Summary
Burada, triptofan metabolizmasını incelemek için bir pozitron emisyon tomografisi görüntüleme ajanı olan 1-(2-[18F]Floroetil)-L-triptofanın radyosentezini, iyi radyokimyasal verimlere, yüksek enantiyomerik fazlalığa ve yüksek güvenilirliğe sahip bir radyokimya sentez sisteminde tek kaplı, iki aşamalı bir strateji kullanarak açıklıyoruz.
Abstract
Kinürenin yolu (KP), triptofan metabolizması için birincil yoldur. Kanıtlar, KP'nin metabolitlerinin, immün modülatör, nöro-modülatör ve nörotoksik etkileri nedeniyle tümör proliferasyonu, epilepsi, nörodejeneratif hastalıklar ve psikiyatrik hastalıklarda hayati bir rol oynadığını güçlü bir şekilde göstermektedir. Triptofan metabolizmasını haritalamak için en yaygın kullanılan pozitron emisyon tomografisi (PET) ajanı olan α-[11C]metil-L-triptofan ([11C]AMT), zahmetli radyosentez prosedürleri ile 20 dakikalık kısa bir yarı ömre sahiptir. [11C]AMT'yi radyosentezlemek için yerinde bir siklotron gereklidir. Sadece sınırlı sayıda merkez, klinik öncesi çalışmalar ve klinik araştırmalar için [11C] AMT üretmektedir. Bu nedenle, daha uzun bir yarı ömre sahip, in vivo kinetik açıdan elverişli ve otomatikleştirilmesi kolay alternatif bir görüntüleme ajanının geliştirilmesine acilen ihtiyaç vardır. Flor-18 etiketli triptofan analoğu olan 1-(2-[18F]floroetil)-L-triptofanın yararlılığı ve değeri, hücre hattı kaynaklı ksenogreftlerde, hasta kaynaklı ksenogreftlerde ve transgenik tümör modellerinde klinik öncesi uygulamalarda bildirilmiştir.
Bu yazıda 1-(2-[18F]floroetil)-L-triptofanın radyosentezi için tek kaplı, iki aşamalı bir strateji kullanılarak bir protokol sunulmaktadır. Bu protokolü kullanarak, radyotracer% 20 ± 5 (sentez sonunda düzeltilen bozunma, n > 20) radyokimyasal verimde, hem radyokimyasal saflık hem de% 95'in üzerinde enantiyomerik fazlalık ile üretilebilir. Protokol, her adımda 0,5 mL'den fazla olmayan reaksiyon çözücüsü içeren küçük bir öncü miktara, potansiyel olarak toksik 4,7,13,16,21,24-hekzaoksa-1,10-diazabiklo [8.8.8] hekzakozan (K222) düşük yüklemesine ve saflaştırma için çevresel olarak iyi huylu ve enjekte edilebilir bir mobil faza sahiptir. Protokol, ticari olarak temin edilebilen bir modülde klinik araştırma için 1-(2-[18F] floroetil)-L-triptofan üretmek üzere kolayca yapılandırılabilir.
Introduction
İnsanlarda, triptofan günlük diyetin önemli bir bileşenidir. Triptofan öncelikle kinürenin yolu (KP) yoluyla metabolize edilir. KP, iki hız sınırlayıcı enzim, indoleamin 2, 3-dioksijenaz (IDO) ve triptofan 2, 3-dioksijenaz (TDO) tarafından katalize edilir. Triptofanın% 95'inden fazlası kinürenine ve aşağı akış metabolitlerine dönüştürülür ve sonuçta hücresel enerji iletimi için gerekli olan nikotinamid adenin dinükleotid üretir. KP, bağışıklık sisteminin önemli bir düzenleyicisi ve nöroplastisite ve nörotoksik etkilerin önemli bir düzenleyicisidir1,2. Anormal triptofan metabolizması çeşitli nörolojik, onkolojik, psikiyatrik ve metabolik bozukluklarda rol oynar; Bu nedenle, radyoaktif işaretli triptofan analogları klinik araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Klinik olarak en sık araştırılan iki triptofan radyotraceri 11C-α-metil-L-triptofan ([11C]AMT) ve 11C-5-hidroksitriptofan (11C-5-HTP)3'tür.
1990'lı yıllarda, serotonin salgılayan nöroendokrin tümörleri4 görselleştirmek ve metastatik hormona dirençli prostat adenokarsinomunun tedavisini teşhis etmek ve izlemek için 11C-5-HTP kullanılmıştır5. Daha sonra endokrin pankreastaki serotonerjik sistemin nicelleştirilmesinde görüntüleme aracı olarak kullanılmıştır6. 11 adet C-5-HTP ayrıca intraportal adacık transplantasyonunda ve tip 2 diyabette canlı adacıkların noninvaziv tespiti için umut verici bir izleyici olmuştur7,8. Son yirmi yılda, birçok radyoaktif etiketli amino asit klinik araştırmalara ilerlemiştir9,10. Özellikle, karbon-11 etiketli triptofan analoğu [11C]AMT, beyin serotonin sentezini11,12,13,14 haritalamak ve epileptik odakları, epileptojenik tümörleri, yumrulu skleroz kompleksini, gliomları ve meme kanserlerini lokalize etmek için büyük ilgi görmüştür15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24,25,26. [11C] AMT ayrıca çocuklarda çeşitli düşük ve yüksek dereceli tümörlerde yüksek alıma sahiptir27. Ayrıca, insan deneklerde [11C] AMT'nin kinetik izleyici analizi, çeşitli tümörleri ayırt etmek ve derecelendirmek ve gliomu radyasyona bağlı doku hasarından ayırt etmek için kullanılmıştır15. [11C] AMT eşliğinde görüntüleme, beyin hastalıklarında önemli klinik faydalar göstermektedir3,25. Bununla birlikte, karbon-11'in (20 dakika) kısa yarı ömrü ve zahmetli radyosentez prosedürleri nedeniyle, [11C] AMT kullanımı, yerinde bir siklotron ve bir radyokimya tesisi olan birkaç PET merkezi ile sınırlıdır.
Flor-18, karbon-11'in 20 dakikalık yarı ömrüne kıyasla, 109.8 dakikalık uygun bir yarı ömre sahiptir. Çabalar giderek artan bir şekilde, triptofan metabolizması için flor-18 etiketli radyotracerlerin geliştirilmesine odaklanmıştır3,28. Ksenogreftlerde radyoetiketleme, taşıma mekanizmaları, in vitro ve in vivo stabilite, biyodağılım ve tümör alımı açısından toplam 15 benzersiz flor-18 radyoişaretli triptofan radyotracer bildirilmiştir. Bununla birlikte, 4-, 5- ve 6-[18F] florotriptofan dahil olmak üzere çeşitli izleyiciler için hızlı in vivo deflorinasyon gözlendi ve bu da daha fazla klinik translasyonu engelledi29. 5-[18F]Floro-α-metiltriptofan (5-[18F]FAMT) ve 1-(2-[18F]floroetil)-L-triptofan (L-[18F]FETrp, (S)-2-amino-3-(1-(2-[18F]floroetil)-1H-indol-3-yl)propanoik asit, moleküler ağırlık 249.28 g / mol), hayvan modellerinde in vivo kinetiği uygun ve aşmak için büyük potansiyele sahip en umut verici iki radyotracerdir [11] C]Düzensiz triptofan metabolizması olan klinik durumların değerlendirilmesi için AMT28. 5-[18F]FAMT, bağışıklık sistemi baskılanmış farelerin IDO1-pozitif tümör ksenogreftlerinde yüksek alım gösterdi ve KP'yi görüntülemede [11C] AMT28,30'dan daha spesifiktir. Bununla birlikte, 5-[18F] FAMT'nin in vivo stabilitesi, tracer30'un enjeksiyonundan sonraki 30 dakikadan sonra in vivo deflorinasyon verisi bildirilmediği için potansiyel bir endişe kaynağı olmaya devam etmektedir.
Genetiği değiştirilmiş bir medulloblastom fare modelinde yapılan klinik öncesi bir çalışma, 18F-florodeoksiglukoz (18F-FDG) ILE KARŞıLAŞTıRıLDıĞıNDA, L-[18F]FETrp'nin beyin tümörlerinde yüksek birikime sahip olduğunu, ihmal edilebilir in vivo deflorinasyona ve düşük arka plan alımına sahip olduğunu ve üstün bir hedef-hedef dışı oran gösterdiğini göstermiştir31,32. Farelerde yapılan radyasyon dozimetrisi çalışmaları, L-[18F]FETrp'nin klinik 18F-FDG PET tracer33'ten yaklaşık% 20 daha düşük bir olumlu dozimetri maruziyetine sahip olduğunu göstermiştir. Diğer araştırmacıların bulgularıyla uyumlu olarak, klinik öncesi çalışma verileri, epilepsi, nöro-onkoloji, otizm ve yumrulu skleroz gibi beyin bozuklukları olan insanlarda anormal triptofan metabolizmasının araştırılması için L-[18F]FETrp'nin klinik çevirisini desteklemek için önemli kanıtlar sunmaktadır28,31,32,33,34,35,36 . Triptofan metabolizması için en çok araştırılan üç izleyici, 11C-5-HTP, [11C] AMT ve L-[18F] FETrp arasındaki genel bir karşılaştırma Tablo 1'de gösterilmiştir. Hem 11C-5-HTP hem de [11C] AMT'nin kısa bir yarı ömrü ve zahmetli radyoetiketleme prosedürleri vardır. L-[18F]FETrp'nin radyosentezi için tek kaplı, iki adımlı bir yaklaşım kullanarak bir protokol burada açıklanmaktadır. Protokol, az miktarda radyoetiketleme öncüsü, az miktarda reaksiyon çözücüsü, düşük miktarda toksik K222 yüklenmesi ve saflaştırma ve kolay formülasyon için çevresel açıdan iyi huylu ve enjekte edilebilir bir mobil fazın kullanılmasını içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
DİKKAT: Protokol radyoaktif maddeler içermektedir. Herhangi bir ek radyoaktif madde dozu, kanser gibi olumsuz sağlık etkileri olasılığında orantılı bir artışa yol açabilir. Araştırmacılar, radyosentez protokolünü sıcak hücrede veya kurşun davlumbazda yeterli koruma ile yönlendirmek için 'makul derecede ulaşılabilir kadar düşük' (ALARA) doz uygulamalarını takip etmelidir. Doğrudan temas süresini en aza indirmek, bir kurşun kalkan kullanmak ve radyosentez işleminde herhangi bir radyasyona maruz kalma adımı için maksimum mesafeyi korumak esastır. Tüm deney boyunca bir radyasyon dozimetri rozeti ve el izleme halkaları takın ve eldivenler, kolluklar ve ayaklar gibi potansiyel olarak kirlenmiş yüzeyleri sık sık izleyin. Herhangi bir radyoaktif malzemenin kullanımı, nakliyesi ve bertarafı için Nükleer Düzenleme Komisyonu (NRC), yerel ve kurumsal düzenlemelere uyulmalıdır.
1. İlk hazırlıklar
- Yarı hazırlayıcı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) için 50 mM sodyum asetat/asetik asit mobil fazında %10 etanol hazırlayın.
- 3 mL buzul asetik asidi temiz bir 1000 mL hacimsel şişeye yerleştirin. Volumetrik şişeye 900 mL ultra saf su (25 °C'de 18 milyon ohm-cm direnç) ekleyin; yaklaşık 8 mL 6 M sodyum hidroksit çözeltisi ekleyin ve kalibre edilmiş bir pH metre ve bir pH şeridi kullanarak pH'ı 5,5'e ayarlayın. Çözelti oda sıcaklığına soğuduktan sonra, 50 mM sodyum asetat / asetik asit (pH 5.5) çözeltisini hazırlamak için ultra saf su ile hacmi 1000 mL'ye kadar yükseltin.
- Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir membran filtreden vakumla filtreleyin ve çözeltiyi iki adet 500 mL solvent şişesine aktarın.
- Yukarıdaki tamponun yaklaşık 250 mL'sini 500 mL'lik hacimsel bir şişeye yerleştirin. 50 mL Amerika Birleşik Devletleri Farmakopesi (USP) etanolünü ölçmek için dereceli bir silindir kullanın ve etanol'ü hacimsel şişeye ekleyin. 50 mM sodyum asetat / asetik asit ile hacmi 500 mL'ye kadar yükseltin ve pH değerini bir pH şeridi ile ölçün.
- Sistem uygunluk testi için kalite kontrol (QC) çözümleri hazırlayın.
- HPLC solvent şişelerini taze ultra saf su (solvent A) ve etanol (solvent B) ile doldurun. HPLC pompasını hazırlayın ve HPLC programını %30 çözücü A ve %70 çözücü B (v/v)'den oluşan 1 mL/dak akış hızıyla yükleyin.
- QC için bir kontrol çözümü (boş çözüm) yapın. 20 mL'lik bir cam şişeye 5 mL% 0.9 sodyum klorür ekleyin. Yukarıdaki çözeltiye 0.15 mL% 23.4 sodyum klorür ekleyin. Cam şişeye adım 1.1.3'te hazırlanan 6 mL yarı hazırlayıcı HPLC mobil fazı (50 mM sodyum asetat / asetik asitte %10 etanol, pH 5.5) ekleyin.
- 1 μg / mL radyoaktif etiketsiz L-FETrp ve 5 μg / mL rasemik L-FETrp ve D-FETrp karışımları (standart çözeltiler) hazırlayın.
- Standart L-FETrp çözeltilerini (0,1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1,0 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL) kullanarak bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.
- HPLC sırasını ayarlayın. Dizinin boş numune çözeltisinin bir çalışmasını, standart L-FETrp'nin iki çalışmasını (1 μg / mL), rasemik L-FETrp ve D-FETrp karışımlarının bir çalışmasını (5 μg / mL) ve son radyofarmasötiğin bir çalışmasını içerdiğinden emin olun.
- Analitik bir HPLC sütunu (250 x 4,6 mm) kullanarak radyoaktif numuneleri analiz etmeden önce sistem uygunluğunu test etmek için kısmi HPLC dizisini çalıştırın.
- Boş bir numune çalıştırın ve boş numunenin kromatogramının boşluk hacmi ile kromatogramın 10 dakikası arasında hiç veya önemsiz pikler göstermediğinden emin olun.
- Standart çözümün iki çoğaltmasını çalıştırın (1 μg/mL L-FETrp içerir). İki kopyadaki L-FETrp alanlarının ortalama değerin% ±5'i içinde olduğundan emin olun.
- L-FETrp ve D-FETrp karışımlarından bir örnek çalıştırın (sırasıyla 5 μg / mL L-FETrp ve D-EFTrp). L-FETrp ve D-FETrp'nin kromatogramda tanımlanabildiğinden ve taban çizgisinin çözüldüğünden emin olun.
- Radyoetiketleme çözümlerini ve diğer malzemeleri hazırlayın.
- Aşağıdaki çözümleri sırasıyla beş adet 1,5 mL V şekilli şişeye ekleyin. Flakon 1: [18F]florür elüsyonu için 1 mL potasyum karbonat (K2CO3)/K222 çözeltisi (bir su/asetonitril çözeltisinde 5 mg/mL K222 ve 1 mg/mL K2CO3), 1/99, v/v); Flakon 2: [18F] florür kurutma için 0.4 mL susuz asetonitril; Flakon 3: [18F] florür birleşmesi için susuz asetonitrilde (0.5 mL susuz asetonitrilde 1-2 mg) radyoetiketleme öncüsü; Flakon 4: asidoliz için asetonitril (0.25 mL) içinde hidroklorik asit (2 M, 0.25 mL); Flakon 5: Reaksiyon karışımlarının nötralizasyonu için 2 M sodyum hidroksit (0.25 mL).
- Önce 10 mL doymuş sodyum bikarbonat çözeltisinden, ardından 10 mL ultra saf sudan geçerek bir kuaterner metilamonyum (QMA) ışık kartuşunu etkinleştirin ve ardından kartuşu bir azot akışıyla yıkayın. Hafif bir C8 kartuşu ve nötr bir alüminyum oksit kartuşunu 10 mL etanolden ve ardından 10 mL ultra saf sudan geçirerek şartlandırın.
- Tonisiteyi ayarlamak ve HPLC fraksiyonunu seyreltmek için 30 mL'lik steril formülasyon şişesine 0,15 mL% 23,4 sodyum klorür ve 5 mL% 0,9 sodyum klorür ekleyin.
- Reaksiyon kabını durulamak için bir şırıngada bir çözelti (1 mL sodyum asetat / asetik asit tamponu, 50 mM, pH = 5.5, 1.1.1 adımında hazırlanmış, 1 mL etanol ve 0.5 mL su [toplam 2.5 mL]) hazırlayın; 10 mL'lik steril bir şişeye yükleyin.
2. Radyoetiketleme malzemelerini ve radyosentez L-[18F] FETrp'yi monte edin
- Radyoetiketleme malzemelerini monte edin.
- Modül gücünü, karbondioksiti, basınçlı havayı, argon hatlarını ve programlanabilir mantık denetleyicisi (PLC) gücünü açın. Radyokimya sentez sisteminin programını etkinleştirmek için mod_pscf18 düğmesine tıklayın. MVP giriş, çıkış ve formülasyon MVP'sini başlatın ve MVP'lerin sırasıyla 4, 1, 1 konumlarında olduğundan emin olun.
- HPLC döngüsünün Enjekte Et konumunda ve QMA ışık kartuşunun [18F] florür yakalama konumunda olduğundan emin olun.
- Yarı hazırlayıcı HPLC mobil faz şişesini takın (adım 1.1.3'te hazırlanan çözeltiyi içerir). Mobil fazı kiral HPLC kolonundan (250 x 10 mm) ve C18 sütunundan (100 x 10 mm) en az 30 dakika boyunca 2 mL / dak akış hızında geçirerek HPLC sistemini dengeleyin, ardından saptırma valfini değiştirin, HPLC mobilinin yalnızca kiral HPLC kolonundan geçmesine izin verin ve akış hızını 3 mL / dak'ya yükseltin.
- QMA ışık kartuşunu [18F] florür yakalama/bırakma hattına takın. İstiflenmiş alümina/C8 kartuşlarını, giriş MVP pozisyonu 6 ile HPLC numune döngüsüne bağlı 10 mL V şeklinde bir şişe olan ara şişe arasına takın. MVP pozisyonu 4'e 10 mL'lik boş bir şişe (havalandırma şişesi) takın ve şişeye havalandırma deliği olarak tutturulmuş başka bir iğne takın. Reaktif şişeleri 1-5'i sırasıyla giriş MVP pozisyonları 1-5'e takın.
- Adım 1.3.4'te hazırlanan durulama çözeltisini içeren şişeyi çıkış MVP pozisyonu 6'ya takın.
- MVP pozisyonu 1'e 500 mL'lik bir atık şişesi takın (hem kiral hem de C18 kolonlarından geçen HPLC atıklarını toplamak için). Dört portlu iki konumlu vananın atık toplama ucuna başka bir 500 mL atık şişesi (kiral kolondan geçen HPLC atıklarını toplamak için) takın.
- Fraksiyon toplama şişesini (adım 1.3.3'te hazırlanan önceden doldurulmuş çözelti) MVP pozisyonu 2 formülasyonuna bağlayın. Nihai formüle edilmiş ürünü geri kazanmak için çıkış MVP pozisyonu 3 (gaz hattı) ve nihai ürün teslimat hattını MVP pozisyon 2 şişeleri formülasyonuna bağlayın. Hedef fraksiyon toplama için yedek şişe olarak kullanılacak MVP pozisyonu 3 formülasyonuna 10 mL boş steril bir şişe takın.
- C18 kısa kolonunu dört portlu, iki konumlu saptırma vanası ile MVP formülasyonu arasına takın.
NOT: Reaktif ve formülasyon şişelerinin montajı sırasında, şişe montajı sırasında beklenmeyen sıvı transferini önlemek için kontrol panelindeki argon beslemesinin kapalı olduğundan ve argon basıncının sıfır olduğundan emin olun. Tekrarlanabilir radyosentez için tüm iğne bağlantılarını, flakon konumlarını ve MVP konumlarını iki kez kontrol edin.
- L-[ radyosentezi18F]FETrp
- [18F] florür alın ve araştırın.
- Sentezin başlangıcında [18F] florür çözeltisini (15 ± 3 gigabecquerel (GBq) alırken, Malzeme Tablosuna bakın), maksimum radyasyona maruz kalma oranlarını kaydetmek için yüzeydeki kurşun kutusunu ve 1 m'yi inceleyin. Nakliye kutusunun kirlenmediğinden emin olmak için bir silme testi yapın. [18F] florür dozunu ve süresini kaydedin.
- Transfer [18F]florür.
- Radyoaktiviteyi radyokimya sentez sistemine aktarın.
- Argon hattını kısa bir iğneyle ve [18F] florür transfer hattını uzun bir iğneyle [18F] florür şişesine bağlayın. Sıcak hücreli cam kapıyı ve kurşun kapıyı kapatın.
DİKKAT: Her iki iğneyi de aşağı itmek için uzun bir kelepçe kullanın; Uzun iğne ucunun [18F] florür şişesinin dibine oturduğundan emin olun, böylece tüm [18F] florür dışarı aktarılabilir. Tipik olarak, [18F] florür dağıtımı için V şeklinde bir şişe talep edilir.
- Tuzak, elute ve azeotropik olarak kuru [18F] florür.
- Argon besleme hattını açmak, argon basıncını artırmak, [18F] florür itme hattını açmak ve sulu [18F] florürü QMA ışık kartuşundan itmek için Ar Supply'a tıklayın. Tüm radyoaktivite QMA ışık kartuşunda sıkıştıktan ve radyoaktivite dedektörü okuması sabit kaldıktan sonra, argon basıncını artırın ve fazla suyu gidermek için argonu kartuştan 5 dakika daha üfleyin.
- [18F] florür itme hattını kapatın, argon basıncını sıfıra düşürün, altı portlu iki konumlu valfi [18F] florür yakalama konumundan elüsyon konumuna getirin. Reaksiyon şişesini açın, giriş MVP pozisyonu 1 argon hattını açın, radyoaktiviteyi reaksiyon şişesine atmak için K222/K2CO3 çözeltisini QMA ışık kartuşu üzerinden giriş MVP pozisyonu 1 şişesine itin. [18F] florür elüsyon pozisyonunu yakalama konumuna getirin.
- Reaktörü 110 °C'de ısıtmak için Isı düğmesine tıklayın, reaktöre bağlanan çıkış MVP konumu 4 argon hattını (süpürme hattı) açın ve çözücüyü çıkış MVP konumu 4 şişesine buharlaştırın.
- Reaktörü sıkıştırılmış karbondioksit ile oda sıcaklığına soğutmak, süpürme hattını kapatmak, giriş MVP konumu 1'i konum 2'ye değiştirmek ve susuz asetonitril'i şişe 2'ye eklemek için Soğut düğmesine tıklayın. 110 °C'de azeotropik olarak kuru [18F] florür için süpürme hattını ve ısıtıcıyı açın.
- Radyoetiketleme öncüsünü ekleyin ve [18F] florür ekleyin.
- Reaktörü oda sıcaklığına soğutun, süpürme hattını kapatın, giriş MVP konumu 2'yi konum 3'e değiştirin ve tosilat radyoetiketleme öncüsünü şişe 3'e ekleyin. Reaktörü kapatın ve reaksiyon karışımlarını 10 dakika boyunca 100 ° C'de ısıtın.
- Reaksiyon çözücüsünü ve asidoliki buharlaştırın.
- Reaktörü soğutun ve açın, süpürme hattını açın ve reaksiyon çözücüsünü 100 ° C'de buharlaştırın.
- Reaktörü soğutun, süpürme hattını kapatın, giriş MVP pozisyonu 3'ü konum 4'e değiştirin ve hidroklorik asit / asetonitril karışımını (0,5 mL, 1/1, v / v) ekleyin. Radyoetiketleme öncüllerindeki tert-bütil ve tert-bütiloksikarbonil koruyucu grupların korumasını gidermek için reaksiyonu 100 °C'de 10 dakika ısıtın.
- Reaksiyonu nötralize edin.
- Reaktörü oda sıcaklığına soğutun ve reaksiyon karışımını nötralize etmek üzere 2 M sodyum hidroksit eklemek için giriş MVP pozisyonu 4'ü konum 5'e değiştirin. Giriş MVP argon hattını kapatın.
- Reaksiyon karışımını ara şişeye aktarın.
- Çıkış MVP'sini havalandırma konumu 4'ten konum 5'e geçirmek için çıkış MVP'sindeki F düğmesini tıklatın ve ardından giriş MVP'sini konum 5'ten konum 6'ya geçirmek için MVP girişindeki F düğmesini tıklatın. MVP argon hattını açın. Reaksiyon karışımını istiflenmiş nötr alüminyum oksit ve C8 kartuşlarından HPLC numune döngüsünden önce takılan ara şişeye itin.
- Reaktörü durulayın ve çözeltiyi aktarın.
- Çıkış MVP pozisyonu 5'i pozisyon 6'ya değiştirin, çıkış MVP pozisyonu 6'nın şişesindeki durulama çözeltisini reaksiyon şişesinden ve kartuşları art arda ara şişeye itin. Kombine karışımın hacminin yaklaşık 3,5 mL olduğunu unutmayın. Reaksiyon kabını kapatın.
- Kombine karışımı HPLC döngüsüne yükleyin ve karışımı saflaştırın.
- HPLC döngüsünü enjeksiyon konumundan yükleme konumuna geçirin, giriş MVP argon hattını açın ve karışımları 5 mL HPLC döngüsüne yükleyin. Yükleme tamamlandığında, yüklemek için yükle düğmesini değiştirin ve HPLC kromatogramını 3 mL/dak akış hızında başlatmak için HPLC Enjekte Et'i tıklatın. Gerçek zamanlı HPLC kromatogramına erişmek için HPLC monitör düğmesine tıklayın.
- Hedef kesiri C18 sütununa yönlendirin.
- Hedef HPLC fraksiyonunu yaklaşık 12 dakikada kısa C18 sütununa yönlendirmek için saptırma MVP düğmesine tıklayın.
- Kiral HPLC kolonunu yıkayın ve C18 kolonundaki fraksiyonu saflaştırın.
- Hedef radyoaktivite C18 sütununda toplandıktan sonra (ve HPLC mobil fazı MVP pozisyon 1 atık şişesi formülasyonuna akar), dört portlu iki konumlu saptırma vanasını atık toplama konumuna getirin. Küçük D-[18F]FETrp enantiyomerini ve diğer ultraviyole (UV) safsızlıklarını gidermek için kiral kolonu 6 dakika boyunca 4 mL / dak'da yıkayın.
- HPLC mobil fazını 3 mL/dak akış hızında formülasyon MVP pozisyonu 1'e geri yönlendirmek için saptırma MVP düğmesine tıklayın. Mobil fazın, C18 sütununda tutulan L-[18F] FETrp'yi saflaştırmak için kiral kolondan ve C18 sütunundan geçtiğini gözlemleyin.
- Hedef fraksiyonu toplayın.
- Elüenti yaklaşık 32-34 dakikada MVP pozisyon 2 şişesi formülasyonuna toplayın.
NOT: Tipik olarak, 2 dakikalık bir HPLC fraksiyonu toplanır ve toplam hacim artı önceden doldurulmuş sodyum klorür çözeltisi 8-15 mL'dir.
- Elüenti yaklaşık 32-34 dakikada MVP pozisyon 2 şişesi formülasyonuna toplayın.
- Dozu steril bir nihai ürün şişesine verin.
- MVP pozisyon 2 şişesi formülasyonundaki çözeltiyi dağıtım hattından ve steril filtreden son doz şişesine itin (önceden monte edilmiş steril havalandırma filtresi iğnesi aracılığıyla).
NOT: 2.2.9-2.2.13 protokol adımları, L-[18F]FETrp'nin HPLC saflaştırılması için kullanılan adımlardır.
- MVP pozisyon 2 şişesi formülasyonundaki çözeltiyi dağıtım hattından ve steril filtreden son doz şişesine itin (önceden monte edilmiş steril havalandırma filtresi iğnesi aracılığıyla).
- Radyoaktivite ve doz hacmini test edin.
- Steril filtreyi çıkarın ve son doz aktivitesini ve hacmini test edin.
- Sistemi ultra saf suyla yıkayın ve ardından her biri en az 15 dakika boyunca 4 mL / dak'da etanol ile yıkayın. HPLC pompasını ve PLC kutusunu kapatın; programı kapatın; basınçlı hava hattını, argon hattını ve karbondioksit hattını kapatın; ve modülün ana gücünü kapatın.
- QC dozunu geri çekin ve QC örneklerini çalıştırın.
- Son dozun yaklaşık 0,1 mL'sini bir QC şişesinin 0,2 mL'lik bir ucuna çekin. Sıcak numuneyi, adım 1.2.6'da açıklanan sistem uygunluk testini izleyerek "kısmi sıra" programı olarak çalıştırın.
- QC verilerini analiz edin ve dozu serbest bırakın.
- Kimyasal ve radyokimyasal saflıkları, enantiyomerik aşırı değeri ve molar aktiviteyi hesaplayın; pH değerini belirleyin.
- Tüm test sonuçları kabul edilebilir aralığı geçerse dozu serbest bırakın.
- [18F] florür alın ve araştırın.
3. Çalıştırma sonrası sistem temizliği
- Sistem temizlenmeden önce radyoaktivitenin yeterince bozunduğundan (en az 24 saat) emin olmak için bir Geiger-Mueller (GM) anket ölçer kullanarak radyoetiketleme modülünü araştırın.
- Radyoetiketleme modülü gücünü ve PLC kutu gücünü açın; radyokimya sentez sisteminin programını aktive etmek; ve giriş MVP'sini, çıkış MVP'sini ve formülasyon MVP'sini başlatın. Sütun seçiciyi atlama konumuna getirin.
- QMA ışığını, alüminasını ve C8 kartuşlarını çıkarın.
- Tüm şişeleri ve hatları önce ultra saf suyla, ardından etanolle yıkayın. Şişeleri ve hatları yüksek saflıkta argon ile kurutun.
- Her hat havalandırma deliğini kapaklı steril bir iğne kullanarak kapatın. Reaktif şişelerini ve reaksiyon kabını sırasıyla fırında yanmış şişeler ve reaksiyon kabı ile değiştirin.
- HPLC pompasını ve PLC kutusunu kapatın; programı kapatın; basınçlı hava hattını, argon hattını ve karbondioksit hattını kapatın; ve modülün ana gücünü kapatın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reaksiyon şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Radyoetiketleme aşağıdaki iki adımı içerir: 1) tosilat radyoetiketleme öncüsünün [18F] florür ile reaksiyonu 18F etiketli ara maddeyi sağlar ve 2) ara üründeki tert-bütiloksikarbonil ve tert-bütil-koruma gruplarının korunması, nihai ürün L-[18F] FETrp'yi sağlar. Her iki reaksiyon adımı da 10 dakika boyunca 100 °C'de devam eder.
Ticari satıcıdan [18F] florür almadan önce, reaktif şişelerini, formülasyon şişelerini ve kartuşları monte edin; yarı hazırlayıcı, QC sistemlerini dengelemek; ve bir QC sistemi uygunluk testi çalıştırın. L-[18F]FETrp'nin radyosentezi için ayrıntılı iş akışı Şekil 2'de özetlenmiştir. Kısacası, radyoaktivite araştırılır ve radyokimya sentez sistemine aktarılır ve [18F] florür, yakalama / serbest bırakma adımlarından sonra reaksiyon kabında azeotropik olarak kurutulur. İlk adımda [18F] florür birleşmesinden sonra, iki fonksiyonel grubun korumasını azaltmak için asit eklenir, ardından baz nötralizasyonu yapılır. Reaksiyon karışımı bir ara şişeye aktarılır ve reaksiyon kabı karışık bir çözelti ile durulanır. Kombine karışım, saflaştırma için HPLC döngüsüne yüklenir. Kimyasal safsızlıkları gidermek için kiral ve C18 HPLC kolonlarının bir kombinasyonu kullanılır. Hedef fraksiyon, doz konsantrasyonunu ve tonisitesini ayarlamak için sodyum klorür ile önceden doldurulmuş bir formülasyon şişesinde toplanır. Nihai ürün, dozlar serbest bırakılmadan önce QC için steril olarak filtrelenir, test edilir ve aliquoted edilir.
Sistem kurulumunun şematik diyagramı Şekil 3'te gösterilmiştir. Modül aşağıdaki ana bileşenlerden oluşur: 1) reaktif ilavesi için giriş MVP'si, 2) reaktör havalandırma ve durulama için çıkış MVP'si, 3) HPLC fraksiyon toplama ve doz formülasyonu için formülasyon MVP, 4) [18F] florür yakalama ve MVP serbest bırakma ve 5) HPLC arıtma sistemi. Radyoaktivite, reaksiyon sıcaklığı ve basınç eğilimleri kontrol panelinden gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Tipik bir yarı hazırlayıcı HPLC kromatogramı Şekil 4'te gösterilmiştir. UV safsızlıkları içeren hedef fraksiyon kısa bir C18 sütununa yönlendirilir (siyah iz kırmızı UV izi ile örtüşür, Şekil 4). Hedef bileşendeki safsızlıklar, fraksiyonu bir C18 sütunundan geçirerek giderilebilir. C18 kolonundan salınan saflaştırılmış HPLC fraksiyonu, formülasyon şişesinde toplanır. Doz QC için test edilir ve aliquoted edilir.
QC için temsili HPLC kromatogramları Şekil 5'te gösterilmiştir. Boş numunenin kromatogramı, boşluk hacmi ile programın 10 dakikası arasındaki önemsiz zirveleri gösterir. Radyoaktif etiketli olmayan standart referans L-FETrp, D-muadilinin standart referansından iyi ayrılmış tek bir izomer gösterir. L-[18F] FETrp'nin son dozu yüksek kimyasal saflık ve radyokimyasal saflık gösterir. Nihai ürünün 8 saate kadar en yüksek doz konsantrasyonunda stabilite testi, L-[18F] FETrp'nin kimyasal saflık, radyokimyasal saflık, enantiyomerik fazlalık ve pH değeri açısından kararlı olduğunu göstermektedir (Tablo 2)37. L-[18F]FET'in tek kaplı, iki aşamalı radyosentezi için bu protokol yaklaşık 100 dakika sürer. Bozunma düzeltilmiş verim% 20 ± 5'tir, kimyasal ve radyokimyasal saflıklar% 95'ten büyüktür. 12-18 GBq [18F] florürden başlayarak, L-[18F] FET'in molar aktivitesi 88-118 GBq / μmol'dür. Kütle konsantrasyonu tipik olarak 0.5 μg / mL'den azdır ve doz konsantrasyonu 37-185 MBq / mL aralığındadır.
Resim 1: L-[18F]FETrp'nin tek kaplı, iki aşamalı radyosentezi için reaksiyon şeması. Kısaltmalar: MeCN = asetonitril; L-[18F]FETrp = 1-(2-[18F]Floroetil)-L-triptofan; K222 = 4,7,13,16,21,24-hekzaoksa-1,10-diazabisiklo[8.8.8]hekzakozan. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: L-[18F]FETrp radyosentez iş akışına genel bakış. * USP823'e göre tam bir kalite kontrolü, L-[18F] FETrp'nin insan kullanımı için USP797 takip edilecektir. Kısaltmalar: QC = kalite kontrol; MeCN = asetonitril; L-[18F]FETrp = 1-(2-[18F]Floroetil)-L-triptofan. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: L-[18F]FETrp üretimi. Kurulumun şematik diyagramı (solda) ve radyosentez platformunun fotoğrafı (sağda). Kurulum aşağıdaki ana bileşenleri içerir: 1. Giriş MVP'si; 2. Çıkış MVP; 3. Formülasyon MVP; 4. [18F]Florür yakalama/serbest bırakma MVP; 5. QMA kartuşu; 6. Ara şişe; 7. Alümina/C8 kartuşları; 8. Reaktör; 9. Kiral HPLC kolonu; 10, C18 sütunu; 11. Kiral kolona HPLC atık şişesi; 12. Saptırma MVP'si; 13. Kiral ve C18 sütunlarına HPLC atık şişesi; 14. Formülasyon şişesi; 15. Şişeyi yedekleyin. Kısaltmalar: L-[18F]FETrp = 1-(2-[18F]Floroetil)-L-triptofan; MVP = modüler şişe konumlandırıcı; QMA = kuaterner metilamonyum. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 4: L-[18F]FETrp'nin saflaştırılması için tipik yarı hazırlayıcı kromatogram. Kırmızı iz, 254 nm'de UV kanalı. Siyah iz, radyoaktivite kanalı. 1, 2 numaralı oklar, L-[18F]FETrp içeren radyoaktif fraksiyonun sırasıyla C18 sütununa yönlendirilmesinin başlangıcını ve bitişini gösterir. 3, 4 numaralı oklar, sırasıyla C18 sütunundan salınan saflaştırılmış hedef fraksiyon L-[18F]FETrp'nin toplanmasının başlangıcını ve bitişini gösterir. Kısaltma: L-[18F]FETrp = 1-(2-[18F]Floroetil)-L-triptofan. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: L-[18F]FETrp'nin kalite kontrolü için tipik analitik HPLC kromatogramı. 1) Boş çözelti, 2) L-FETrp'nin standart çözeltisi, 3) L-FETrp ve D-FETrp karışımlarının standart çözeltisi, 4) 230 nm'de L-FETrp'nin UV izi, 4) L-[18F] FETrp formülasyonunun radyoaktivite izi. Kısaltma: L-[18F]FETrp = 1-(2-[18F]Floroetil)-L-triptofan; L-FETrp = 1-(2-Floroetil)-L-triptofan; D-FETrp = 1-(2-Floroetil)-D-triptofan. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Izleyici | Klinik Araştırma | Başlıca Endikasyonları | Profesyonel | Eksi -lerini | |||
| 11 adet C-5-HTP | Evet | Serotonin üreten nöroendokrin tümörlerin, nöropsikiyatrik hastalıkların görüntülenmesi | Küçük nöroendokrin tümörlerin saptanmasında hassastır | Yerinde bir siklotrona, kısa yarı ömre, zahmetli prosedürlere, multi-enzimatik radyosenteze, öncü konsantrasyona ve çözelti pH'ına duyarlı, dopaminerjik ve noradrenerjik alanlarda spesifik olmayan alıma ihtiyaç duyar | |||
| [11C] AMT | Evet | Epileptojenik doku ve beyin tümörlerinin güçlü kinürenin yolu aktivasyonlarına dayalı lokalizasyonu | cGMP üretimi mevcuttur, protein sentezine dahil edilmemiştir | Yerinde bir siklotrona, kısa yarı ömre, zahmetli prosedürlere, patolojik koşullar altında karmaşık nicelleştirmeye ihtiyaç duyar | |||
| L-[18F]FETrp | Hayır | Epileptik odakları, beyin tümörlerini içeren kinürenin yolağının görüntülenmesi ve epilepsi ile ilişkili nöroinflamatuar anormalliklerin saptanması | Uydu dağıtımı için uygun yarı ömür, cGMP radyosentezi, deflorlamaya karşı yüksek stabilite ve uygun radyasyon dozimetrisi | Hem L-amino asit taşıyıcı hem de alanin-serin-sistein taşıyıcı tarafından kolaylaştırılan alım, henüz insan araştırması yapılmamıştır. | |||
Tablo 1: 11C-5-HTP, [11C]AMT ve L-[18F]FETrp'nin karşılaştırılması. Kısaltmalar: cGMP = mevcut iyi üretim uygulamaları; α-[11C]metil-L-triptofan; L-[18F]FETrp = 1-(2-[18F]Floroetil)-L-triptofan; 11 adet C-5-HTP = 11C-5-hidroksitriptofan.
| Tahlil Sentezinin Bitiminden Saatler Sonra | HPLC ile Radyokimyasal Saflık (%) | Kimyasal Saflık (%) | Enantiyomerik Fazlalık (%) | pH Değeri |
| 0 | 99 | >95 | 98 | 5.5 |
| 1 | 99 | >95 | 99 | 5.5 |
| 2 | 99 | >95 | 99 | 5.5 |
| 4 | 99 | >95 | 98 | 5.5 |
| 6 | 98 | >95 | 98 | 5.5 |
| 8 | 97 | >95 | 97 | 5.5 |
Tablo 2: En yüksek doz konsantrasyonunda tipik bir partide L-[18F] FETrp'nin stabilite testi. Kısaltma: L-[18F]FETrp = 1-(2-[18F]Floroetil)-L-triptofan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Triptofan, insanlar için gerekli bir amino asittir. Ruh halinin, bilişsel işlevin ve davranışın düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Radyoaktif etiketli triptofan türevleri, özellikle karbon-11 etiketli [11C] AMT, serotonin sentezinin haritalandırılmasında38,39, tümörlerin saptanmasında ve derecelendirilmesinde40, epilepsi cerrahisine rehberlik etmede41,42 ve diyabette tedavi yanıtının değerlendirilmesinde benzersiz rolleri nedeniyle kapsamlı bir şekilde çalışılmıştır43. Bununla birlikte, kısa yarı ömür ve zahmetli radyoetiketleme prosedürleri, [11C] AMT'nin yaygın uygulamasını sınırlandırmaktadır. triptofan metabolizması için flor-18 etiketli ajanlar geliştirme çabaları devam etmektedir. Son zamanlarda yayınlanan iki derleme makalesi, flor-18 etiketli triptofan görüntüleme ajanlarının gelişimini ve görüntüleme özelliklerini özetlemektedir3,28.
11C etiketli selefi ile karşılaştırıldığında, L-[18F]FETrp olumlu in vivo görüntüleme özellikleri, iyi metabolik stabilite ve deflorlamaya karşı direnç göstermektedir33. Ek olarak, L-[18F]FETrp, 18F-FDG ile karşılaştırıldığında olumlu bir dozimetri profili göstermektedir ve klinik çeviri için umut verici bir triptofan görüntüleme ajanı olarak önerilmiştir32,33. Burada açıklanan metodoloji, bir radyokimya sentez sisteminde L-[18F] FETrp'nin radyosentezi için tek kaplı, iki adımlı bir strateji kullanmaktadır. L-[18F]FETrp yüksek kimyasal saflık, radyokimyasal saflık ve enantiyomerik fazlalık ile üretildi. Son dozdaki toplam radyoaktif olmayan L-FETrp kütlesi 5 μg'den fazla değildir ve etanol içeriği% 10'dan fazla değildir. L-[18F]FETrp, transgenik bir medulloblastom fare beyin tümörü modelinde triptofan metabolizmasının görüntülenmesi için PET merkezinde rutin olarak üretilir ve olumlu görüntüleme sonuçları göstermiştir32. L-[18F]FETrp için bildirilen yöntemle karşılaştırıldığında, mevcut protokol aşağıda ayrıntılı olarak açıklanan faydaları içerir.
İlk olarak, radyoetiketleme için bildirilen diğer radyoetiketleme modülleri ve yöntemleriyle karşılaştırıldığında (1.1 mL çözücüde 9 mg öncül kullanılmış)35 ve reaksiyona 0.5 mL çözücüde sadece 1-2 mg radyoetiketleme öncüsü eklenir, ancak çok daha yüksek bir enantiyomer verimi ile. Enantiyomerik aşırı değere dair herhangi bir rapor olmaksızın L-[18F]FETrp'nin iki kaplı, üç aşamalı radyosentezi için% 1'den az verim bildirilmiştir44.
İkincisi, L-[18F]FETrp veya rasemik [18F]FETrp için bildirilen prosedürlerle karşılaştırıldığında en düşük toksik K222 miktarı kullanılır. Tipik olarak 4-5 mg K222, diğerleri tarafından kullanılan 37,5 mg ile karşılaştırıldığında kullanılır35. K222, 18F etiketli PET izleyicilerin radyosentezinde sıklıkla kullanılan bir faz transfer katalizörüdür. K222 için USP'de belirtilen sınır 50 μg/mL'den azdır. Kalıntı K222 konsantrasyonunun tespiti için bir renk lekesi testi, klinik kullanım için son dozu serbest bırakmadan önce kriterleri karşılamak için yapılmalıdır45.
Üçüncü olarak, [18F] florür elüsyonu için K2CO3 / K222 çözeltisine sadece% 1 su verilir, bu da sulu [18F] florürün kurutma işlemini hızlandırır. [18F] florür anyonları ağır şekilde nemlendirilir ve sulu ortamda kimyasal olarak inert hale gelir46. Bu nedenle, [18F] florür birleşmesi için sulu çözeltinin [18F] florür ve azeotropik kurutulmasının çözülmesiyle nükleofilikliğin arttırılması gereklidir. Su ayrıca, radyoetiketleme öncüsünün istenen [18F] florür nükleofilik ikamesi yerine hidrolize etmek için [18F] florür ile rekabet edecektir.
Dördüncüsü, L-[18F]FETrp'nin saflaştırılması için enjekte edilebilir bir mobil faz kullanılır. 50 mM sodyum asetat / asetik asitte yüzde on etanol, pH 5.5, radyotracer'i saflaştırmak için mobil faz olarak kullanılır ve etanol içeriğini klinik kullanım için son dozda% 10'un altına kolayca getirir. Sudaki %90 etanolün enantiyomerleri çözdüğü bildirilirken, etanol içeriğinin 78 °C34'te %10'un altına buharlaşması daha fazla zaman alır.
Transgenik bir medulloblastoma fare modelinde L-[18F]FETrp'nin klinik öncesi çalışması, 1-L-[18F]FETrp'nin olumlu kinetik ile yüksek beyin tümörü birikimine, ihmal edilebilir in vivo deflorinasyona ve düşük arka plan alımına sahip olduğunu göstermektedir32. 1-L-[18F]FETrp ayrıca 18F-FDG31'e karşı üstün bir hedef-hedef dışı oran gösterir. Ayrıca, klinik araştırmalar için L-[18F]FETrp üretimi için protokolün kurulması kolaydır37. Ek olarak, filtre bütünlüğü, radyonüklidik saflık, artık çözücü seviyeleri, K222 konsantrasyonu, bakteriyel endotoksin seviyesi ve sterilite testleri dahil olmak üzere kapsamlı QC testleri, radyofarmasötiğin son dozu için kolayca yapılabilir. L-[18F]FETrp'nin insan deneklerde klinik kullanımı için düzenleyici onay süreci aktif olarak devam etmektedir.
Yöntemin bazı sınırlamaları vardır. Yeterli kimyasal saflık ve L-[18F] FETrp'nin enantiyomerik fazlalığını elde etmek için iki HPLC sütunu kullanılır. Arıtma için mobil fazın 3 mL/dak'lık bir akış hızı kullanılır. Daha yüksek bir akış hızı yüksek karşı basınç ile sonuçlanırken, daha düşük bir akış hızı arıtma için daha uzun süreye ve piklerin zayıf taban çözünürlüğüne yol açar. Mobil faz ile uyumlu olan ve enantiyomerlere karşı daha iyi seçicilik ve safsızlıklara karşı iyi çözünürlük gösteren alternatif HPLC kolonları, saflaştırma adımlarını basitleştirebilir.
Radyokimya sentez modülü ticari olmayan bir sistemdir. Rasemik [18F]FETrp'nin tam otomatik radyosentezi, ticari bir GE FASTlab sentezleyicisinde bildirilmiştir. Enantiyomerlerin kiral ayrımı kiral analitik HPLC kolonu ile gerçekleştirilir; Son L- ve D-izomerleri ikinci bir FASTLab kasetinde35 formüle edilmiştir. Xin ve Cai34 , bir GE FX-N sistemi kullanarak optik olarak saf L-[18F] FETrp'nin otomatik radyosentezini bildirdi. İki enantiyomer, yarı hazırlayıcı kiral HPLC kolonu ile kolayca ayrılabilirken, yüksek etanol içeriğine sahip mobil faz (suda% 90 etanol) doğrudan insan enjeksiyonu için uygun değildir34. Yüksek enantiyomerik fazlalığa sahip L-[18F] FETrp için ticari bir radyosentezleyici ve enjekte edilebilir bir mobil fazın kullanılması, kolay klinik araştırmalar için oldukça arzu edilir.
Sonuç olarak, flor-18 etiketli triptofan analog L-[18F]FETrp, yüksek güvenilirlik ve tekrarlanabilirliğe sahip tek kaplı, iki adımlı bir yaklaşım kullanılarak bir radyokimya sentez sisteminde sentezlendi. Radyosentez, az miktarda radyoetiketleme öncüsü ve çözücü, enjekte edilebilir bir mobil faz ve insan kullanımı için L-[18F] FETrp'nin klinik üretimi için kolay uygulama özelliklerine sahiptir. Protokol, bu radyotracer'in triptofan metabolizması ile ilişkili nörolojik bozukluklar ve kanserler için daha yaygın kullanımını kolaylaştıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rakip finansal çıkarların olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma Tanı ve Araştırma PET/MRI Merkezi ve Nemours/Alfred I. duPont Çocuk Hastanesi Biyomedikal Araştırma ve Radyoloji Bölümleri tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [18F]Fluoride in [18O]H2O | PETNET Solutions Inc. | N/A | |
| 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosane | ACROS | 291950010 | Kryptofix 222 or K222, 98% |
| Acetic acid | ACROS | 222142500 | 99.8% |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | anhydrous, 99.8% |
| Agilent 1260 HPLC system | Agilent Technologies | Agilent 1260 | Agilent 1260 series |
| Analytcial chiral HPLC column | Sigma-Aldrich | 12024AST | Astec CHIROBIOTIC T, 25 cm × 4.6 mm |
| Carbon dioxide, 60 LBS | Airgas | REFR744R200S | 99.99% |
| D-FETrp standard reference | Affinity Research Chemicals Inc | N/A | Custom synthesis |
| Empty sterile vial | Jubilant HollisterStier | 7515 | 20 mm closure, 10 mL |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | 200 proof, USP grade. ≥99.9% |
| Fisherbrand 13 mm Syringe Filter, 0.22 µm, PVDF, sterile | Fisher Scientific | 09-720-3 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 30721 | ≥37% |
| Isopropanol | Decon Labs | 8316 | 70%, sterile |
| L-[18F]FETrp radiolabeling precursor | Affinity Research Chemicals Inc | N/A | Custom synthesis |
| L-FETrp standard reference | Affinity Research Chemicals Inc | N/A | Custom synthesis |
| Light C8 cartridge | Waters | WAT036770 | Sep-Pak C8 plus light cartridge |
| Needle, 20 G x 1 | Becton-Dickinson & Co. | 305175 | |
| Needle, 20 G x 1 ½ | Becton-Dickinson & Co. | 305176 | |
| Needle, 21 G x 2 | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | |
| Neutral aluminum oxide | Waters | WAT023561 | Sep-Pak alumina N plus light |
| Nylon membrane (0.20 µm ) | MilliPore | GNWP04700 | 47 mm |
| Pall Acrodisc 25 mm syringe sterile filter | Pall Corporation | 4907 | |
| PETCHEM radiochemistry synthesis system | PETCHEM Solutions Inc. Pinckney, MI | N/A | Radiosynthesizer |
| pH strips 2.0 - 9.0 | EMD Millipore | 1.09584.0001 | |
| Potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 367877 | 99.995% |
| Quaternary methylammonium light cartridge | Waters | 186004051 | Sep-Pak QMA light |
| Semi-preparative C18 HPLC column | Phenomenex | 00D-4253-N0 | 100 × 10 mm |
| Semi-preparative chiral HPLC column | Sigma-Aldrich | 12034AST | Astec CHIROBIOTIC T, 25 cm × 10 mm |
| Sodium chloride injection 23.4% | APP Pharmaceutical, LLC | 18730 | USP grade |
| Sodium chloridei injection 0.9% | Hospira | NDC 0409-4888-10 | USP grade |
| Sodium hydroxide | Honeywell | 306576 | 99.99% |
| Spinal needle, 20 G x 3 ½ | Becton-Dickinson & Co. | 405182 | |
| Sterile alcohol prep pads | BioMed Resource Inc. | PC661 | |
| Sterile empty vials, 2 mL | Hollister Stier | 7505ZA | 13 mm closure |
| Sterile empty vials, 30 mL | Jubilant HollisterStier | 7520ZA | 20 mm closure |
| Syringe PP/PE, 3 mL, Luer Lock | Air-Tite | 4020-X00V0 | |
| Syringe PP/PE, 5 mL, Luer Lock | Becton-Dickinson & Co. | 309646 | |
| Syringe, PP/PE, 10 mL, NORM-JECT | Air-Tite | 4100-000V0 | |
| Syringe, 1 mL, Luer Slip | Becton-Dickinson & Co. | 309659 | |
| Syringe, 3 mL, Luer-Lock | Becton-Dickinson & Co. | 309657 | |
| Ultra high purity argon | Airgas | AR UHP300 | 99.999% |
| Ultrapure water | MilliporeSigma | ZRQSVP300 | Direct-Q 3 tap to pure and ultrapure water purification system |
References
- Cetina Biefer, H. R., Vasudevan, A., Elkhal, A. Aspects of tryptophan and nicotinamide adenine dinucleotide in immunity: A new twist in an old tale. International Journal of Tryptophan Research. 10, 1178646917713491 (2017).
- Savitz, J. The kynurenine pathway: a finger in every pie. Molecular Psychiatry. 25 (1), 131-147 (2020).
- Zlatopolskiy, B. D., et al. 11C- and 18F-labelled tryptophans as PET-tracers for imaging of altered tryptophan metabolism in age-associated disorders. Russian Chemical Reviews. 89 (9), 879-896 (2020).
- Eriksson, B., et al. Positron emission tomography (PET) in neuroendocrine gastrointestinal tumors. Acta Oncologica. 32 (2), 189-196 (1993).
- Kälkner, K. M., et al. Positron emission tomography (PET) with 11C-5-Hydroxytryptophan (5-HTP) in patients with metastatic hormone-refractory prostatic adenocarcinoma. Nuclear Medicine and Biology. 24 (4), 319-325 (1997).
- Eriksson, O., et al. Quantitative imaging of serotonergic biosynthesis and degradation in the endocrine pancreas. Journal of Nuclear Medicine. 55 (3), 460-465 (2014).
- Carlbom, L., et al. 11C]5-hydroxy-tryptophan pet for assessment of islet mass during progression of type 2 diabetes. Diabetes. 66 (5), 1286-1292 (2017).
- Eriksson, O., et al. Positron emission tomography to assess the outcome of intraportal islet transplantation. Diabetes. 65 (9), 2482-2489 (2016).
- Jager, P. L., et al. Radiolabeled amino acids: Basic aspects and clinical applications in oncology. Journal of Nuclear Medicine. 42 (3), 432-445 (2001).
- Langen, K. J., Galldiks, N. Update on amino acid pet of brain tumours. Current Opinion in Neurology. 31 (4), 354-361 (2018).
- Chugani, D. C., Muzik, O., Chakraborty, P., Mangner, T., Chugani, H. T. Human brain serotonin synthesis capacity measured in vivo with α-[C-11]methyl-L-tryptophan. Synapse. 28 (1), 33-43 (1998).
- Chugani, D. C., Muzik, O. Alpha[C-11]methyl-L-tryptophan PET maps brain serotonin synthesis and Kynurenine pathway metabolism. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 20, 2-9 (2000).
- Diksic, M., Nagahiro, S., Sourkes, T. L., Yamamoto, Y. L. A new method to measure brain serotonin synthesis in vivo. I. Theory and basic data for a biological model. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 10 (1), 1-12 (1990).
- Diksic, M., Young, S. N. Study of the brain serotonergic system with labeled α-methyl-L-tryptophan. Journal of Neurochemistry. 78 (6), 1185-1200 (2001).
- Alkonyi, B., et al. Accurate differentiation of recurrent gliomas from radiation injury by kinetic analysis of α-11C-methyl-L-tryptophan PET. Journal of Nuclear Medicine. 53, 1058-1064 (2012).
- Bagla, S., et al. A distinct microRNA expression profile is associated with α[11C]-methyl-L-tryptophan (AMT) PET uptake in epileptogenic cortical tubers resected from patients with tuberous sclerosis complex. Neurobiology of Disease. 109, 76-87 (2018).
- Alkonyi, B., et al. Increased tryptophan transport in epileptogenic dysembryoplastic neuroepithelial tumors. Journal of Neuro-oncology. 107 (2), 365-372 (2012).
- Chugani, D. C. α-methyl-L-tryptophan: Mechanisms for tracer localization of epileptogenic brain regions. Biomarkers in Medicine. 5 (5), 567-575 (2011).
- Chugani, D. C., et al. Imaging epileptogenic tubers in children with tuberous sclerosis complex using α-[11C]methyl-L-tryptophan positron emission tomography. Annals of Neurology. 44 (6), 858-866 (1998).
- Chugani, H. T., et al. α-[11C]-Methyl-L-tryptophan-PET in 191 patients with tuberous sclerosis complex. Neurology. 81 (7), 674-680 (2013).
- Jeong, J. W., et al. Multi-modal imaging of tumor cellularity and tryptophan metabolism in human Gliomas. Cancer Imaging. 15 (1), 10 (2015).
- Juhász, C., et al. Quantitative PET imaging of tryptophan accumulation in gliomas and remote cortex. Clinical Nuclear Medicine. 37 (9), 838-842 (2012).
- Juhász, C., et al. Tryptophan metabolism in breast cancers: Molecular imaging and immunohistochemistry studies. Nuclear Medicine and Biology. 39 (7), 926-932 (2012).
- Juhász, C., et al. Successful surgical treatment of an inflammatory lesion associated with new-onset refractory status epilepticus. Neurosurgical Focus. 34, 5 (2013).
- Kumar, A., Asano, E., Chugani, H. T. α-[11C]-methyl-L-tryptophan PET for tracer localization of epileptogenic brain regions: Clinical studies. Biomarkers in Medicine. 5 (5), 577-584 (2011).
- Tiwari, V. N., Kumar, A., Chakraborty, P. K., Chugani, H. T. Can diffusion tensor imaging (DTI) identify epileptogenic tubers in tuberous sclerosis complex? Correlation with α-[11C]methyl-L-tryptophan ([11C]AMT) positron emission tomography (PET). Journal of Child Neurology. 27 (5), 598-603 (2012).
- Juhász, C., et al. In vivo uptake and metabolism of α-[11C]methyl-L-tryptophan in human brain tumors. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (3), 345-357 (2006).
- John, F., Muzik, O., Mittal, S., Juhász, C. Fluorine-18-labeled PET radiotracers for imaging tryptophan uptake and metabolism: a systematic review. Molecular Imaging and Biology. 22 (4), 805-819 (2020).
- Zlatopolskiy, B. D., et al. Discovery of 7-[ 18 F]fluorotryptophan as a novel positron emission tomography (PET) probe for the visualization of tryptophan metabolism in vivo. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (1), 189-206 (2018).
- Giglio, B. C., et al. Synthesis of 5-[18F]fluoro-α-methyl tryptophan: New trp based PET agents. Theranostics. 7 (6), 1524-1530 (2017).
- Yue, X., et al. Comparison of 1-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tryptophan and FDG for the detection of medulloblastoma in a transgenic mouse model. Journal of Nuclear Medicine. 60, Supplement 1 545 (2019).
- Xin, Y., et al. PET imaging of medulloblastoma with an 18F-labeled tryptophan analogue in a transgenic mouse model. Scientific Reports. 10 (1), 3800 (2020).
- Michelhaugh, S. K., et al. Assessment of tryptophan uptake and kinetics using 1-(2-18F-fluoroethyl)-L-tryptophan and α-11C-methyl-L-tryptophan PET imaging in mice implanted with patient-derived brain tumor xenografts. Journal of Nuclear Medicine. 58 (2), 208-213 (2017).
- Xin, Y., Cai, H. Improved radiosynthesis and biological evaluations of L- and D-1-[18F]fluoroethyl-tryptophan for PET imaging of IDO-mediated kynurenine pathway of tryptophan metabolism. Molecular Imaging and Biology. 19 (4), 589-598 (2017).
- Henrottin, J., et al. Fully automated radiosynthesis of N1-[18F]fluoroethyl-tryptophan and study of its biological activity as a new potential substrate for indoleamine 2,3-dioxygenase PET imaging. Nuclear Medicine and Biology. 43 (6), 379-389 (2016).
- Xin, Y., et al. Evaluation of l-1-[18F]Fluoroethyl-tryptophan for PET imaging of cancer. Molecular Imaging and Biology. 21 (6), 1138-1146 (2019).
- Yue, X., et al. Automated production of 1-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tryptophan for imaging of tryptophan metabolism. Applied Radiation and Isotopes. 156, 109022 (2020).
- Booij, L., et al. Brain serotonin synthesis in adult males characterized by physical aggression during childhood: A 21-year longitudinal study. PLoS ONE. 5 (6), 11255 (2010).
- Chandana, S. R., et al. Significance of abnormalities in developmental trajectory and asymmetry of cortical serotonin synthesis in autism. International Journal of Developmental Neuroscience. 23 (2-3), 171-182 (2005).
- Juhász, C., Dwivedi, S., Kamson, D. O., Michelhaugh, S. K., Mittal, S. Comparison of amino acid positron emission tomographic radiotracers for molecular imaging of primary and metastatic brain tumors. Molecular Imaging. 13 (6), 1-10 (2014).
- Rubí, S., et al. Positron emission tomography with α-[11C]methyl-L-tryptophan in tuberous sclerosis complex-related epilepsy. Epilepsia. 54 (12), 2143-2150 (2013).
- Chugani, H. T., et al. Clinical and histopathologic correlates of 11C-alpha-methyl-L-tryptophan (AMT) PET abnormalities in children with intractable epilepsy. Epilepsia. 52 (9), 1692-1698 (2011).
- Muzik, O., Burghardt, P., Yi, Z., Kumar, A., Seyoum, B. Successful metformin treatment of insulin resistance is associated with down-regulation of the kynurenine pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications. 488 (1), 29-32 (2017).
- Sun, T., et al. Radiosynthesis of 1-[18F]fluoroethyl-L-tryptophan as a novel potential amino acid PET tracer. Applied Radiation and Isotopes. 70 (4), 676-680 (2012).
- Mock, B. H., Winkle, W., Vavrek, M. T. A color spot test for the detection of Kryptofix 2.2.2 in [18F]FDG preparations. Nuclear Medicine and Biology. 24 (2), 193-195 (1997).
- Kim, D. W., Jeong, H. J., Lim, S. T., Sohn, M. H. Recent trends in the nucleophilic [18F]-radiolabeling method with no-carrier-added [18F]fluoride. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 44 (1), 25-32 (2010).
![1-(2-[<sup>18F</sup>]Floroetil)-L-Triptofanın Tek Kaplı, İki Adımlı Protokol Kullanılarak Radyosentezi](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/63025.jpg)
