Summary
De huidige studie toont de oprichting van drie verschillende longdonatiemodellen (donatie na hersendood, donatie na overlijden na de bloedsomloop en donatie na hemorragische shock). Het vergelijkt de ontstekingsprocessen en pathologische aandoeningen die met deze gebeurtenissen gepaard gaan.
Abstract
Experimentele modellen zijn belangrijke hulpmiddelen voor het begrijpen van de etiologische verschijnselen die betrokken zijn bij verschillende pathofysiologische gebeurtenissen. In deze context worden verschillende diermodellen gebruikt om de elementen te bestuderen die de pathofysiologie van primaire transplantaatdisfunctie na transplantatie veroorzaken om mogelijke behandelingen te evalueren. Momenteel kunnen we experimentele donatiemodellen in twee grote groepen verdelen: donatie na hersendood en donatie na circulatiestilstand. Bovendien moet rekening worden gehouden met de schadelijke effecten die gepaard gaan met hemorragische shock bij het overwegen van diermodellen van orgaandonatie. Hier beschrijven we de oprichting van drie verschillende longdonatiemodellen (donatie na hersendood, donatie na overlijden na de bloedsomloop en donatie na hemorragische shock) en vergelijken we de ontstekingsprocessen en pathologische aandoeningen die met deze gebeurtenissen gepaard gaan. Het doel is om de wetenschappelijke gemeenschap te voorzien van betrouwbare diermodellen van longdonatie voor het bestuderen van de bijbehorende pathologische mechanismen en het zoeken naar nieuwe therapeutische doelen om het aantal levensvatbare transplantaten voor transplantatie te optimaliseren.
Introduction
Klinische relevantie
Orgaantransplantatie is een gevestigde therapeutische optie voor verschillende ernstige pathologieën. In de afgelopen jaren is er veel vooruitgang geboekt op het klinische en experimentele gebied van orgaantransplantatie, zoals meer kennis van de pathofysiologie van primaire transplantaatdisfunctie (PGD) en vooruitgang op het gebied van intensive care, immunologie en farmacologie 1,2,3. Ondanks de verwezenlijkingen en verbeteringen in de kwaliteit van de gerelateerde chirurgische en farmacologische procedures, blijft de relatie tussen het aantal beschikbare organen en het aantal ontvangers op de wachtlijst een van de belangrijkste uitdagingen 2,4. In dit verband heeft de wetenschappelijke literatuur diermodellen voorgesteld voor het bestuderen van therapieën die kunnen worden toegepast op orgaandonoren om de organen te behandelen en/of te bewaren tot het moment van transplantatie 5,6,7,8.
Door de verschillende gebeurtenissen na te bootsen die in de klinische praktijk worden waargenomen, maken diermodellen de studie mogelijk van de bijbehorende pathologische mechanismen en hun respectieve therapeutische benaderingen. De experimentele inductie van deze gebeurtenissen, in de meeste geïsoleerde gevallen, heeft experimentele modellen van orgaan- en weefseldonatie opgeleverd die uitgebreid worden onderzocht in de wetenschappelijke literatuur over orgaantransplantatie 6,7,8,9. Deze onderzoeken maken gebruik van verschillende methodologische strategieën, zoals die welke hersendood (BD), hemorragische shock (HS) en bloedsomloopdood (CD) induceren, aangezien deze gebeurtenissen verband houden met verschillende schadelijke processen die de functionaliteit van de gedoneerde organen en weefsels in gevaar brengen.
Hersendood (BD)
BD wordt geassocieerd met een reeks gebeurtenissen die leiden tot de geleidelijke verslechtering van verschillende systemen. Het treedt meestal op wanneer een acute of geleidelijke toename van de intracraniale druk (ICP) optreedt als gevolg van hersentrauma of bloeding. Deze toename van ICP bevordert een verhoging van de bloeddruk in een poging om een stabiele cerebrale bloedstroom te behouden in een proces dat bekend staat als de reflex van Cushing10,11. Deze acute veranderingen kunnen leiden tot cardiovasculaire, endocriene en neurologische disfuncties die de kwantiteit en kwaliteit van de gedoneerde organen in gevaar brengen, naast de gevolgen voor de morbiditeit en mortaliteit na transplantatie 10,11,12,13.
Hemorragische shock (HS)
HS wordt op zijn beurt vaak geassocieerd met orgaandonoren, aangezien de meesten van hen het slachtoffer zijn van trauma met aanzienlijk verlies van bloedvolume. Sommige organen, zoals de longen en het hart, zijn bijzonder kwetsbaar voor HS als gevolg van hypovolemie en de daaruit voortvloeiende weefselhypoperfusie14. HS induceert longbeschadiging door verhoogde capillaire permeabiliteit, oedeem en infiltratie van ontstekingscellen, mechanismen die samen de gasuitwisseling in gevaar brengen en leiden tot progressieve verslechtering van organen, waardoor het donatieproces ontspoort 6,14.
Overlijden in de bloedsomloop (CD)
Het gebruik van post-cd-donatie is exponentieel gegroeid in grote wereldcentra, wat bijdraagt aan de toename van het aantal verzamelde organen. Organen die zijn hersteld van post-CD-donoren zijn kwetsbaar voor de effecten van warme ischemie, die optreedt na een interval van lage (agonische fase) of geen bloedtoevoer (asystolische fase)8,15. Hypoperfusie of de afwezigheid van bloedstroom zal leiden tot weefselhypoxie geassocieerd met het abrupte verlies van ATP en de accumulatie van metabole toxines in weefsels15. Ondanks het huidige gebruik voor transplantatie in de klinische praktijk, blijven er veel twijfels bestaan over de impact van het gebruik van deze organen op de kwaliteit van het transplantaat na transplantatie en op de overleving van de patiënt15. Zo neemt ook het gebruik van experimentele modellen voor een beter begrip van de etiologische factoren die verband houden met de ziekte van Crohn toe: 8,15,16,17.
Experimentele modellen
Er zijn verschillende experimentele orgaandonatiemodellen (BD, HS en CD). Studies richten zich echter vaak op slechts één strategie tegelijk. Er is een merkbare kloof in studies die twee of meer strategieën combineren of vergelijken. Deze modellen zijn zeer nuttig bij de ontwikkeling van therapieën die tot doel hebben het aantal donaties te verhogen en bijgevolg de wachtlijst van potentiële ontvangers te verkorten. De diersoorten die voor dit doel worden gebruikt, variëren van studie tot studie, waarbij varkensmodellen vaker worden geselecteerd wanneer het doel een meer directe vertaling is met de fysiologie van de menselijke morfo en minder technische moeilijkheden bij de chirurgische ingreep als gevolg van de grootte van het dier. Ondanks de voordelen zijn er logistieke problemen en hoge kosten verbonden aan het varkensmodel. Aan de andere kant bevorderen de lage kosten en de mogelijkheid van biologische manipulatie het gebruik van knaagdiermodellen, waardoor de onderzoeker kan uitgaan van een betrouwbaar model om laesies te reproduceren en te behandelen, en om de opgedane kennis op het gebied van orgaantransplantatie te integreren.
Hier presenteren we een knaagdiermodel van hersendood, bloedsomloopdood en hemorragische shockdonatie. We beschrijven ontstekingsprocessen en pathologische aandoeningen die verband houden met elk van deze modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierproeven voldeden aan de Ethische Commissie voor Proefdiergebruik en -verzorging van de Faculteit der Geneeskunde van de Universiteit van São Paulo (protocolnummer 112/16).
1. Groepering van dieren
- Wijs willekeurig twaalf mannelijke Sprague Dawley-ratten (250-300 g) toe aan een van de drie experimentele groepen (n=4) om de effecten van de diermodellen te analyseren en te vergelijken.
- Wijs dieren toe aan hemorragische shockgroep (HS, n=4): dieren die vasculaire katheterisatie ondergaan met hemorragische shockinductie + onderhoud gedurende 360 minuten + cardiopulmonale blokextractie + monstervoorbereiding voor analyse.
- Wijs dieren toe aan de hersendoodgroep (BD, n=4): dieren die zijn onderworpen aan hersendood + onderhoud gedurende 360 minuten + cardiopulmonale blokextractie + monstervoorbereiding voor analyse.
- Wijs de dieren toe aan de groep met bloedsomloopsterfte (CD, n=4): dieren die vasculaire katheterisatie + inductie van bloedsomloopsterfte + opschorting van beademing + ischemie bij kamertemperatuur gedurende 180 minuten + monstervoorbereiding voor analyse hebben ondergaan.
2. Anesthesie en preoperatieve voorbereiding
- Plaats de rat gedurende 1 - 4 minuten in een gesloten kamer met 5% isofluraan. Controleer de juiste verdoving door de teenknijpreflex te controleren. Als er geen reflexreacties zijn (geen terugtrekking van de poot), voer dan orotracheale intubatie (14-G angiocath) uit met behulp van een pediatrische laryngoscoop.
- Sluit met een vooraf afgesteld mechanisch beademingsapparaat (FiO2 100%, teugvolume 10 ml/kg, 90 cycli/min en PEEP 3,0 cmH2O) de tracheakatheter aan op het beademingsapparaat en stel de anesthesieconcentratie in op 2%.
OPMERKING: Alle procedures met betrekking tot diermodellen volgden hetzelfde anesthesieprotocol dat in deze sectie wordt beschreven. - Verwijder de vacht van de interessegebieden (hoofd, nek, borst en buik). Desinfecteer vervolgens met gaas het operatieveld en de staart van het dier. Desinfectie wordt uitgevoerd met drie afwisselende rondes van een alcoholische oplossing van chloorhexidinedigluconaatscrub.
- Knip het puntje van de staart van het dier af, plaats de duim en wijsvinger over de basis van de staart en druk ze dan weg van de basis. Verzamel een perifeer bloedmonster (20 μL) via de staart voor het totale aantal leukocyten8.
OPMERKING: Deze procedure moet worden uitgevoerd vóór het begin van de tracheostomie en onmiddellijk aan het einde van elk protocol (BD en HS - na 360 min). - Gebruik een precisiepipet om het verzamelde bloed te verdunnen in 380 μL (1:20) Turk's oplossing (ijsazijn 99%). Eenmaal verdund, pipetteert u het bloedmonster in een Neubauer-kamer en plaatst u het onder een microscoop (40x). Voer het totale aantal leukocyten uit in de vier laterale kwadranten van de kamer.
3. Tracheostomie
- Voer met behulp van een geschikte schaar en pincet longitudinale dissectie van de cervicale luchtpijp uit, beginnend bij het middelste derde deel van de nek tot de suprasternale inkeping (
incisie van 1,5 cm). Na de incisie van de huid en het onderhuidse weefsel, ontleedt u de cervicale spieren totdat de luchtpijp bloot komt te liggen. - Plaats een 2-0 zijden ligatuur onder de luchtpijp.
- Gebruik een microschaar om het bovenste derde deel van de luchtpijp te tracheostomiseren om een gelijkmatige ventilatie te bereiken. Snijd de luchtpijp horizontaal tussen twee kraakbeenringen om de diameter van een metalen canule (3,5 cm) op te vangen.
- Plaats de ventilatiebuis en zet deze vast met voorbereide ligaturen.
- Sluit de ventilatiebuis aan op het ventilatiesysteem voor kleine dieren.
- Ventileer de rat met een ademvolume van 10 ml/kg, een snelheid van 70 cycli/min en een PEEP van 3 cmH2O.
incisie van 1,5 cm). Na de incisie van de huid en het onderhuidse weefsel, ontleedt u de cervicale spieren totdat de luchtpijp bloot komt te liggen.4. Katheterisatie van de dijbeenslagader en ader
- Leg de femurdriehoek bloot via een kleine incisie (1,5 cm) in de liesstreek. Identificeer en isoleer de femurvaten. Gebruik voor deze procedure een stereomicroscoop (3,2x vergroting).
- Plaats twee 4-0 zijden ligaturen onder de bloedvaten (ader of slagader), één distaal en de andere proximaal. Sluit de meest distale ligatuur, plaats vervolgens een vooraf afgestelde knoop in de proximale ligatuur en trek.
- Breng de katheter in via een kleine, voorgevormde incisie in de bloedvaten. Fixeer de canule om ontwrichting te voorkomen.
OPMERKING: Maak de katheters van een neonatale extender van 20 cm die door verhitting is gelast aan een perifere intraveneuze katheter die geschikt is voor het kaliber van het veneuze netwerk van het dier, waardoor regurgitatie van de bloedinhoud wordt voorkomen. Smeer de canule in met heparine en vermijd de vorming van trombi en complicaties tijdens de meting van de gemiddelde arteriële druk (MAP). - Sluit de slagaderkatheter aan op een druktransducer en een bewakingssysteem voor vitale functies om de gemiddelde arteriële druk (MAP) te registreren. De transducer moet ter hoogte van het hart van het dier worden geplaatst. Neem de MAP elke periode van 10 minuten op.
- Plaats de spuitkatheter (3 ml) in de ader en streef indien nodig naar hydratatie en verbloeding.
5. Hemorragische schokinductie
- Verwijder via veneuze toegang en met een gehepariniseerde spuit kleine hoeveelheden bloed totdat MAP-waarden van 50 mmHg zijn bereikt, waardoor hemorragische shock ontstaat.
OPMERKING: Verzamel elke 10 minuten in het eerste uur van het experiment een aliquot van 2 ml bloed en elke 30 minuten in de daaropvolgende uren. - Houd de druk stabiel op ongeveer 50 mmHg gedurende een periode van 360 min. Om dit te doen, verwijdert of voegt u aliquots bloed toe als de druk respectievelijk stijgt of daalt.
- Plaats een warmtebron in de buurt om onderkoeling te voorkomen.
OPMERKING: Hier wordt een warmtelamp gebruikt. - Aan het einde van het protocol oogst u het longblok bij de totale longcapaciteit (TLC) en vriest u het snel in vloeibare stikstof in of plaatst u het in een fixeeroplossing voor verder onderzoek.
OPMERKING: Met behulp van een ventilator voor kleine dieren zijn de beademingsparameters toegankelijk tijdens het protocol. In de huidige studie werden deze parameters geëvalueerd onmiddellijk vóór HS-inductie (baseline) en 360 minuten later (definitief).
6. Inductie van overlijden in de bloedsomloop
- Om overlijden in de bloedsomloop te induceren, dient u 150 mg/kg natriumthiopental toe via de veneuze lijn. Schakel vervolgens het ventilatiesysteem uit.
- Let op de geleidelijke afname van de MAP totdat deze 0 mmHg bereikt. Overweeg vanaf dit punt het begin van de warme ischemieperiode en begin met het tellen van de tijd. Het dier moet gedurende 180 minuten op kamertemperatuur (ongeveer 22 °C) blijven.
- Sluit aan het einde van het protocol de longen weer aan op de mechanische ventilator en oogst het longblok bij TLC voor verzameling. Vries het snel in met vloeibare stikstof of plaats het in de fixatieoplossing voor verder onderzoek.
7. Inductie van hersendood
- Zet de rat in buikligging.
- Verwijder de huid van de schedel met een chirurgische schaar. Boor een boorgat met kaliber 1 mm, 2,80 mm voor en 10,0 mm ventrale tot bregma en 1,5 mm lateraal tot de sagittale hechtdraad.
- Breng de hele ballonkatheter in de schedelholte en zorg ervoor dat de ballon voorgevuld is met zoutoplossing (500 μL).
- Blaas de katheter snel op met behulp van een injectiespuit.
- Bevestig hersendood door het observeren van een abrupte MAP-verhoging (Cushing's reflex), de afwezigheid van reflexen, bilaterale mydriasis en apneu. Stop na bevestiging met de anesthesie en houd het dier gedurende 360 minuten aan de mechanische beademing.
- Plaats een warmtebron in de buurt om onderkoeling te voorkomen.
- Aan het einde van het protocol oogst je het longblok bij TLC voor verzameling en vries je het snel in vloeibare stikstof in of plaats je het in een fixeeroplossing voor verder onderzoek.
OPMERKING: Met behulp van een ventilator voor kleine dieren zijn de beademingsparameters toegankelijk tijdens het protocol. In de huidige studie evalueerden we deze parameters onmiddellijk vóór BD-inductie (baseline) en na 360 minuten (definitief).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gemiddelde arteriële druk (MAP)
Om de hemodynamische repercussies van BD en HS te bepalen, werd MAP geëvalueerd gedurende de 360 minuten van het protocol. De nulmeting werd verzameld na het verwijderen van de huid en het boren van de schedel en vóór het verzamelen van bloed voor dieren die respectievelijk aan BD of HS waren onderworpen. Voorafgaand aan BD- en HS-inductie was de baseline MAP van de twee groepen vergelijkbaar (BD: 110,5 ± 6,1 vs. HS: 105,8 ± 2,3 mmHg; p=0,5; tweerichtingsANOVA). Na katheterinsufflatie ervoer de BD-groep een abrupte stijging van de bloeddruk (138,7 ± 10,1 mmHg). De hypertensieve piek is een eigenaardige gebeurtenis die verband houdt met verhoogde intracraniale druk en kan worden beschouwd als het eerste bewijs van het ontstaan van BD. Bovendien zagen we de afwezigheid van reflexen, bilaterale mydriasis en apneu na inflatie bij alle dieren. Deze piekdruk werd gevolgd door een snelle afname van MAP (10 min - 81,2 ± 10 mmHg). Hypotensie hield ongeveer 50 minuten aan, waarna de MAP-niveaus terugkeerden naar waarden die dicht bij die van baseline lagen (120 min - 120,7 ± 7,5 mmHg) (Figuur 1).
Anders dan in de BD-groep wordt de afname van MAP in de HS-groep geassocieerd met het terugtrekken van bloedaliquots in de eerste 10 minuten van het experiment. Hypovolemische shock werd gedurende 360 minuten aangehouden (gemiddelde variatie gedurende het protocol 52,3 ± 1,2 mmHg). Na het einde van het protocol vertoonde de BD-groep een significant ander MAP-patroon gedurende de 6-uurs follow-up van de HS-groep (BD: 93,7 ± 4,5 vs. HS: 52,3 ± 0,5 mmHg; p<0,0001; Student's t-toets).
Longmechanica
Om de elastische en resistieve parameters van het ademhalingssysteem te evalueren, werd een analyse uitgevoerd van de longmechanica van de dieren die aan BD en HS werden onderworpen. 360 minuten na aanvang en na behoud van hypotensie vertoonde de HS-groep een verhoogde weerstand van het longweefsel (G) (HS: baseline - 0,26 ± 0,02 vs. finale - 0,51 ± 0,05 cmH2O.ml-1; p=0,03; Twee richtingen ANOVA), gevolgd door verminderde therapietrouw van het ademhalingssysteem (Crs) (HS: basislijn - 0,64 ± 0,05 vs. finale - 0,23 ± 0,004 cmH2O/ml; p=0,001; Twee richtingen ANOVA) (figuur 2A,B).
Longoedeem
Aan het einde van het protocol werd de middenkwab van de rechterlong verzameld voor alle groepen en werd het gewicht gemeten om de nat/droog gewichtsverhouding te analyseren, die werd gebruikt als de longoedeemindex. Het natte gewicht werd onmiddellijk na extractie van het orgel bepaald en het drooggewicht werd na 24 uur gemeten in een oven van 80 °C. Volgens deze verhouding vertoonde de BD-groep (2,32 ± 0,1) meer oedeem dan de HS-groep (1,97 ± 0,03) en CD-groepen (2,04 ± 0,02) (Figuur 3).
Systemische en weefselinflammatoire parameters
Aan het einde van het protocol was er een significante toename van het totale aantal systemische leukocyten in de groep die HS onderging (basislijn - 13888 ± 887,3 vs. finale - 35263 ± 4076 mm3; p=0,0189); Twee richtingen ANOVA) (figuur 4). De HS-groep vertoonde ook een toename van het aantal leukocyten, zowel in vergelijking met de uitgangswaarden als in relatie tot de BD-groep (p = 0,0132).
Weefselontsteking werd beoordeeld door ontstekingsmarkers in het longweefsel te kwantificeren. Voor dit doel werden longweefselbiopsiemonsters gehomogeniseerd in fosfaatbuffer en vervolgens opgestuurd voor analyse op expressie van tumornecrosefactor-alfa (TNF-α) en interleukine 1-bèta (IL1-β). IL1-β expressieniveaus waren hoger in de BD-groep (304,4 ± 91 pg/mg) en HS-groep (327,5 ± 25,2 pg/mg) dan in de CD-groep (8 ± 2,3 pg/mg; p=0,004; One-way ANOVA) (figuur 5B). De HS-groep vertoonde ook hogere niveaus van TNF-α (4,7 ± 0,3 pg/mg; p<0,0001; One-way ANOVA) dan de BD-groep (1,3 ± 0,3 pg/mg) en de CD-groep (0,4 ± 0,2 pg/mg) (Figuur 5B).
Figuur 1: Tijdsverloop van de gemiddelde arteriële druk (MAP) in de groepen hersendood (BD) en hemorragische shock (HS). De waarden voor alle metingen worden uitgedrukt als de gemiddelden ± standaardfouten van de gemiddelden (SEM's). MAP, gemiddelde arteriële druk; BD, hersendood; HS, hemorragische shock. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Longmechanica. Longmechanica zoals bepaald door (A) compliantie van het ademhalingssysteem en (B) weefselweerstand in de hersendood (BD)-groep en de hemorragische shock (HS)-groep. * geeft significante verschillen aan tussen de basiswaarde en de eindwaarde in de HS-groep (p<0,05). De waarden voor alle metingen worden uitgedrukt als de gemiddelden ± standaardfouten van de gemiddelden (SEM's), en voor vergelijkingen werd tweerichtings-ANOVA gebruikt. Crs, naleving van het ademhalingssysteem; G, weefselweerstand; BD, hersendood; HS, hemorragische shock. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Longoedeem bepaald door de nat-droog gewichtsverhouding van de longen in de hersendood (BD)-groep en de hemorragische shock (HS)-groep. De waarden voor alle metingen worden uitgedrukt als de gemiddelden ± standaardfouten van de gemiddelden (SEM's), en er zijn vergelijkingen gemaakt met eenrichtings-ANOVA . BD, hersendood; HS, hemorragische shock; CD, overlijden van de bloedsomloop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Leukogram van de hemorragische shock (HS) groep en de hersendood (BD) groep. * geeft significante verschillen aan tussen baseline en eindwaarden in de HS-groep (p<0,05). De waarden voor alle metingen worden uitgedrukt als de gemiddelden ± standaardfouten van het gemiddelde (SEM's) en er zijn vergelijkingen gemaakt met tweerichtings-ANOVA . BD, hersendood; HS, hemorragische shock. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Lokale ontstekingsreacties waren minder prominent in de groep met bloedsomloopsterfte (CD). (A) Longweefselexpressie van IL-1β; (B) Longweefselexpressie van TNF-α. De waarden voor alle metingen worden uitgedrukt als de gemiddelden ± standaardfouten van het gemiddelde (SEM's) en er zijn vergelijkingen gemaakt met eenrichtings-ANOVA . BD, hersendood; HS, hemorragische shock; CD, overlijden van de bloedsomloop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de afgelopen jaren heeft het toenemende aantal diagnoses van hersendood ertoe geleid dat het de grootste leverancier is geworden van organen en weefsels die bedoeld zijn voor transplantatie. Deze groei ging echter gepaard met een ongelooflijke toename van donaties na overlijden in de bloedsomloop. Ondanks de multifactoriële aard ervan, beginnen de meeste triggerende mechanismen van de doodsoorzaken na of gaan ze gepaard met een trauma met uitgebreid verlies van bloedgehalte 4,18.
In deze context zijn experimentele modellen van hersendood, circulatiestilstand en hemorragische shock belangrijke hulpmiddelen voor de prospectieve studie van complicaties die verband houden met de doodsoorzaak van de donor en hun impact op de levensvatbaarheid van potentiële organen die bedoeld zijn voor transplantatie 6,8,10. Er zijn verschillende dierlijke afstammingslijnen gesuggereerd voor modelvestiging, zoals varkens, konijnen, ratten en muizen. Ratten- en muismodellen komen vaker voor in de literatuur omdat ze niet erg duur zijn en weinig logistieke moeilijkheden met zich meebrengen, terwijl ze de pathofysiologische gebeurtenissen die worden bestudeerd op bevredigende wijze reproduceren 8,13,14,15.
We willen benadrukken dat recente richtlijnen en studies het gebruik van pre-anesthesie-analgesie hebben onderschreven als een integraal onderdeel van chirurgische protocollen, zelfs in acute situaties, gericht op een uitgebreider beheer van perioperatieve pijn en dierenwelzijn. We raden onderzoekers aan om een dergelijke aanpak in toekomstige studies te evalueren.
Hersendood (BD)
Het BD-model bleek reproduceerbaar te zijn door middel van een abrupte toename van ICP. Het gebruik van geschikte instrumenten en opgeleid personeel maakt chirurgisch succes en reproductie van de techniek mogelijk met een paar weken training. Tijdens de ontwikkeling van de BD-techniek moet trepanatie worden uitgevoerd met een geschikte gemotoriseerde boor, zodat er geen speling in de katheter ontstaat, waardoor de projectie van hersenweefsel uit het gat wordt voorkomen. Bovendien moet tijdens het boren de voorwaartse beweging van de boor worden gestopt zodra de aanvankelijke weerstand van de schedel is overwonnen.
Onderzoekers moeten alert blijven en zorgen voor een snelle inflatie van de katheter, aangezien geleidelijke inflatie verschillende ontstekings- en hemodynamische reactiesbevordert21. Veranderingen in de bloeddruk moeten op hun beurt gedurende het hele protocol voortdurend worden gecontroleerd, vooral tijdens katheterinsufflatie, die gepaard moet gaan met een abrupte toename van MAP en tijdens het eerste uur na het opzetten van BD (periode van hypotensie na inflatie). Deze resultaten zijn in overeenstemming met de literatuur, die het vaststellen van een hypertensieve piek onmiddellijk na katheterinsufflatie aantoont, gevolgd door een daling van de drukniveaus, in een waarschijnlijke reactie op de voorbijgaande toename van circulerende catecholaminespiegels22.
Het langdurig in BD houden van het dier kan leiden tot hypotensie gevolgd door dood van de bloedsomloop, waardoor het experiment onhaalbaar wordt. Dienovereenkomstig stellen de meeste protocollen die in de literatuur worden gebruikt een follow-upperiode vast die varieert van 4 tot 6 uur, waarna vasoactieve geneesmiddelen moeten worden toegediend 12,13,21,22,23.
Naast hemodynamische veranderingen bevorderen herseninfarct en ischemie een toename van de systemische circulatie van pro-inflammatoire factoren, die, wanneer ze de longen bereiken, bijdragen aan longparenchymbeschadiging 24,25,26.
In onze studie ging BD gepaard met een significante toename van de IL-1β-expressie in weefsel (boven CD) en de nat/droog gewichtsverhouding, een index van longoedeem. Eerdere studies hebben een toename van de circulerende niveaus van pro-inflammatoire cytokines na een BD-gebeurtenis aangetoond, wat uiteindelijk de modulatie van de expressie van adhesiemoleculen, verhoogde vasculaire permeabiliteit en de daaruit voortvloeiende leukocytenmigratie kan bevorderen 27,28,29,30.
Hemorragische shock (HS)
Het vaste drukmodel van HS, dat tot stand komt door het terugtrekken of opnieuw ingieten van bloedaliquots met als doel langdurig hypotensie te handhaven (≤ 50 mmHg), heeft tot doel de afname van het bloedvolume veroorzaakt door het hemorragische proces na te bootsen en bijgevolg de verzwakking van de systemische vuldruk. Deze gebeurtenissen leiden tot een afname van de MAP, vergezeld van een afname van de pulmonale perfusiedruk31,32.
Een van de voordelen van dit HS-model is de mogelijkheid om de mate en duur van hypotensie te regelen, naast de grotere reproduceerbaarheid van de techniek in vergelijking met modellen op basis van een vooraf vastgesteld bloedvolume. Dienovereenkomstig stellen de meeste protocollen die in de literatuur worden gebruikt een protocolperiode vast die varieert van 15 minuten tot meer dan 180 minuten, met gemiddelde bloeddrukniveaus variërend van 20-55 mmHg, afhankelijk van de analyse die in het onderzoek is gekozen 6,32. In de huidige studie werd hypotensie gedurende 3 uur gehandhaafd, wat leidde tot verhoogde weefselweerstand, gevolgd door verminderde longcompliantie bij dieren die aan HS werden blootgesteld. Dit wordt bevestigd door verschillende studies in de literatuur die een proportioneel verband hebben aangetoond tussen de tijd die in HS wordt doorgebracht en de effecten van hypovolemie op de luchtwegweerstand en de compliantie van de longen 6,33,34.
Bovendien ging HS in de huidige studie gepaard met significante leukocytose en verhoogde weefselexpressie van IL-1β (met betrekking tot CD) en TNF-α. Schade aan het endotheel van de pulmonale microvasculatuur, veroorzaakt door het vrijkomen van reactieve zuurstofsoorten uit het primaire proces van hypoxie en vastgestelde ischemie, zal de vasculaire permeabiliteit verhogen, wat, samen met de toename van de druk in de longslagader, zal fungeren als een chemotactische factor voor leukocyten en de daaropvolgende afgifte van ontstekingsmediatoren 6,20,31,35,36, 37,38.
Overlijden in de bloedsomloop (CD)
Het belangrijkste verschil tussen de marginale transplantaten die afkomstig zijn van de BD- en CD-processen is de warme ischemietijd (WIT) waaraan het transplantaat zal worden onderworpen, door sommige onderzoekers gedefinieerd als de tijd tussen de afwezigheid van perifere pulsen en onderbreking van de bloedstroom als gevolg van verwijdering van levensondersteunende apparatuur tot koude of regionale perfusie van het orgaan17, 39,40.
In de huidige studie werden de organen en weefsels van dieren afgeleid van het CD-model onderworpen aan een WIT-periode van 180 minuten. Verschillende studies in de literatuur hebben een proportionele relatie aangetoond tussen de WIT en disfunctie na transplantatie, wat suggereert dat de ischemietijd moet variëren afhankelijk van de bijzonderheden en integriteit van elk orgaan. In deze context is aangetoond dat longtransplantaten van ratten tot 3 uur durende perioden van warme ischemie verdragen41,42.
Met bewijs van weefselbeschadiging veroorzaakt door de overheersende sympathische fase, hemodynamische instabiliteit en systemische ontsteking als gevolg van het BD-proces, zijn donaties na circulatiestilstand heroverwogen als een mogelijke strategie om complicaties geassocieerd met transplantatie te verminderen 41,42,43. In die zin wijzen onze gegevens op een dramatische afname van IL-1β- en TNF-α-niveaus in het CD-model ten opzichte van de andere twee bestudeerde modellen. Dit bevestigend merkten Iskender et al.4 de lage niveaus van weefselcytokines op in een model van longreperfusie bij ratten met weefsels die na de WIT waren gedoneerd via mechanismen die nog steeds slecht worden begrepen.
Op basis van het bovenstaande moeten de keuze van de methodologie en de aanpassingen ervan afhangen van de door de onderzoeker ontwikkelde doelstellingen. Eenmaal vastgesteld, moeten deze doelstellingen als leidraad dienen voor het type donatiemodel, de protocoltijd en de uit te voeren analyses. Het is ook mogelijk om het type donatie te relateren aan diermodellen van longreconditionering en reperfusie.
Conclusies
Concluderend kunnen we stellen dat de hier beschreven orgaandonormodellen potentiële hulpmiddelen zijn bij de studie van de veranderingen die verband houden met verschillende methoden voor het oogsten van transplantaten en dat ze middelen kunnen bieden waarmee een volledig inzicht kan worden verkregen in de impact van de kwaliteit van deze organen op de resultaten na transplantatie, gezien de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van de hier gepresenteerde methoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We willen bevestigen dat er geen bekende belangenconflicten zijn in verband met deze publicatie en dat er geen significante financiële steun voor dit werk is geweest die de uitkomst ervan had kunnen beïnvloeden.
Acknowledgments
Wij danken FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) voor het verlenen van financiële steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14-gauge angiocath | DB | 38186714 | Orotracheal intubation |
| 2.0-silk | Brasuture | AA553 | Tracheal tube fixation |
| 24-gauge angiocath | DB | 38181214 | Arterial and venous access |
| 4.0-silk | Brasuture | AA551 | Fixation of arterial and venous cannulas |
| Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%). | Vic Pharma | Y/N | Asepsis |
| Trichotomy apparatus | Oster | Y/N | Clipping device |
| Precision balance | Shimadzu | D314800051 | Analysis of the wet/dry weight ratio |
| Barbiturate (Thiopental) | Cristália | 18080003 | DC induction |
| Balloon catheter (Fogarty-4F) | Edwards Life Since | 120804 | BD induction |
| Neonatal extender | Embramed | 497267 | Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath |
| FlexiVent | Scireq | 1142254 | Analysis of ventilatory parameters |
| Heparin | Blau Farmaceutica SA | 7000982-06 | Anticoagulant |
| Isoflurane | Cristália | 10,29,80,130 | Inhalation anesthesia |
| Micropipette (1000 µL) | Eppendorf | 347765Z | Handling of small- volume liquids |
| Micropipette (20 µL) | Eppendorf | H19385F | Handling of small- volume liquids |
| Microscope | Zeiss | 1601004545 | Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure |
| Multiparameter monitor | Dixtal | 101503775 | MAP registration |
| Motorized drill | Midetronic | MCA0439 | Used to drill a 1 mm caliber borehole |
| Neubauer chamber | Kasvi | D15-BL | Cell count |
| Pediatric laryngoscope | Oxygel | Y/N | Assistance during tracheal intubation |
| Syringe (3 mL) | SR | 3330N4 | Hydration and exsanguination during HS protocol |
| Pressure transducer | Edwards Life Since | P23XL | MAP registration |
| Metallic tracheal tube | Biomedical | 006316/12 | Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator |
| Isoflurane vaporizer | Harvard Bioscience | 1,02,698 | Anesthesia system |
| Mechanical ventilator for small animals (683) | Harvard Apparatus | MA1 55-0000 | Mechanical ventilation |
| xMap methodology | Millipore | RECYTMAG-65K-04 | Analysis of inflammatory markers |
References
- Paterno, F., et al. Clinical implications of donor warm and cold ischemia time in donor after circulatory death liver transplantation. Liver Transplantation. 25 (9), 1342-1352 (2019).
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for heart and lung transplantation: thirty-third adult lung and heart-lung transplant report-2016; focus theme: primary diagnostic indications for transplant. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1170-1184 (2016).
- Jung, H. Y., et al. Comparison of transplant outcomes for low-level and standard-level tacrolimus at different time points after kidney transplantation. Journal of Korean Medical Science. 34 (12), e103 (2019).
- Cypel, M., et al. The International Society for heart and lung transplantation donation after circulatory death registry report. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 34 (10), 1278-1282 (2015).
- Drake, M., Bernard, A., Hessel, E.
- Nepomuceno, N. A., et al. Effect of hypertonic saline in the pretreatment of lung donors with hemorrhagic shock. Journal of Surgical Research. 225, 181-188 (2018).
- Menegat, L., et al. Evidence of bone marrow downregulation in brain-dead rats. International Journal of Experimental Pathology. (3), 158-165 (2017).
- Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. (5), 760-768 (2018).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo perfusion prevents lung injury compared to extended cold preservation for transplantation. American Journal of Transplantation. 9 (10), 2262-2269 (2009).
- Wauters, S., et al. Evaluating lung injury at increasing time intervals in a murine brain death model. Journal of Surgical Research. 183 (1), 419-426 (2013).
- Smith, M. Physiologic changes during brain stem death--lessons for management of the organ donor. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 23 (9), S217-S222 (2004).
- Belhaj, A., et al. Mechanical versus humoral determinants of brain death-induced lung injury. PLoS One. 12 (7), e0181899 (2017).
- Kolkert, J. L., et al. The gradual onset brain death model: a relevant model to study organ donation and its consequences on the outcome after transplantation. Laboratory Animals. 41 (3), 363-371 (2007).
- Rocha-E-Silva, M. Cardiovascular effects of shock and trauma in experimental models: A review. Revista Brasileira de Cirurgia Cardiovascular. 31 (1), 45-51 (2016).
- Manara, A. R., Murphy, P. G., O'Callaghan, G.
- Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. The Lancet. 385 (9987), 2585-2591 (2015).
- Boucek, M. M., et al. Pediatric heart transplantation after declaration of cardiocirculatory death. The New England Journal of Medicine. 359 (7), 709-714 (2008).
- Kramer, A. H., Baht, R., Doig, C. J. Time trends in organ donation after neurologic determination of death: a cohort study. CMAJ Open. 5 (1), E19-E27 (2017).
- Reino, D. C., et al. Trauma hemorrhagic shock-induced lung injury involves a gut-lymph-induced TLR4 pathway in mice. PLoS One. 6 (8), e14829 (2011).
- Pascual, J. L., et al. Hypertonic saline resuscitation of hemorrhagic shock diminishes neutrophil rolling and adherence to endothelium and reduces in vivo vascular leakage. Annals of Surgery. 236 (5), 634-642 (2002).
- Van Zanden, J. E., et al. Rat donor lung quality deteriorates more after fast than slow brain death induction. PLoS One. 15 (11), e0242827 (2020).
- Shivalkar, B., et al. Variable effects of explosive or gradual increase of intracranial pressure on myocardial structure and function. Circulation. 87 (1), 230-239 (1993).
- López-Aguilar, J., et al. Massive brain injury enhances lung damage in an isolated lung model of ventilator-induced lung injury. Critical Care Medicine. 33 (5), 1077-1083 (2005).
- Catania, A., Lonati, C., Sordi, A., Gatti, S. Detrimental consequences of brain injury on peripheral cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (7), 877-884 (2009).
- McKeating, E. G., Andrews, P. J., Mascia, L. Leukocyte adhesion molecule profiles and outcome after traumatic brain injury. Acta Neurochirurgica Supplement. 71, 200-202 (1998).
- Ott, L., McClain, C. J., Gillespie, M., Young, B. Cytokines and metabolic dysfunction after severe head injury. Journal of Neurotrauma. 11 (5), 447-472 (1994).
- Avlonitis, V. S., Wigfield, C. H., Kirby, J. A., Dark, J. H. The hemodynamic mechanisms of lung injury and systemic inflammatory response following brain death in the transplant donor. American Journal of Transplantation. 5 (4), 684-693 (2005).
- De Jesus Correia, C., et al. Hypertonic saline reduces cell infiltration into the lungs after brain death in rats. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 61, 101901 (2020).
- Kalsotra, A., Zhao, J., Anakk, S., Dash, P. K., Strobel, H. W. Brain trauma leads to enhanced lung inflammation and injury: evidence for role of P4504Fs in resolution. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 27 (5), 963-974 (2007).
- Simas, R., Zanoni, F. L., Silva, R., Moreira, L. F. P. Brain death effects on lung microvasculature in an experimental model of lung donor. Journal Brasileiro de Pneumologia. 46 (2), e20180299 (2020).
- Moore, K. The physiological response to hemorrhagic shock. Journal of Emergency Nursing. 40 (6), 629-631 (2014).
- Fülöp, A., Turóczi, Z., Garbaisz, D., Harsányi, L., Szijártó, A. Experimental models of hemorrhagic shock: a review. European Surgical Research. 50 (2), 57-70 (2013).
- Hillen, G. P., Gaisford, W. D., Jensen, C. G. Pulmonary changes in treated and untreated hemorrhagic shock. I. Early functional and ultrastructural alterations after moderate shock. The American Journal of Surgery. 122 (5), 639-649 (1971).
- Sprung, J., Mackenzie, C. F., Green, M. D., O'Dwyer, J., Barnas, G. M. Chest wall and lung mechanics during acute hemorrhage in anesthetized dogs. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 11 (5), 608-612 (1997).
- Liu, X., et al. Inhibition of BTK protects lungs from trauma-hemorrhagic shock-induced injury in rats. Molecular Medicine Reports. 16 (1), 192-200 (2017).
- Maeshima, K., et al. Prevention of hemorrhagic shock-induced lung injury by heme arginate treatment in rats. Biochemical Pharmacology. 69 (11), 1667-1680 (2005).
- Gao, J., et al. Effects of different resuscitation fluids on acute lung injury in a rat model of uncontrolled hemorrhagic shock and infection. The Journal of Trauma. 67 (6), 1213-1219 (2009).
- Wohlauer, M., et al. Nebulized hypertonic saline attenuates acute lung injury following trauma and hemorrhagic shock via inhibition of matrix metalloproteinase-13. Critical Care Medicine. 40 (9), 2647-2653 (2012).
- Morrissey, P. E., Monaco, A. P. Donation after circulatory death: current practices, ongoing challenges, and potential improvements. Transplantation. 97 (3), 258-264 (2014).
- Snell, G. I., Levvey, B. J., Levin, K., Paraskeva, M., Westall, G. Donation after brain death versus donation after circulatory death: lung donor management issues. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 39 (2), 138-147 (2018).
- Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
- Yamamoto, S., et al. Activations of mitogen-activated protein kinases and regulation of their downstream molecules after rat lung transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 43 (10), 3628-3633 (2011).
- Kang, C. H., et al. Transcriptional signatures in donor lungs from donation after cardiac death vs after brain death: a functional pathway analysis. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 30 (3), 289-298 (2011).
