中的FVIII浓度，以检测人FVIII。载体小鼠处于定量下限（LLOQ），因此用LLOQ值（2 U / L）绘制。未测量WT动物，因为应用的FVIII测定是检测人类FVIII的特异性。rFVIII和WT对照的不同测试剂量在x轴上表示。** P < 0.01，*** P < 0.001，**** P < 0.0001。 请点击此处查看此图的大图。
图7：血液学数据。 F8-KO小鼠的血小板计数（左图）和血细胞比容（右图）显示为SEM的个体观察平均值。rFVIII和WT对照的不同测试剂量在x轴上表示。Brown-Forsythe和Welch方差分析了数据，应用Dunnett的测试来调整多重比较。** P < 0.01 和 *** P < 0.001。 请点击此处查看此图的大图。
图 8.性别的影响。 按治疗分类的失血量（左图）和出血时间（右图）显示为平均±SEM的个体观察结果，通过应用Bonferroni校正的双向方差分析数据以调整多重比较。 请点击此处查看此图的大图。
| ED50 出血时间（国际单位/公斤） | ED50 失血量 （国际单位/公斤） | ED50 存活率（国际单位/公斤） | ||
| 麻醉下的模型 | 优化的尾静脉横断模型 | 2.6 ± 2.8 | 2.4 ± 1.7 | 不相关 |
| 梭子叶植物30型 | 8.1 ± 2.2 | 5.1 ± 2.1 | 不相关 | |
| 中等尾夹（长=3毫米）27 | 未报告 | 4.6 ± 0.5 | 不相关 | |
| 中度尾夹（长=4毫米）28 | 39 | 28 | 不相关 | |
| 中度尾夹（长=4毫米）20 | 未报告 | 53 | 不相关 | |
| 生存模型 | 尾静脉横断术生存模型36 | 未报告 | 未报告 | 58 |
| 尾静脉横断术生存模型10 | 未报告 | 未报告 | 21 |
表 1：ED50 值。 比较不同可用出血模型的ED50 值，用于小鼠血友病研究。数据从引用的文章[参考文献上标]中提取，并以ED50 （IU / kg）的形式呈现
补充图1：测量模板。 铝制。尺寸规格：20 毫米 x 40 毫米 x 10 毫米（长 x 宽 x 高）。凹槽：2.5毫米深，2.5毫米宽;半径 1.25 mm. 请点击这里下载此文件。
补充图2：切割模板。 采用不锈钢制成。尺寸规格：20 毫米 x 40 毫米 x 10 毫米（长 x 宽 x 高）。凹槽：3毫米深，3毫米宽;半径 1.5 mm. 请单击此处下载此文件。
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Discussion
与TVT生存方法相比，这种优化的尾静脉横断（TVT）方法具有几个优点。在整个研究期间，动物被完全麻醉，这使得小鼠处理更容易，并增加了动物的健康。此外，与TVT生存模型不同，不需要过夜观察，并且这种优化的模型提供了测量失血量和观察40分钟内确切出血时间的可能性。此外，意识动物出血时间较长会导致血液出血，导致动物疼痛和痛苦，并可能产生压力，可能导致变异增加14。失血和出血时间已被成功表征和验证为终点，取代了死亡或濒死时间。实际的尾部损伤是明确定义的和标准化的，因为它使用切割块导轨来执行TVT，确保可重复的切割，降低程序的难度和技术可变性。因此，可以实现更高的模型鲁棒性，从而减少所需的动物数量。此外，数据表明，根据3R原则，可以同时使用雄性和雌性小鼠，从而减少要繁殖的动物总数。随着这些观察，有一种趋势是雌性小鼠在高出血组中出血略少，差异略大，但在低出血组中则不然。较低的失血量措施可能与女性体型较小有关，因此与同龄男性相比血容量较小。
血友病患者的自发性出血通常是内部出血，特别是累及肌肉骨骼、软组织和皮肤黏膜出血，而外部损伤（如轻微割伤）不是长期出血的最常见原因，尽管更严重的割伤和创伤可能危及生命40，41。这种优化的模型诱导仅静脉出血，而其他模型，如尾夹，诱导动静脉出血的混合。由于所描述的模型是仅静脉模型，因此该TVT模型中的促凝剂剂量效应可能无法反映更严重动脉损伤中的效果;因此，如果此类出血是焦点，则应使用其他出血模型。
如个体出血概况所示，所有组中的原发性出血非常相似，表明原发性止血，即活化血小板聚集，在血友病A设置42中是完整的。在固定性损伤中，即使在重度血友病下，血小板聚集也足以减轻出血。出于这个原因，通过实证研究，我们发现每10分钟诱导一次出血挑战是方案中的必要步骤，以破坏活化血小板的聚集体，即使没有功能凝血产生的纤维蛋白，也可以足够强地防止出血。由于完全麻醉的小鼠不会移动，并且不能像非麻醉的TVT生存模型中发生的那样对损伤进行物理挑战，因此有必要引入挑战步骤以防止血小板聚集单独减轻出血。一些未经治疗的血友病小鼠在激发之前自发地再出血，但在第一次激发后，大多数未经治疗的血友病小鼠发生自发性再出血，并且在第二次挑战之后，许多小鼠连续出血直到实验结束。正如预期的那样，与WT小鼠相比，载体F8-KO小鼠的出血增加。用增加剂量的rFVIII治疗的小鼠显示出失血和出血时间的剂量依赖性减少。在剂量为5 IU / kg及以上时观察到对出血的显着影响（与载体处理的小鼠相比）。两种最高剂量将出血减少到非常接近野生型出血反应的水平，表明出血正常化或接近正常化。
在表1中，我们比较了几种出血模型的不同ED50值，按研究的终点分类。在这个优化的模型中，我们观察到出血量和出血时间的ED50值相当（分别为2.4±1.7 IU / kg和2.6±2.8 IU / kg）。使用研究rFVIIa的相同模型，ED50的失血量和出血时间值分别为0.42mg / kg和0.39mg / kg，分别为38。与之前描述的麻醉下出血模型（例如尾夹模型）相比，这对药物干预的敏感性更高，FVIII ED50 的失血量为 4.6 ± 0.5 IU/kg27、28 IU/kg28 和 53 IU/kg20。此外，在不同的尾部夹子型号20，27，28中存在ED50值的高可变性。麻醉下的另一个模型是严重的尾夹模型。这是一种更快的方法，因为观察期仅为20分钟，但它对促凝活性不太敏感。与载体处理的动物相比，必须使用高于200 IU / kg的FVIII剂量才能实现统计学上显着的失血减少25。在囊泡膜模型30中，出血时间的ED50值为8.1±2.2 IU / kg，平均失血量的ED50为5.1±2.1 IU / kg，在两个参数方面也不如我们的精制模型敏感。此外，该模型需要精细的工作来执行血管损伤和多次重复干预，如果不能重复执行，可能会影响结果。
在传统的TVT生存模型中，在给药后评估存活期24小时，在此期间可以随时发生出血或再出血。因此，TVT 生存模型中的疗效要求治疗的促凝剂效果至少在 24 小时观察期的大部分时间里持续存在。在这里介绍的方法中，我们评估给药后5分钟至40分钟之间的急性效果;因此，很难建立ED50值的直接比较，因为在生存模型中需要更高的剂量，以便在观察期的后半部分保持止血覆盖率。然而，如果需要，优化的TVT模型可用于通过引入给药和出血过程之间的延迟来评估止血覆盖的持续时间。这已经针对我们优化的TVT模型的先前版本进行了描述，其中在加样后24小时执行TVT导致未经修改的rFVIII26的ED50约为10-15 IU / kg。如表1所述，在以24小时生存期为终点的尾部横断层模型中，报告了21 IU / kg 9和rFVIII的58 IU / kg36的ED50值。类似地，尾夹生存模型8也需要比其急性对应物更高的促凝剂剂量。
从长远来看，几种不同的凝血因子（FVIII，FVIIa，FIX）和衍生物，其中一些现已上市，已经使用不同的血友病小鼠菌株26，38，43，44，45，46，47进行了优化模型的评估。 我们还能够通过在第一个挑战之前，在横断期后给药，使模型适应按需干预的研究。此外，我们已经成功地使用该模型来评估具有促凝活性的双特异性抗体（Østergaard等人，被接受在血液中发表），通过给予人类FIX和人类FX来克服物种交叉反应性挑战。这证明了该模型在血友病领域新药开发中的多功能性和转化价值，例如血小板靶向策略48。基于AAV或基因组编辑策略也可以在存在在小鼠中具有药理活性的替代物的情况下进行评估。因此，这种优化的TVT出血模型是尾静脉横断和尾夹生存模型的替代方法，也是麻醉下其他出血模型的有价值的替代方案。与生存模式相比，这种模式更加人性化，也是精致的一个例子，因为动物不会经历痛苦和痛苦。我们认为，对临床相关剂量水平的敏感性，相对技术简单性以及避免死亡/濒死作为终点是显着的优势。
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Disclosures
作者是或曾经是诺和诺德A/S在进行本研究时的员工和/或股东。
Acknowledgments
Esther Bloem和Thomas Nygaard因支持等离子体中FVIII的测量而受到认可。Bo Alsted因绘制和加工模板和切割块而获得认可。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 Scalpel blade | Swann-Morton | 503 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One, Austria | 188271 | |
| 30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing | BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe | 320830 | |
| Advate | Takeda, Japan | Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII) | |
| Alcohol pads 70% ethanol | Hartmann, Soft-Zellin | 999 979 | |
| Centrifuge | Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech | ||
| Cutting template (Stainless steel) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm | |
| Erythrocytes (RBC) lysing solution | Lysebio, ABX Diagnostics | 906012 | |
| Gauze | |||
| Haematological analyser | Sysmex | CT-2000iv | |
| Heating lamp on stand | Phillips | IR250 | |
| Heating pad with thermostat | CMA | model 150 | |
| Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependent | HemoCue, Denmark | HemoCue calibrator, 707037 | Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH). |
| Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box | Sigma Delta Dameca | ||
| Isoflurane | Baxter | 26675-46-7 | |
| Magnifier with lights | Eschenbach | ||
| Measuring template (Aluminum) | Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings | Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm | |
| Micropipettes + tips | Finnpipette | ||
| Photometer | Molecular Devices Corporation, CA, USA | SpectraMax 340 photometer | |
| Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | Version 9.0.1 | |
| Saline 0.9% NaCl | Fresenius Kabi, Sweden | 883264 | |
| Special tail marker block for TVT tail cut | |||
| Tail holder | |||
| Vacuum liquid suction | Vacusafe comfort, IBS | ||
| Waterbath and thermostat | TYP 3/8 Julabo |
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