Summary
Denne undersøgelse viser etableringen af tre forskellige lungedonationsmodeller (post-hjernedød, post-kredsløbsdød donation og post-hæmoragisk chokdonation). Det sammenligner de inflammatoriske processer og patologiske lidelser forbundet med disse hændelser.
Abstract
Eksperimentelle modeller er vigtige værktøjer til forståelse af de etiologiske fænomener, der er involveret i forskellige patofysiologiske begivenheder. I denne sammenhæng bruges forskellige dyremodeller til at studere de elementer, der udløser patofysiologien af primær transplantatdysfunktion efter transplantation for at evaluere potentielle behandlinger. I øjeblikket kan vi opdele eksperimentelle donationsmodeller i to store grupper: donation efter hjernedød og donation efter kredsløbsstop. Desuden bør de skadelige virkninger forbundet med hæmoragisk shock overvejes, når man overvejer dyremodeller for organdonation. Her beskriver vi etableringen af tre forskellige lungedonationsmodeller (post-hjernedødsdonation, post-kredsløbsdød donation og post-hæmoragisk chokdonation) og sammenligner de inflammatoriske processer og patologiske lidelser forbundet med disse hændelser. Målet er at give det videnskabelige samfund pålidelige dyremodeller for lungedonation til at studere de tilknyttede patologiske mekanismer og søge efter nye terapeutiske mål for at optimere antallet af levedygtige transplantater til transplantation.
Introduction
Klinisk relevans
Organtransplantation er en veletableret terapeutisk mulighed for flere alvorlige patologier. I de senere år er der opnået mange fremskridt inden for de kliniske og eksperimentelle områder af organtransplantation, såsom større viden om patofysiologien ved primær transplantatdysfunktion (PGD) og fremskridt inden for intensivpleje, immunologi og farmakologi 1,2,3. På trods af resultaterne og forbedringerne i kvaliteten af de relaterede kirurgiske og farmakologiske procedurer er forholdet mellem antallet af tilgængelige organer og antallet af modtagere på ventelisten fortsat en af de største udfordringer 2,4. I denne henseende har den videnskabelige litteratur foreslået dyremodeller til undersøgelse af terapier, der kan anvendes på organdonorer til behandling og / eller bevarelse af organerne indtil transplantationstidspunktet 5,6,7,8.
Ved at efterligne de forskellige hændelser, der observeres i klinisk praksis, tillader dyremodeller undersøgelsen af de associerede patologiske mekanismer og deres respektive terapeutiske tilgange. Den eksperimentelle induktion af disse begivenheder har i de fleste isolerede tilfælde genereret eksperimentelle modeller for organ- og vævsdonation, der er bredt undersøgt i den videnskabelige litteratur om organtransplantation 6,7,8,9. Disse undersøgelser anvender forskellige metodologiske strategier, såsom dem, der inducerer hjernedød (BD), hæmoragisk chok (HS) og kredsløbsdød (CD), da disse begivenheder er forbundet med forskellige skadelige processer, der kompromitterer funktionaliteten af de donerede organer og væv.
Hjernedød (BD)
BD er forbundet med en række begivenheder, der fører til den progressive forringelse af forskellige systemer. Det sker normalt, når en akut eller gradvis stigning i intrakranielt tryk (ICP) sker på grund af hjernetraumer eller blødning. Denne stigning i ICP fremmer en stigning i blodtrykket i et forsøg på at opretholde en stabil cerebral blodgennemstrømning i en proces kendt som Cushings refleks10,11. Disse akutte ændringer kan resultere i kardiovaskulære, endokrine, og neurologiske dysfunktioner, der kompromitterer mængden og kvaliteten af de donerede organer, ud over at påvirke post-transplantation sygelighed og dødelighed 10,11,12,13.
Hæmoragisk chok (HS)
HS er igen ofte forbundet med organdonorer, da de fleste af dem er ofre for traumer med betydeligt tab af blodvolumen. Nogle organer, såsom lunger og hjerte, er særligt sårbare over for HS på grund af hypovolæmi og deraf følgende vævshypoperfusion14. HS inducerer lungeskade gennem øget kapillærpermeabilitet, ødem og infiltration af inflammatoriske celler, mekanismer, der tilsammen kompromitterer gasudveksling og fører til progressiv organforringelse, hvilket følgelig afsporer donationsprocessen 6,14.
Kredsløbsdød (CD)
Brugen af post-cd-donation er vokset eksponentielt i store verdenscentre og bidrager dermed til stigningen i antallet af indsamlede organer. Organer genvundet fra post-CD-donorer er sårbare over for virkningerne af varm iskæmi, som opstår efter et interval med lav (agonisk fase) eller ingen blodforsyning (asystolisk fase)8,15. Hypoperfusion eller fravær af blodgennemstrømning vil føre til vævshypoxi forbundet med det pludselige tab af ATP og akkumulering af metaboliske toksiner i væv15. På trods af den nuværende anvendelse til transplantation i klinisk praksis hersker der fortsat stor tvivl om virkningen af anvendelsen af disse organer på kvaliteten af transplantatet efter transplantationen og på patienternes overlevelse15. Således vokser brugen af eksperimentelle modeller til en bedre forståelse af de etiologiske faktorer forbundet med CD også 8,15,16,17.
Eksperimentelle modeller
Der er forskellige eksperimentelle organdonationsmodeller (BD, HS og CD). Undersøgelser fokuserer dog ofte kun på én strategi ad gangen. Der er et mærkbart hul i undersøgelser, der kombinerer eller sammenligner to eller flere strategier. Disse modeller er meget nyttige i udviklingen af terapier, der søger at øge antallet af donationer og dermed mindske ventelisten over potentielle modtagere. De dyrearter, der anvendes til dette formål, varierer fra undersøgelse til undersøgelse, hvor svinemodeller vælges mere almindeligt, når målet er en mere direkte oversættelse med human morfofysiologi og mindre tekniske vanskeligheder i det kirurgiske indgreb på grund af dyrets størrelse. På trods af fordelene er logistiske vanskeligheder og høje omkostninger forbundet med svinemodellen. På den anden side favoriserer de lave omkostninger og muligheden for biologisk manipulation brugen af gnavermodeller, så forskeren kan starte fra en pålidelig model til at reproducere og behandle læsioner samt at integrere den viden, der er erhvervet inden for organtransplantation.
Her præsenterer vi en gnavermodel af hjernedød, kredsløbsdød og hæmoragisk chokdonation. Vi beskriver inflammatoriske processer og patologiske tilstande forbundet med hver af disse modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg overholdt den etiske komité for brug og pleje af forsøgsdyr ved det medicinske fakultet ved universitetet i São Paulo (protokolnummer 112/16).
1. Gruppering af dyr
- Tildel tilfældigt tolv hanrotter fra Sprague Dawley (250-300 g) til en af tre forsøgsgrupper (n=4) for at analysere og sammenligne effekterne forbundet med dyremodellerne.
- Tildel dyr til hæmoragisk chokgruppe (HS, n = 4): dyr, der udsættes for vaskulær kateterisering med hæmoragisk chokinduktion + vedligeholdelse i 360 min + kardiopulmonal blokekstraktion + prøveforberedelse til analyse.
- Tildel dyr til hjernedødsgruppe (BD, n = 4): dyr udsat for hjernedød + vedligeholdelse i 360 min + kardiopulmonal blokekstraktion + prøveforberedelse til analyse.
- Tildel dyr til kredsløbsdødsgruppe (CD, n = 4): dyr, der udsættes for vaskulær kateterisering + induktion af kredsløbsdød + suspension af ventilation + iskæmi ved stuetemperatur i 180 min + prøveforberedelse til analyse.
2. Anæstesi og prækirurgisk forberedelse
- Placer rotten i et lukket kammer med 5% isofluran i 1 - 4 min. Bekræft korrekt bedøvelse ved at kontrollere tåklemmerefleksen. I mangel af refleksreaktioner (ingen pote tilbagetrækning), udfør orotracheal intubation (14-G angiocath) ved hjælp af et pædiatrisk laryngoskop.
- Med en tidligere justeret mekanisk ventilator (FiO2 100%, tidevandsvolumen 10 ml / kg, 90 cyklusser / min og PEEP 3,0 cmH2O) skal du tilslutte trakealkateteret til ventilatoren og justere anæstesikoncentrationen til 2%.
BEMÆRK: Alle procedurer relateret til dyremodeller fulgte den samme bedøvelsesprotokol beskrevet i dette afsnit. - Fjern pels fra interesseområderne (hoved, nakke, bryst og mave). Derefter desinficeres det kirurgiske felt og dyrets hale ved hjælp af gasbind. Desinfektion udføres med tre vekslende runder af en alkoholisk opløsning af chlorhexidindigluconatskrubbe.
- Skær spidsen af dyrets hale, læg tommelfingeren og pegefingeren over bunden af halen, og tryk derefter og skub dem væk fra bunden. Saml en perifer blodprøve (20 μL) gennem halen for det samlede leukocyttal8.
BEMÆRK: Denne procedure skal udføres før starten af trakeostomien og umiddelbart i slutningen af hver protokol (BD og HS - efter 360 min). - Brug en præcisionspipette til at fortynde det opsamlede blod i 380 μL (1:20) Turks opløsning (iseddike 99%). Når den er fortyndet, pipetteres blodprøven ind i et Neubauer-kammer og placeres under et mikroskop (40x). Udfør det samlede leukocyttal i kammerets fire laterale kvadranter.
3. Trakeostomi
- Ved hjælp af passende saks og tang udføres langsgående dissektion af livmoderhalsrøret, startende fra den midterste tredjedel af nakken til det suprasternale hak (
1,5 cm snit). Efter snittet i huden og subkutant væv dissekeres livmoderhalsmusklerne, indtil luftrøret er udsat. - Placer en 2-0 silkeligatur under luftrøret.
- Ved hjælp af mikrosaks trakeostomiserer trakeostomisere den øverste tredjedel af luftrøret for at opnå ensartet ventilation. Skær luftrøret vandret mellem to bruskringe for at rumme diameteren af en metalkanyle (3,5 cm).
- Indsæt ventilationsrøret og fastgør det med forberedte ligaturer.
- Tilslut ventilationsrøret til ventilationssystemet til små dyr.
- Rotten ventileres med et tidevandsvolumen på 10 ml/kg, en hastighed på 70 cyklusser/min og PEEP på 3 cmH2O.
1,5 cm snit). Efter snittet i huden og subkutant væv dissekeres livmoderhalsmusklerne, indtil luftrøret er udsat.4. Femoral arterie og venekateterisering
- Udsæt lårbenstrekanten gennem et lille snit (1,5 cm) i lyskeområdet. Identificer og isoler lårbenene. Til denne procedure skal du bruge et stereomikroskop (3,2x forstørrelse).
- Placer to 4-0 silkeligaturer under blodkarrene (vene eller arterie), den ene distalt og den anden proximalt. Luk den mest distale ligatur, placer derefter en forudjusteret knude i den proksimale ligatur og træk.
- Indsæt kateteret gennem et lille, præformet snit i karrene. Fastgør kanylen for at undgå forskydning.
BEMÆRK: Gør katetrene fra en 20 cm neonatal extender svejset ved opvarmning til et perifert intravenøst kateter egnet til kaliber af dyrets venøse netværk, hvilket forhindrer regurgitation af blodindhold. Smør kanylen med heparin, undgå dannelse af trombi og komplikationer under måling af gennemsnitligt arterielt tryk (MAP). - Tilslut arteriekateteret til en tryktransducer og et vitalt tegnovervågningssystem for at registrere det gennemsnitlige arterielle tryk (MAP). Transduceren skal placeres på dyrets hjerteniveau. Optag MAP hver 10-minutters periode.
- Anbring sprøjtekateteret (3 ml) i venen med henblik på hydrering og ekssanguinering, når det er nødvendigt.
5. Induktion af hæmoragisk stød
- Gennem venøs adgang og med en hepariniseret sprøjte fjernes små mængder blod, indtil MAP-værdier på 50 mmHg nås, hvorved der etableres hæmoragisk shock.
BEMÆRK: Opsaml en 2 ml alikvote blod hvert 10. minut i den første time af eksperimentet og hvert 30. minut i de efterfølgende timer. - Hold trykket stabilt på ca. 50 mmHg i en periode på 360 min. For at gøre dette skal du fjerne eller tilføje alikvoter af blod, hvis trykket henholdsvis stiger eller falder.
- Sæt en varmekilde i nærheden for at undgå hypotermi.
BEMÆRK: Her bruges en varmelampe. - I slutningen af protokollen høstes lungeblokken ved den samlede lungekapacitet (TLC) og enten flashfryses i flydende nitrogen eller placeres i en fikseringsopløsning til yderligere undersøgelser.
BEMÆRK: Ved hjælp af en ventilator til små dyr kan de respiratoriske parametre tilgås under protokollen. I denne undersøgelse blev disse parametre evalueret umiddelbart før HS-induktion (Baseline) og 360 minutter senere (Final).
6. Induktion af kredsløbsdød
- For at fremkalde kredsløbsdød administreres 150 mg/kg natriumthiopental gennem veneslangen. Sluk derefter ventilationssystemet.
- Bemærk det progressive fald i MAP, indtil det når 0 mmHg. Fra dette tidspunkt skal du overveje starten på den varme iskæmiperiode og begynde tidstællingen. Dyret skal forblive ved stuetemperatur (ca. 22 °C) i 180 minutter.
- I slutningen af protokollen skal du tilslutte lungerne til den mekaniske ventilator igen og høste lungeblokken ved TLC til opsamling. Enten flashfryse ved hjælp af flydende nitrogen eller placere det i fikseringsopløsningen til yderligere undersøgelser.
7. Induktion af hjernedød
- Placer rotten i den udsatte position.
- Fjern huden fra kraniet ved hjælp af kirurgisk saks. Bor et 1 mm kaliberborehul 2,80 mm forreste og 10,0 mm ventral til bregma og 1,5 mm lateralt til sagittal sutur.
- Indsæt hele ballonkateteret i kraniehulen, og sørg for, at ballonen er fyldt med saltvand (500 μL).
- Ved hjælp af en sprøjte blæses kateteret hurtigt op.
- Bekræft hjernedød ved at observere en abrupt MAP-forhøjelse (Cushings refleks), fraværet af reflekser, bilateral mydriasis og apnø. Efter bekræftelse skal du afbryde anæstesi og holde dyret på mekanisk ventilation i 360 minutter.
- Placer en varmekilde i nærheden for at undgå hypotermi.
- I slutningen af protokollen høstes lungeblokken ved TLC til opsamling og enten flashfryses i flydende nitrogen eller placeres i en fikseringsopløsning til yderligere undersøgelser.
BEMÆRK: Ved hjælp af en ventilator til små dyr kan de respiratoriske parametre tilgås under protokollen. I dette studie evaluerede vi disse parametre umiddelbart før BD-induktion (Baseline) og efter 360 minutter (Final).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gennemsnitligt arterielt tryk (MAP)
For at bestemme de hæmodynamiske konsekvenser af BD og HS blev MAP evalueret over protokollens 360 minutter. Baselinemålingen blev indsamlet efter hudfjernelse og kranieboring og før blodalikvote indsamling for dyr, der blev udsat for henholdsvis BD eller HS. Før BD- og HS-induktion var baseline MAP for de to grupper ens (BD: 110,5 ± 6,1 vs. HS: 105,8 ± 2,3 mmHg; p = 0,5; tovejs ANOVA). Efter kateterinsufflation oplevede BD-gruppen en pludselig stigning i blodtryksniveauerne (138. 7 ± 10,1 mmHg). Den hypertensive top er en ejendommelig begivenhed relateret til øget intrakranielt tryk og kan betragtes som det første bevis på etableringen af BD. Derudover observerede vi fraværet af reflekser, bilateral mydriasis og postinflationsapnø hos alle dyr. Dette toptryk blev efterfulgt af et hurtigt fald i MAP (10 min - 81,2 ± 10 mmHg). Hypotensionen varede i ca. 50 minutter, hvorefter MAP-niveauerne vendte tilbage til værdier tæt på værdierne ved baseline (120 min - 120,7 ± 7,5 mmHg) (figur 1).
I modsætning til BD-gruppen er faldet i MAP i HS-gruppen forbundet med tilbagetrækning af blodalikvoter i de første 10 minutter af eksperimentet. Hypovolemisk shock blev opretholdt i 360 minutter (gennemsnitlig variation i hele protokollen 52,3 ± 1,2 mmHg). Efter afslutningen af protokollen viste BD-gruppen et signifikant anderledes MAP-mønster i forhold til 6-timers opfølgningen fra HS-gruppen (BD: 93,7 ± 4,5 vs. HS: 52,3 ± 0,5 mmHg; s<0,0001; Elevens ikke test).
Lungemekanik
For at evaluere de elastiske og resistive parametre i åndedrætssystemet blev der udført en analyse af lungemekanikken hos de dyr, der blev udsat for BD og HS. 360 min efter debut og efter hypotensionsvedligeholdelse udviste HS-gruppen øget lungevævsresistens (G) (HS: Baseline - 0,26 ± 0,02 vs. Final - 0,51 ± 0,05 cmH2O.ml-1; p = 0,03; tovejs ANOVA), efterfulgt af nedsat respiratorisk overensstemmelse (Crs) (HS: Baseline - 0,64 ± 0,05 vs. Final - 0,23 ± 0,004 cmH2O/ml; p = 0,001; tovejs ANOVA) (figur 2A, B).
Lungeødem
I slutningen af protokollen blev den midterste lap i højre lunge indsamlet for alle grupper, og dens vægt blev målt for at analysere forholdet mellem våd og tørvægt, som blev brugt som lungeødemindekset. Den våde vægt blev vurderet umiddelbart efter ekstraktion af organet, og tørvægten blev målt efter 24 timer i en ovn på 80 °C. Ifølge dette forhold viste BD-gruppen (2,32 ± 0,1) større ødem end HS- (1,97 ± 0,03) og CD-grupperne (2,04 ± 0,02) (figur 3).
Systemiske og vævsinflammatoriske parametre
I slutningen af protokollen var der en signifikant stigning i det samlede antal systemiske leukocytter i gruppen, der gennemgik HS (Baseline - 13888 ± 887,3 vs. Final - 35263 ± 4076 mm3; p = 0,0189); tovejs ANOVA) (figur 4). HS-gruppen viste også en stigning i antallet af leukocytter både sammenlignet med baselineværdierne og i forhold til BD-gruppen (p = 0,0132).
Vævsbetændelse blev vurderet ved at kvantificere inflammatoriske markører i lungevævet. Til dette formål blev lungevævsbiopsiprøver homogeniseret i fosfatbuffer og derefter sendt til analyse for tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) og interleukin 1 beta (IL1-β) ekspression. IL1-β ekspressionsniveauer var større i BD-gruppen (304,4 ± 91 pg/mg) og HS-gruppen (327,5 ± 25,2 pg/mg) end i CD-gruppen (8 ± 2,3 pg/mg; p = 0,004; envejs ANOVA) (figur 5B). HS-gruppen viste også højere niveauer af TNF-α (4,7 ± 0,3 pg/mg; p<0,0001; envejs ANOVA) end BD-gruppen (1,3 ± 0,3 pg/mg) og CD-gruppen (0,4 ± 0,2 pg/mg) (figur 5B).
Figur 1: Tidsforløb for gennemsnitligt arterielt tryk (MAP) i hjernedød (BD) og hæmoragisk chok (HS) grupper. Værdierne for alle målingerne udtrykkes som middelværdien ± standardfejl for middelværdierne (SEM'erne). MAP, gennemsnitligt arterielt tryk; BD, hjernedød; HS, hæmoragisk chok. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Lungemekanik. Lungemekanik som bestemt af (A) åndedrætssystemets overholdelse og (B) vævsmodstand i hjernedødsgruppen (BD) og hæmoragisk chok (HS) gruppen. * angiver signifikante forskelle mellem basislinjen og de endelige værdier i HS-gruppen (p<0,05). Værdierne for alle målingerne udtrykkes som middelværdien ± standardfejl for middelværdierne (SEM'erne), og tovejs-ANOVA blev anvendt til sammenligninger. Crs, åndedrætssystemets overholdelse; G, vævsresistens; BD, hjernedød; HS, hæmoragisk chok. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Lungeødem bestemt ved lunge våd-til-tør vægtforhold i hjernedød (BD) gruppen og hæmoragisk chok (HS) gruppen. Værdierne for alle målingerne er udtrykt som middelværdien ± standardfejl for middelværdierne (SEM'erne), og der blev foretaget sammenligninger med envejs ANOVA. BD, hjernedød; HS, hæmoragisk chok; CD, kredsløbsdød. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Leukogram af hæmoragisk chok (HS) gruppe og hjernedød (BD) gruppe. * angiver signifikante forskelle mellem baseline og endelige værdier i HS-gruppen (p<0,05). Værdierne for alle målingerne er udtrykt som middelværdien ± standardfejlene for middelværdien (SEM'er), og der er foretaget sammenligninger med tovejs ANOVA. BD, hjernedød; HS, hæmoragisk chok. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Lokale inflammatoriske reaktioner var mindre fremtrædende i gruppen af kredsløbsdød (CD). (A) Lungevævsekspression af IL-1β; B) Lungevævsekspression af TNF-α. Værdierne for alle målingerne er udtrykt som middelværdien ± standardfejlene for middelværdien (SEM'er), og der er foretaget sammenligninger med envejs ANOVA. BD, hjernedød; HS, hæmoragisk chok; CD, kredsløbsdød. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de senere år har det stigende antal diagnoser af hjernedød ført til, at det er blevet den største udbyder af organer og væv beregnet til transplantation. Denne vækst har imidlertid været ledsaget af en utrolig stigning i donationer efter kredsløbsdød. På trods af sin multifaktorielle karakter begynder de fleste af de udløsende mekanismer for dødsårsagerne efter eller ledsager traumer med omfattende tab af blodindhold 4,18.
I denne sammenhæng er eksperimentelle modeller af hjernedød, kredsløbsstop og hæmoragisk chok vigtige værktøjer til prospektiv undersøgelse af komplikationer forbundet med årsagen til donordød og deres indvirkning på levedygtigheden af potentielle organer beregnet til transplantation 6,8,10. Flere dyreslægter er blevet foreslået til modelvirksomhed, såsom svin, kanin, rotte og mus. Rotte- og musemodeller er mere almindelige i litteraturen, fordi de ikke er meget dyre og involverer lave logistiske vanskeligheder, mens de tilfredsstillende gengiver de patofysiologiske hændelser, der er under undersøgelse 8,13,14,15.
Vi vil gerne understrege, at nylige retningslinjer og undersøgelser har godkendt brugen af præbedøvelsesanalgesi som en integreret del af kirurgiske protokoller, selv i akutte situationer, med det formål at opnå mere omfattende styring af perioperativ smerte og dyrs trivsel. Vi anbefaler, at forskere evaluerer en sådan tilgang i fremtidige undersøgelser.
Hjernedød (BD)
BD-modellen viste sig at være reproducerbar ved hjælp af en brat stigning i ICP. Brug af passende instrumenter og uddannet personale tillader kirurgisk succes og reproduktion af teknikken med et par ugers træning. Under udviklingen af BD-teknikken skal trepanation udføres med en passende motoriseret boremaskine, så der ikke er slæk i kateteret, hvilket forhindrer projektion af hjernevæv ud af hullet. Derudover skal borets fremadgående bevægelse stoppes under boringen, så snart den oprindelige modstand, der tilbydes af kraniet, er overvundet.
Forskere bør forblive opmærksomme og sikre hurtig inflation af kateteret, da gradvis inflation fremmer forskellige inflammatoriske og hæmodynamiske reaktioner21. Blodtryksændringer bør igen overvåges konstant gennem hele protokollen, især under kateterinsufflation, som bør ledsages af en pludselig stigning i MAP og i løbet af den første time efter BD-etablering (hypotensionsperiode efter inflation). Disse resultater er i overensstemmelse med litteraturen, som viser etableringen af en hypertensiv top umiddelbart efter kateterinsufflation efterfulgt af et fald i trykniveauer i en sandsynlig reaktion på den forbigående stigning i cirkulerende catecholaminniveauer22.
Opretholdelse af dyret i BD i længere perioder kan føre til hypotension efterfulgt af kredsløbsdød, hvilket gør forsøget umuligt. Følgelig etablerer de fleste protokoller, der anvendes i litteraturen, en opfølgningsperiode, der varierer fra 4 til 6 timer, hvorefter vasoaktive lægemidler skal administreres 12,13,21,22,23.
Ud over hæmodynamiske ændringer fremmer cerebral infarkt og iskæmi en stigning i den systemiske cirkulation af proinflammatoriske faktorer, som, når de når lungerne, bidrager til lungeparenkymskade 24,25,26.
I vores undersøgelse blev BS ledsaget af en signifikant stigning i vævs IL-1β-ekspression (over CD) og forholdet mellem våd og tør vægt, et indeks for lungeødem. Tidligere undersøgelser har indikeret en stigning i cirkulerende niveauer af proinflammatoriske cytokiner efter en BD-begivenhed, hvilket i sidste ende kan favorisere moduleringen af ekspressionen af adhæsionsmolekyler, øget vaskulær permeabilitet og deraf følgende leukocytmigration 27,28,29,30.
Hæmoragisk chok (HS)
Etableret ved tilbagetrækning eller reinfusion af blodalikvoter med det formål at forlænge hypotensionsvedligeholdelse (≤ 50 mmHg), sigter HS's faste trykmodel mod at efterligne faldet i blodvolumen forårsaget af den hæmoragiske proces og følgelig dæmpningen af det systemiske påfyldningstryk. Disse hændelser fører til et fald i MAP ledsaget af et fald i lungeperfusionstrykket31,32.
Blandt fordelene ved denne HS-model er muligheden for at kontrollere graden og varigheden af hypotension ud over den større reproducerbarhed af teknikken sammenlignet med modeller baseret på et præfikset blodvolumen. Følgelig etablerer de fleste protokoller, der anvendes i litteraturen, en protokolperiode, der varierer fra 15 min til mere end 180 min, med gennemsnitlige blodtryksniveauer fra 20-55 mmHg, afhængigt af analysen valgt i undersøgelsen 6,32. I dette studie blev hypotension opretholdt i 3 timer, hvilket førte til øget vævsresistens efterfulgt af nedsat lungekomplians hos dyr, der blev udsat for HS. For at bekræfte dette har forskellige undersøgelser i litteraturen indikeret et proportionalt forhold mellem den tid, der bruges i HS, og virkningerne af hypovolæmi på luftvejsresistens og lungeoverensstemmelse 6,33,34.
Desuden blev HS i nærværende undersøgelse ledsaget af signifikant leukocytose og øget vævsekspression af IL-1β (med hensyn til CD) og TNF-α. Skader på lungemikrovaskulaturendotelet, induceret ved frigivelse af reaktive oxygenarter fra den primære proces med hypoxi og etableret iskæmi, vil øge vaskulær permeabilitet, som sammen med stigningen i lungearterietryk vil fungere som en kemotaktisk faktor for leukocytter og den efterfølgende frigivelse af inflammatoriske mediatorer 6,20,31,35,36, 37,38.
Kredsløbsdød (CD)
Hovedforskellen mellem de marginale transplantater, der stammer fra BD- og CD-processerne, er den varme iskæmitid (WIT), som transplantatet vil blive udsat for, defineret af nogle forskere som tiden mellem fraværet af perifere impulser og afbrydelse af blodgennemstrømningen på grund af fjernelse af livsstøtteudstyr indtil kold eller regional perfusion af organet17, 39,40.
I denne undersøgelse blev organer og væv fra dyr afledt af CD-modellen udsat for en WIT-periode på 180 min. Flere undersøgelser i litteraturen har afsløret et proportionalt forhold mellem WIT og dysfunktion efter transplantation, hvilket tyder på, at iskæmitiden bør variere alt efter hvert organs særlige forhold og integritet. I denne sammenhæng har lungetransplantater fra rotter vist sig at tolerere op til 3-timers perioder med varm iskæmi41,42.
Med tegn på vævsskade forårsaget af den fremherskende sympatiske fase, hæmodynamisk ustabilitet og systemisk inflammation som følge af BD-processen er donationer efter kredsløbsstop blevet genovervejet som en potentiel strategi til at mindske komplikationer forbundet med transplantation 41,42,43. I denne forstand indikerer vores data et dramatisk fald i IL-1β- og TNF-α-niveauer i CD-modellen i forhold til de to andre undersøgte modeller. Iskender et al.4 bekræftede dette og bemærkede de lave niveauer af vævscytokiner i en model af lungereperfusion hos rotter med væv doneret efter WIT gennem mekanismer, der stadig er dårligt forstået.
På baggrund af ovenstående bør valget af metode og dens tilpasninger afhænge af de mål, som forskeren har udviklet. Når disse mål er fastlagt, bør de være retningsgivende for donationsmodellens art, protokoltiden og de analyser, der skal udføres. Det er også muligt at relatere typen af donation med dyremodeller for lungerekonditionering og reperfusion.
Konklusioner
Det kan konkluderes, at de organdonormodeller, der er beskrevet her, er potentielle værktøjer i undersøgelsen af de ændringer, der er forbundet med forskellige metoder til høstning af transplantater, og som kan give mulighed for at opnå en fuld forståelse af virkningen af disse organers kvalitet på resultaterne efter transplantation i betragtning af reproducerbarheden og pålideligheden af de metoder, der præsenteres her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi vil gerne bekræfte, at der ikke er nogen kendte interessekonflikter forbundet med denne publikation, og at der ikke har været nogen væsentlig økonomisk støtte til dette arbejde, der kunne have påvirket resultatet.
Acknowledgments
Vi takker FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) for at yde økonomisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14-gauge angiocath | DB | 38186714 | Orotracheal intubation |
| 2.0-silk | Brasuture | AA553 | Tracheal tube fixation |
| 24-gauge angiocath | DB | 38181214 | Arterial and venous access |
| 4.0-silk | Brasuture | AA551 | Fixation of arterial and venous cannulas |
| Alcoholic chlorhexidine digluconate solution (2%). | Vic Pharma | Y/N | Asepsis |
| Trichotomy apparatus | Oster | Y/N | Clipping device |
| Precision balance | Shimadzu | D314800051 | Analysis of the wet/dry weight ratio |
| Barbiturate (Thiopental) | Cristália | 18080003 | DC induction |
| Balloon catheter (Fogarty-4F) | Edwards Life Since | 120804 | BD induction |
| Neonatal extender | Embramed | 497267 | Used as catheters with the aid of the 24 G angiocath |
| FlexiVent | Scireq | 1142254 | Analysis of ventilatory parameters |
| Heparin | Blau Farmaceutica SA | 7000982-06 | Anticoagulant |
| Isoflurane | Cristália | 10,29,80,130 | Inhalation anesthesia |
| Micropipette (1000 µL) | Eppendorf | 347765Z | Handling of small- volume liquids |
| Micropipette (20 µL) | Eppendorf | H19385F | Handling of small- volume liquids |
| Microscope | Zeiss | 1601004545 | Assistance in the visualization of structures for the surgical procedure |
| Multiparameter monitor | Dixtal | 101503775 | MAP registration |
| Motorized drill | Midetronic | MCA0439 | Used to drill a 1 mm caliber borehole |
| Neubauer chamber | Kasvi | D15-BL | Cell count |
| Pediatric laryngoscope | Oxygel | Y/N | Assistance during tracheal intubation |
| Syringe (3 mL) | SR | 3330N4 | Hydration and exsanguination during HS protocol |
| Pressure transducer | Edwards Life Since | P23XL | MAP registration |
| Metallic tracheal tube | Biomedical | 006316/12 | Rigid cannula for analysis with the FlexiVent ventilator |
| Isoflurane vaporizer | Harvard Bioscience | 1,02,698 | Anesthesia system |
| Mechanical ventilator for small animals (683) | Harvard Apparatus | MA1 55-0000 | Mechanical ventilation |
| xMap methodology | Millipore | RECYTMAG-65K-04 | Analysis of inflammatory markers |
References
- Paterno, F., et al. Clinical implications of donor warm and cold ischemia time in donor after circulatory death liver transplantation. Liver Transplantation. 25 (9), 1342-1352 (2019).
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for heart and lung transplantation: thirty-third adult lung and heart-lung transplant report-2016; focus theme: primary diagnostic indications for transplant. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1170-1184 (2016).
- Jung, H. Y., et al. Comparison of transplant outcomes for low-level and standard-level tacrolimus at different time points after kidney transplantation. Journal of Korean Medical Science. 34 (12), e103 (2019).
- Cypel, M., et al. The International Society for heart and lung transplantation donation after circulatory death registry report. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 34 (10), 1278-1282 (2015).
- Drake, M., Bernard, A., Hessel, E.
- Nepomuceno, N. A., et al. Effect of hypertonic saline in the pretreatment of lung donors with hemorrhagic shock. Journal of Surgical Research. 225, 181-188 (2018).
- Menegat, L., et al. Evidence of bone marrow downregulation in brain-dead rats. International Journal of Experimental Pathology. (3), 158-165 (2017).
- Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. (5), 760-768 (2018).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo perfusion prevents lung injury compared to extended cold preservation for transplantation. American Journal of Transplantation. 9 (10), 2262-2269 (2009).
- Wauters, S., et al. Evaluating lung injury at increasing time intervals in a murine brain death model. Journal of Surgical Research. 183 (1), 419-426 (2013).
- Smith, M. Physiologic changes during brain stem death--lessons for management of the organ donor. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 23 (9), S217-S222 (2004).
- Belhaj, A., et al. Mechanical versus humoral determinants of brain death-induced lung injury. PLoS One. 12 (7), e0181899 (2017).
- Kolkert, J. L., et al. The gradual onset brain death model: a relevant model to study organ donation and its consequences on the outcome after transplantation. Laboratory Animals. 41 (3), 363-371 (2007).
- Rocha-E-Silva, M. Cardiovascular effects of shock and trauma in experimental models: A review. Revista Brasileira de Cirurgia Cardiovascular. 31 (1), 45-51 (2016).
- Manara, A. R., Murphy, P. G., O'Callaghan, G.
- Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. The Lancet. 385 (9987), 2585-2591 (2015).
- Boucek, M. M., et al. Pediatric heart transplantation after declaration of cardiocirculatory death. The New England Journal of Medicine. 359 (7), 709-714 (2008).
- Kramer, A. H., Baht, R., Doig, C. J. Time trends in organ donation after neurologic determination of death: a cohort study. CMAJ Open. 5 (1), E19-E27 (2017).
- Reino, D. C., et al. Trauma hemorrhagic shock-induced lung injury involves a gut-lymph-induced TLR4 pathway in mice. PLoS One. 6 (8), e14829 (2011).
- Pascual, J. L., et al. Hypertonic saline resuscitation of hemorrhagic shock diminishes neutrophil rolling and adherence to endothelium and reduces in vivo vascular leakage. Annals of Surgery. 236 (5), 634-642 (2002).
- Van Zanden, J. E., et al. Rat donor lung quality deteriorates more after fast than slow brain death induction. PLoS One. 15 (11), e0242827 (2020).
- Shivalkar, B., et al. Variable effects of explosive or gradual increase of intracranial pressure on myocardial structure and function. Circulation. 87 (1), 230-239 (1993).
- López-Aguilar, J., et al. Massive brain injury enhances lung damage in an isolated lung model of ventilator-induced lung injury. Critical Care Medicine. 33 (5), 1077-1083 (2005).
- Catania, A., Lonati, C., Sordi, A., Gatti, S. Detrimental consequences of brain injury on peripheral cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (7), 877-884 (2009).
- McKeating, E. G., Andrews, P. J., Mascia, L. Leukocyte adhesion molecule profiles and outcome after traumatic brain injury. Acta Neurochirurgica Supplement. 71, 200-202 (1998).
- Ott, L., McClain, C. J., Gillespie, M., Young, B. Cytokines and metabolic dysfunction after severe head injury. Journal of Neurotrauma. 11 (5), 447-472 (1994).
- Avlonitis, V. S., Wigfield, C. H., Kirby, J. A., Dark, J. H. The hemodynamic mechanisms of lung injury and systemic inflammatory response following brain death in the transplant donor. American Journal of Transplantation. 5 (4), 684-693 (2005).
- De Jesus Correia, C., et al. Hypertonic saline reduces cell infiltration into the lungs after brain death in rats. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 61, 101901 (2020).
- Kalsotra, A., Zhao, J., Anakk, S., Dash, P. K., Strobel, H. W. Brain trauma leads to enhanced lung inflammation and injury: evidence for role of P4504Fs in resolution. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 27 (5), 963-974 (2007).
- Simas, R., Zanoni, F. L., Silva, R., Moreira, L. F. P. Brain death effects on lung microvasculature in an experimental model of lung donor. Journal Brasileiro de Pneumologia. 46 (2), e20180299 (2020).
- Moore, K. The physiological response to hemorrhagic shock. Journal of Emergency Nursing. 40 (6), 629-631 (2014).
- Fülöp, A., Turóczi, Z., Garbaisz, D., Harsányi, L., Szijártó, A. Experimental models of hemorrhagic shock: a review. European Surgical Research. 50 (2), 57-70 (2013).
- Hillen, G. P., Gaisford, W. D., Jensen, C. G. Pulmonary changes in treated and untreated hemorrhagic shock. I. Early functional and ultrastructural alterations after moderate shock. The American Journal of Surgery. 122 (5), 639-649 (1971).
- Sprung, J., Mackenzie, C. F., Green, M. D., O'Dwyer, J., Barnas, G. M. Chest wall and lung mechanics during acute hemorrhage in anesthetized dogs. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 11 (5), 608-612 (1997).
- Liu, X., et al. Inhibition of BTK protects lungs from trauma-hemorrhagic shock-induced injury in rats. Molecular Medicine Reports. 16 (1), 192-200 (2017).
- Maeshima, K., et al. Prevention of hemorrhagic shock-induced lung injury by heme arginate treatment in rats. Biochemical Pharmacology. 69 (11), 1667-1680 (2005).
- Gao, J., et al. Effects of different resuscitation fluids on acute lung injury in a rat model of uncontrolled hemorrhagic shock and infection. The Journal of Trauma. 67 (6), 1213-1219 (2009).
- Wohlauer, M., et al. Nebulized hypertonic saline attenuates acute lung injury following trauma and hemorrhagic shock via inhibition of matrix metalloproteinase-13. Critical Care Medicine. 40 (9), 2647-2653 (2012).
- Morrissey, P. E., Monaco, A. P. Donation after circulatory death: current practices, ongoing challenges, and potential improvements. Transplantation. 97 (3), 258-264 (2014).
- Snell, G. I., Levvey, B. J., Levin, K., Paraskeva, M., Westall, G. Donation after brain death versus donation after circulatory death: lung donor management issues. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 39 (2), 138-147 (2018).
- Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
- Yamamoto, S., et al. Activations of mitogen-activated protein kinases and regulation of their downstream molecules after rat lung transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 43 (10), 3628-3633 (2011).
- Kang, C. H., et al. Transcriptional signatures in donor lungs from donation after cardiac death vs after brain death: a functional pathway analysis. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 30 (3), 289-298 (2011).
